therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu

Transkript

1 Ağustos 2012 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 24 Versiyon 1 in vitro diyagnostik kullanım için Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM ya da Rotor-Gene Q 5plex HRM cihazda kullanım için QIAGEN Manchester Ltd, Skelton House, Lloyd Street North, Manchester, M15 6SH, UK R TR Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN Sample and Assay Technologies QIAGEN, her türlü biyolojik örnek içeriğinin izolasyonunu ve deteksiyonununa olanak tanıyan, yenilikçi örnek ve tahlil teknolojilerinde lider bir sağlayıcıdır. Bizim gelişmiş, üstün kaliteli ürünlerimiz ve servislerimiz örnekten sonuca kadar başarıyı garanti ederler. QIAGEN şunlarda standartları belirler: DNA, RNA ve proteinlerin purifikasyonu Nükleik asit ve protein tahlilleri microrna araştırmaları ve RNAi Örnek ve tahlil teknolojilerinin otomasyonu Misyonumuz sizlerin önemli ve göze çarpan başarılar kazanmanıza olanak sağlamak. Daha fazla bilgi için sitesini ziyaret ediniz.

3 İçindekiler Kullanım Amacı 5 Özet ve Açıklama 5 İşlem Prensibi 6 Prosedür 6 Sağlanan Materyaller 9 Kit içeriği 9 Gereken ancak Sağlanmayan Materyaller 9 Uyarılar ve Önlemler 10 Güvenlik bilgisi 10 Genel önlemler 11 Ayıraç Depolama ve İşleme 12 Numunelerle Çalışma ve Depolama 12 Prosedür 13 DNA izolasyonu 13 Protokoller Numune değerlendirme 14 BRAF mutasyon tespiti 20 Rotor-Gene Q BRAF kurulumu 27 Sonuçların Açıklaması 33 Numune değerlendirme veri analizi 33 BRAF mutasyon tespiti veri analizi 34 Verilerin yorumlanması için notlar 41 Arıza giderme kılavuzu 45 Kalite Kontrol 46 Kısıtlamalar 46 Performans Karakteristikleri 47 Boş limiti (LOB), çalışma aralığı ve cutoff değerleri 47 Doğruluk: Analitik referans yöntemi ile karşılaştırma 47 C T değerleri üzerindeki girdi DNA etkisi 48 Çapraz-reaksiyon 49 Algılama limiti (LOD) değerleri 50 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012 3

4 Kit performansı üzerindeki melanin etkisi 50 Tekrarlanabilirlik 51 Çoğaltılabilirlik 51 Referanslar 52 Semboller 53 İletişim Bilgileri 53 Sipariş Bilgisi 54 4 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012

5 Kullanım Amacı therascreen BRAF RGQ PCR Kit BRAF geninde bulunan beş somatik mutasyondun tespiti için bir in vitro diyagnostik testtir ve mutasyon durumunun kalitatif bir değerlendirmesini sağlar. DNA, formalin-sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) tümör dokusundan ekstrakte edilecek ve Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM ya da Rotor-Gene Q 5plex HRM cihazda gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak test edilecektir. Tablo 1. Mutasyonlar ve COSMIC IDs listesi* Mutasyon Baz değişim COSMIC ID V600E GTG>GAG 476 V600E complex GTG>GA 475 V600D GTG>GAT 473 V600K GTG>AAG 474 V600R GTG>AGG 477 * COSMIC ID ler Catalog of Somatic Mutations in Cancer den alınmıştır ( Özet ve Açıklama therascreen BRAF RGQ PCR Kit, Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM ya da Rotor-Gene Q 5plex HRM cihazda gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak BRAF geninde bulunan beş somatik mutasyonun tespiti için kullanıma hazır bir kittir. ARMS (Amplifikasyon Refrakter Mutasyon Sistemi) ve Scorpions teknolojilerini kullanarak, therascreen BRAF RGQ PCR Kit BRAF onkojeninin 600 kodonundaki aşağıdaki mutasyonların wild-type genomik DNA arka planına karşı tespit edilmesini mümkün kılar. V600E V600Ec V600D V600K V600R Kullanılan yöntemler oldukça selektiftir ve toplam DNA varlığının miktarına bağlı olarak wild-type genomik DNA arka planındaki düşük bir yüzdedeki mutantın tespitine imkan tanır. Bu seçicilik ve algılama limitleri boya-terminatör sekanslama gibi teknolojilerden üstündür. therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012 5

6 İşlem Prensibi therascreen BRAF RGQ PCR Kit gerçek zamanlı PCR deki mutasyonların tespiti için iki teknolojiyi kullanır ARMS ve Scorpions. ARMS Alel ya da mutasyon spesifik amplifikasyon ARMS kullanılarak başarılır. Taq DNA polimeraz (Taq) bir PCR primerinin 3' uzundaki uyumlu ve uyumsuz olanı ayırt etmekte etkindir. Mutasyona uğramış spesifik sekanslar, sekansların çoğunluğunun mutasyon taşımadığı numunelerde bile seçici olarak amplifiye edilirler. Primer tamamen uyumlu olduğunda, amplifikasyon tam etkinlikte gerçekleşir. 3' baz uyuşmadığında, yalnızca düşük seviyede geri planlı amplifikasyon oluşur. Scorpions Amplifikasyonun tespiti Scorpions kullanılarak gerçekleştirilir. Scorpion lar kovalent olarak floresanlı olarak etiketlenmiş bir proba bağlı bir PCR primeri içeren çift fonksiyonlu moleküllerdir. Bu prop içindeki florofor bir söndürücü ile bağlantılıdır, ayrıca floresanı azaltan bir probun içine yerleşmiştir. PCR sırasında prop amplikona bağlandığında, florofor ve söndürücü ayrılırlar. Bu reaksiyon tüpündeki floresanda ölçülebilir bir artışa yol açar. Kit formatı therascreen BRAF RGQ PCR Kit içerisinde beş tahlil sağlanır. Bir kontrol tahlili (Control Reaction Mix; CTRL) Dört mutasyon tahlili (mutant reaksiyon karışımları; V600E/Ec, V600D, V600K, V600R) V600E/Ec tahlil hem V600E hem de V600Ec mutasyonlarını tespit eder ancak bunlar arasında bir ayırım yapmaz. Tüm reaksiyon karışımları dublekstir ve FAM olarak etiketlenmiş hedefleri ve HEX olarak etiketlenmiş bir dahili kontrolu tespit etmek için ayıraçlar içerir. Dahili kontrol tahlili yanlış negatif sonuçlara yol açabilecek inhibitörlernin varlığını kontrol eder. Prosedür therascreen BRAF RGQ PCR Kit iki aşamalı bir prosedür içerir. İlk aşamada, kontrol tahlili numune içindeki amplifiye edilebilir toplam BRAF DNA değerlendirmesi için gerçekleştirilir. İkinci aşamada, hem mutasyon hem da kontrol tahlilleri mutant DNA nın varlığı ya da yokluğunu belirlemek için yapılır. 6 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012

