RIDASCREEN Biotin Makale No.: H 1601 R-Biopharm AG. Landwehrstr. 54, D 64293 Damstadt, Germany Tel: + 49 (0) 61 51 81 02-0 / Telefax + 49 (0) 61 51 81 02-20 1
RIDA SCREEN Biotin 1. Kullanım Amacı In vitro diyagnostik kullanım içindir. Bu enzim bağlama testi mikrotitre formatta, insan serumu, plazması ve idrarında biotin (Vitamin H) tespiti içindir. 2. Özet ve testin açıklaması Vitamin H olarakta bilinen Biotin organizmanın ve insan biyokimyası için çok önemlidir. Prostatik grubun mitokondiral enzimi (karbolayz) olan biotin CO2 taşıyıcısı olarak, amino asit metabolizması, yağ asiti sentezi, glikojenesiz gibi metabolik reaksiyonlarda rol oynar. Daha da ötesi, kan hücrelerinin, deri, saç ve tırnak büyümesi ve bakımında büyümesinde etkindir. Biotinin serbest formu, biotin lisine bağlanır, biositin olarak bilinir Enzim biotinaz olarak proteinden vitamin kaynağı olarak faydalanılır. Biotin metabolizmasında beslenme yetersizliği kadar kalıtsal bozuklukta da biotin eksikliği görülebilir. Daha da ötesi hayat boyunca, biotin ihtiyacının artması(hamilelik, emzirmek, atletik aktiviteler, patolojik durumlar) biotin bozukluğuna sebep olur.eksikliği saçta, deride, ve tırnaklardaki bozukluk biotin eksikliği ile ilişkilidir. Deutsche Gesellschaft für Ernahrung (DGE) ve American Recomended Dietary Allawances (RDA) günde 30 100 ug biatinin günlük diyette alınması tavsiye edilir. Plazmadaki normal seviyesi 200-1200 ng/l dir. Sağlıklı insanlarda optimum plazma konsantrasyonu 400mg/l dir. Biotin seviyesi günden güne % 100 değişebileceğinden 2-3 gün ardı ardına test yapılmalıdır. Sebep ne olursa olsun plazmadaki biotin seviyesi 100 ng/ l den düşük olması eksikliği gösterir. Bu durumda yerine konulması kesinlikle gerekir. 2
Eğer biotin dışarıdan alınırsa fazlası emilmez ve gaita ile atılır, halbuki biotinin emilen miktarı organizmanın saklama kapasitesini aşarsa idrarla elimine edilir. Kısaca biotin alımından sonra, plazmadaki plazma konsantrasyonu artar, ama 24 saat sonra ortalama değere ulaşır. Farmokolojik dozlarda (mg aralık), biotin epidermal hücreleri uyarır. Tüm keratinli yapılara saça, deri ve tırnaklara etki eder. Son çalışmalar, 300 ng/l yaşlı insanlarda biotine sahip gençler ve çocuklardan daha düşük biotin seviyesine sahip olduğu görülmüştür.optimal seviye 400-500 ng/l dir.tüm yaş gruplarındaki idrar biotin konsantrasyonu serum konsantrasyonunun 30-40 katıdır. Serum, idrar ve plazma için ELISA ile yapılan kantitatif test, izotop dilüsyon testinden ve bilinen mikrobiyolojik dilüsyon testden daha hızlı ve kolaydır.gerekli dilüsyon yapıldıktan sonra numunelere direk olarak çalışılır. 3. Test Prensibi Testin temeli avidinin yüksek çekimine dayanır, mikroorganizmalar tarafından üretilen protein. Numuneler, biotin standartları ve enzimle işaretlenmiş biotin eklenir. Serbest biotin ve enzimle etiketlenmiş biotin avidin bağlı yerler ile yarışır.bağlanmamış enzim etiktli biotin yıkama adımı ile uzaklaştırılır.substrat(üre peroksidaz) ve kromojen ( Tetramethylbenzidine) ilavesi ile tespit edilir.konjugat avidine bağlanır, renksiz kromojen mavi renkli son ürüne dönüşür.stop solüsyonunun eklenmesi ile mavi renk sarıya dönüşür.ölçüm 450 nm de yapılır( Referans filre > 600) Numunenin biotin konsantrasyonu absorbans ile ters orantılıdır. 3
