Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir. ULUSAL MĠKROBĠYOLOJĠ STANDARTLARI (UMS) X,V ve XV faktör gereksinimi Hazırlayan Birim Klinik Bakteriyoloji Tanı Standartları ÇalıĢma Grubu Onaylayan Birim Türkiye Halk Sağlığı Kurumu Kategori Bakteriyoloji Bölüm Test Prosedürleri Standart No B-TP-23 Sürüm No 1.1 Onay tarihi 01.01.2015 Geçerlilik tarihi 01.01.2018 Sürüm no Tarih Değişiklik
İÇİNDEKİLER KAPSAM VE AMAÇ... 3 KISALTMALAR VE TANIMLAR... 3 GENEL BĠLGĠ... 3 TEKNĠK BĠLGĠLER... 4 1 Test için asgari laboratuvar koģulları... 4 2 Testin uygulanması... 6 3 Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması... 7 4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar... 7 ĠLGĠLĠ DĠĞER UMS BELGELERĠ... 9 KAYNAKLAR... 9 Sayfa 2 / 9 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-23 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Kapsam ve Amaç Haemophilus türleri üremek için kan hücrelerinde bulunan bazı maddelere ihtiyaç duyarlar. Bunlar X faktör olarak adlandırılan hemin, hematin ve V faktör olarak adlandırılan NAD olup, üreme faktörleri olarak da bilinirler. Faktör gereksinimi türlere göre değiģmektedir ve laboratuvarda Haemophilus üyelerinin bu özellikleri temelinde ayrımlarını yapmak mümkündür. Bu UMS nin amacı X, V ve XV faktör gereksinimi testlerinin yapılıģı ve yorumlanmasına dair bir rehber sunmaktır. Kısaltmalar ve Tanımlar BHI NAD, NADP TSA TSB Brain heart infusion (beyin kalp infüzyonu) Nikotinamid-adenin-dinükleotid, (NAD-fosfat) Triptik soya agar Triptik soya buyyonu Genel Bilgi Hemophilus türleri üremek için kanda bulunan bazı maddelere (X ve V faktörler) gereksinim duyan bakterilerdir. Bazı türler sadece X faktöre gereksinim duyar ki, X faktör tek bir maddeden ziyade pek çok demirli pigment (hemin, hematin) tarafından sağlanabilen ısıya-dirençli tetrapirol bileģikleridir. Bu bileģikler bakterinin katalaz, peroksidaz ve elektron transport sistemi sitokromlarının sentezinde kullanılırlar. Bazı Haemophilus türleri de ayrıca V faktöre (NAD; koenzim I veya NADP; koenzim II) gereksinim duyarlar. Her iki faktör de kan hücreleri içinde bulunur ve üreme faktörleri olarak da adlandırılırlar (1,2). Kanlı agar içeriğindeki koyun eritrositleri de bu faktörleri taģırlar. Ancak eritrositler hücre bütünlüğü bozulmamıģ halde olduklarından üremeleri bu faktörlere bağlı olan Haemophilus lar koyun kanlı agarda üreyemezler. * Eğer besiyeri, yapılıģı esnasında kan eklendikten sonra hücrelerin parçalanacağı bir sıcaklığa ısıtılırsa hem X, V faktörleri ortama salınır, hem de koyun kanında normalde bulunan ve V faktörünü hidrolize edebilen enzimlerin aktivitesi engellenmiģ olur. Nitekim bu Ģekilde elde edilen çikolata agar, Haemophilus ların üremesine elveriģli bir besiyeridir ve klinik örneklerden bakterinin izolasyonunda laboratuvarların çoğunun ilk tercihidir (1). Haemophilus ların X ve V faktör gereksinimleri onların hem izolasyonlarında hem de tür düzeyinde tanımlanmalarında kullanılan temel karakteristikleridir. Örneğin, her ne kadar koyun kanlı agara saf inokulum pasajı yapıldığında üremezlerse de solunum yolu örnekleri vb. karıģık kültürlerinde diğer bakterilere ait kolonilere komģu küçük koloniler yaparak üredikleri gözlenmiģtir. Bu tür üremenin özellikle stafilokok kolonilerinin hemoliz zonları içinde gözlenmesi satellit fenomeni olarak adlandırılmıģ ve satellit testine temel teģkil etmiģtir (1,2). * Haemophilus türleri, farklı olarak, %5 at kanlı ve tavģan kanlı agarlarda ürerler. Bu besiyerlerinde hemoliz karakterini (bazı türler -hemolitiktir) görmek mümkün olduğundan dolayı, tanımlamada tercih edilirler. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 3 / 9 Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-23 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Satellit testi için Staphylococcus aureus, kanlı agarda Ģüpheli örneğin (sürüntü veya koloni) ekiminin yapıldığı bölgeye çizgi ekimi tekniği ile inoküle edilir. S. aureus hemoliz aktivitesi ile eritrositlerden X faktörünü serbestleģtirirken kendisi de üremesi esnasında NAD üretip ortama salan bir bakteridir. Ġnkübasyon sonunda hemoliz zonu içinde -örnekte varsa- Haemophilus kolonilerinin üremesi beklenir. Bugün teknik sadece S. aureus ile değil -bazı ek avantajlar sağladıkları için- diğer stafilokok türleri ile de uygulanabilmektedir (2). X ve V faktörlerine gereksinim laboratuvarda, filtre kâğıdına (disk/ģerit) emdirilmiģ ürünlerin kullanılması ile de araģtırılabilir. Piyasada X faktör, V faktör ve XV faktör diskleri/ģeritleri Ģeklinde kullanıma hazır ürünler vardır. Testi uygulamak için öncelikle bu faktörleri kesinlikle içermeyen bir besiyerine (TSA, BHI agar) Ģüpheli organizmanın yoğun yüzey ekimi yapıldıktan sonra diskler/ģeritler yerleģtirilir. X ve V faktörleri suda eriyebilir özellikte maddeler olduklarından kolayca besiyerine yayılır. Yeterli bir inkübasyon süresinin sonunda plak incelendiğinde, disklerin/ģeritlerin etrafındaki üreme paternine göre yorum yapılır. Örneğin, Haemophilus parainfluenzae V faktör varlığında ürerken, Haemophilus influenzae ancak her iki faktörün varlığında üreyebilir (1,3,4). Teknik Bilgiler 1 Test için asgari laboratuvar koģulları 1.1. Laboratuvar güvenliği Bu UMS de bahsi geçen organizmalar ile ilgili iģlemler asgari BGD2 laboratuvar Ģartlarında gerçekleģtirilmelidir. Bütün kültürler enfeksiyöz kabul edilmeli ve daima standart önlemler uygulanmalı, önlemler risk değerlendirmesi ile de desteklenmelidir. Aerosol oluģturması muhtemel tüm laboratuvar çalıģmaları bir biyolojik güvenlik kabininde gerçekleģtirilmelidir (ayrıca bkz. Ulusal Laboratuvar Güvenliği Rehberi ). 1.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri Bu UMS yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) testten önce, amaçlanan kullanım ile ilgili eğitim almıģ olmalı; (ii) uygulamaya tüm yönleriyle aģina olmalı, ve; (iii) daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır. 1.3. Örnek, Besiyeri, Reaktif, Donanım İnceleme örneği Haemophilus Ģüpheli izolatın çikolata agardaki taze kültürü X ve V faktör gereksinimi veya satellit fenomeni testleri için. Alt solunum yolu örneği satellit fenomeni testi için (primer izolasyon amacıyla kanlı agara bilinen stafilokok suģu ile birlikte inokülasyon için) Sayfa 4 / 9 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-23 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Besiyeri, Reaktif, Test organizması TSA, BHI, TSB (5) X ve V faktör disk testi için. Besiyerleri piyasadan hazır temin edilebilir veya toz maddesinden laboratuvarda hazırlanabilir. Laboratuvarda hazırlama ve saklama koģulları için üretici firmanın talimatları izlenmelidir. ÖNEMLĠ: Her ne kadar bu prosedürün dayandığı değiģik kaynaklar faktör içermeyen herhangi bir besiyerinin test için kullanılabileceğini belirtiyor olsalar da araģtırmacılar Doern ve Chapin (5) 187 H.influenza suģunun X-V faktör gereksinimini test ettikleri çalıģmalarında dört besiyerini (TSA, BHI agar, nutrient agar ve Mueller-Hinton agar) incelemiģler ve bunların doğru tanımlama performansını sırasıyla %95.7, %92.5, %56.1 ve %71.1 bulmuģlardır. TSA, X-V faktör gereksinimi testleri için en ideal besiyeri olarak önerilmiģtir (5). X, V ve XV faktör diskleri (ya da Ģeritleri) - piyasadan temin edilir; üretici firmanın talimatına göre saklanır. Kanlı agar satellit fenomeni testi için Staphylococcus aureus ATCC 25923 veya bir Staphylococcus epidermidis suģu ( -laktamaz negatif) - satellit fenomeni testi için NOT: Herhangi bir stafilokok testte kullanılabilir. Ancak eğer test kanlı agar plağa yapılan bir primer kültüre uygulanacaksa koagülaz negatif, -laktamaz negatif, nonhemolitik bir stafilokokun seçilmesi Haemophilus türlerinin hemoliz karakterinin de gözlenebilmesi için kullanıģlıdır. Diğer gereç, donanım Öze, steril tek kullanımlık veya nikrom, Eküvyon, steril Vorteks Ġnkübatör, CO 2 li ya da mumlu jar 1.4. Kalite kontrol Her yeni besiyeri ve reaktif lotu kullanıma sokulmadan önce pozitif ve negatif kalite kontrol suģları ile test edilmelidir. Periyodik olarak (özellikle balgam kültürlerinde doğrudan örneğin ekildiği plaklara inoküle edilecek ise), satellit testinde kullanılacak stafilokok suģunun kontamine olup olmadığı test edilmelidir. Alternatif olarak derin dondurucuda saklanan stafilokok stokundan ayda bir yeni pasaj yapılmalıdır. Kalite kontrol organizmaları: Haemophilus influenzae ATCC 43065, XV faktör varlığında ürer Haemophilus parainfluenzae ATCC 7901, V faktör varlığında ürer Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 5 / 9 Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-23 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