7 Tahliller Kontrol tahlili FAM olarak etiketlenmiş kontrol tahlili bir numune içindeki amplifiye edilebilir toplam BRAF DNA değerlendirmesi için kullanılır. Kontrol tahlili BRAF geninin ekson 3 bölgesini amplifiye eder. Primerler ve Scorpion probu bilinen herhangi bir BRAF polimorfizmini bağımsız olarak amplifiye etmek üzere tasarlanmıştır. Mutasyon tahlilleri Her bir mutasyon tahlili wild-type DNA ile spesifik bir mutant DNA arasındaki ayırım için bir FAM-etiketli Scorpion ile bir ARMS primeri içerir. Kontroller Not: Deneysel çalışmaların tümü pozitif ve negatif kontroller içermelidirler. Pozitif kontrol Her bir çalışma 1-5 tüpleri içinde pozitif bir kontrol içermelidir. therascreen BRAF RGQ PCR Kit pozitif kontrol reaksiyonunda şablon olarak kullanılmak üzere BRAF Positive Control (PC) içerir. Pozitif kontrol sonuçları kitin beyan edilen kabul kriterleri içine performans gösterdiğini garanti etmek üzere değerlendirileceklerdir. Negatif kontrol Her bir çalışma 9-13 tüpleri içinde negatif bir kontrol ( no template control ) bulundurmalıdır. therascreen BRAF RGQ PCR Kit şablon olmayan kontrol için template olarak kullanılmak üzere Water for NTC (NTC) içerir. Şablon olmayan kontrol çalışma sırasında herhangi bir potansiyel kontaminasyonu değerlendirmek ve dahili kontrol reaksiyonunun performansını değerlendirmek için kullanılır. Dahili kontrol reaksiyon değerlendirmesi Her bir reaksiyon karışımı hedef reaksiyona ilave olarak bir dahili kontrol içerir. Bir başarısızlık ya yanlış bir sonuca neden olabilecek inhibitörlerin varlığını ya da o tüp için bir operatör ayarı hatasının gerçekleşmiş olduğunu gösterir. Eğer dahili kontrol başarısız olursa, Numune analizi Numune dahili kontrol mutasyon tahlilleri HEX C T ne bakınız, sayfa 38. Eğer dahili kontrol PCR inhibisyonu nedeniyle başarısız olursa, numunenin seyreltilmesi inhibitörlerin etkisini azaltabilir ancak bunun aynı zamanda hedef DNA yı da seyrelteceği not edilmelidir. Kit içerisine bir tüp Water for Sample Dilution (Dil) dahil edilmiştir. Numune değerlendirme Numune içindeki toplam amplifiye edilebilir BRAF DNA değerlendirmesi için therascreen BRAF RGQ PCR Kit ile birlikte verilen Control Reaction Mix (CTRL) kullanılması şiddetle önerilir. Kontrol tahlili BRAF geninin ekzon 3 ünün bir therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012 7

8 bölgesini amplifiye eder. Numunelerin yalnızca pozitif kontrol olarak BRAF Positive Control (PC) ve şablon olmayan kontrol olarak Water for NTC (NTC) kullanan kontrol tahlili ile hazırlanması önerilir. Not: DNA değerlendirmesi PCR ye bağlı olmalıdır ve absorban değerine dayanan miktar belirlemesinden ayrılabilir. Değerlendirmenin kalitesini ve therascreen BRAF RGQ PCR Kit ile analiz öncesinde numune içindeki DNA miktarını garanti etmek için ilave Control Reaction Mix (CTRL) sağlanır. 8 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012

9 Sağlanan Materyaller Kit içeriği therascreen BRAF RGQ PCR Kit (24) Katalog no Reaksiyon sayısı 24 Control Reaction Mix Kırmızı 1 CTRL 2 x 720 µl V600E/Ec Reaction Mix Mor 2 V600E/Ec 720 µl V600D Reaction Mix Portakal 3 V600D 720 µl V600K Reaction Mix Pembe 4 V600K 720 µl V600R Reaction Mix Yeşil 5 V600R 720 µl BRAF Positive Control Bej PC 250 µl Taq DNA Polymerase Nane yeşili Taq 138 µl Water for NTC Beyaz NTC 1.9 ml Water for Sample Dilution Beyaz Dil. 1.9 ml therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu (Türkçe) 1 Gereken ancak Sağlanmayan Materyaller Kimyasallarla çalışırken her zaman uygun laboratuvar ceketi giyin, tek kullanımlık eldiven ve koruyucu gözlükler takın. Daha fazla bilgi için, ürün tedarikçisinde mevcut uygun güvenlik veri sayfalarına (SDSs) bakınız. QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN, kat. no ; DNA izolasyonu na bakınız, sayfa 13) Xylene Etanol (96 %100)* 1.5 ml ya da 2 ml mikro santrifüj tüpleri (liziz aşamaları için) 1.5 ml mikro santrifüj tüpleri (elüsyon aşamaları için) (Brinkmann [Safe- Lock, kat. no ], Eppendorf [Safe-Lock, kat. no ] ya da Sarstedt [Safety Cap, kat. no ] dan temin edilebilir) * Metanol ya da metiletilketon gibi diğer maddeleri içeren denatüre alkol kullanmayınız. Bu tedarikçelerin tam bir listesi değildir. therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012 9

10 Özel pipetler* (ayarlanabilir) numune preparasyonu için Özel pipetler* (ayarlanabilir) PCR master karışım preparasyonu için Özel pipetler* (ayarlanabilir) şablon DNA dağıtımı için Filtreli steril pipet uçları (çapraz kontaminasyondan kaçınmak için, aerosol bariyerli pipet uçları öneririz) Termomikser, ısıtıcılı orbital inkübatör, ısıtma bloğu ya 90 C de inkübasyon yapabilen su banyosu* 2 ml reaksiyon tüpleri için rotorlu tezgah üstü santrifüj* Vortex* Floresan kanallı Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM ya da Rotor-Gene Q 5plex HRM cihaz*, Cycling Green ve Cycling Yellow için (sırasıyla FAM ve HEX tespiti için) Rotor-Gene Q yazılım versiyonu ya da üstü 0.1 ml Strip Tubes ve Caps, 72-hazneli rotor ile kullanım için (QIAGEN, kat. no ya da ) Master karışımlar hazırlamak için steril mikrosantrifüj tüpler Loading Block 72 x 0.1 ml Tubes, tek kanallı bir pipet ile manüel reaksiyon hazırlığı için alüminyum blok (QIAGEN, kat. no ) Uyarılar ve Önlemler In Vitro Diyagnostik Kullanım İçin Güvenlik bilgisi Kimyasallarla çalışırken her zaman uygun laboratuvar ceketi giyin, tek kullanımlık eldiven ve koruyucu gözlükler takın. QIAGEN bu ürün ile çalışırken ya da dokunmaktan kaynaklanan zararların sorumluluğunu kabul etmez. 24-saat acil bilgi İngilizce, Fransızca ve Almanca acil tıbbi bilgi günün 24 saatinde aşağıdaki iletişim numarasından alınabilir: Zehirlenme Bilgi Merkezi Mainz, Germany Tel: * Kullanmadan önce cihazların üreticinin önerileri doğrultusuna kontrol edilmiş ve kalibre edilmiş olduğundan emin olun. 10 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012