4. Sağlanan Reaktifler Reaktif paketinde 96 teste yetecek kadar reaktif mevcuttur. ( 5 standart dahil) Tablo 1 İçerik Mikrotitre Pleyt 96 test Strip tutucuda 12 mikrokuyucuklu strip, avidin kaplı Dilüsyon Solüsyonu 50 ml NaCl solüsyonu(ph 7.4), kullanıma hazır,%0.1 Kathon CG ve %0.1 Tween 20 içerir. Yıkama solüsyonu Tuz 1 L distile suya PBS (10mM, ph 7.4) ; 0.05 Tween 20 içerir. Standart 1 0 ppm Standart 2 37 ppm Standart 3 111 ppm Standart 4 333 ppm Standart 5 1000ppm Kontrol serum Siyah kapak 1.2 ml Biotinsiz sıvı solüsyon, kullanıma hazır; Kathon CG <% 0.1 ve Tween 20 < %0.1 içerir. 1.2 ml 37 ng/l Biotin içerir, Kathon CG <% 0.1 ve Tween 20 < %0.1 içerir. 1.2 ml 111 ng/l Biotin içerir, Kathon CG <% 0.1 ve Tween 20 < %0.1 içerir. 1.2 ml 333 ng/l Biotin içerir, Kathon CG <% 0.1 ve Tween 20 < %0.1 içerir. 1.2ml 1000 ng/l Biotin içerir, Kathon CG <% 0.1 ve Tween 20 < %0.1 içerir. 1.2 ml Dilüe edilmiş insan serumu, kullanıma hazır; Biotin konsantrasyonu kitteki ektedir.(sarı Not) Kathon CG <% 0.1 ve Tween 20 < %0.1 içerir. Konjugat 1.5 ml Biotinlenmiş peroksidaz (11x kons); stabilize protein solüsyonu; 10 ppm proklin, %0.01 methylisothiazolinone, % 0.01 bromonitrodioxane Substrat 7ml Üre Peroksidaz, kullanıma hazır. Yeşil Kapak Kromojen 7ml Tetramethylbenzidine, kullanıma hazır Mavi Kapak Stop solüsyonu 14 ml 1 N sülfirik asit, kullanıma hazır. 4
5. Saklama Gereklilikleri Tüm reaktifler 2 8 C de saklanabilir ve etiketin üzerinde basılı tarih kadar kullanılabilir. Dilüe edilen yıkama solüsyonu 2 8 C de saklanır. Maksimum 4 hafta kullanılabilir.mikrobiyal kontaminasyon mutlaka önlenmelidir. Miadı geçtikten sonra kalite garantisi geçerli değildir. Alüminyum çanta kilidinden açılmalı, kilit yırtılmamalı. Kullanılmayan kuyucular çantanın içine geri konulmalıdır ve 2 8 C de saklanmalıdır. Renksiz kromojen, bozulmasını engellemek için, direk olarak gün ışığından korunarak saklanmalıdır. Reaktifler kontaminasyondan sakınarak kullanımalıdır. 6. Gereken materyaller fakat sağlanmayanlar 6.1 Reaktifler - Distile veya deiyonize su 6.2 Aksesuarlar - Test tüpleri - Mikropipetler ( 10-100ul ve 100 1000 ul kapasiteli) - Vorteks mikser - Mikropipet 50-100 l ve 1 ml hacim çekebilenµ - Mezür (1000 ml) - Saat - Mikropleyt yıkayıcı (300 µl) - Mikropleyt okuyucu (450 nm ve referans filtre 600 nm ) - Filtre kağıdı (laboratuvar havlusu) - %0.5 hipoklorit solüsyonu içeren atı kabı - Kalibrasyon eğrisi için semi logaritmik grafik kağıdı. Alternatif olarak RIDA SOFT Win (Art No 9999) 7. Kullanıcılar için önlemler Sadece in vitro diyagnostik kullanım içindir. Mutlaka eğitimli bir personel tarafından kullanılmalıdır.medikal laboratuvar çalışanları için olan rehber takip edilmeli ve talimatlara tamamen uyulmalıdır. 5
