Kullanım Talimatları SAS-3 Yüksek Rezolüsyon Katalog No: 300700
KULLANIM AMACI SAS-3 Yüksek Rezolüsyon Kit agaroz jel elektroforezi tarafından serum veya plazma proteinlerini ayırmayı amaçlamıştır. Serum, farklı patolojik koşullar altında konsantrasyonda spesifik varyasyona bağlı olan fonksiyonların belirli bir seti100 den fazla özel protein içerir. 1 Tiselius 2 tarafından yapılan hareketli sınır elektroforezin başlangıcından ve zone elektroforezinin sonraki kullanımından beri, serum proteinleri kendi yüklerine göre belirli bir ph da fraksiyonlara ayrılırlar. SAS-3 Yüksek Rezolüsyon kiti 10-15 ayrı fraksiyonlar içinde klasik 5 bant paterninden başka serum proteinlerini ayırır, böylece protein paternlerinin teşhis kullanışlılığı artar. 3-5 Yaklaşık olarak 15 serum proteinini kapsamlı olarak incelenmiştir çünkü kolayca ölçülebilir. 6-9 SAS-3 Yüksek Rezolüsyon kiti tamponlu bir agaroz jeldeki yüke göre serum/ plazma proteinlerini ayırır. Protein bantları daha sonra görüntüleme ve kantitatif yorum için sabitlenmiş ve boyanmıştır. UYARILAR VE ÖNLEMLER Tüm kitler yalnızca in-vitro diyagnostikte kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini ağzınızla pipetlemeyin, ağzınıza sürmeyin. Tüm kit bileşenlerinin işlemi sırasında eldiven giyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kılavuzuna başvurun. BİLEŞENLER 1. SAS-3 Yüksek Rezolüsyon Jel (x10) Agaroz koruyucu olarak sodyum azid ve tiyomersal ile bir Barbital buffer içerir. Paket içindeki jel kullanım için hazırdır. 2. Konsantre Yüksek Rezolüsyon Boyası (1x75) 5 part metanol:5 part su:1 part asetik sirke asidi içeren solüsyonda konsantre yüksek rezolüsyon içerir. Boya arındırıcı ile 700 ml ye şişe içeriğini dilüe edin ve iyice karıştırın. 3. Diğer Kit Bileşenleri Her kit kullanım talimatları ve 10 jeli tamamlamak için yeterli miktarda kurutma kağıdı C içerir. SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ 1. SAS-3 Yüksek Rezolüsyon jel Jeller 15-30 derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. DOLABA KOYMAYIN VEYA DONDURMAYIN. Jelin bozulmasını belirtebilir,1) jelin dondurulması kristal görünümü belirtir, 2) jelin 1
kuruması, çatlama ve kuruluğu veya 3)bakteriyal yada fungal kaynaklı agarozun görülür kontaminasyonunu belirtir. 2. Yüksek Rezolüsyon Boyası Konsantre boya 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe boya solüsyonu 15-30 derecede 6 ay stabildir. Zayıf boyama performansı, boya solüsyonunun bozulduğunun göstergesidir. SAĞLANMAYAN FAKAT GEREKSİNİLEN ÖĞELER Katalog No.310200 Numune Aplikatör Ucu (1 x 10) Katalog No.310300 Numune Aplikatör Ucu (5 x 10) Katalog No.3100 REP Prep Katalog No.210100 Tek kullanımlık numune kapları (100) 60-70 derece hava üfleme kapasiteli kurutma fırını. Boya arındırıcı solüsyon: 500 ml metanol ve 500 ml saf suyu karıştırın. 