11 Genel önlemler Kullanıcı her zaman aşağıdaki hususlara dikkat etmelidir. Filtreli steril pipet uçları kullanın ve pipetlerin üreticinin talimatları doğrultusunda kalibre edilmiş olduklarından emin olun. Pozitif materyalleri (numuneler ve pozitif kontroller) tüm diğer ayıraçlardan ayrı olarak depolayın ve ekstrakte edin ve bunları reaksiyon reaksiyon karışımlarına özel olarak ayrılmış bir alanda ilave edin. Bileşenlerin tümünü tahlile başlamadan önce oda sıcaklığında (15 25 C) en 1 bir saat süreyle çözdürün. Çözüldüklerinde, her bir tüpü 10 kez aşağı yukarı çevirerek ve kısaca santrifüjleyerek bileşenleri karıştırın. Not: PCR lerin sentetik kontrol materyalleri ile kontaminasyonunu önlemek için aşırı dikkat gösterin. Reaksiyon karışımlarının hazırlanması ve DNA şablonunun ilave edilmesinde ayrı, özel pipetler kullanılmasını öneririz. Reaksiyon karışımlarının hazırlanması ve dağıtılması ve şablon ilavesi ayrı bir alanda gerçekleştirilmelidir. PCR çalışmasının tamamlanmasından sonra Rotor-Gene Q tüpleri açılmamalıdır. Bu PCR sonrası ürünler ile laboratuvar kontaminasyonunu önlemek içindir. Not: therascreen BRAF RGQ PCR Kit ayıraçları optimal olarak seyreltilmişlerdir. Ayıraçların daha fazla seyreltilmelerini önermeyiz zira bu performans kaybına neden olabilir. 25 µl den daha az volümde reaksiyon kullanımını önermeyiz zira bu yanlış negatif riskini artıracaktır. Not: therascreen BRAF RGQ PCR Kit içindeki ayıraçların tamamı optimal performans için özel olarak formüle edilirler. therascreen BRAF RGQ PCR Kit içinde sağlanan ayıraçların tümü yalnızca aynı therascreen BRAF RGQ PCR Kit içindeki diğer ayıraçlar ile birlikte kullanılmak üzere tasarlanmışlardır. Eğer optimal performans korunmak isteniyorsa kit içindeki ayıraçların yerine başkaları kullanılmamalıdır. Not: Yalnızca kit içinde sağlanan Taq DNA polimeraz (Taq) kullanın. Taq DNA polimerazı aynı ya da diğer türdeki kitlerdekiler ile ya da diğer tedarikçilerden sağlanan Taq DNA polimeraz ile değiştirmeyin. Not: therascreen BRAF RGQ PCR Kit içindeki ayıraçların optimal kullanımını sağlamak için, numuneler gruplandırılmalıdır. Eğer numuneler ayrı olarak tahlil edilirlerse, bu daha fazla ayıraç tüketilmesine neden olacak ve therascreen BRAF RGQ PCR Kit ile tahlil edilebilecek numene sayısını azaltacaktır. Not: Doğru numune tahlili ve analizini sağlamak için, kullanıcının pipetlerken, PCR şerit tüplerini 72-hazneli rotorun uygun pozisyonlarına yerleştirirken ve numune adlarını girerken özel dikkat göstermesi gerekir. therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/

12 Ayıraç Depolama ve İşleme therascreen BRAF RGQ PCR Kit kuru buz üzerinde sevk edilir ve teslim alındığında hala donmuş olmalıdır. Eğer therascreen BRAF RGQ PCR Kit teslim alındığında donmamış ise, nakliye sırasında dış paketi açılmış ise ya da sevkiyat bir paketleme notu, kullanım kılavuzu ya da ayıraçlar içermiyorsa, lütfen QIAGEN Teknik Servis Departmanlarından birisi ile veya yerel distribütörler ile iletişime geçiniz (arka kapağa bakın ya da sayfasını ziyaret edin). therascreen BRAF RGQ PCR Kit teslim alınmasının ardından derhal sabit ısılı bir dondurucuda 15 ila 30 C arasında depolanmalı ve güneş ışığından korunmalıdır. Belirtilen depolama koşulları altında orijinal paketi içinde depolandığında, kit etiketi üzerine belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Tekrarlanan dondurma ve çözme işleminden kaçınılmalıdır. Maksimum 6 donma-çözme döngüsü aşılmamalıdır. Not: Optimal aktivite ve performansı sağlamak için, Scorpionlar (tüm floresanlı olarak etiketlenmiş moleküllerde olduğu gibi) foto beyazlamadan kaçınmak için ışıktan korunmalıdırlar. Numunelerle Çalışma ve Depolama Not: Numunelerin tümü potansiyel olarak enfeksiyonlu materyaller olarak muamele görmelidir. Numune materyalleri formalin-sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) dokulardan ekstrakte edilmiş insan genomik DNA sı olmalıdır. Numunelerin kalitesini korumak için numuneler standart patolojik yöntemlere göre nakledilmelidirler. Tümör numuneleri homojen değillerdir ve bir tümör numunesinden alınan veriler aynı tümörün diğer bölümlerinden alınanlar ile konkordant olmayabilirler. Tümör numuneleri aynı zamanda tümör olmayan dokular da içerebilirler. Tümör olmayan dokudan alınan DNA nın therascreen BRAF RGQ PCR Kit tarafından tespit edilen mutasyonları içermesi beklenmeyecektir. 12 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012

13 Prosedür DNA izolasyonu DNA izolasyonu QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN, kat. no ) kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Not: therascreen BRAF RGQ PCR Kit manuel ekstraksiyon tekniği ile QIAamp DNA FFPE Tissue Kit kullanılarak geliştirilmiştir. Optimal performansı sağlamak için, diğer ekstraksiyon ürünleri ve otomatik sistemler önerilmez. DNA purifikasyonunu aşağıdaki değişikliklerle birlikte QIAamp DNA FFPE Tissue Kullanım Kılavuzu ndaki talimatlara göre gerçekleştirin. FFPE bölümlerini cam slaytlar üzerinde toplayın. Doku bölümlerinin etrafındaki fazla parafini yeni, steril bir bisturi kullanarak kazıyın. Doku bölümlerini ekstrakte edilecek her bir numune için yeni bir bisturi kullanarak mikrosantrifüj içine sıyırın. Arıtılmış genomik DNA µl Buffer ATE içinde elüte edilmelidir. (QIAamp DNA FFPE Tissue Kit içinde sağlanmaktadır). Arıtılmış genomik DNA yı 15 ila 30 C arasında depolayın. DNA değerlendirmesi therascreen BRAF RGQ PCR Kit ile birlikte sağlanan Control Reaction Mix (CTRL) e dayanmalıdır ve absorban değerlerine dayanan miktar belirlemesinden ayrılabilir. therascreen BRAF RGQ PCR Kit ile analiz öncesinde numuneler içindeki DNA nın kalitesinin değerlendirilmesini ve miktar belirlemesini sağlamak için ilave Control Reaction Mix (CTRL) sağlanır. Not: Analiz için yeterli DNA sağlamak için, öncelikle minimum iki FFPE slaytın birlikte ekstrakte edilmesi ve kontrol tahlili ile değerlendirilmesi önerilir. Eğer PCR için yetersiz DNA elde edilirse, daha fazla slayt ekstrakte edilir ve DNA Not: Analiz için yeterli DNA sağlamak için, FFPE bölümlerinin minimum 5 µm kalınlıkta olması gerekir. therascreen BRAF RGQ PCR Kit içindeki tüm tahliller kısa PCR ürünleri üretirler. Ancak, therascreen BRAF RGQ PCR Kit fazla şekilde parçalanmış DNA ile çalışmayacaktır. therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/

14 Protokol: Numune değerlendirme Bu protokol numuneler içindeki toplam amplifiye edilebilir DNA değerlendirmesi için kullanılır. Başlamadan önceki önemli hususlar İşleme başlamadan önce Genel önlemler i okuyun, sayfa 11. İşleme başlamadan önce Rotor-Gene Q hakkında bilgi sahibi olmak için kendinize zaman ayırın. Cihazın kullanım kılavuzuna bakın. Taq DNA polimeraz ya da Taq DNA polimeraz içeren her türlü karışımı vortekslemeyin zira bu enzimi inaktive eder. Taq DNA polimerazı, ucun fazla enzim ile kaplanmasından kaçınmak için pipet ucunu sıvı yüzeyin tam altına dikkatlice yerleştirmek suretiyle pipetleyin. Mevcut Control Reaction Mix (CTRL) kullanılarak 24 numune değerlendirilebilir. Başlamadan önce yapılması gerekenler Her bir kullanım öncesinde içeriği tüpün tabanında toplanmasını sağlamak için, tüm ayıraçların oda sıcaklığında (15 25 C) minimum 1 saat süreyle tamamen çözülmesi, 10 kez baş aşağı çevrilerek karıştırılması ve kısaca santrifüjlenmesi gerekir. Her bir kullanım öncesinde Taq DNA polimerazın (Taq) oda sıcaklığında (15 25 C) olduğundan emin olun. Enzimi tüpün tabanına toplamak için tüpü kısaca santrifüjleyin. Prosedür 1. Control Reaction Mix (CTRL), Water for No Template Control (NTC) ve Positive Control (PC) yi oda sıcaklığında (15 25 C) minimum 1 saat süreyle tamamen çözdürün. Ayıraçlar çözüldüğünde, tuzların lokal konsantrasyonlarından kaçınmak için her bir tüpü 10 kez baş aşağı çevirmek suretiyle bunları karıştırın ve daha sonra içeriğin tüpün tabanında toplanmasını sağlamak için kısaca santrifüjleyin. 14 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012

