RespiFinder RG Panel El Kitabı

Kasım 2013 RespiFinder RG Panel El Kitabı 25 Versiyon 1 Kalitatif in vitro diagnostik Rotor-Gene Q aletleriyle kullanılmak üzere 4692163 PathoFinder B.V., Randwycksingel 45, 6229 EG Maastricht, THE HOLLANDA Distribütör: QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, 40724 Hilden, ALMANYA R1 1075775TR Sample & Assay Technologies

QIAGEN Sample and Assay Technologies QIAGEN her biyolojik örneğin içeriğinin saptanması ve izolasyonunu mümkün kılacak şekilde yenilikçi örnek ve test teknolojilerinin önde gelen sağlayıcısıdır. Gelişmiş ve yüksek kalitede ürünlerimiz ve hizmetlerimiz örnekten sonuca kadar başarıyı garanti eder. QIAGEN şunlarda standartları belirler: DNA, RNA ve protein saflaştırma Nükleik asit ve protein testleri microrna araştırmaları ve RNAi Test ve örnek teknolojilerinin otomasyonu Misyonumuz olağanüstü başarılar elde etmenizi ve yeni buluşlar yapmanızı sağlamaktır. Daha fazla bilgi için, www.qiagen.com adresini ziyiaret ediniz.

İçindekiler Kullanım Amacı 4 Özet ve Açıklama 4 İşlemin Prensibi 4 Hedef genler 6 Sağlanan Materyal 9 Kit içeriği 9 Gereken ama Sağlanmayan Malzemeler 9 Uyarılar ve Önlemler 10 Genel önlemler 11 Reaktif Saklama ve Muamele 12 Örnek Kullanımı ve Saklama 12 İşlem 13 Nükleik asit ekstraksiyonu ve hazırlama 13 Bir negatif kontrol kullanma 13 Bir dahili kontrol ve taşıyıcı RNA kullanma 14 Protokol: PCR amplifikasyonu ve erime analizi 16 Sonuçların Yorumlanması 33 Normalizasyon 33 Analiz 33 Eşik 33 Sorun Giderme kılavuzu 34 Kalite Kontrol 37 Sınırlamalar 38 Performans Özellikleri 38 Referanslar 38 Semboller 38 İrtibat Bilgisi 39 Sipariş Bilgisi 40 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013 3

Kullanım Amacı RespiFinder RG Panel insanlarda solunum yolu enfeksiyonlarına yol açabilen 16 RNA virüsü,* 2 DNA virüsü ve 3 bakteriyi saptamak ve ayırmak için bir kalitatif multipleks PCR testidir: adenovirüs, bocavirüs, corona NL63, corona OC43, corona 229E, corona HKU1, hmpv, influenza A, influenza B, influenza A H1N1v, parainfluenza 1, parainfluenza 2, parainfluenza 3, parainfluenza 4, rinovirüs/enterovirüs, RSV-A, RSV-B, Bordetella pertussis, Legionella pneumophila ve Mycoplasma pneumoniae. RespiFinder RG Panel diğer klinik ve laboratuvar bulgularıyla birlikte kullanıldığında solunum yolu enfeksiyonunun tanısına yardımcı olur. Negatif sonuçlar viral veya bakteriyel solunum yolu enfeksiyonu olmadığı anlamına gelmez; negatif sonuçlar tanı, tedavi ve diğer ilgili kararlar için tek temel olarak kullanılmamalıdır. Pozitif sonuçlar diğer patojenlerle ortak enfeksiyon olasılığını ortadan kaldırmaz. Saptanan patojen(ler) hastalığın kesin nedeni olmayabilir. Son tanı için diğer laboratuvar testleri ve klinik durumun değerlendirilmesi de kullanılmalıdır. Ürün sadece laboratuvar uzmanları tarafından kullanım içindir. Özet ve Açıklama Akut solunum yolu enfeksiyonu, yetişkinler ve çocuklarda en sık görülen akut enfeksiyon tipidir ve immünyetmezlikli hastalarda önemli bir hastalık nedenidir. Solunum yolu enfeksiyonları sıklıkla üst solunum yolu enfeksiyonları (ÜSYE) ve alt solunum yolu enfeksiyonları (ASYE) olarak ayrılır. ÜSYE, rinore, konjonktivit, farenjit, otitis media ve sinüziti içerir. ASYE pnömoni, bronşiyolit ve bronşiti içerir. Hem virüsler hem bakteriler akut SYE durumuna neden olabilir ve neden olan ajanların hem sayısı çoktur hem de çok değişik ajanlar vardır ve böylece tanı koymak açısından önemli zorluklara yol açarlar. Nükleik asit amplifikasyon testlerinin tek başına veya çoklu formatta hızlı, hassas ve spesifik alternatifler oldukları ispatlanmıştır. Çoklu (multipleks) testler birden fazla hedefin birlikte amplifikasyonunu mümkün kılarak miks enfeksiyonların önemi açısından ve solunum hastalığının prognozu ve nüks durumu açısından bilgi verir. İşlemin Prensibi RespiFinder RG Panel tek bir gerçek zamanlı PCR reaksiyonunda 13 adede kadar hedefin yüksek ölçüde ayrıntılı analizini mümkün kılan bir teknoloji olan SmartFinder teknolojisini temel alır. RespiFinder RG Panel 21 farklı patojenin ve ayrıca bir dahili kontrolün saptanmasını mümkün kılan floresan etiketli 12 SMART (gerçek zamanlı tek tüp multipleks amplifikasyon) probuyla birlikte çeşitli MultiFinder prob setleri bulunur. Reaksiyon hedef (c)dna'yı amplifiye etmek için * RespiFinder RG Panel 16 virüsü saptar ama rinovirüsü enterovirüsten ayırmaz. 4 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013

bir PCR adımıyla revers transkripsiyon adımını birleştiren bir ön amplifikasyonla başlar. Bunun sonucunda ön amplifikasyon reaksiyonunun bir kısmı 2 PCR tüpüne aktarılır. Bir prob hibridizasyonu adımı ve bir prob ligasyonu ve amplifikasyonu adımından oluşan iki ayrı SmartFinder reaksiyonu yapılır. Saptama, erime eğrisi analizi kullanılarak gerçekleştirilir. Tüm iş akışının şematik bir temsili Şekil 1'de verilmiştir. Şekil 1. RespiFinder RG Panel iş akışına genel bakış. RespiFinder RG Panel patojen nükleik asitlerini saptamak için Rotor-Gene Q MDx veya Rotor-Gene Q aletini kullanır. RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013 5