100 ml glisial asetik asit ekleyin. Sıkı kapatılmış şişede saklanır. NUMUNE TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI Tercih edilen numune taze toplanmış plazma veya serumdur. Numuneler maksimum 48 saate kadar 2-6 C kapalı olarak saklanmalıdır. Plazma kullanımı beta ve gama fraksiyonları arasında bir fibrinojen bandına sebep olur. Eski numunelerin kullanımı transferrin bölgesinde C3 bandına göçe neden olacaktır. Serum ve Plazma örnekleri kullanım öncesi serum fizyolojik ile 1:1 oranında dilüe edilmelidir. İdrar ve CSF numuneleri aşağıda uygun konsantrasyon adımında kullanılabilir: Konsantrasyon ardından, ürine ve CSF numuneleri direk olarak jele uygulanır. ADIM-ADIM PROSEDÜR 1. Cihaza aşağıdaki parametreleri programlayın: 2
Adım Zaman(dk:sn) Sıcaklık(derece) Voltaj Diğer Numune Yükleme 00:30 21 Hız 6 Numune Uygulama 00:30 21 Hız 6* Elektroforezler 18:00 16 525 * SPIFE 3000 / SAS-3 için pozisyon 1 kullanılır. 2. Aplikatör ucunu cihaz üzerindeki pozisyonuna yerleştirin: 3. i) SPIFE Kombo Kullanıcıları: Numune bazının uygun kuyusu içine 17μl numune pipetleyin. Buharlaşmadan numuneleri koruyun. ii) SPIFE 2000 / 3000 / SAS-3 Kullanıcıları: Tek kullanımlık uygun numune kaplarına 35μl numune pipetleyin. Buharlaşmadan numuneleri koruyun. 4. Jeli paketinden çıkarın ve kaplamasını atın. 5. 2ml REP Prep i bölmenin sol tarafına boşaltın ve dikkatlice bölme içine jeli koyun, bölme içinde iğneler ile jel bağlarındaki delikleri hizalayın ve jelin altında kabarcık oluşturmamaya dikkat edin. Elektrot kollarına elektrotlar eklenir böylece jel blokları ile temasa ederler. 6. Jelin yüzeyi kurutma kağıdı C ile kurutulur, kurutma kağıdı alınır. 7. Hİ-Res test programını seçin ve uyarıları izleyin, numuneleri uygulayın, elektroforezi yapın ve jeli inkübe edin. 8. Elektroforezi takiben, elektrotları alın ve Gel Block Remover kullanarak her iki jelin kurutucusunu alın. 9. 15 dakika boyunca Hi-Res Boya içine jeli daldırın. 10. 30 saniye boyunca jeli boya arındırıcı solüsyon içine koyun ve 60...70 C de kurutun. 11. Arka plan temizlenene kadar 3 x 01:30 mm:ss boyunca jeli boya arındırıcı solüsyon içine koyun. 12. Jeli kurutun. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Jelin değerlendirmesi, her laboratuarda bu yöntem için üretilen normal paternlere karşı yapılmalıdır. Belirli protein bantlarının varlığı veya yokluğu jelde görsel olarak incelenecektir. Şekil 1 de SAS-3 Yüksek Rezolüsyon Prosedür kullanılarak belirlenen ana plazma proteinlerin göç paternlerini göstermektedir. 3
Şekil 1 Yüksek Rezolsüyon protein elektroforez paternleri öncelikle normal bireylerden elde edilen bilinmeyen numunelerin bantlarının relatif yoğunluğu ile karşılaştırılarak yorumlanır. Anormal serum protein paternlerinde en yaygın olanlardan biri azalmış prealbumin, albümin ve transferine sahip haptoglobin ve α1 antitripsin de artarak karakterize olan spesifik olmayan inflamatuar yanıtı olarak görülmektedir. Genel bir teşhis kabul etmek yararlı değil iken, tedavi için bir hastanın yanıtının izlenmesi yararlıdır. Klinik olarak önemli varyasyonların diğer örnekleri şunlardır: 1. Transferrin bandının yüksekliği, demir düşük seviyesini gösterir. 2. Monoklonal proteinlerin varlığı, immun sistemde abnormalitesini gösterir. 3.Düşük haptoglobin, yüksek eritrosit turnover veya in-vitro hemoliz gösterir. 