15 2. Tablo 2 de verilen volümlere göre yeterli master karışımı (Control Reaction Mix [CTRL] artı DNA numuneleri için Taq DNA polimeraz [Taq]), bir pozitif kontrol reaksiyonu ve bir şablon olmayan kontrol reaksiyonu hazırlayın. PCR hazırlığı için yeterli fazlalık sağlamak üzere 1 ekstra numune için ayıraç ilave edin. Master karışım numune hariç PCR için gerekli tüm bileşenleri içerir. Tablo 2. Kontrol tahlil master karışımının preparasyonu * Bileşen Control Reaction Mix (CRL) Taq DNA polymerase (Taq) Toplam volüm Volüm 19.5 µl x (n+1)* 0.5 µl x (n+1)* 20.0 µl/reaksiyon * n=reaksiyon sayısı (numuneler artı kontroller). PCR hazırlığı için yeterli fazlalık sağlamak üzere 1 ekstra numune (n+1) için ayıraç ilave edin. n değeri üzerinde olmamalıdır. 3. Aşağı ve yukarı 10 kez pipetlemek suretiyle master karışımı tamamen karıştırın. Uygun sayıdaki şerit tüpü Şekil 1 deki yerleşim düzenine göre yükleme bloğuna yerleştirin. Derhal 20 µl master karışımı her bir PCR şerit tüpüne (sağlanmamıştır) ilave edin. Kapaklar gerekinceye kadar plastik kaplar içinde kalmalıdır. Numune değerlendirme için, kontrol tahlil master karışımı bir pozitif kontrol haznesine, bir negatif kontrol haznesine ila ve edilmeli ve her bir numune için bir hazne olmalıdır. Tahlil Control 1 (PC) Control 2 (NTC) Control Control Control Control Control Control Şekil 1.Yükleme bloğundaki numune değerlendirme tahlilleri yerleşim düzeni. Sayılar yükleme bloğundaki pozisyonları gösterir ve nihai rotor pozisyonunu gösterir. therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/

16 4. Derhal 5 µl Water for No Template Control (NTC) yi şablon olmayan kontrol tüpüne (2 nolu PRC tüpü) ekleyin ve tüpün kapağını kapatın. Her bir numuneden 5 µl ü numune tüplerine (PCR tüp numaraları 3-36) ekleyin ve tüplerin kapağını kapatın. 5 µl BRAF Positive Control (PC) yi pozitif kontrol tüpüne (PCR tüp no. 1) ekleyin ve tüpün kapağını kapatın. Tüplerin Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM ya da Rotor-Gene Q 5plex HRM cihazların içine yerleştirilme yönünü göstermek için tüp kapaklarını işaretleyin. 5. Tüm PCR tüpleri kapaklandıktan sonra, tüm tüplere numune ilave edilmiş olduğundan emin olmak için numune tüp dolum seviyelerini görsel olarak kontrol edin. 6. Numuneleri ve reaksiyon karışımlarını karıştırmak için tüm PCR tüplerini evirtin (4 kez). 7. PCR şerit tüpleri 72-hazneli rotorun uygun pozisyonlarını yerleştirin (Şekil 1). Eğer rotor tamamen dolu değilse, rotor üzerindeki tüm boş pozisyonlar kapaklı, boş tüpler ile doldurulmalıdır. 8. Derhal 72-hazneli rotoru Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM veya Rotor- Gene Q 5plex HRM cihaza yerleştirin. Çalışma sırasında tüpleri güvenceye almak için kilitleme halkasının (Rotor-Gene Q cihaz aksesuarı) rotorun üzerine yerleştirilmiş olduğundan emin olun. 9. Uygun Rotor-Gene Q serisi yazılımını ( ya da yüksek) ve therascreen BRAF Assessment Run Template açın. Şablonun nasıl indirileceği ve çalışma parametrelerinin kontrolü bilgileri için Protokol: Rotor-Gene Q BRAF, sayfa 27 ye bakın. 10. Doğru rotorun seçilmiş olduğundan emin olun ve kilitleme halkasının takılı olduğunu teyit için kutuyu işaretleyin. Next e tıklayın (Şekil 2). 1 2 Şekil 2. New Run Wizard iletişim kutusu therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012

17 11. Operatörün adını girin. Notları ekleyin ve reaksiyon volümünün 25 e ayarlanmış ve Sample Layout kutusunun 1, 2, 3... olduğunu kontrol edin. Next üzerine tıklayın (Şekil 3). 1 2 Şekil 3. New Run Wizard iletişim kutusu. 12. Protokol: Rotor-Gene Q BRAF, sayfa 27 deki talimatlara göre çalışma parametrelerini kontrol edin. Next üzerine tıklayın (Şekil 4). 3 Döngü parametrelerini değiştirmeyin. therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/

18 Şekil 4. New Run Wizard iletişim kutusu. 13. Özeti kontrol edin ve çalışma dosyasını kaydetmek ve çalışmayı başlatmak için Start Run üzerine tıklayın (Şekil 5). 1 1 Şekil 5. New Run Wizard iletişim kutusu. 14. Çalışma başladıktan sonra yeni bir pencere görünür, buradan şimdi yeni numune adlarını girebilir ya da Finish tıklayabilir daha sonra 18 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012

19 bunları çalışma sırasında ya da çalışma tamamlandıktan sonra Sample butonunu seçerek bunları girebilirsiniz. Finish and Lock Samples tıklandığında numune adlarını değiştirmeniz engellenir. Kullanıcının numune adlarını girerken doğru numune test ve analizinin girilmesine özel dikkat göstermesi gerekir. 15. Çalışma tamamlandıktan sonra BRAF ne göre verileri analiz edin, sayfa Eğer miktar tayini raporları gerekiyorsa, Rotor-Gene Q çalışma dosyasındaki araç çubuğunun Reports ikonuna tıklayın. 17. Report browser içinden Report Categories altındaki Cycling A Green (sayfa1) üzerine tıklayın (Şekil 6). 1 Şekil 6. Report tarayıcısı. 18. Templates altından Quantitation (Full Report) seçin (Şekil 7). 1 Şekil 7. Miktar tayini raporu (tam rapor). 19. Raporu oluşturmak için Show üzerine tıklayın. 20. Elektronik bir versiyonunu kaydetmek için Save As tıklayın. 21. Cycling A Yellow (Page1) için tekrarlayın. therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/