Teste gerçek negatif örneklerle nükleik asit degredasyonu, PCR inhibisyonu veya test başarısızlığı nedeniyle yalancı negatif örnekleri ayırmak üzere bir dahili kontrol (IC) dahil edilmiştir. Kullanılan örnek nazofaringeal sürüntülerden ekstraksiyonu ve saflaştırması yapılmış total nükleik asitlerdir. Örneklerin hazırlanması panel kapsamında ayrı bir süreçtir. Örnekleri kullanmak ve nükleik asitlerin ekstraksiyonunu ve saflaştırmasını yapmak için uygun yöntemler veya ürünler kullanın (bakınız Örnek Kullanımı ve Saklama, sayfa 12, ve Nükleik asit ekstraksiyonu ve hazırlama, sayfa 13). Hedef genler Prob ve primer tasarımı için kullanılan hedef genler Tablo 1'de gösterilmektedir. Tablo 1. RespiFinder RG Panel hedef genleri Hedef Kontrol Gen Dahili kontrol (IC) MS2 faj lizis proteini geni IC Virüsler Patojen kodu Adenovirüs Hekson geni (H) Adeno Bocavirüs Nonkapsid geni (NP1) Boca Corona 229E Nükleokapsid protein geni (NP) 229E Corona HKU1 Nükleokapsid fosfoprotein geni (N) HKU1 Corona NL63 Nükleokapsid protein geni (NP) NL63 Corona OC43 Nükleokapsid protein geni (NP) OC43 hmpv Nükleokapsid protein geni (NP) hmpv İnfluenza A Matriks protein geni (M1) InfA İnfluenza B Matriks protein geni (M1) InfB İnfluenza A H1N1v Nöraminidaz geni H1N1 Parainflüenza 1 Hemaglutinin-nöraminidaz geni (HN) PIV1 Parainflüenza 2 Hemaglutinin-nöraminidaz geni (HN) PIV2 Parainflüenza 3 Hemaglutinin-nöraminidaz geni (HN) PIV3 Tablo bir sonraki sayfada devam ediyor 6 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013

Tablo 1. Devam Hedef Virüsler (devam) Gen Patojen kodu Parainflüenza 4 Majör nükleokapsid protein geni (N) PIV4 Rinovirüs/ Enterovirüs 5' çevrilmemiş bölge poliprotein geni (PP) Rino/ Entero RSV-A Majör nükleokapsid protein geni (N) RSVA RSV-B Majör nükleokapsid protein geni (N) RSVB Bakteri Bordetella pertussis İnsersiyon dizisi 481 (IS481) B. pert Chlamydophila pneumoniae* Legionella pneumophila Mycoplasma pneumoniae Majör dış membran geni (OmpA) Makrofaj inhibitör potansiyatör geni (Mip) Sitadhesin protein geni (P1) C. pneu L. pneu M. pneu * Not: RespiFinder RG Panel Chlamydophila pneumoniae saptanması Sadece Araştırma Kullanımı içindir. Diagnostik işlemlerde kullanım için değildir. Bir hastalığın tanısı, önlenmesi veya tedavisi hakkında bilgi sağlamak açısından kullanılması için herhangi bir iddiada veya temsilde bulunulmaz. Her örnek için bir ön amplifikasyon ve 2 SmartFinder reaksiyonu yapılır. Patojenler, etiketler ve 2 SmartFinder reaksiyonunda karşılık gelen SMART hibridizasyon probları için belirtilen T m Tablo 2'de gösterilmiştir. RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013 7

Tablo 2. SMART problarının hedefleri ve karşılık gelen T m değerleri Etiket SMART probu T m ( C) kabul edilebilir aralık Patojen kodu (karışım 1) Patojen kodu (karışım 2) Cy5 probu 1 50,5-53,5 L. pneu OC43 Cy5 probu 2 54,5-57,5 B. pert NL63 Cy 5 Cy5 probu 3 60,0-63,0 Rino/Entero 229E Cy5 probu 4 66,0-69,0 C. pneu* HKU1 Cy5 probu 5 70,5-73,5 M. pneu Cy5 probu 6 76,5-79,5 H1N1 ROX probu 1 52,5-55,5 RSVA PIV1 ROX probu 2 57,5-60,5 Adeno PIV2 ROX ROX probu 3 62,5-65,5 hmpv PIV3 ROX probu 4 66,5-69,5 RSVB PIV4 ROX probu 5 72,5-75,5 InfA Boca ROX probu 6 76,5-79,5 InfB BHQ 1 BHQ1 probu 1 70,5-73,5 IC IC * Not: RespiFinder RG Panel Chlamydophila pneumoniae saptanması Sadece Araştırma Kullanımı içindir. Diagnostik işlemlerde kullanım için değildir. Bir hastalığın tanısı, önlenmesi veya tedavisi hakkında bilgi sağlamak açısından kullanılması için herhangi bir iddiada veya temsilde bulunulmaz. 8 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013

Sağlanan Materyal Kit içeriği RespiFinder RG Panel (25) Katalog no. 4692163 Reaksiyon sayısı 25 İçindekiler Pre-amplification Master Mix (Ön amplifikasyon Ana Karışım) Kapak rengi Hacim Mor 180 µl Internal Control (IC) (Dahili Kontrol) Siyah 300 µl Pre-amplification Primermix (Ön amplifikasyon Primermix) Hybridization Buffer (Hibridizasyon Tamponu) Beyaz 65 µl Sarı 80 µl Probemix 1 Kırmızı 40 µl Probemix 2 Mavi 40 µl TwoStep Buffer (İki Adımlı Tampon) Yeşil (amber tüpte) 1600 µl Ligase Enzyme (Ligaz Enzimi) Kahverengi 50 µl Taq Polymerase (Taq Polimeraz) Turuncu 20 µl Dilution Buffer (Dilüsyon Tamponu) Saydam 1700 µl RespiFinder RG Panel Handbook (English) (RespiFinder RG Panel El Kitabı) 1 Gereken ama Sağlanmayan Malzemeler Kimyasallarla çalışırken daima uygun bir laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık eldivenler ve koruyucu gözlükler kullanın. Daha fazla bilgi için, ürün tedarikçisinden elde edilebilecek uygun güvenlik veri sayfalarına (SDS'ler) başvurun. RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013 9

Reaktifler RNA/DNA ekstraksiyon kiti (bakınız Nükleik asit ekstraksiyonu ve hazırlama, sayfa 13) RNaz/DNaz içermeyen su Sarf Malzemesi Hidrofobik filtreler içeren tek kullanımlık uçlar Hidrofobik filtreler içeren tek kullanımlık düşük retansiyon uçlar RNaz/DNaz içermeyen 1,5 ml tüpler RNaz/DNaz içermeyen 0,2 ml PCR tüpleri (kapaklı tek tüpler veya ayrı kapaklı strip tüpler) Strip Tüpler ve Kapaklar, 0,1 ml (kat. no. 981103 veya 981106) Rotor- Gene Q aletleriyle kullanılmak üzere Ekipman Ayarlanabilir pipetler:* 0,1 2 µl, 2 20 µl, 20 200 µl Çok kanallı ayarlanabilir pipet:* 1 10 µl (isteğe bağlı) Vorteks karıştırıcı* Tezgah santrifüjü* 2 ml tüpler için rotorlu Santrifüj*, 0,2 ml reaksiyon tüpleri için Soğutma bloğu veya buz Termal döngüleyici* 0,2 ml PCR tüpleri için ısıtmalı kapaklı ve 1 5 C/saniye rampa hızlı (ön-amplifikasyon ve hibridizasyon için; örn., GeneAmp PCR System 9700 blok tabanlı termal döngüleyici) Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM* veya Rotor-Gene Q 5plex HRM* aleti ve aksesuarları Uyarılar ve Önlemler İn vitro diagnostik kullanım için Kimyasallarla çalışırken daima uygun bir laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık eldivenler ve koruyucu gözlükler kullanın. Daha fazla bilgi için, lütfen uygun güvenlik veri sayfalarına (SDS'ler) başvurun. Bunlar çevrim içi olarak PDF halinde www.qiagen.com/safety adresinde yer almaktadır ve kullanıcılar burada her QIAGEN kiti ve kit bileşeni için SDS'yi bulabilir, okuyabilir ve yazdırabilir. * Aletleri üreticinin önerilerine göre kontrol edildi ği ve kalibre edildiğinden emin olun 10 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013

