BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS İLE α-amilaz ÜRETİMİNİN RSM ANALİZİ

BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS İLE α-amilaz ÜRETİMİNİN RSM ANALİZİ M. Ş. TANYILDIZI *, M. ELİBOL, D. ÖZER ÖZET Bacillus amyloliquefaciens ile alfa amilaz üretim ortamının optimizasyonu response surface metodu (RSM) ile yapılmıştır. Bu yöntemle daha az sayıda deneyle sistem hakkında daha fazla bilgi sahibi olunmaktadır. Ayrıca fermantasyon prosesleri gibi birbirlerini etkileyen paramereleri içeren sistemlerde klasik yöntemin açıklayamadığı bileşenlerin birbirleri arasındaki etkileşim incelenmiştir. Deney planı ve sonuçların istatiksel değerlendirilmesinde Design exper 6.0 yazılımı kullanılmıştır. Yapılan deney sonucunda maksimum enzim üretimi 16 g/l nişasta, 1.625 g/l ve 7.15 g/l YE içeren fermantasyon ortamında elde edilmiştir. Anahtar Kelimeler ; RSM, alfa amilaz, B. amyloliquefaciens 1. GİRİŞ α-amilaz (1-4 α-d-glukanohidrolaz,e.c.3.2.1.1) α-1, α-4 e bağlı D-glukoz birimli polisakkaritlerde α-1,4 glikozidik bağlarını maltoz yada daha büyük oligosakkaritleri üretmek için hidrolizini katalizleyen bir enzimdir (1). Enzim kullanılan endüstrilerde üretim maliyetini düşürmek için enzim maliyetlerinin düşürülmesi gereklidir. Enzim üretimini artırmak hem genetik manipulasyonla hem de ortam mühendisliğiyle sağlanabilir. Genetik yaklaşımla üretim artışını sağlayan bir çok çalışma vardır. Metabolik ürünlerin salgılanması mikroorganizmaların belirli ortamlarda hayatta kalma stratejilerinin bir kısmıdır. Buna göre rekombinantlar kararlı olmayabilir. Ortam manipülasyonu ile enzim üretiminin artırılmasının daha iyi bir strateji olduğu düşünülebilir (2,3). Enzim üretimini artırmak amacıyla yapılan çalışmalarda ortam bileşenleri ve proses şartları diğer faktörler sabit tutularak tek faktör optimizasyonuyla yapılmaktadır. Tek faktör optimizasyonunda tüm değişkenlerin sonuç değişkeni üzerine kombine etkilerini açıklamak mümkün değildir. Parametrelerin birbiriyle etkileşimini de inceleyen RSM kullanarak optimum değerler elde edilebilir. Bu teknik sistemin optimum cevabını hesaplamak için iki veya daha fazla değişkenlerin lineer, etkileşimli ve quadratik etkilerini belirlemede kullanılabilir. Bu çalışmada RSM ile ortam bileşenlerinin α-amilaz üretimi üzerine olan etkisi belirlenmeye çalışılmıştır. Bu amaçla karbon kaynağı olarak nişasta, azot kaynağı olarak pepton ve yeast ekstrakt kullanılmıştır. Ortamda kullanılan diğer bileşenler daha önceden yapılan klasik yöntemle belirlenen oranlarda fermantasyon ortamına konulmuştur. Elde edilen matematiksel eşitlikten optimum ortam bileşimi elde edilmiştir. Model ile açıklanan varyans oranı R 2, F-test varyans analizi (ANNOVA) ile verilmiştir. 2. KURAMSAL RSM bir veya daha fazla kritere göre ölçülen cevap ve kontrol edilen deneysel faktörler arasında var olan ilişkileri ortaya çıkarır. RSM, matematiksel ve istatiksel yöntemlerden oluşan bir metot olup, bir çok biyoteknolojik prosesi optimize etmek amacıyla kullanılmaktadır (4). Daha gerçekçi bir model oluşturmak için proses ve proses değişkenleri hakkında ön bilgi gereklidir (5,6). Cevap üzerine etkisi olan bağımsız değişenler ve bunların sistemi etkilediği aralığın bilinmesi model için önemlidir. Regresyon eşitliklerinin geliştirilmesinde test değişkenleri aşağıdaki eşitliğe göre kodlandı. * Fırat Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 23119, ELAZIĞ