20 Protokol: BRAF mutasyon tespiti Bu protokol BRAF mutasyonlarının tespiti içindir. Bir numune numune değerlendirmesini geçtiğinde, bu BRAF mutasyon tahlilleri kullanılarak test edilebilir. Başlamadan önceki önemli hususlar İşleme başlamadan önce Genel önlemler i okuyun, sayfa 11. İşleme başlamadan önce Rotor-Gene Q hakkında bilgi sahibi olmak için kendinize zaman ayırın. Cihazın kullanım kılavuzuna bakın. Taq DNA polimeraz ya da Taq DNA polimeraz içeren her türlü karışımı vortekslemeyin zira bu enzimi inaktive eder. therascreen BRAF RGQ PCR Kitin etkin kullanımı için, numuneler 6 dan daha az olmamak üzere gruplar halinde gruplanmalıdır. Daha küçük grup sayısı therascreen BRAF RGQ PCR Kit ile daha az numunenin test edilebileceği anlamına gelecektir Taq DNA polimeraz ya da Taq DNA (Taq) polimeraz içeren her türlü karışımı vortekslemeyin zira bu enzimi inaktive eder. Başlamadan önce yapılması gerekenler Her bir kullanım öncesinde içeriği tüpün tabanında toplanmasını sağlamak için, tüm ayıraçların oda sıcaklığında (15 25 C) minimum 1 saat süreyle tamamen çözülmesi, 10 kez baş aşağı çevrilerek karıştırılması ve kısaca santrifüjlenmesi gerekir. Her bir kullanım öncesinde Taq DNA polimerazın (Taq) oda sıcaklığında (15 25 C) olduğundan emin olun. Enzimi tüpün tabanına toplamak için tüpü kısaca santrifüjleyin Prosedür 1. Reaksiyon karışımlarını, Water for No Template Control (NTC) ve BRAF Positive Control (PC) yi oda sıcaklığında (15 25 C) minimum 1 saat süreyle tamamen çözdürün. Ayıraçlar çözüldüğünde, tuzların lokal konsantrasyonlarından kaçınmak için her bir tüpü 10 kez baş aşağı çevirmek suretiyle bunları karıştırın ve daha sonra içeriğin tüpün tabanında toplanmasını sağlamak için kısaca santrifüjleyin. 20 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012

21 2. Tablo 3 de verilen volümlere göre yeterli master karışımı (reaksiyon karışımı artı DNA numuneleri için Taq DNA polimeraz [Taq]), bir pozitif kontrol reaksiyonu ve bir şablon olmayan kontrol reaksiyonu hazırlayın. PCR hazırlığı için yeterli fazlalık sağlamak üzere 1 ekstra numune için ayıraç ilave edin. Master karışım numune hariç PCR için gerekli tüm bileşenleri içerir Tablo 3. Tahlil master karışımının preparasyonu* Tahlil Reaksiyon karışımı volümü Taq DNA polimeraz (Taq) Volümü Control 19.5 µl x (n+1) 0.5 µl x (n+1) V600E/Ec 19.5 µl x (n+1) 0.5 µl x (n+1) V600D 19.5 µl x (n+1) 0.5 µl x (n1) V600K 19.5 µl x (+1) 0.5 µl x (n+1) V600R 19.5 µl x (n+1) 05 µl x (n+1) * n=reaksiyon sayısı (numuneler artı kontroller). PCR hazırlığı için yeterli fazlalık sağlamak üzere 1 ekstra numune (n+1) için ayıraç ilave edin. n değeri üzerinde olmamalıdır. therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/

22 3. Aşağı ve yukarı 10 kez pipetlemek suretiyle master karışımı tamamen karıştırın. Uygun sayıdaki şerit tüpü Şekil 8 deki yerleşim düzenine göre yükleme bloğuna yerleştirin. Derhal 20 µl master karışımı her bir PCR şerit tüpüne (sağlanmamıştır) ilave edin. Kapaklar gerekinceye kadar plastik kaplar içinde kalmalıdır. Kontroller Numune sayısı Assay PC NTC Control V600E/Ec V600D V600K V600R Şekil 8. Yükleme bloğundaki numune değerlendirme tahlilleri yerleşim düzeni. Sayılar yükleme bloğundaki pozisyonları gösterir ve nihai rotor pozisyonunu gösterir. 4. Derhal 5 µl Water for No Template Control (NTC) yi şablon olmayan kontrol PCR şerit tüplerine (PCR tüp numaraları 9-13) ekleyin ve tüplerin kapağını kapatın. Her bur numuneden 5 µl ü numune tüplerine (PCR tüp numaraları 17 21, 25 29, 33 37, 41 45, 49 53, ve 65 69) ekleyin ve tüplerin kapaklarını kapatın. 5 µl BRAF Positive Control (PC) yi pozitif kontrol tüplerine (PCR tüp numaraları 1-5) ekleyin ve tüplerin kapağını kapatın. Her bir DNA numunesi hem kontrol hem de tüm mutasyon tahlilleri ile test edilmelidir. Tüplerin Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM ya da Rotor-Gene Q 5plex HRM cihazların içine yerleştirilme yönünü göstermek için tüp kapaklarını işaretleyin. 5. Tüm PCR tüpleri kapaklandıktan sonra, tüm tüplere numune ilave edilmiş olduğundan emin olmak için numune tüp dolum seviyelerini görsel olarak kontrol edin. 6. Numuneleri ve reaksiyon karışımlarını karıştırmak için tüm PCR tüplerini evirtin (4 kez). 7. PCR şerit tüpleri 72-hazneli rotorun uygun pozisyonlarını yerleştirin (Şekil 8). Her bir PCR çalışmasına en fazla 7 numune dahil edilebilir. Eğer rotor tamamen dolu değilse, rotor üzerindeki tüm boş pozisyonlar kapaklı, boş tüpler ile doldurulmalıdır. 22 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012

23 8. Derhal 72-hazneli rotoru Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM veya Rotor- Gene Q 5plex HRM cihaza yerleştirin. Çalışma sırasında tüpleri güvenceye almak için kilitleme halkasının (Rotor-Gene Q cihaz aksesuarı) rotorun üzerine yerleştirilmiş olduğundan emin olun. 9. Uygun Rotor-Gene Q serisi yazılımını ( ya da yüksek) ve therascreen BRAF Assessment Run Template açın. Şablonun nasıl indirileceği ve çalışma parametrelerinin kontrolü bilgileri için Protokol: Rotor-Gene Q BRAF, sayfa 27 ye bakın. 10. Doğru rotorun seçilmiş olduğundan emin olun ve kilitleme halkasının takılı olduğunu teyit için kutuyu işaretleyin. Next e tıklayın (Şekil 9) 1 2 Şekil 9. New Run Wizard iletişim kutusu. 3 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/

24 11. Operatörün adını girin. Notları ekleyin ve reaksiyon volümünün 25 e ayarlanmış ve Sample Layout kutusunun 1, 2, 3... olduğunu kontrol edin. Next üzerine tıklayın (Şekil 10). 1 2 Şekil 10. New Run Wizard iletişim kutusu. 12. Protokol: Rotor-Gene Q BRAF, sayfa 27 deki talimatlara göre çalışma parametrelerini kontrol edin. Next üzerine tıklayın (Şekil 11). 3 Döngü parametrelerini değiştirmeyin. 24 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012

25 Şekil 11. New Run Wizard iletişim kutusu. 13. Özeti kontrol edin ve çalışma dosyasını kaydetmek ve çalışmayı başlatmak için Start Run üzerine tıklayın (Şekil 12). 1 1 Şekil 12. New Run Wizard iletişim kutusu. 14. Çalışma başladıktan sonra yeni bir pencere görünür, buradan şimdi yeni numune adı daha sonra bunları çalışma sırasında ya da çalışma tamamlandıktan sonra Sample butonunu seçerek bunları girebilirsiniz. therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/

