KENE KAYNAKLI ENSEFALİTLERDE LABORATUVAR TANI Uz. Dr. Yavuz Uyar Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Viroloji Referans ve Araştırma Laboratuarı yavuz.uyar@rshm.gov.tr
KENE KAYNAKLI ENSEFALİTLER Viral Tick-borne encephalitis (TBE) Rus ilkbahar yaz ensefaliti, Orta Avrupa kene ensefaliti Japon B ensefaliti
KENE KAYNAKLI ENSEFALİTLER İnsanlarda yüzün üzerinde virusun ensefalit oluşturduğu bilinmektedir. Santral sinir sisteminini enfekte eden virüsler, spinal kord (myelit), beyin hücreleri (rhombensefalit), serebellum (serebellit) serebrum (ensefalit) da infeksyon oluşturabilirler. SSS nin akut viral infeksiyonlarında çeşitli derecelerde meningeal ve parenkimal inflamasyon oluşabilir.
KENE KAYNAKLI ENSEFALİTLER Kardinal klinik bulgular ateş, baş ağrısı, değişken mental durum. Kardinal laboratuar bulguları Beyin omurilik sıvısında %90 vakada; tipik olarak lenfositik pleositozis orta derecede artmış protein glukoz düzeyi normal
TICK-BORNE ENCEPHALITIS (TBE) TBE vakaları Rusya (Urallar ve Batı Sibirya Bölgesi), Litvanya, Almanya gibi Kuzey ve Doğu Avrupa ülkelerinde görülmektedir. Rusya: 700-1200 vaka/yıl Doğu Avrupa ülkelerinde: 3000 vaka/yıl Ortalama 100.000 kişide 4 vaka ortaya çıkmaktadır. Genellikle Nisan ve Kasım ayları arasında enfekte kenelerin yaygın olduğu dönemlerde sık
TICK-BORNE ENCEPHALITIS (TBE) Klinik menenjit, meningoensefalit, meningoensefalomyelit / radikülit. TBE tipik olarak bifazik bir klinik ile seyreder. Kısa bir kuluçka dönemi - birinci fazda karakteristik olmayan grip benzeri bir durum - ardından semptomsuz bir dönemle seyreder.
TICK-BORNE ENCEPHALITIS (TBE) İkinci fazda, SSS semptomları görülür. Bu dönemdeki en önemli nokta, yüksek ateş ve şiddetli baş ağrısı olduğu zaman hasta hekime veya hastaneye başvurur ve TBE için tanı uygulamaları başlamış olur.
TANI Direkt tanı İzolasyon Serolojik Moleküler yöntemler
TICK-BORNE ENCEPHALITIS (TBE) (Holzmann H. Vaccine. 2003;21:S1:36-40.)
Direkt tanı BOS İncelemesi: orta derecede pleositozis (100-300 hücre/µl), segmentli granülositler % 60-70, lenfositler %30-40 görülmektedir. Kan BOS bariyeri orta derecede bozulmuştur BOS / Serum albumin oranı artmıştır Nadiren ölümcül vakalarda beyin dokusunda elektron mikroskobu ile virus gösterilebilmiştir.
İzolasyon TBEV izolasyonu: Hastalara ait serum ve / veya BOS örnekleri memeli hücre kültürü ortamları Vero BHK-21 PK RH 293 A549 hücreleri Fare beynine inokülasyonu
Serolojik Tanı 1. Kompleman fiksasyonu 2. Hemaglütinasyon inhibisyon testi 3. ELISA Kompleman fiksasyonu veya hemaglütinasyon inhibisyon testi 1980 lerden önce Hızlı tanı: Hemaglütinasyon inhibisyon testinde 2-merkaptoetanol ile muamele sonrası spesifik IgM antikorları saptanabilir.
ELISA IgM ön planda olmak üzere intratekal antikor üretimi artmıştır. Serum ve BOS da serolojik tanı için oldukça iyi ve kullanılışlı bir yöntem Capture TBEV-IgM ELISA Romatoid Faktör veya heterofil antikor interferansı nedeniyle oluşabilecek yalancı pozitifliklerden uzaklaşılır ELISA yöntemi ile IgM in gösterilmesi oldukça güvenilir bir serolojik testtir.
TBE de ELISA yönteminin Dezavantajları: Erken dönemde antikoru saptayamaması Aşı sonrası ve doğal vakalarda 10 aya kadar devam eden IgM antikor varlığı ELISA ile spesifik IgG antikorunun saptanması veya Seronötralizasyon testleri ile konfirmasyonu önerilmektedir.