2 Testin uygulanması 2.1. X ve V faktör gereksinimi için disk testi Steril bir tüpe 2-3 ml uygun bir sıvı besiyeri (faktör içermeyen; BHI, TSB gibi) konur. Sıvı besiyeri yerine SF de kullanılabilir. Ġncelenecek izolatın kolonisi bir öze ile alınarak sıvı besiyerinde yeterince koyu (McFarland No 1) bir süspansiyon hazırlanır. Homojen bir süspansiyon elde etmek için vortekslenir. Eğer primer izolasyon plağında yeterli üreme yoksa ya da plak kontamine ise önce çikolata agara pasaj yapılmalıdır. ÖNEMLĠ: Sıvı besiyerine inokulum transfer ederken agar besiyerinden parça taģınmamasına özen gösterilmelidir. Çünkü primer izolasyon plağı X ve V faktörleri içerir ve bunların çok küçük miktarları bile testi etkileyerek hatalı tanımlamaya neden olabilir. Bir TSA (veya benzeri, kesinlikle X ve V faktör içermeyen bir besiyeri) plağı alınır. Steril bir eküvyon süspansiyona daldırılır. Tüpün kenarında süzdürüldükten sonra eküvyon plak yüzeyine en az iki yönde sürülerek ekim yapılır. Plak yüzeyi kuruduktan sonra X, V ve XV faktörlerini içeren kâğıt Ģerit/diskler ekim alanının üzerine yerleģtirilir (bkz. ġekil 1). Disklerin arasında en az 3.5 cm (veya üretici firmanın önerdiği kadar) mesafe olmalıdır. Eğer iki izolat test edilecekse diskler ġekil-1 de görüldüğü gibi yerleģtirilir! Plağın kapağı kapatılır, ters çevrilir ve mumlu jara (veya varsa doğrudan CO 2 inkübatöre) yerleģtirilir. Nemli ve %3-5 CO 2 li ortamda 18-24 saat 35 C de inkübe edilir. NOT: Yeterli nem oranı için (i) inkübatör tabanına düz cam bir tepside distile su, veya (ii) jar tabanına ıslatılmıģ filtre kağıdı, konmalıdır Ġnkübasyonu takiben plak iyi bir aydınlatma altında disklerin etrafında üreme varlığı açısından incelenir ve yorumlanır. 2.2. Satellit fenomeni testi ġüpheli izolat kanlı agara pasajlanır. Eğer klinik örnek söz konusu ise hem kanlı agara hem de çikolata agara ekim yapılır. Stafilokok kolonisinden bir steril öze ile alınır ve kanlı agarda ekim yapılmıģ bölgeyi çaprazlayan bir çizgi ekim (veya birden fazla kısa çizgi ekimler) yapılır. Her iki plak da %3-5 CO 2 li ortamda 18-24 saat 35 C de inkübe edilir. Kanlı agar plağı stafilokok ekim çizgisinin etrafında satellit kolonilerin varlığı yönünden incelenir (bkz. ġekil 2). Çikolata agar plağı Haemophilus Ģüpheli üreme yönünden değerlendirilir ve tanımlama testleri uygulanır. Sayfa 6 / 9 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-23 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
3 Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması 3.1. X ve V faktör gereksinimi için disk testi Sadece XV diski (X ve V faktörlerinin ikisini bir arada içeren disk) etrafında üreme olması (ġekil 1 deki plağın üst yarısında olduğu gibi) H. influenzae veya Haemophilus haemolyticus olabilir. H. haemolyticus tavģan veya at kanlı besiyerinde hemoliz yapma özelliği ile H.influenzae dan ayrılabilir (Tablo 1). X veya V faktörlerinden yalnız birinin etrafında üreme olması - organizma diğer Haemophilus türlerinden biri olabilir. 3.2. Satellit fenomeni testi Pozitif sonuç stafilokok ekim çizgisi etrafında üremiģ narin koloniler görülmesi (bkz. ġekil 2). Negatif sonuç kanlı agarda kolonilerin sadece stafilokok ekim çizgisine yakın değil her yerde üremiģ olması veya hiç üreme olmaması. H. haemolyticus ve H. parahaemolyticus V faktöre gereksinim duyan bakterilerdir; ancak stafilokok ekimi olmadan da kanlı agarda üreyebilir ve satellit fenomeni göstermezler. Çünkü bu bakteriler hemolitiktir ve besiyerine NAD salınmasını sağlayabilirler. 