26 Finish and Lock Samples tıklandığında numune adlarını değiştirmeniz engellenir. Kullanıcının numune adlarını girerken doğru numune test ve analizinin girilmesine özel dikkat göstermesi gerekir. 15. Çalışma tamamlandıktan sonra BRAF mutasyon tespiti veri analizi ne göre verileri analiz edin, sayfa Eğer miktar tayini raporları gerekiyorsa, Rotor-Gene Q çalışma dosyasındaki araç çubuğunun Reports ikonuna tıklayın. 17. Report browser içinden Report Categories altındaki Cycling A Green (sayfa1) üzerine tıklayın (Şekil 13). 1 Şekil 13. Rapor tarayıcısı. 18. Templates altından Quantitation (Full Report) seçin (Şekil 14). 1 Şekil 14. Miktar tayini raporu (tam rapor). 19. Raporu oluşturmak için Show üzerine tıklayın. 20. Elektronik bir versiyonunu kaydetmek için Save As tıklayın. 21. Cycling A Yellow (Page1) için tekrarlayın. 26 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012

27 Protokol: Rotor-Gene Q BRAF kurulumu Bu protokol Protokol: Numune değerlendirme (sayfa 14), ve Protokol: BRAF mutasyon tespiti (sayfa 20) içinde refere edildi. İlgili şalonun sıcaklık profili kullanım öncesinde aşağıdaki prosedüre göre kontrol edilmelidir. Başlamadan önceki önemli hususlar therascreen BRAF Assessment Run Template (Şekil 15) ve therascreen BRAF Mutation Analysis Template (Şekil 16) her zaman kullanılmalıdır. Şekil 15. therascreen BRAF Assessment Run Template ikonu. Şekil 16. therascreen BRAF Mutation Analysis Template ikonu. Başlamadan önce yapılması gerekenler therascreen BRAF Assessment Run Template ve therascreen BRAF Mutation Analysis Template sayfasından indirilebilir. Dosya therascreenbraftemplate şifresi ile korunmaktadır. Şablon dosyalarını Rotor-Gene Q serisi yazılım kurulum klasörü içindeki Templates klasörünün bir alt dosyasına kopyalayın. Prosedür 1. Aşağıdaki aşamamalara göre uygun şablonu kontrol edin. Kilitleme halkasının takılı olduğunun teyidi Şekil 17 Operatör adının ve reaksiyon karışımının girilmesi Şekil 18 Genel tahlil parametrelerinin kontrolü Şekiller Çalışmayı başlatma Şekil 23 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/

28 Özetlemek için, döngü parametreleri aşağıdaki gibidir. Tablo 4. Döngü parametreleri Döngü Sıcaklık Süre Veri kazanımı 1 95 C 15 dakika Yok C 60 C 30 saniye 60 saniye Yok Yeşil ve sarı Özelliklerin tümü Rotor-Gene Q yazılım versiyonu a işaret ederler. Resimlerde, bu ayarlar kalın siyah içinde çerçevelenmişlerdir. 2. Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM ya da Rotor-Gene Q 5plex HRM cihaza bağlı laptop masa üstündeki Rotor-Gene Q Series Software yazılım ikonu üzerine çift tıklayın. 3. Rotor tipi olarak 72-Well Rotor seçin. Kilitleme halkasının takılı olduğunu teyit edin ve Locking Ring Attached kutusunu seçin. Next üzerine tıklayın (Şekil 17) Şekil 17. New Run Wizard iletişim kutusu 28 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012

29 4. Operatörün adını girin. Notları ekleyin ve reaksiyon volümünün 25 e ayarlanmış ve Sample Layout kutusunun 1, 2, 3... olduğunu kontrol edin. Next üzerine tıklayın (Şekil 18) Şekil 18. Operatör adının ve reaksiyon volümlerinin girilmesi. 5. New Run Wizard iletişim kutusu içinden Edit Profile butonuna tıklayın (Şekil 19) ve aşağıdaki aşamalara göre çalışma parametrelerini kontrol edin. 5 Döngü parametrelerini değiştirmeyin. therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/

30 1 Şekil 19. Profilin kontrol edilmesi. 6. Hold parametrelerinin doğru olup olmadığını kontrol edin (Şekil 20). 1 2 Şekil 20. Hold parametrelerinin kontrolü. 30 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012

31 7. Döngü parametrelerinin doğru olup olmadığını kontrol edin (Şekil 21) ve OK üzerine tıklayın Şekil 21. Döngü parametrelerinin kontrolü. 8. Next tıklayın. Summary kontrol edin (Şekil 22). 4 1 Şekil 22. Summary kontrolü. therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/

32 9. Çalışma dosyasını kaydetmek ve çalışmaya başlatmak için Start Run üzerine tıklayın (Şekil 23). 1 Şekil 23. Çalışmayı başlatma. 10. Çalışma başladıktan sonra yeni bir pencere görünür, buradan şimdi yeni numune adlarını girebilir ya da Finish tıklayabilir daha sonra bunları çalışma sırasında ya da çalışma tamamlandıktan sonra Sample butonunu seçerek bunları girebilirsiniz. Çalışma tamamlandıktan sonra, mutasyon analizi protokolüne göre verileri analiz edin ( BRAF ne bakınız, sayfa 34). 32 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012

33 Sonuçların Açıklaması Numune değerlendirme veri analizi Çalışma tamamlandıktan sonra, aşağıdaki prosedüre göre veriyi analiz edin. Yazılım analizi ayarları 1. Rotor-Gene Q serisi yazılımı ( ya da üstü) kullanarak uygun dosyayı açın. 2. Analysis üzerine tıklayın. Analysis sayfası üzerinde HEX kanalına görüntülemek için Cycling A. Yellow tıklayın. 3. dynamic tube ün belirlenmiş olduğunu kontrol edin. 4. Linear scale seçilmiş olduğunu kontrol edin. 5. Eşiğin 0.05 olarak ayarlanmış olduğunu kontrol edin. 6. elimination of cycles ın15 olarak ayarlandığını kontrol edin. 7. HEX C T değerlerini kontrol edin. 8. Analysis sayfasından FAM kanalını görüntülemek için, Cycling A. Green üzerine tıklayın. 9. dynamic tube ün belirlenmiş olduğunu kontrol edin. 10. Linear scale seçilmiş olduğunu kontrol edin. 11. Eşiğin 0.05 olarak ayarlanmış olduğunu kontrol edin. 12. elimination of cycles ın15 olarak ayarlandığını kontrol edin 13. FAM C T değerlerini kontrol edin. Çalışma tamamlandıktan sonra, aşağıdaki şekilde veriyi analiz edin. Negatif kontrol: Şablon kontaminasyonunun olmadığından emin olmak için, şablon olmayan kontrolün yeşil (FAM) kanalı içinde 40 altında bir C T değeri oluşturması gerekir. Plakanın doğru şekilde hazırlanmış olmasını sağlamak için, şablon olmayan kontrolün sarı (HEX) kanalında aralığında amplifikasyon göstermesi gerekir. Belirlenen değerler bu değerler içerisindedir ve bu değerleri içerirler. Pozitif kontrol: BRAF Positive Control (PC) aralığında bir kontrol tahlili C T (FAM kanalı) vermelidir. Belirlenen değerler bu değerlerin içindedirler ve onları da içerirler. Bu aralığın dışındaki bir değer bir kurulum problemi dolayısıyla bir çalışma başarısızlığını gösterir. Bu iki çalışma kontrolünden birisinin geçersiz olması durumunda numune verisi kullanılmamalıdır. Her iki çalışma kontrolünün de geçerli olması durumunda, her bir numune C T değeri yeşil kanal içinde aralığı içinde olmalıdır. Eğer numune bu aralığın dışında ise, aşağıdaki rehber verilmektedir. therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/