Kullanılan saflaştırma kiti için güvenlik bilgisi açısından ilgili kit el kitabına bakınız. Aletlerle ilgili güvenlik bilgisi açısından ilgili alet kullanıcı el kitabına bakınız. Örnek ve test atığını yerel güvenlik düzenlemelerinize uygun olarak atın. 24 saat acil bilgisi Kimyasal acil veya kaza yardımı aşağıdan günün 24 saati alınabilir: CHEMTREC ABD ve Kanada dışında Tel: +1-703-527-3887 (ödemeli aramalar kabul edilir) Genel önlemler Daima şunlara dikkat edin: Bu moleküler test sadece vasıflı laboratuvar personelince yapılmalıdır. Pozitif materyalleri (örnekler ve pozitif kontroller) tüm diğer reaktiflerden ayrı saklayın ve ekstrakte edin ve bunları reaksiyon karışımına konumsal açıdan ayrılmış bir yerde ekleyin. Testi yaparken tek kullanımlık eldivenler giyin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için hidrofobik filtreler içeren tek kullanımlık uçlar kullanın. RT-PCR enzim karışımı, ligaz enzimi ve Taq polimerazı kullanırken hidrofobik filtreler içeren tek kullanımlık düşük retansiyon uçlar kullanın. Rnaz/DNaz içermeyen PCR flakonları kullanın. RNA/DNA örneklerini daima buz üstünde çözün ve bunları buz üstünde veya bir soğutma bloğunda tutun. Enzimleri buzluktan çıkardıktan sonra daima buzda veya bir soğutma bloğu içinde tutun. Enzimlere dikkatli davranın ve çok yavaş karıştırın. Çözüldüğünde reaktifleri bir santrifüjde 5 saniye santrifüje edin ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Tüm döngüleme programları Rotor-Gene Q yazılımına test yapılmadan önce girilmelidir. PCR flakonları ve plakları daima kısa süre santrifüje edin ve aerosollerden kaçınmak için dikkatli açın. Not: Kontaminasyonu önlemek için deneysel aktiviteleri PCR kabinlerinde şu 3 ayrı alan şeklinde yapmanızı kuvvetle öneririz: Alan 1: Ön amplifikasyon, hibridizasyon ve ligasyon/çözünme analizi için ana karışımlar hazırlayın. RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013 11

Alan 2: Karışıma RNA/DNA örneği ekleyin. Alan 3: Ön amplifikasyon, hibridizasyon ve erime eğrisi analizini 3 adımda yapın: Ön amplifikasyonu yapın. Ön amplifikasyon ürünlerini hibridizasyon karışımına ekleyin (tercihen bir PCR kabini içinde) ve hibridizasyon yapın. TwoStep karışımına hibridizasyon ürünlerini ekleyin (tercihen PCR kabininde) ve ligasyon, amplifikasyon ve erime eğrisi analizini yapın. Reaktif Saklama ve Muamele RespiFinder RG Panel bileşenleri 15 ila 30 C'de saklanmalıdır ve etikette belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Tekrarlanan dondurma çözmeden (>5 x) kaçınılmalıdır çünkü test performansını azaltabilir. Örnek Kullanımı ve Saklama Solunum patojeni saptanması yüksek kalitede örneklerin toplanması, laboratuvara hızla taşınmaları ve laboratuvar testinden önce uygun saklamaya dayanır. Nazofaringeal sürüntüler solunum yolunun viral ve/veya bakteriyel enfeksiyonlarının saptanması için uygundur. Klinik örnekler laboratuvara mümkün olduğunca hızlı şekilde taşınmalı, bölüntülere ayrılmalı ve işlenmelidir Örnekler 4 C'de tutulmalıdır. Eğer örnekler 48 saat içinde işlenemeyecekse dondurulmaları ve/veya 20 C altında, tercihen 70 C'de tutulmaları gerekir. 12 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013

İşlem Nükleik asit ekstraksiyonu ve hazırlama Tablo 3'te gösterilen QIAGEN'den QIAamp MinElute Virus Spin Kiti RespiFind RG Panel kullanım için belirtilen insan örneği tipinden DNA ve RNA saflaştırma için doğrulanmıştır. Nükleik asit saflaştırmayı kit el kitabındaki talimata göre yapın. Tablo 3. RespiFinder RG Panel kullanılmak üzere doğrulanmış saflaştırma kiti Örnek tipi Nükleik asit izolasyon kiti Katalog numarası (QIAGEN) Nazofaringeal sürüntüler QIAamp MinElute Virus Spin Kit (50) 57704 200 µl örnek materyali kullanın ve 60 µl elüsyon tamponunda elüsyon yapın. Nükleik asitleri konsantre etmeye kalkışmamanızı kuvvetle öneririz çünkü bu durum RT-PCR enzimlerinin inhibisyon riskini arttırabilir. Lizis yapılmış örneğe bir dahili kontrol eklenir (bakınız Bir dahili kontrol ve taşıyıcı RNA kullanma, sayfa 14). QIAamp MinElute Virus Spin Kitini kullanırken lizis tamponunu örneğe bir laminar hava akışı kabininde eklemenizi öneririz. Örnek lizis yapıldıktan sonra ekstraksiyon işlemine tezgahta devam edilebilir. Kullandıktan sonra laminar hava akışı kabinini bir dekontaminasyon solüsyonu (örn., 1000 ppm çamaşır suyu)* ve UV ışığını 30 dakika çalıştırarak dekontamine etmek önerilir. Ekstraksiyonu yapılmış DNA/RNA'da dondurma-çözme döngülerinden mümkün olduğunca kaçının ve bir gün içinde işlenecekse nükleik asit ekstrelerini 4 C'de saklayın. Daha uzun dönemler için ekstraksiyonu yapılmış RNA/DNA'yı 20 C veya 70 C'de saklayın. Bir negatif kontrol kullanma Her çalışmada bir negatif kontrol olmalıdır. Bir negatif kontrol 200 µl PCR sınıfı su artı dahili kontrolden (IC) oluşur. Bu negatif kontrol nükleik asit * Kimyasallarla çal ışırken, tek kullanımlık daima uygun eldivenler bir laboratuvar ve koruyucu önlüğü gözlükler kullanın. Daha fazla bilgi için, ürün tedarikçisinden elde edilebilecek uygun güvenlik veri sayfalar ına (SDS'ler) başvurun. RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013 13