x i = (X i -X t * ) / X i 1 Yapılan çalışmada sonuçlar ikinci mertebe modelle ifade edildi. İkinci mertebe model aşağıdaki şekildedir: 2 Y β ο + β x + β x + β x x 2 3. DENEYSEL İ i ii i İ = ij i j Bacillus amyl. (NRRL B-645) ARS kültür koleksiyonundan temin edildi. Standart aşı ortamının başlangıç ph 7.0 ye ayarlandı. 250 ml lik erlenlerde 50 ml ortama mikroorganizma ekiminden sonra 37 C de 150 rpm çalkalamalı inkübatörde fermente edildi. Enzim üretim ortamında bağımsız değişken olarak nişasta, pepton, yeast extrakt kullanıldı. Diğer ortam bileşenleri daha önceden belirlenen oranlarda katıldı. Hücreler santrifüjle uzaklaştırıldıktan sonra kültür sıvısında aktivite tayini yapıldı. Alfa amilaz aktivitesi iyodun nişasta ile verdiği renk esasına dayanılarak 620 nm de spektrofotometre yardımıyla aktivite belirlendi. 0.0284 OD azalması 1 birim internasyonel ünite (IU/ml) olarak tanımlandı ( 7). Deneysel dizayn ve optimizasyon Design Expert (version 6.0, Stat-Ease Inc. Mineapoli, USA) programı kullanılarak gerçekleştirildi. 4. SONUÇLAR Bu teknik uygulanarak değişkenlerin birbiriyle olan etkileşimleri ve ortam optimizasyonu sınırlı sayıda deneyle yapılabilmektedir. Gerçekçi bir model elde edebilmek için çalışılan sistem hakkında ön bilgilere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu amaçla yapılan çalışmada α-amilaz üretimini etkileyen ortam bileşenleri bunların etkin olduğu aralık klasik yöntemle yapılan çalışmalarla belirlenmiştir. Tablo1 de üç bağımsız değişkenin kodlanmış ve gerçek değerleri ve aktivite değerleri görülmektedir. Fermantasyon ortamında bulunan diğer tüm bileşenler klasik yöntemle belirlenen oranlarında ortama konulmuştur. Tablo 1. İncelenen bağımsız değişkenlerin kodlanmış ve gerçek değerleri Değişkenler Sembol İncelen aralık değerleri Kod -1.68-1 0 +1 +1.68 Nişasta (g/l) X 1 0 5 10 15 20 Pepton (g/l) X 2 0 2.5 5 7.5 10 YE (g/l) X 3 0 2.5 5 7.5 10 Merkez kompozit dizaynı her biri beş konsantrasyonda 3 bağımsız değişken ve altı kez tekrarlanan merkez noktası olmak üzere toplam 20 deneyle yapıldı (Tablo 2). Elde edilen verilerin regresyon ve grafiksel analizi için Design Expert yazılımı kullanıldı. Bağımsız üç parametreye bağlı ikinci derece denklem program yardımıyla elde edilmiş ve eşitlik 3 de kodlanmış değişkenler cinsinden verilmiştir. Y = 1627.09 + 225.36* X 1-83.65* X 2 + 90.22*X 3-198.65*X 1 2-93.71* X 2 2-165.66* X 3 2-5.03* X 1 * X 2-26.52* X 1 *X 3-98.19* X 2 * X 3 3 İkinci dereceden model eşitliğinin istatistiksel olarak varians analizi (ANOVA) ile kontrol edilmiştir. Çok düşük olasılık değeri (Pmodel>F= 5) modelin önemli olduğunu göstermektedir. Modelin uygunluğu R 2 katsayılarıyla kontrol edilebilir. Bu durumda R 2 =0.9226 olarak belirlenmesi model tarafından değişimlerin % 92 sinin açıklanabildiğini göstermektedir. Ayrıca varyasyon katsayısı değeri (CV= % 9.65 ) düşük olması yapılan deneylerin güvenilir olduğunu göstermektedir (Tablo 3). Tablo 2. Üç bağımsız değişken için deneysel plan ve gözlenen α-amilaz aktivitesi.