4. CRP varlığı, akut enflamatuar yanıt gösterir. 5.Düşük prealbumin, albümin ve yaygın hypergammaglobulinaemia ile transferrin, kronik inflamasyon, enfeksiyon veya antijenik stimülasyon gösterir. 6.Taze numunelerde düşük C3, tamamlayıcı tüketimi gösterir. Yüksek Resolsüsyon protein elektroforezi ürin proteini elde etmek için mükemmel bir analitik araçtır 3,10. Normal ürine normalde albumin bir izini ve bazen hafif bir transferrin bant içerir. Glomerüler-tip proteinüri genellikle geniş bir α1 bölgesinde ve transferrin β1 bölgedesin de ve hem α1-asit glikoprotein hem de a1-antitrypsin de albuminin güçlü bandından oluşur. Serum patern, glomerul tarafından tutulmuş proteinlerde artarken bu proteinlerde düşüşler gösterir. Tübüler proteinüri de ürine paterni, genellikle α2- mikroglobulin nedeniyle α2 bölgesinde çift bant, zayıf bir albümin bandından, β2- mikroglobulin nedeniyle orta-beta bölgesinde güçlü bir banttan ve bazen serbest hafif zincirlerden dolayı gama bölgesinde yaygın arka plan boyanmasından oluşur. Kronik böbrek hastalığı veya böbrek yetmezliği, hem tübüller hem de glomerul oluşan hasardan kaynaklanan karışık tip paternine yol açabilir. 4
Belirli numunelerdeki bileşenlerin azalması veya yükselmesi veya olağandışı numune bileşenlerinin tespiti daha fazla araştırma gerektirir. Tamamlanmış SAS-3 Yüksek Rezolsüyon jeli süresiz bir zaman için stabildir. KALİTE KONTROL High Resolution Protein Marker (Kat. No. 5141) her plaka çalışmasında ve prosedürün tüm basamaklarını doğrulamak için kullanılabilir. Uygun test değerleri için sağlanan paket içeriğine bakın. BİBLİYOGRAFİ 1. Alper, C.A. Plasma Protein Measurements as a Diagnostic Aid, N. Eng. J. Med., 1974; 291 : 287-290. 2. Tiselius, A. A New Approach for Electrophoretic Analysis of Colloidal Mixtures, Trans. Faraday Soc., 1937; 33 : 524. 3. Laurell, C.B. Composition and Variation of the Gel Electrophoretic Fractions of Plasma, Cerebrospinal Fluid and Urine Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1972; 29 (Suppl. 24) : 71. 4. Killingsworth, L.M. et al. Protein Analysis, Deciphering Cerebrospinal Fluid Patterns Diag. Med., 1980; March/April : 1-7. 5. Killingsworth, L.M. et al. Protein Analysis, Finding Clues to Disease in Urine Diag. Med., 1980; May/June : 69-75. 6. Killingsworth, L.M. Clinical Applications of Protein Determinations in Biological Fluids Other Than Blood Clin. Chem., 1982; 28(5) : 1093-1102. 7. Ritzmann, S.E and Daniels, J.C. Diagnostic Proteinology: Separation and Characterization of Proteins. Qualitative and Quantitative Assays in Laboratory Medicine, Harper & Row, Inc., Hagerstown, 1979. 8. Killingsworth, L.M. et al. Protein Analysis Diag. Med., 1980; Jan/Feb : 3-15. 9. Killingsworth, L.M. Plasma Protein Patterns in Health and Disease CRC Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences, August 1979. 10. Peterson, P.A., Ervin, P.E. and Beggard, I. Differentiation of Glomerular, Tubular and Normal Proteinuria: determination of Urinary Excretion of a2-microglobulin, Albumin and Total Protein J. Clin. Invest., 1969; 48 : 1189-1198. 5