ekstraksiyonu işlemi dahil olmak üzere normal bir örnek muamelesi görür. Son analizde negatif kontrol FAM/ROX ve FAM/Cy5 kanallarında arka alan sinyali ve Green kanalında pozitif IC sinyali için bir referans görevi görür. Bir dahili kontrol ve taşıyıcı RNA kullanma QIAamp MinElute Virus Spin Kitinin RespiFinder RG Panel kombinasyon halinde kullanılması örnek hazırlama ve aşağı doğru test etkinliğini izlemek için saflaştırma işlemine bir dahili kontrol (IC) konmasını gerektirir. Ayrıca QIAamp MinElute Virus Spin Kiti taşıyıcı RNA hazırlanmasını gerektirir. IC bir MS2 fajıdır ve lizis RNA/DNA ekstraksiyonu ve RespiFinder RG Panel test performansı için ve olası PCR inhibisyonunun kontrolü için bir kontrol olarak sağlanır. IC, taşıyıcı RNA ile birlikte örneğin eklenmesinden önce lizis tamponuna eklenir. Eklenen IC miktarı örneğin başlangıç hacminden bağımsızdır. Eklenen IC miktarı elüsyon hacmine bağlıdır. QIAamp MinElute Virus Spin Kitini kullanıldığında ekstraksiyonu yapılmış RNA/DNA elüsyonu 60 µl içinde yapılacaktır. AL tamponuna eklenecek IC hacmi örnek başına 5,5 µl'dir (bakınız Tablo 4). Kuvvetli bir enfeksiyon ve/veya çoklu enfeksiyon durumunda IC erime tepesi son analizde görülmeyebilir. Bunun nedeni yüksek miktarda patojenik nükleik asidin testteki reaktiflerin çoğunu tüketmesidir. Bunun sonucunda IC sinyali bir enfeksiyon belirten bir veya daha fazla spesifik çözünme tepesi varlığında yoksa test halen geçerlidir. 14 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013

Tablo 4. Gereken AL Tamponu, taşıyıcı RNA AVE Tamponu karışımı ve IC hacmi Örnek sayısı AL Tamponu Hacmi (ml) Taşıyıcı RNA AVE hacmi (µl) Dahili kontrol hacmi (µl) 1 0,22 6,2 5,5 2 0,44 12,3 11 3 0,66 18,5 16,5 4 0,88 24,6 22 5 1,1 30,8 27,5 6 1,32 36,9 33 7 1,54 43,1 38,5 8 1,76 49,2 44 9 1,98 55,4 49,5 10 2,2 61,5 55 11 2,42 67,7 60,5 12 2,64 73,8 66 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013 15

Protokol: PCR amplifikasyonu ve erime analizi Başlamadan önce yapılacaklar Şablon RNA/DNA'yı (donmuşsa) ve tüm reaktifleri çözün ve tüpleri buz üstünde tutun. Pipetleme kayıplarını dengelemek üzere çeşitli karışımların gereken miktarlarından biraz daha fazlasını hazırlayın. İşlem Ön amplifikasyon 1. Ön amplifikasyon ana karışımını ana karışımın tam olarak çözünmesi ve homojenizasyonunu sağlamak üzere ters çevirin. Tüpü kısa süre santrifüje edin. Ön amplifikasyon reaksiyon karışımını Tablo 5 uyarınca hazırlayın ve buz üstünde tutun. Reaksiyon karışımı tipik olarak örnek dışında PCR için gerekli tüm bileşenleri içerir. Not: Hibridizasyon karışımları (adım 6) ve TwoStep karışımı (adım 12) ön amplifikasyon karışımıyla aynı anda hazırlanabilir ve kullanılıncaya kadar karanlıkta 4 C sıcaklıkta saklanmalıdır. Tüm 3 karışımın aynı anda hazırlanması ancak tüm protokol gecikme olmaksızın izlendiğinde yapılabilir; farklı adımlar arasında duraklamaya izin verilmez. Daha uzun süre saklama (gece boyunca gibi) sonrasında karışımların stabilitesi garanti edilmez. Tablo 5. Ön amplifikasyon reaksiyon karışımının hazırlanması Örnek sayısı (reaktif tüpünün kapak rengi) 1 12 Seyreltme tamponu (saydam) 6,25 µl 75 µl Ön amplifikasyon ana karışımı (mor) 6,25 µl 75 µl Ön amplifikasyon primer karışımı (beyaz) 2,5 µl 30 µl Toplam hacim 15 µl 180 µl 2. Ön amplifikasyon reaksiyon karışımını hafifçe ama iyice karıştırın ve karışımdan 15 µl miktarını her 0,2 ml PCR tüpüne pipetleyin. Sonra elüsyon yapılmış örnek DNA/RNA'sı veya negatif kontrolden 10 µl ekleyin (bakınız Tablo 6). 16 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013

3. PCR tüplerini kapatın. İyice karıştırın. Tüpleri kısa süre santrifüjleyin ve tüp tipleri tekrar buza veya bir soğutma bloğuna koyun. Tablo 6. Ön amplifikasyon reaksiyonlarının hazırlanması Örnek sayısı 1 12 Ön amplifikasyon reaksiyon karışımı 15 µl her birinden 15 µl Örnek veya negatif kontrol 10 µl her birinden 10 µl Toplam hacim 25 µl her birinden 25 µl 4. Blok tabanlı termal döngüleyiciyi Tablo 7'ye göre programlayın. Tablo 7. Ön amplifikasyon için termal döngüleyici programı Ters transkripsiyon: 20 dakika 50 C Başlangıç aktivasyon adımı: 3 adımlı döngüleme: 2 dakika 95 C Denatürasyon 25 saniye 94 C Birleştirme 25 saniye 55 C Uzatma 40 saniye 72 C Döngü sayısı 40 Tut: 20 C 5. Ön amplifikasyon programını PCR tüpleri halen buzdayken başlatın. Termal döngüleyicinin 50 C'ye ulaşmasını bekleyin. Sonra tüpleri termal döngüleyici bloğuna koyun ve ısıtmalı kapağı kapatın. Hibridizasyon 6. Hibridizasyon karışımı 1'i Tablo 8'e ve hibridizasyon karışımı 2'yi Tablo 9'a göre hazırlayın ve yavaşça ama iyice karıştırın. RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013 17

Hibridizasyon karışımları adım 1 içinde zaten hazırlanmışsa ön amplifikasyon programının tamamlanmasını bekleyin ve sonra 7 ile devam edin. Tablo 8. Hibridizasyon karışımı 1 hazırlanması Örnek sayısı (reaktif tüpünün kapak rengi) 1 12 Hibridizasyon tamponu (sarı) 1,5 µl 18 µl Prob karışımı 1 (kırmızı) 1,5 µl 18 µl Seyreltme tamponu (saydam) 3,0 µl 36 µl Hibridizasyon karışımı 1 toplam hacmi 6,0 µl 72 µl Tablo 9. Hibridizasyon karışımı 2 hazırlanması Örnek sayısı (reaktif tüpünün kapak rengi) 1 12 Hibridizasyon tamponu (sarı) 1,5 µl 18 µl Prob karışımı 2 (mavi) 1,5 µl 18 µl Seyreltme tamponu (saydam) 3,0 µl 36 µl Hibridizasyon karışımı 2 toplam hacmi 6,0 µl 72 µl 7. Her örnek için hibridizasyon karışımı 1'den 6 µl miktarını yeni bir PCR tüpüne pipetleyin ve hibridizasyon karışımı 2'den 6 µl miktarını yeni bir PCR tüpüne pipetleyin. 8. Ön amplifikasyon programı bittikten sonra (adım 5), PCR tüplerini termal döngüleyiciden çıkarın ve kısa süre santrifüjleyin. 2 tüpten her birine her ön-amplifikasyon reaksiyonundan 2 µl pipetleyin birinde hibridizasyon karışımı 1 ve birinde hibridizasyon karışımı 2 vardır (bakınız Tablo 10). 18 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013