Deney sırası Nişasta X 1 Pepton X 2 YE X 3 Aktivite Y gözlenen (UI) 1 800 2 1245.95 3 980.59 4 1350 5 1312.24 6 1595.69 7 1043.66 Fraksiyonel 2 3 ffaktoriyel dizayn 8 1363.38 9-1.68 512 10 1.68 1498.59 11-1.68 1577.46 12 1.68 1026.76 13-1.68 1011.27 14 1.68 1185.92 15 1639.44 16 1601.41 17 1664.79 18 1633.8 19 1609.86 20 Suç noktalar Merkez noktalar 1633.8 Tablo. 3 Quadratik model için varyans analizi (ANNOVA) SS DF MS F-değeri Prob(p)>F Model 1.916E6 9 2.129E5 13.24 02 Residual (error) 1.608E5 10 16079.27 Lack of Fit 1.582E5 5 31648.62 62.06 02 Pure Error 2549.67 5 509.93 Total 2.077E6 19 R 2 = 0.9226; CV= 9.65%; Adj R 2 = 0.8529 P-değeri katsayıların her bir bileşenin sonuç üzerine olan etkisini kontrol etmek için kullanılabilir. Bu katsayılar tarafından bağımsız değişkenler arasındaki etkileşim de belirlenebilir. Düşük olasılık değerlerine sahip değişkenler modele katkıda bulunurken diğerleri modelden çıkarılabilir. Lineer, quadratik ve etkileşimleri terimlerin P-değerleri Tablo 4 te görülmektedir. Tablodan da görüldüğü gibi nişastanın lineer teriminin ve quadratik teriminin etkisi model için en önemli parametredir. Enziminde substratı olan nişastanın enzim üretiminde etkin olması literatürle uyum içerisindedir. Nişasta ve nispeten YE tın sınırlayıcı bileşen olarak enzim üretimini etkilediği görülmektedir. Bu komponentlerin konsantrasyonlarındaki küçük bir değişim enzim üretimini önemli oranda etkilediği görülmektedir. Fermantasyon prosesleri değişkenlerin birbirinden etkilendiği ortamlarda ortam optimizasonu incelenirken bileşenlerin birbirleriyle olan etkileşimlerini belirlemek önemlidir. RSM değişkenler arasında bu etkileşim tabakalı grafikler ve 3 boyutlu grafikler kullanılarak kolaylıkla belirlenebilmektedir. Tabakalı grafikler optimum sınırları gösteren yapıdadır. Çalışmada düşünülen sınırların ötesine uzanan gerçek optimum noktalar ulaşabilir. Grafiklerdeki her bir hat diğer değişkenin optimum tutulduğunda incelenen iki değişkenin sonsuz sayıda kombinasyonunu temsil eder. Bulunan maksimum değer grafik alanında en küçük elipsle gösterilmektedir.

Tablo4. Quadratik model için Varyans Analiz Tablosu Model terimleri Katsayılar Standart hata F-oranı P-değeri kayma 1627.09 51.72 - X 1 225.36 34.31 43.14 < 01 X 2-83.65 34.31 5.94 0.0350 X 3 90.22 34.31 6.91 0.0252 X 2 1-198.65 33.40 35.37 01 X 2 2-93.71 33.40 7.87 0.0186 X 2 3-165.66 33.40 24.60 06 X 1 X 2-5.03 44.83 0.013 0.9128 X 1 X 3-26.52 44.83 0.35 0.5672 X 2 X 3-98.19 44.83 4.80 0.0533 Şekil 1 de Nişasta ile pepton arasında çizilen grafik görülmektedir. Şekilden de görüldüğü maksimum enzim üretiminde nişasta konsantrasyonu 15-16 gr/l,pepton ise 1-2 g/l konsantrasyonlarına karşılık gelen noktalarda ulaşmaktadır. Bu iki bağımsız değişken arasındaki etkileşimin enzim üretimini önemli oranda değiştirmediği görülmektedir. 1750 1600 1450 1300 Activity (IU) 1150 1000 Peptone (g /l) - - Starch (g/l) Şekil.1. Alfa amilaz üretimi üzerine nişasta ve pepton konsantrasyonlarının eşzamanlı etkileşimi.