34 Numune kontrol tahlil C T <20.95: C T <20.95 değerindeki bir kontrole sahip numune seyreltilmelidir zira bu onaylanmış tahlil aralığının düşük ucunu temsil eder. Düşük bir seviyede her bir mutasyonu tespit etmek için, aşırı konsantre numuneler, yarı yarıya seyreltinin C T yi 1 derece artıracağı temeline dayalı olarak yukarıdaki değer aralığı içine düşürmek için seyreltilmelidir. Eğer numune e yakın ise, numune testi (BRAF mutasyon tespiti) çalışmasından bir sonuç elde etmek için seyrelti önerilir. Numuneler kit içinde sağlanan su kullanılarak (Water for Dilution [Dil.]) seyreltilmelidir. Numune kontrol tahlil C T >33.00: Numunenin yeniden ekstrakte edilmesi önerilir zira tahlil için belirtilen cutoff değerlerinde tüm mutasyonları tespit için yetersiz başlama DNA şablonu bulunacaktır. BRAF mutasyon tespiti veri analizi Çalışma tamamlandıktan sonra, aşağıdaki prosedüre göre veriyi analiz edin. Yazılım analizi ayarları 1. Rotor-Gene Q serisi yazılımı ( ya da üstü) kullanarak uygun dosyayı açın. 2. Analysis üzerine tıklayın. Analysis sayfası üzerinde HEX kanalına görüntülemek için Cycling A. Yellow tıklayın. 3. dynamic tube ün belirlenmiş olduğunu kontrol edin. 4. Linear scale seçilmiş olduğunu kontrol edin. 5. Eşiğin 0.05 olarak ayarlanmış olduğunu kontrol edin. 6. elimination of cycles ın15 olarak ayarlandığını kontrol edin. 7. HEX C T değerlerini kontrol edin. 8. Analysis sayfasından FAM kanalını görüntülemek için, Cycling A. Green üzerine tıklayın. 9. dynamic tube ün belirlenmiş olduğunu kontrol edin. 10. Linear scale seçilmiş olduğunu kontrol edin. 11. Eşiğin 0.05 olarak ayarlanmış olduğunu kontrol edin. 12. elimination of cycles ın15 olarak ayarlandığını kontrol edin. 13. FAM C T değerlerini kontrol edin. Çalışma kontrol analizi Şekil 24 deki çalışma kontrol analizi akış tablosuna başvurun. 34 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012

35 Şekil 24. Çalışma kontrol analizi akış grafiği. Çalışma kontrol analizi ile ilgili talimatlar için, sayfa ya bakın. Negatif kontrol: Reaksiyon karışımı kontaminasyonunun olmadığından emin olmak için, şablon olmayan kontrolün yeşil kanal içinde 40 altında bir CT değeri oluşturması gerekir. Plakanın doğru şekilde hazırlanmış olmasını sağlamak için, şablon olmayan kontrolün sarı kanalında aralığında amplifikasyon göstermesi gerekir. Belirlenen değerler bu değerler içerisindedir ve bu değerleri içerirler. Pozitif kontrol: BRAF Positive Control (PC) Her bir BRAF tahlili için yeşil kanalda Tablo 5 de gösterildiği şekilde bir C T değeri vermelidir. Belirlenen therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/

36 değerler bu değerlerin içindedirler ve onları da içerirler. Bu aralığın dışındaki bir değer bir kurulum problemi dolayısıyla bir çalışma başarısızlığını gösterir Not: Bu iki çalışma kontrolünden birisinin geçersiz olması durumunda numune verisi kullanılmamalıdır Tablo 5. Reaksiyon kontrolleri için kabul edilebilir C T aralığı. Reaksiyon karışımı Numune Kanal C T aralığı Control PC FAM V600E/Ec PC FAM V600D PC FAM V600K PC FAM V600R PC FAM Numune analizi Numune kontrolü FAM C T değeri Her iki çalışma kontrolünün de geçerli olması durumunda, her bir numune CT değeri yeşil kanal içinde aralığı içinde olmalıdır. Şekil 25 deki numune analizi akış grafiğine bakınız. Eğer numune bu aralığın dışında ise, aşağıdaki rehber verilmektedir Numune kontrol tahlili C T <20.95: C T <20.95 mutasyon tahlilini aşırı yükleyecektir ve seyreltilmelidir. Düşük bir seviyede her bir mutasyonu tespit etmek için, aşırı konsantre numuneler, yarı yarıya seyreltinin C T yi 1 derece artıracağı temeline dayalı olarak yukarıdaki değer aralığı içine düşürmek için seyreltilmelidir. Numuneler kit içinde sağlanan su kullanılarak (Water for Dilution [Dil.]) seyreltilmelidir. Numune kontrol tahlili C T >33.00: Çok düşük seviyedeki mutasyonlar tespit edilemeyebileceğinden açıklama dikkatle yapılmalıdır. 36 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012

37 Şekil 25. Numune analizi akış grafiği. Daha fazla bilgi için, sayfalar a bakınız. therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/

38 Numune analizi Numune dahili kontrol mutasyon tahlilleri HEX C T değeri Şekil 25 deki numune analizine bakınız. Her bir numunenin tüm hazneleri analiz edilmelidir. Her bir haznenin dahili kontrolden bir HEX sinyali üretmekte olduğunu kontrol edin. Olası 3 sonuç vardır. Eğer dahili kontrol C T belirlenen değer aralığı içine ( ) düşerse, HEX amplifikasyonu pozitiftir. Eğer dahili kontrol C T belirlenen değer aralığı üzerinde ise (>38.16), HEX amplifikasyonu negatiftir. Eğer dahili kontrol C T belirlenen aralığın altında ise (>32.53), bu geçersizdir. Eğer dahili kontrol PCR inhibisyonu nedeniyle başarısız olursa, numunenin seyreltilmesi inhibitörlerin etkisini azaltabilir ancak bunun aynı zamanda hedef DNA yı da seyrelteceği not edilmelidir. Kit içerisine bir tüp Water for Sample Dilution (Dil) dahil edilmiştir. Numune analizi Numune mutasyon tahlilleri FAM C T değeri 4 reaksiyon karışımının tümü için FAM değerleri Tablo 6 daki değerlere karşı kontrol edilmelidir. Tablo 6. Kabul edilebilir numune mutasyon reaksiyon değerleri (FAM)* Tahlil Kabul edilebilir C T aralığı C T aralığı V600E/Ec V600D V600K V600R * Kabul edilebilir değerler gösterilen değerler içindedirler ve onları içermektedir. Eğer FAM C T değerleri belirlenen aralık içine düşürse, bu FAM amplifikasyonu pozitiftir. Eğer FAM C T değeri belirlenen aralığın üzerinde ise ya da amplifikasyon yoksa bu FAM amplifikasyonu negatiftir. FAM amplifikasyonu pozitif olan her bir mutasyon tüpü için aşağıdaki şekilde C T değerini hesaplayın; mutasyon ve kontrol C T değerlerinin aynı numuneden olduğundan emin olun. C T = mutation C T control C T 38 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012