Tablo 10. Hibridizasyon reaksiyonlarının hazırlanması Örnek sayısı 1 12 Hibridizasyon karışımı 1 (adım 7) 6,0 µl her birinden 6,0 µl Ön amplifikasyon reaksiyonu (adım 8) 2,0 µl her birinden 2,0 µl Toplam hacim 8,0 µl Hibridizasyon karışımı 2 (adım 7) 6,0 µl her birinden 8,0 µl her birinden 6,0 µl Ön amplifikasyon reaksiyonu (adım 8) 2,0 µl her birinden 2,0 µl Toplam hacim 8,0 µl her birinden 8,0 µl 9. PCR tüplerini kapatın ve kısa süre santrifüje edin. 10. Blok tabanlı termal döngüleyiciyi Tablo 11'ye göre programlayın. Tablo 11. Hibridizasyon için termal döngüleyici programı Denatürasyon: 10 dakika 98 C Probların hibridizasyonu: 30 dakika 60 C Tut: 60 C 11. Ön amplifikasyon reaksiyonunun karışımları ve hibridizasyon karışımlarını içeren tüpleri termal döngüleyici bloğuna yerleştirin ve ısıtmalı kapağı kapatın. Hibridizasyon programını başlatın. Ligasyon ve PCR 12. TwoStep karışımını Tablo 12 uyarınca hazırlayın. Yavaşça ama iyice karıştırın ve kullanıncaya kadar buzda tutun. Not: Örnekler 2 kısma bölündüğünden (hibridizasyon karışımı 1 ve hibridizasyon karışımı 2) TwoStep karışımı iki kat olarak hazırlanmalıdır. Her iki hibridizasyon karışımının her biri için 32,0 µl TwoStep gerekir. RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013 19

TwoStep karışımı adım 1 içinde zaten hazırlanmışsa adım 13 ile devam edin. Tablo 12. TwoStep karışımı hazırlama Örnek sayısı (reaktif tüpünün kapak rengi) 1* 2 x 1 2 x 12 TwoStep tamponu (yeşil) 30,6 µl 61,2 µl 734,4 µl Ligaz enzimi (kahverengi) 1,0 µl 2,0 µl 24,0 µl Taq polimeraz (turuncu) 0,4 µl 0,8 µl 9,6 µl Toplam hacim 32,0 µl 64,0 µl 768,0 µl * Not: 1x TwoStep karışımı hazırlamak asla gerekmez çünkü her örnek için TwoStep karışımından 2 x 1 hacim hazırlanmalıdır. 13. Rotor-Gene Q aleti için aşağıdaki adımlara göre bir sıcaklık profili oluşturun. Tablo 13, sayfa 21 içinde termal döngüleyici programına bir genel bakış sağlanmıştır. Genel test parametrelerini kurma Şekil 2, 3 Yeni kanallar oluşturma Şekil 4-7 Yükseltmeyi düzenleme Şekil 8, 9 Sıcaklık profilini programlama Şekil 10-16 Erime programını programlama Şekil 17, 18 Özet ve şablonu kaydetme Şekil 19, 20 Çalışmayı başlatma Şekil 21 Tüm spesifikasyonlar Rotor-Gene Q yazılım versiyonu 2.1.0 ile ilgilidir. Rotor-Gene aletlerini programlamak ile ilgili ek bilgiyi alet kullanıcı el kitabında bulabilirsiniz. Şekillerde bu ayarlar kalın siyah çerçeveyle gösterilmiştir. Rotor-Gene Q aletleri için şekiller dahil edilmiştir. 20 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013

Tablo 13. TwoStep döngüleme için termal döngüleyici programına genel bakış Probların bağlanması: 15 dakika 54 C Notlar Başlangıç denatürasyon adımı: 2 dakika 95 C PCR 1: 3 adımlı döngüleme: Yüksek özgüllüklü PCR Denatürasyon 15 saniye 94 C Birleştirme 15 saniye 60 C Uzatma 15 saniye 72 C Döngü sayısı 10 PCR 2: 3 adımlı döngüleme: Denatürasyon 15 saniye 94 C Birleştirme 15 saniye 50 C Alma* Denatürasyon 15 saniye 72 C Döngü sayısı 23 Denatürasyon: 2 dakika 95 C Erime programı: 45-85 C Alma * Alan kanallar: Yeşil, yükseltme 4; Kırmızı, yükseltme 1; FAM /ROX, yükseltme 8 ve FAM/Cy5, yükseltme 10. Alan kanallar: Yeşil, Kırmızı, FAM/ROX ve FAM/Cy5. Optimize gain before melt on all tubes (Tüm tüplerde erime öncesinde yükseltmeyi optimize et) kullanın. The gain giving the highest fluorescence less than 95 will be selected (95 altında en yüksek floresansı veren yükseltme seçilecektir). RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013 21

14. Önce New Run Wizard (Yeni Çalışma Sihirbazı) diyalog kutusunu açın (Şekil 2). Locking Ring Attached (Kilitleme Halkası Tutturulmuş) kutusunu seçin ve Next (Sonraki) kısmına tıklayın. 1 2 Şekil 2. New Run Wizard diyalog kutusu. 15. Reaksiyon hacmi için 40 seçin ve Next kısmına tıklayın (Şekil 3). 1 2 Şekil 3. Genel test parametrelerini kurma. 22 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013

16. Sonraki New Run Wizard diyalog kutusunda Create New (Yeni Oluştur) düğmesine tıklayın (Şekil 4) ve Şekil 5 7'de gösterildiği gibi 2 ek kanal programlayın. 1 Şekil 4. Yeni kanallar oluşturun. 1 2 Şekil 5. Yeni kanal FAM/ROX oluşturun. RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013 23

1 2 Şekil 6. Yeni kanal FAM/Cy5 oluşturun. 1 2 Şekil 7. Yeni kanallar dahil edilmiştir. 17. Her kanal için yükseltmeyi Şekil 8'de belirtildiği şekilde düzenleyin. Her kanal için son yükseltme ayarları Şekil 9'da belirtilmiştir. Rotor-Gene Q aleti için yükseltme ayarları saptama kanallarında satürasyonu önleyecek şekilde seçilir. Ancak saptama kanallarından herhangi birinde satürasyon gözlenirse bu satüre olmuş kanal için yükseltme ayarları uyarlanmalı ve yeni bir erime eğrisi analizi yapılmalıdır. 24 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013

1 2 Şekil 8. Yükseltmeyi düzenleme. Örnek olarak şekil Cycling Green kanalı için yükseltmeyi 4'e ayarlamayı göstermektedir. 1 Şekil 9. Tüm kanallar için son yükseltme ayarları. Gerekli kanallar şunlardır: Yeşil, yükseltme 4; Kırmızı, yükseltme 1; FAM/ROX, yükseltme 8 ve FAM/Cy5, yükseltme 10. RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013 25

18. Sonraki New Run Wizard diyalog kutusunda Edit Profil (Profil Düzenle) düğmesine tıklayın (Şekil 10) ve sıcaklık profilini Şekil 11-13'de gösterildiği gibi programlayın. 1 Şekil 10. Profili düzenleme. 1 2 Şekil 11. Probların bağlanması. 3 26 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013