1750 1600 1450 1300 Activity (IU) 1150 1000 - Starch (g /l) - YE (g /l) Şekil.2. Alfa amilaz üretimi üzerine nişasta ve YE konsantrasyonlarının eşzamanlı etkileşimi. 1750 1600 1450 1300 Activity (IU) 1150 1000 - Peptone (g /l) - YE (g /l) Şekil.3. Alfa amilaz üretimi üzerine pepton ve YE konsantrasyonlarının eşzamanlı etkileşimi. Şekil 2 de nişasta ile YE ın biriyle etkileşimini göstermektedir. Grafiklerden de görüldüğü gibi maksimum enzim üretimi 15 g/l nişasta konsantrasyonları civarında ulaşmaktadır. Enzim üretimi maksimuma YE konsantrasyonu üst çalışma sınırına yakınken pepton konsantrasyonu ise alt çalışma sınırına yakın değerlerinde ulaşmaktadır (şekil2,3). Ayrıca pepton ile YE arasındaki etkileşiminin enzim üretimi üzerinde etkiliği olduğu görülmektedir.

Maksimum enzim üretimini veren ortam, Myers ve Montgomery tarafından önerilen nümerik metotla eşitlik den hesaplanmıştır. Bulunan optimum değerler kodlanmış değerleri aşağıda verilmiştir. Nişasta =0.55, pepton= -0.69, YE=0.43 Gerçek değerler cinsinden 16 g/l nişasta, 1.625 g/l ve 7.15 g/l YE optimum değerlerle yapılan deneyde elde edilen aktivite değeri 1722 IU olarak bulunmuştur. Modelin önerdiği aktivite değeriyle (1739 IU) uyum içerisinde olduğu görülmüştür. 5. SEMBOLLER xi,i =Bağımsız değişkenin kodlanmış değeri, Xi,i =Bağımsız değişkenin kodlanmamış gerçek değeri, Xi*,i =Bağımsız değişkeninin merkez noktadaki kodlanmamış değeri Xi = Değişkenin basamak değişkeni. Yi = Tahmin edilen cevap, Enzim aktivitesi xi, xj = Cevap değişkenin etkileyen giriş değişkenleri βo= Kayma terimi βi = i. terimin lineer katsayısı βii= i. terimin quadratik katsayısı βij = i ve j. terimin karşılıklı etkileşim katsayısı R 2 = Regreasyon katsayısı CV= Varyasyon katsayısı SS = Kareler toplamı DF = Serbestlik derecesi; MS = Kareler ortalaması Adj R 2 = Adjoint regreasyon katsayısı 6. KAYNAKLAR 1- Yoo Y.J., Cadman T.,W., Hong J., Hatch R.,T., 1987, Kinetics of α-amylase Synthesis from Bacillus amuloliquefaciens, Biotechnology end Bioengineering, 31,357-365. 2- Haki, G.D.,Rakshit S.K, 2003, Developments in industrially important thermostable enzymes:a review Bioresource Technology,89,17-34 3- Dey G., Mitra A., Banerjee R., Maiti B.,R.,2001, Enhanced production of alpha amylase by optimization of nutrional constituent using response surface methodology, Biochemical eng. J., 7,221-231. 4- Dasu V.V, Panda T.,2000, Optimization of microbiological parameters for enhanced griseofulvin production using response surface methodology,bioprocess Engineering 22, 45-49. 5- Elibol M., 2003, Optimization of medium composition for actinorhodin production by Streptomyces coelicolor A3(2) with response surface methodology Process Biochemistry 39 (2004) 1057 1062 6- Sen R., Swaminathan T., 1997, Application of response-surface methodology to evaluate the optimum environmental conditions for the enhanced production of surfactin, Appl Microbiol Biotechnol, 47, 358-363. 7- Pfueller S.L., Eliot W.H., The extraceluler α-amylase of Bacillus stearotermophillus, J. Biological Chemistry,.1969, 244, 48-54.