Kontrol serumu HIV, HbsAg, HCV-Ab ye karşı test edilmiştir. Yine de enfekte mataryel olarak davranılmalı ve ulusal güvenlik kurallarına uyarak kullanılmalıdır. Numuneler ya da reaktifler ağız ile pipetlememeli ve yaralı deriyle, mukoz membran ile teması önlemelidir. Numuneler, eldiven giyilerek çalışılmalı ve test bittiği zaman eller yıkanmalıdır. Numuneler veya reaktifler ile çalışırken sigara içmeyiniz, yemek yiyip içmeyiniz. Üre peroksidaz yanmaya sebep olur.dikkatli kullanınız. Stop reaktifi 1 N H2SO4 içerir. Elbise ve deri ile temasından kaçının. Temas ederse bol su ile yıkayın. Tüm reaktifler ve metaryeller enfekte bir malzemeye dönüşür. Aynı numuneler davranıldığı gibi uygun bir dezenfektan ile dezenfekte edilmelidir.(örn: Sodyum hipoklorit) ya da 121 C de en az bir saat otoklavda bekletiniz. Tüm reaktifler ve metaryeller enfekte bir malzemeye dönüşür. Aynı numuneler davranıldığı gibi uygun bir dezenfektan ile dezenfekte edilmelidir.(örn: Sodyum hipoklorit) ya da 121 C de en az bir saat otoklavda bekletiniz. DİKKAT: Zehirli gazların oluşmasını önlemek için, stop solüsyonu içeren her sıvıya hipo klorit eklemeden önce nötralize edilmelidir. 8. Numune toplama ve saklama Bu test serum,plazma ve idrar numunelerini çalışmak için uygundur. Test taze numuneler ile çalışılmalıdır. Numuneler 48 saat 2-8 C de saklanabilir. Daha uzun saklamalar için serum, plazma ve idrar numuneleri -20 C de dondurulmalıdır.tekrar tekrar dondurup çözmeden ve mikrobiyal kontaminasyon sakınılmalıdır. Isı-inaktive edilmiş,lipemik, Hemolitik, ihterik ya da bulanık numuneler ile çalışmak yanlış sonuçlara sebep olabilir. 6
9.Test Prosedürü 9.1. Genel bilgi Tüm reaktifler ve mikropleyt Pleyt kullanmadan önce oda sıcaklığına getirilmeli (20 25 C) Kuyucuklar oda sıcaklığına gelene kadar alüminyum çantadan çıkarılmamalıdır.reaktifler kullanılmadan önce karıştırılmalıdır.kit kullanıldıktan hemen sonra kullanılmayan kuyucuklar ve reaktifler 2 8 C de saklanmalıdır. Gerekli hacim kadar reaktifi kaba alınız. Kalan reaktifleri reaktif kutularının içine atmayınız.kontaminasyona sebep olabilirsiniz. Kullanılan sonra hemen kuyucuklar tekrar kullanılmamalıdır.zarar görmüş paketteki malzemeler kullanılmamalıdır. EIA testleri sıcaklığa, inkübasyon süresine tam doğru pipetlemeye ve ayıkma adımını doğru olarak yapılmasına dayanır.inkübasyon süresi boyunca direk gün ışığından sakınınız.üzerinin kapatılması tavsiye edilir. 9.2. Konjugat hazırlama Konjugat konsantre formda gelir.dilüe edile konjugatın sınırlı miadı olduğu için yetecek kadar hazırlanır.pipetleme yapmadan önce şişeyi karıştırınız.dilüsyon yapmadan önce dilüsyon bufer ile 1:11 oranında dilüe edilmelidir. Tablo 2 Kullanıma hazır konjugat hazırlama Stripler Konjugat(Konsantre) Dilüsyon bufer 2 100ul 1ml 4 200ul 2ml 6 300ul 3ml 8 400ul 4ml 10 500ul 5ml 12 600ul 6ml 7
9.3 Yıkama Bufer Hazırlama Tuz ile birlikte tüm içerik 1000ml distile su içinde çözülür.2-8 C de saklanırsa 4 hafta kullanılabilir. 9.4 Numune Hazırlama Serum ve plazma numunelerine 1:3 dilüsyon hazırlanır.temiz ve bakterial kontaminasyondan uzak olmalıdır. İdrar numuneleri 1:21 dilüsyon ile dilüe edilir. Örn: 100 ul serum + 200ul bufer (1:3) 10ul ul idrar + 200ul bufer (1: 21) Not: Kontrol serumu değeri lota göre değişir.diğer lotlardaki test kitleri ile kullanılmamalıdır. Standartlar ve kontrol serumları kullanıma hazırdır dilüe edilmemelidir. 9.5 İlk İnkübasyon Çerçeveye yeteri kadar kuyucuk konur 50ul standart, kontrol serum ve numuneler pipetlenir.oda ısısında 20 25 C de 30 dk inkübe edilir.daha iyi Presizyon için çift çalışma önerilir. 