1 2 Şekil 12. Başlangıç denatürasyon adımı. 3 1 2 5a 4 5 3 Şekil 13. Bağlanmış probların amplifikasyonu. 6 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013 27

1 2 4a 4 5 3 Şekil 14. 50 C'de sinyal alma dahil bağlanmış probların amplifikasyonu. Alma için gerekli kanallar Şekil 15'te gösterilmiştir. 6 1 2 Şekil 15. Alma için gerekli tüm kanalların seçilmesi. 28 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013

1 2 Şekil 16. PCR ürünleri ve problarının denatürasyonu. 3 1 2 Şekil 17. Erime programı. 3 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013 29

1 2 Şekil 18. Erime programı sırasında alma. 1 Şekil 19. Sıcaklık profilinin özeti. 30 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013

19. Şablonu daha sonra kullanma için kaydedin (Şekil 20). 1 Şekil 20. Şablonu daha sonra kullanma için kaydedin 20. TwoStep karışımının (adım 12 kısmından) oda sıcaklığına (15 25 C) dengelenmesini bekleyin ve Rotor-Gene Q aletinin her Strip Tüpü içine TwoStep karışımından 32,0 µl pipetleyin. Not: Her örnek için 2 yeni tüpün her birine 32,0 µl TwoStep karışımı pipetleyin. 21. Her hibridizasyon reaksiyonunu (8 µl) TwoStep karışımı içeren Strip Tüplerine pipetleyin. Son hacim örnek başına 40 µl verir. Not: Hibridizasyon reaksiyonlarını TwoStep karışımına ekleninceye kadar 60 C'de tutun. 22. Strip Tüplerini uygun kapaklarla kapatın ve hemen Rotor-Gene Q aleti rotoruna yerleştirin. 23. Rotoru Rotor-Gene Q aletine yerleştirin. Kilitleme halkasını (Rotor-Gene Q aleti aksesuarı) tüplerin çalışma sırasında yanlışlıkla aşınmasını önlemek üzere en üste yerleştirildiğinden emin olun. RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013 31

24. Çalışmayı (Şekil 21) kaydedilen şablonu kullanarak (adım 19) başlatın. 1 Şekil 21. Çalışmayı başlatma. 32 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013

Sonuçların Yorumlanması Normalizasyon Rotor-Gene Q aletlerinde FAM/Cy5 kanalı için ham veriler farklı kanallar arasında çapraz geçişi dengelemek üzere önce normalize edilmelidir. Cy5 sinyallerinin normalizasyonu için ham kanal Erime FAM/Cy5 (filtre ayarları 470 660 nm) açın. Option (Seçenek) düğmesine basın ve Normalise to Melt FAM/ROX (FAM/ROX Erime için normalize et) seçin. Yeni oluşturulmuş Melt FAM/Cy5/Melt FAM/ROX ham veri dosyasının kırmızı kanal için ek olarak normalize edilmesi gerekir (filtre ayarları 625/660 nm). Bu yeni Melt FAM/Cy5/Melt FAM/ROX, ham veri dosyası açılıp Option düğmesine tıklanması ve Normalise to Melt Red (Kırmızı Erime için Normalize Et) seçilerek yapılır. Bu normalizasyonla Cy5 sıcaklık bağımlı floresansı düzeltilir ve daha simetrik bir erime tepesiyle sonuçlanır. Analiz Ham veri dosyasını analiz etmek için Analysis (Analiz) penceresini açın ve FAM/Cy5 için uygun normalize ham veri dosyasını Melt (Erime) sekmesi altında seçin. Green (Yeşil) kanaldaki sinyaller (IC) (filtre ayarları 470 510 nm) ve FAM/ROX kanalındaki sinyallerin (filtre ayarları 470 610 nm) normalize edilmesi gerekmez FAM/ROX ve Green kanalları içinde karşılık gelen ham veri dosyaları seçilir. SMART problarının farklı erime sıcaklıkları Tablo 14 sayfa 34 içinde gösterilmiştir. Eşik Tablo 13 (sayfa 21) ve Şekil 17 (sayfa 29) içinde tanımlandığı şekilde TwoStep reaksiyonunun erime programında Rotor-Gene Q yazılımı yükseltme optimizasyonu kullanılarak örnek sonuçlarını analiz etmek için erime eğrisi analiz plotlarında şu eşik değerleri ayarlanmalıdır. FAM/ROX kanalı: Eşik = 1 FAM/Cy5 kanalı (normalize): Eşik = 0 Green kanal (IC): df/dt işaretini çevirin ve her iki karışımla FAM/ROX ve FAM/Cy5 kanallarında pozitif erime tepesi göstermeyen tüm örnekleri seçin. Eşiği bu negatif örneklerle elde edilen 50 C'de en yüksek floresans seviyesine manuel olarak ayarlayın. Dahili kontrolün (70,5 73,5 C) kabul edilebilir T m aralığı dahilinde her iki karışımla erime tepeleri gösteren örneklere artık gerçek negatif örnekler denebilir. Tek pozitif dahili kontrol sonucu gösteren veya hiç göstermeyen örnekler geçersiz kabul edilmelidir. Geçersiz örnekler tekrarlanmalıdır. RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013 33

Tablo 14. SMART problarının hedefleri ve karşılık gelen T m değerleri Etiket SMART probu T m ( C) kabul edilebilir aralık Patojen kodu (karışım 1) Patojen kodu (karışım 2) Cy5 probu 1 50,5-53,5 L. pneu OC43 Cy5 probu 2 54,5-57,5 B. pert NL63 Cy5 Cy5 probu 3 60,0-63,0 Rino/Entero 229E Cy5 probu 4 66,0-69,0 C. pneu* HKU1 Cy5 probu 5 70,5-73,5 M. pneu Cy5 probu 6 76,5-79,5 H1N1 ROX probu 1 52,5-55,5 RSVA PIV1 ROX probu 2 57,5-60,5 Adeno PIV2 ROX ROX probu 3 62,5-65,5 hmpv PIV3 ROX probu 4 66,5-69,5 RSVB PIV4 ROX probu 5 72,5-75,5 InfA Boca ROX probu 6 76,5-79,5 InfB BHQ1 BHQ1 probu 1 70,5-73,5 IC IC * Not: RespiFinder RG Panel Chlamydophila pneumoniae saptanması Sadece Araştırma Kullanımı içindir. Diagnostik işlemlerde kullanım için değildir. Bir hastalığın tanısı, önlenmesi veya tedavisi hakkında bilgi sağlamak açısından kullanılması için herhangi bir iddiada veya temsilde bulunulmaz. Sorun Giderme kılavuzu Bu sorun giderme kılavuzu çıkabilecek herhangi bir problemi çözmekte faydalı olabilir. Daha fazla bilgi için Teknik Destek Merkezimizde Sık Sorulan Sorular sayfasına da bakınız: www.qiagen.com/faq/faqlist.aspx. QIAGEN Teknik Servisindeki bilim insanları bu el kitabındaki bilgi ve protokollerle ya da örnek ve test teknolojileriyle ilgili herhangi bir sorunuzu cevaplandırmaktan daima mutlu olacaktır (irtibat bilgileri için arka kapağa bakınız veya www.qiagen.com adresini ziyaret ediniz). 34 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013