4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar Disk testinde, primer izolasyon plağından koloni alınırken besiyeri parçası alınması X faktör (hemin) taģınmasına ve dolayısı ile hatalı sonuca neden olabilir. Disk testinde kullanılan baz besiyerinde eser miktarda hemin bulunması bile hatalı test sonucuna neden olabilmektedir. Ancak hiç X faktörü içermeyen bir besiyeri mevcut değildir. Disk test daha çok H. parainfluenzae ve H. influenzae tiplendirmesinde olmak üzere, hatalı sonuçlar verebilmektedir ki bu oran %20 ye kadar çıkabilir. Özellikle bazı H. parainfluenzae suģlarının güç üreme özelliği bu suģlar için disk testlerinin okunmasını güçleģtirebilir. Daha doğru sonuç almak için porfirin sentezi testi önerilir. V faktör, X faktörden daha hızlı bir Ģekilde besiyerine yayılma özelliğindedir. Diskler birbirine çok yakın yerleģtirilirse V faktör X faktör diskinin yayılma alanına girebilir ve hatalı sonuçlar elde edilebilir. Üretici firmalar X, V disklerindeki faktör konsantrasyonunu vermezler. Bu nedenle satın alınacak disklerin kabulü, ambalaj içeriğinin kontrolünden ziyade, bir dizi Haemophilus suģu ile laboratuvarda test edilerek ürünün performansının değerlendirilmesine dayanmalıdır. Satellit testi ile elde edilen bulgular ön tanı niteliğindedir. Mutlaka diğer testlerle tanımlama iģlemi tamamlanmalıdır. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 7 / 9 Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-23 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Şekil 1. Üreme faktörleri gereksinimi: agar plakta bakteri ekim alanlarının üzerine yerleģtirilmiģ X, V ve XV faktör diskleri. Üstteki izolat sadece XV diskinin etrafında üremiģ olup H. influenzae ön tanısı konabilir (3 no.lu kaynaktan alınmıģtır) Şekil 2. Satellit fenomeni. Kanlı agar plağında stafilokok ekim çizgisi yakınında küçük Haemophilus sp kolonileri gözlenirken ekim çizgisinin uzağında üreme olmadığı dikkati çekmektedir. (Kaynak:http://infectionnet.org/notes/mi croorganisms/bacterial-pathogens-ofthe-respiratory-tract-andcns/attachment/satellite2/ ) Tablo 1. Üreme gereksinimlerine göre Haemophilus türlerinin tanımlanması (3). Tür X ve V Faktör gereksinimi X At veya tavşan kanlı agarda β-hemoliz H. influenzae + + - H. haemolyticus + + + H. parahaemolyticus - + + H. aphrophilus + - - H. parainfluenzae* - + - H. paraphrophilus* - + - *H. paraphrophilus ve H. parainfluenzae ornitin testi ile ayrılır; ilki negatif iken ikincisi pozitiftir. V Sayfa 8 / 9 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-23 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
İlgili diğer UMS belgeleri Bu UMS belgesi (X,V ve XV Faktör Gereksinimi) Haemophilus spp tanımlanma Ģeması ile ilgilidir ve kullanımı ile ilgili bu belgeye de baģvurulabilir: UMS, B-MT-05 Haemophilus influenzae invaziv enfeksiyonlarının mikrobiyolojik tanısı Kaynaklar 1 Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC, Jr. (eds). Haemophilus. Chapter 6. In: Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 4th ed., J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA. 1992, p. 279-301. 2 York MK, Traylor MM, Hardy J, Henry M. Biochemical tests for the identification of aerobic bacteria. Satellite Test. In: Garcia LS (editor in chief). Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2007, p. 3.17.44.1-3.17.44.3 3 Perilla MJ, Ajello G, Bopp C, Elliott J, Facklam R, Knapp JS, Popovic T, Wells J, Dowell SF. Streptococcus pneumoniae. In: Manual for the Laboratory Identification and Antimicrobial Susceptibility Testing of Bacterial Pathogens of Public Health Importance in the Developing World. Chapter V. CDC, and WHO. 2003, p. 45-62 4 Popovic T, Ajello GW, Facklam RR. Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis Caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA. 1998. 5 Doern GV, Chapin KC. Laboratory identification of Haemophilus influenzae. Effets of basal media on the results of the satellitism test and evaluation of the RapID NH system. J Clin Microbiol 1984;20:599-601. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 9 / 9 Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-23 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015