ELISA Hastalığın manifest olduğu dönemde TBE-spesifik IgM ve IgG antikorları birinci serum örneğinde saptanabilir. BOS da ise hastaların %50 sinde IgM antikorları saptanabilir. IgM antikoru BOS ta ilk 10 gün içinde saptanabilir
TBE tanısında dikkat edilmesi gereken durumlar Bazı nadir vakalarda IgM antikoru serumda tek başına pozitif bulunabilir. ikinci bir örnekle test konfirme edilmeli Enfeksiyonun erken döneminde antikor testleri negatif olabilir Ticari ELISA kitleri arasında duyarlılık ve özgüllük açısından farklılık olabilir 1-2 hafta sonra testler tekrar edilmelidir
TBE tanısında dikkat edilmesi gereken durumlar Antikorların çapraz reaksiyonlarından dolayı Geçirilmiş diğer flavivirüs enfeksiyonları - Dengue, - Japon Ensefaliti, - Batı Nil virusu Aşılanma durumu bilinmeli - Sarıhumma, - Japon Ensefaliti, - TBE Hastalığın verifikasyonunda spesifik IgG ile doğrulama gerekli
Nötralizasyon Testleri TBE nin endemik olarak görülmediği yerlerde saptanan antikor pozitiflikerinde doğrulama gereklidir Antikorlar için nötralizasyon testleri yapılır Bu testlerde infeksiyöz virus kullanılır BSL-3 laboratuvarlarda yapılır Tekniği zordur Pahalı yöntemler
Nötralizasyon Testleri PRNT Plaque reduction neutralisation test RFFT (Holzmann H. J Med Virol 1996;48:102-7) Rapid fluorescent focus neutralisation test (Vene S. J Virol Methods 1998; 73:71-5)
TICK-BORNE ENCEPHALITIS (TBE) Tablo.1. Klinik olarak TBE şüpheli vakalarda serolojik test sonuçlarına göre değerlendirme. SEROLOJİK TEST SONUÇLARI Spesifik IgM ve IgG pozitif Spesifik IgM ve IgG negatif Spesifik IgM pozitif, IgG negatif Spesifik IgM negatif, IgG pozitif DEĞERLENDİRME TBE virus enfeksiyonu Aşılama sonrası persistan antikor varlığı Yeni bir örnekle tekrar test edilmeli Şüpheli TBE enfeksiyonu, tanı yeni bir örnekle tekrar test edilmeli İmmünite Başarılı aşılama Pasif immünizasyon Aşıya karşı yetersiz yanıt Çapraz reaktif antikorlar (Holzmann H. Vaccine. 2003;21:S1:36-40.)
Moleküler Tanı Hastalığın ilk fazı boyunca, - Kan ve BOS örneğinde RT-PCR tekniği ile TBEV genomu saptanabilmektedir Bu teknikler pratikte tanıda minör derecede önemlidir - Hastaların çoğu hastalığın ikinci fazında hekim muayenesine başvurmaktadır ve bu dönemde zaten kan ve BOS tan virüs temizlenmiş olmaktadır.
RT-PCR tekniği hastalığın birinci faz dönemi hariç kullanılışlı değildir Virus izolasyonu ve moleküler yöntemler - Rutin tanıda pek kullanılmaz Genellikle ikinci fazın aşılmasıyla beraber - spesifik antikorların saptanmasıyla tanı konur
Yeni real-time PCR yöntemleri TBE tanısında daha başarılıdır. Vireminin araştırılması ve kenelerde virüs prevalansının epidemiyolojik surveyinde - RT-PCR ile tarama kullanılır
Moleküler Tanı BOS PCR testinde başarılı olabilmek için: PCR testinin sensitivitesi örneğin miktarıyla doğrudan ilişkili BOS örneğininin taze olması testte başarıyı arttırır BOS örneklerinde RNA virüslerinin stabilitesi DNA virüslerinden daha az Kısa süreli saklanacaksa +4 C de veya -20 C de saklanabilir Eğer uzun süreli saklanacaksa -70 C de saklanmalı Örneklere çok miktarda dondur-çöz işlemi yapılmamalı
Kenelerde epidemiyolojik surveyans Keneler toplanır %20 (v/v) fetal bovine serum içeren 500-1000 µl PBS içerisinde ezilir Total RNA ekstraksiyonu için aliquot buradan alınır. RT-PCR uygulanır -80 C de saklanabilir (Charrel RN. Clin Microbiol Infect 2004;10:1040-55.)
Teşekkür ederim.