Açıklama ve öneriler Görünür spesifik erime tepesi yok ve IC erime tepesi yok a) Termal döngüleme programında programlama hatası/hataları Termal döngüleyiciyi Protokol: PCR amplifikasyonu ve erime analizi, sayfa 16 uyarınca programlayın ve testi tekrarlayın. b) Pipetleme hatası veya eksik reaktif. c) IC eklenmemiş veya IC örneğe lizis tamponu eklenmesinden önce eklenmiş d) Örnekte PCR inhibitörleri var RespiFinder testini Protokol: PCR amplifikasyonu ve erime analizi, sayfa 16 izleyerek tekrarlayın. IC ve taşıyıcı RNA'yı lizis tamponuna kullanılan ekstraksiyon protokolüne bakılmaksızın tercihen örneğe eklendikten sonra eklemek önemlidir (bakınız Bir dahili kontrol ve taşıyıcı RNA kullanma, sayfa 14). Aksi halde IC, örnekteki nükleazlar nedeniyle bozulabilir. Nükleik asit ekstraksiyonu ve RespiFinder testini tekrarlayın. Testi izole RNA/DNA'nın beş kat dilüsyonunu kullanarak tekrarlayın. Patojene spesifik erime tepeleri varlığında IC erime tepesi yok Kuvvetli enfeksiyon ve/veya çoklu enfeksiyon Yanlış erime tepeleri görünüyor Çapraz kontaminasyon IC test içinde rekabet nedeniyle elenmiş. Sonuç halen geçerli. Çapraz kontaminasyonu önlemek için reaksiyon adımlarının ayrı odalarda yapıldığından emin olun. RespiFinder testini tekrarlayın. Döngüleme programını kontrol edin ve tüm muamele adımlarının Protokol: PCR amplifikasyonu ve erime analizi, sayfa 16 içinde tanımlandığı şekilde yapıldığından emin olun. Protokolde belirtilen yerlerde buz üzerinde çalıştığınızdan emin olun. RespiFinder testini tekrarlayın. RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013 35

Açıklama ve öneriler Örnek reaksiyonunda spesifik bir amplifikasyon olmadığında artmış arka alan floresans sinyalleri görülebilir. a) Örnek nükleik asit ekstresinde bulunan inhibe edici faktörler etkin ve spesifik amplifikasyonu önlüyor. Artmış arka alan sinyalleri RespiFinder RG Panel eşik değerleri üzerinde olabilir ama nonspesifik erime tepeleri olarak kolayca tanınır. Artmış arka alana bir örnek Şekil 22 sayfa 37 içinde verilmiştir. b) Negatif örneklerde dahili kontrol olmaması Artmış arka alan sinyalleri RespiFinder RG Panel eşik değerleri üzerinde olabilir ama nonspesifik erime tepeleri olarak kolayca tanınır. RespiFinder testini tekrarlayın. Artmış arka alana bir örnek Şekil 22 sayfa 37 içinde verilmiştir. 36 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013

FAM/ROX kanalı Karışım 1 Karışım 2 Gerçek pozitif Negatif kontrol IC yok IC yok Negatif kontrol FAM/Cy5 kanalı Karışım 1 Karışım 2 IC yok Negatif kontrol Gerçek f Negatif kontrol IC yok Green kanal (IC) Karışım 1 Karışım 2 Negatif kontrol IC yok IC yok Negatif kontrol Şekil 22. Artmış arka alan örneği. Negative control (Negatif kontrol): Çizgiler negatif kontrolle uyumludur ve FAM/ROX ve FAM/Cy5 kanallarında sinyal göstermez ama Green kanalda (IC) spesifik bir dahili kontrol tepesi gösterir. True positive (Gerçek pozitif): FAM/ROX karışım 1 ve FAM/Cy5 karışım 2 için belirtilen çizgiler gerçek pozitif erime tepeleri gösteren örneklere karşılık gelir. No IC (IC yok): Çizgiler dahili kontrolün eklenmemiş olduğu bir örneğe karşılık gelir. Bu örnekte spesifik bir amplifikasyon olmamış ve sonuçta FAM/ROX kanalı için artmış arka alan floresansı olmuştur ve açık erime tepeleri göstermez ama eşik değerinin üzerinde floresans seviyeleri gösterir. Kalite Kontrol RespiFinder RG Panel Hollanda'da Maastricht'de PathoFinder BV tarafından ISO13485:2003 ve EN ISO 13485:2012 akreditasyonunu kalite sistemlerine göre üretilmiştir. RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013 37

Sınırlamalar RespiFinder RG Panel diğer klinik ve laboratuvar bulgularıyla birlikte kullanıldığında solunum yolu enfeksiyonunun tanısına yardımcı olur. Negatif sonuçlar viral veya bakteriyel solunum yolu enfeksiyonunun bulunmadığına işaret etmez. Negatif sonuçlar tanı, terapi veya diğer tedavi kararları için tek temel olarak kullanılmamalıdır. Pozitif sonuçlar diğer patojenlerle ortak enfeksiyon olasılığını ortadan kaldırmaz. Saptanan patojen(ler) hastalığın kesin nedeni olmayabilir. Son tanı için diğer laboratuvar testleri ve klinik durumun değerlendirilmesi de kullanılmalıdır. Performans özellikleri QCMD'den doğrulanmış EQA panelleriyle belirlenmiştir. Ürün sadece laboratuvar uzmanları tarafından kullanım içindir. RespiFinder RG Panel Chlamydophila pneumoniae saptanması Sadece Araştırma Kullanımı içindir. Diagnostik işlemlerde kullanım için değildir. Bir hastalığın tanısı, önlenmesi veya tedavisi hakkında bilgi sağlamak açısından kullanılması için herhangi bir iddiada veya temsilde bulunulmaz. Performans Özellikleri RepliFinder RG Panel performans özellikleri için bakınızwww.qiagen.com/p/replifinder-rg-panel-ce. Referanslar QIAGEN, QIAGEN ürünlerini kullanan bilimsel yayınların büyük ve güncel bir çevrimiçi veri tabanını tutmaktadır. Kapsamlı araştırma seçenekleri gereksinim duyduğunuz makaleleri basit bir anahtar kelime arama veya uygulama, araştırma alanı, başlık, vs. belirterek bulmanızı mümkün kılar. Referans listesi için www.qiagen.com/refdb/search.asp adresindeki çevrim içi QIAGEN Referans Veri Tabanını ziyaret edin veya QIAGEN Teknik Servis ya da yerel distribütörünüzle irtibat kurun. Semboller Ambalaj veya etikette şu semboller belirebilir: <N> <N> reaksiyon için yeterli reaktif içermektedir Son kullanma tarihi 38 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013

İn vitro diagnostik tıbbi cihaz Katalog numarası Lot numarası Materyal sayısı Sıcaklık sınırlaması Üretici Kullanma talimatına başvurun Dikkat İrtibat Bilgisi Teknik yardım ve daha fazla bilgi için lütfen www.qiagen.com/support adresindeki Teknik Destek Merkezimize gidin veya 00800-22-44-6000 numarasını arayın veya QIAGEN Teknik Servis Bölümlerinden ya da yerel distribütörlerden birini arayın (arka kapağa bakın veya www.qiagen.com adresini ziyaret edin). RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013 39