39 Söz konusu tahlil için (Tablo 6) numune C T değerini cutoff noktası ile karşılaştırın, her bir tahlili doğru cutoff noktası uygulandığından emin olun. Cutoff noktası, üzerinde wild-type DNA daki ARMS primerinin arka plan sinyali nedeniyle potansiyel olarak pozitif bir sinyalin olabileceği bir noktadır. Eğer numune C T değeri cutoff noktasından büyük ise, bu negatif olarak ya da kit algılama limiti üzerinde olarak sınıflandırılır. Her bir numune için, her mutasyon reaksiyonu, aşağıdaki kriterleri kullanarak mutasyon tespit edildi, mutasyon tespit edilmedi ya da geçersiz durumunu verecektir. Mutasyon tespit edildi: FAM amplifikasyonu pozitif ve C T değerleri cutoff değerinde ya da altında. Eğer çoklu mutasyonlar tespit edilmiş ise, mutasyon durumları Tablo ye göre belirlenmelidir. Tablo 7. Numune mutasyon durumlarının çağrılması V600E/Ec V600D V600K V600R Mutasyon durumları Pozitif Negatif Negatif Negatif V600E veya V600Ec pozitif Pozitif Negatif Pozitif Negatif V600Ec veya V600K pozitif Pozitif Pozitif Negatif Negatif V600D pozitif Negatif Pozitif Negatif Negatif V600D Pozitif Negatif Negatif Pozitif Negatif V600K Pozitif Negatif Negatif Negatif Pozitif V600R Pozitif Mutasyon tespit edildi: FAM amplifikasyonu pozitif ve C T değerleri cutoff değerinin üzerinde. FAM amplifikasyonu negatif ve HEX (dahili kontrol) amplifikasyonu pozitif. Geçersiz: HEX (dahili kontrol) geçersiz. FAM amplifikasyonu negatif ve HEX amplifikasyonu negatif. Daha fazla açıklama için, akış grafiğine bakın (Şekil 25). Eğer bir numune HEX amplifikasyonu bir tüp içerisinde negatif ancak FAM amplifikasyonu farklı bir tüp içinde pozitif ise, bu durumda farklı tüp içerisinde bir mutasyon detected sonucu hala geçerli olarak kabul edilebilir ancak tanımlanan belirli mutasyon güvenilir şekilde atanmayabilir. therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/

40 Eğer bir numune aynı tüp içinde HEX amplifikasyon negatif ve FAM amplifikasyon pozitif ise, o zaman mutation detected sonucu geçerli olarak kabul edilmelidir. Eğer bir tüp HEX (dahili kontrol) geçerli ise, bu tüpün sonucu kullanılmamalıdır. Numune analizi Numune mutasyon durumları Tüm mutasyon reaksiyon tüpleri değerlendirildiklerinde, numunenin mutasyon durumları aşağıdaki şekilde belirlenir. Mutasyon tespit edildi: Dört mutasyon reaksiyonunun birisi ya da daha fazlası pozitiftir. Eğer çoklu mutasyonlar tespit edilirse, mutasyon Tablo 7 ye göre rapor edilir. Mutasyon tespit edilmedi: Mutasyon reaksiyonlarının tümü negatiftir. Geçerli: Pozitif mutasyon reaksiyonu yoktur ve bir ya da daha fazla mutasyon reaksiyonu geçersizdir. Not: therascreen BRAF RGQ PCR Kit bir DNA numunesi içindeki BRAF geni mutasyonlarını tespit için tasarlanmıştır. Bir numune BRAF mutasyon tespit edildi olarak adlandırıldığında, yalnızca bir spesifik mutasyon rapor edilmelidir. Eğer çoklu mutasyonlar tespit edilirse, rapor edilen mutasyon Tablo 7 ye uygun olmalıdır. Mutasyon reaksiyonları arasında bazı çapraz reaksiyonlar oluşur. Örneğin, eğer bir V600D mutasyonu varsa V600E/Ec tahlili pozitif bir sonuç verebilir, eğer bir V600K mutasyonu mevcutsa V600E/Ec tahlili bir pozitif sonuç verebilir ve eğer bir V600E kompleks mutasyonu mevcutsa V600K tahlili bir pozitif sonuç verebilir. Bununla birlikte, Tablo 7 kullanılarak mutasyon durumları ayırt edilebilir. Çapraz reaksiyon birbirine benzer diğer mutasyonları tespit eden ARMS primerleri nedeniyle oluşur. Eğer ikinci bir mutasyon tahlili pozitif bir sonuç verirse, bunun çapraz reaksiyon olması olasıdır. Çok nadir olmalarına rağmen çift mutantlar gözlemlenmiştir. O nedenle, nadir vakalarda, pozitif sonuçların konbinasyonları tespit edilmeyebilirler ki bunlar Tablo 7 de verilmemişlerdir. Numune hala BRAF mutasyonu tespit edildi olarak adlandırılabilir. Ancak, çapraz reaksiyon nedeniyle, belirli bir mutasyon ayırt dilemez. O nedenle, numune yalnızca BRAF mutasyon tespit edildi olarak adlandırılır. Eğer bir ya da daha fazla mutasyon reaksiyonu geçersiz ancak bir ya da daha fazlası pozitif ise, numune hala BRAF mutasyon tespit edildi olarak adlandırılabilir zira bir mutasyon vardır. Ancak, rapor edilen spesifik mutasyon doğru olmayabilir ve çapraz reaksiyon sonucu olabilir. O nedenle, numune yalnızca BRAF mutasyon tespit edildi olarak adlandırılmalıdır. 40 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012

41 Verilerin yorumlanması için notlar Lineer amplifikasyon Tüm reaksiyonların Rotor-Gene Q grafikleri kontrol edilmelidir. Zaman zaman, NTC, negatif numuneler ve boş tüplerin içerisindeki floresan sinyalinde bir artış görülür. Eğer durum bu ise ve bir C T değeri elde edilmiş ise, kullanıcının NTC içerisinde kontaminasyonu gösterecek olan doğru bir amplifikasyon olayı ile bir floresan artifaktı nedeniyle yükselebilecek floresanda lineer bir artışı ayrıt edebilmesi gerekir. Boş tüpler içindeki lineer amplifikasyon bir floresan artifaktı yüzündendir. Boş tüplerin C T değeri o nedenle dikkate alınmamalıdır. NTC analizi Şekiller 26 ve 27 NTC numunelerinin iki davranışlarının iki örneğini gösterirler. Şekil 26 da, numune kontaminasyonu nedeniyle lineer olmayan (doğru) amplifikasyon görülür. Bu çalışma dikkate alınmamalı ve numuneler yeniden test edilmelidir. Şekil 27 de, NTC içinde lineer bir amplifikasyon görülür. Bu koşullar altında, ham floresan incelenmelidir. İlgili ham floresan grafiği şekil 28 de görülmektedir ve gerçek bir amplifikasyon vakasından ziyade floresanda lineer bir artışı göstermektedir. Bu çalışmanın verileri ancak pozitif ve dahili kontrollerin geçmesi durumunda kullanılabilir. Şekil 28 ile karşılaştırma için, Şekil 29 doğru amplifikasyonun yer aldığı ham floresan verisini gösterir. bu koşullar altında, veriler dikkate alınmamalı ve numuneler yeniden test edilmelidirler zira bu kontaminasyonun varlığını gösterir. Şekil 26. Analiz edilen bir çalışmada NTC içindeki kontaminasyon. Ok bir NTC tüpü içindeki kontaminasyonu gösteren omplifikasyonu göstermektedir. therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/

42 Şekil 27. Bir NTC tüpündeki floresanda lineer bir artış örneği. Ok bir NTC tüpü içinde floresandaki lineer bir artışı göstermektedir. Şekil 28. Şekil 27 nin ham floresanı. Ok bir NTC haznesindeki lineer amplifikasyonu göstermektedir. 42 therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012

43 Şekil 29. Doğru bir amplifikasyon vakası bulunan bir NTC tüpünü gösteren ham floresan verisi. Ok bir NTC haznesindeki kontaminasyonu göstermektedir. Tüm diğer hazneler kontaminant bulunmadığını göstermektedir. Numunelerin analizi Şekiller 30 ve 31 bir numune reaksiyonundaki iki amplifikasyon örneğini göstermektedir. Analiz edilen bir çalışmada bir numune tüpü içindeki gerçek bir amplifikasyon örneği Şekil 30 da görülmektedir. Eğer bir çalışma bu tür sigmamsı amplifikasyon eğrisi gösteriyorsa, bu gerçek bir amplifikasyondur ve bu çalışmanın verileri ancak pozitif ve dahili kontrollerin geçmesi durumunda kullanılabilir. Şekil 30. Analiz edilen bir çalışmada bir numune tüpündeki gerçek amplifikasyon. Ok gerçek amplifikasyonu gösteren grafiği göstermektedir. therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/