Sipariş Bilgisi Ürün İçindekiler Kat. no. RespiFinder RG Panel (25) CE 25 reaksiyon için: Ön amplifikasyon Ana Karışımı, Dahili Kontrol, Ön amplifikasyon Primermix, Probemixes, Ligase Enzyme, Taq Polymerase ve Tamponlar 4692163 QIAamp MinElute Virus Spin Kit RespiFinder RG Panel kullanılmak üzere nazofaringeal sürüntülerden viral DNA ve RNA'nın eş zamanlı saflaştırılması için QIAamp MinElute Virus Spin Kit (50) 50 miniprep için: 50 QIAamp MinElute Sütunu, QIAGEN Proteaz, taşıyıcı RNA, tamponlar, Toplama Tüpleri (2 ml) Rotor-Gene Q MDx klinik uygulamalarda in vitro diagnostik olarak doğrulanmış gerçek zamanlı PCR analizi için Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Platform 5 kanal artı HRM kanallı (yeşil, sarı, turuncu, kırmızı, kızıl) gerçek zamanlı PCR döngüleyici ve yüksek çözünürlüklü eritme analizörü dizüstü bilgisayar, yazılım, aksesuarlar parçalar ve işçilik için 1 yıllık garanti dahildir kurulum ve eğitim dahil değildir 57704 9002032 Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System 5 kanal artı HRM kanallı (yeşil, sarı, turuncu, kırmızı, kızıl) gerçek zamanlı PCR döngüleyici ve yüksek çözünürlüklü eritme analizörü dizüstü bilgisayar, yazılım, aksesuarlar parçalar ve işçilik için 1 yıllık garanti dahildir kurulum ve eğitim dahil değildir 9002033 40 RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013

Ürün İçindekiler Kat. no. Rotor-Gene Q gerçek zamanlı PCR'de olağanüstü performans için Rotor-Gene Q 5plex HRM Platform 5 kanal artı HRM kanallı (yeşil, sarı, turuncu, kırmızı, kızıl) gerçek zamanlı PCR döngüleyici ve yüksek çözünürlüklü eritme analizörü dizüstü bilgisayar, yazılım, aksesuarlar parçalar ve işçilik için 1 yıllık garanti dahildir kurulum ve eğitim dahil değildir 9001580 Rotor-Gene Q 5plex HRM System 5 kanal artı HRM kanallı (yeşil, sarı, turuncu, kırmızı, kızıl) gerçek zamanlı PCR döngüleyici ve yüksek çözünürlüklü eritme analizörü dizüstü bilgisayar, yazılım, aksesuarlar parçalar ve işçilik için 1 yıllık garanti dahildir kurulum ve eğitim dahil değildir 9001650 Rotor-Gene Q aksesuarları Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (2500) 10 50 µl 1000 reaksiyon için 4 tüp ve kapaklı 250 strip 10 50 µl'lik 10.000 reaksiyon için 4 tüp ve kapaklı 10 x 250 strip 981103 981106 Güncel lisanslama bilgisi ve ürüne spesifik red beyanları için ilgili QIAGEN kiti el kitabı veya kullanıcı el kitabına bakınız. QIAGEN kit el kitapları ve kullanıcı el kitapları www.qiagen.com adresinde bulunabilir veya QIAGEN Teknik Servis veya yerel distribütörünüzden istenebilir. RespiFinder RG Panel El Kitabı 11/2013 41

Ticari markalar: QIAGEN, QIAamp, MinElute, Rotor-Gene (QIAGEN Group); BHQ (Biosearch Technologies, Inc.); Cy (GE Healthcare); FAM, GeneAmp, ROX (Life Technologies Corporation); RespiFinder (PathoFinder BV). RespiFinder RG Panel için Sınırlı Lisans Sözleşmesi Bu ürünün kullanılması ürünün herhangi bir satın alanı veya kullanıcısının şu şartları kabul ettiğini belirtir: 1. Ürün sadece ürünle birlikte ve bu el kitabında sağlanan protokollerle uyumlu olarak ve panel içindeki bileşenlerle kullanım için kullanılabilir. QIAGEN ürünle sağlanan protokoller, bu el kitabı ve www.qiagen.com adresinde bulunan ek protokollerde tanımlananlar dışında bu kite dahil edilmemiş herhangi bir bileşen ile kitin içindeki bileşenleri kullanma veya birleştirme açısından herhangi bir fikri mülkiyet altında bir lisans vermez. Bu ek protokollerden bazıları QIAGEN kullanıcıları tarafından QIAGEN kullanıcıları için sağlanmıştır. Bu protokoller QIAGEN tarafından iyice test edilmiş veya optimize edilmiş olmayabilir. QIAGEN üçüncü tarafların haklarını ihlal etmediklerini garanti etmez ve beyan etmez. 2. Açık olarak belirtilen lisanslar dışında QIAGEN bu kitin ve/veya kullanımının/kullanımlarının üçüncü tarafların haklarını ihlal etmediği konusunda garanti vermez. 3. Bu panel ve bileşenleri tek kullanım için lisanslanmıştır ve tekrar kullanılamaz, yenilenemez veya tekrar satılamaz. 4. QIAGEN açık olarak belirtilenler dışında açık veya zımni herhangi bir başka lisansı özellikle reddeder. 5. Panelin satın alıcısı ve kullanıcısı yukarıda yasaklanan herhangi bir eyleme neden olabilecek veya bunları kolaylaştırabilecek herhangi bir adım atmamayı veya başkasının atmasına izin vermemeyi kabul eder. QIAGEN bu Sınırlı Lisans Sözleşmesinin yasaklarını herhangi bir mahkemede yürürlüğe koyabilir ve kit ve/veya bileşenleriyle ilişkili herhangi bir fikri mülkiyet hakkı veya bu Sınırlı Lisans Sözleşmesini yürürlüğe koymak için tüm araştırma ve mahkeme masraflarını avukat masrafları dahil olmak üzere geri alacaktır. Güncellenmiş lisans şartları için bakınız www.qiagen.com. Satın alana not Bu ürün Hollanda'da Maastricht'de PathoFinder BV tarafından ISO13485:2003 akreditasyonlu kalite sistemlerine göre üretilmiş bir RespiFinder ürünüdür. Bu ürünler sadece son kullanıcı tarafından kullanım için satılır ve tekrar satılamaz, dağıtılamaz veya tekrar paketlenemez. 2013 QIAGEN, tüm hakları saklıdır.

www.qiagen.com Australia techservice-au@qiagen.com Austria techservice-at@qiagen.com Belgium techservice-bnl@qiagen.com Brazil suportetecnico.brasil@qiagen.com Canada techservice-ca@qiagen.com China techservice-cn@qiagen.com Denmark techservice-nordic@qiagen.com Finland techservice-nordic@qiagen.com France techservice-fr@qiagen.com Germany techservice-de@qiagen.com Hong Kong techservice-hk@qiagen.com India techservice-india@qiagen.com Ireland techservice-uk@qiagen.com Italy techservice-it@qiagen.com Japan techservice-jp@qiagen.com Korea (South) techservice-kr@qiagen.com Luxembourg techservice-bnl@qiagen.com Mexico techservice-mx@qiagen.com The Netherlands techservice-bnl@qiagen.com Norway techservice-nordic@qiagen.com Singapore techservice-sg@qiagen.com Sweden techservice-nordic@qiagen.com Switzerland techservice-ch@qiagen.com UK techservice-uk@qiagen.com 1075775TR 145021934 Sample & Assay Technologies