9.6 İkinci İnkübasyon Kuyucuklara 50ul dilüe edilen konjugat pipetlenir. 30 dakika oda ısısısında inkübe edilir. 9.7 Yıkama Yıkamada tamamen direktiflere uymak doğru sonuç elde etmek için çok önemlidir. Kuyucuklarda inkübe edilen madde mutlaka dezenfeksiyon için hipoklorit içeren atık kabına atılmalıdır. Bundan sonra, kalan damlaları için emici bir kağıt üzerinde vurarak alınız.bundan sonra her seferinde 250 µl olmak üzere, yıkama bufer ile 3 defa yıkayınız.her yıkamadan sonra her yıkamadan sonra, emici kağıda vurarak kalan damlalar emdirilir.mikropleyt yıkayıcı kullanılırsa cihaz kuyucuklara uygun bir şekilde ayarlanmalıdır.yıkamadan sonra kalan nem emici bir havluya vurularak alınır. 9.8 Üçüncü İnkübasyon 50ul substrat ve kromojen her kuyucuğa eklenir. Yavaşça karıştırın oda ısısında karanlıkta 30 dk inkübe ediniz. İnkübasyondan sonra, reaksiyonu durdurmak için her 8
kuyucuğa 100 ul stop reaktifi ekleyiniz. 450nm de absorbansı okuyunuz (Opsiyonel : referans filtre 600nm) Stop reaktifi eklendikten 60 dk sonra okuma yapınız. 10. Kalite kontrol- stabilitenin bozulmasının belirtisi ya da bozulma Kalite kontrol için kontrol serumu her çalışmada kullanılmamalıdır.test eğer doğru çalışılırsa ekteki sarı kağıtta yazan biotin konsantrasyonunda olmalıdır. 2SD standart deviasyon tolere edilebilir.daha da ötesi ortalama standart 1 OD 450 nm de 0.6 dan büyük olmalıdır. Eğer değerler gerekenden farklı ise, kromojen bulanık ve kuyucuklara eklemeden maviye dönüşmüş ise reaktifin eskidiğine işaret edebilir. 11. Yorumlama ve Değerlendirme 11.1 Biotin Konsantrasyonu Hesaplama Çift çalışılan OD lerin ortalaması hesaplanır.daha sonra standart (2-5), kontrol ve numune değerleri standart 1 (sıfır standart ) değerine bölünür ve 100 ile çarpılır.zero standart zero % 100 e eşittir ve absorbans değerleri yüzde olarak aktarılır. % OD= OD standart (2-5) ya da numune x 100 OD standart 1 Hesaplanan standartların %OD değerleri ile konsantrasyonları semi logaritmik grafik kağıtı üzerinde belirlenip grafik çizilir.kalibrasyon grafiği standart 2-4 görsel olarak lineer olmalı.dilüe edilen numunelerin biotin konsantrasyonu kalibrasyon eğrisinden okunabilir.daha sonra dilüsyon faktörü ile çarpılır. 11.2 Test Sonucu Biotin Konsantrasyonu Yorumlama < 100 ng/l Tedavi gerektiren biotin eksikliği 100-250 Suboptimal biotin yeterliliği >250 ng/l Biotin yeterli miktarda 9
12 Metot Limitleri Biotin seviyesi günden güne % 100 değişkenlik gösterdiği için gerçek biotin eksikliğini bulmak için 2-3 günlük periyotta bakılmalı. Bu prosedür biotin terapisi (ağızdan alma terapisi) boyunca kontrol olarak takip edilmeli. Kısaca, biotin tabletleri alındıktan sonra, plazmada biotin konsantrasyonu birkaç kez yükselir. Böylece, numuneler aynı perhiz ve eşit koşullarda iken alınmalı. 13. Performans Karakterleri Normal biotin plazma seviyesi 200 1200 ng/l arasındadır.sağlıklı insanlarda optimum plazma seviyesi 400ng/l dir.eliza ile ölçülen değerler bu aralığın içindedir.friedrich-schiller Jena Üniversitesindeki çalışmalar yaşa bağlı olarak ölçülen biotin seviyesini gösterdi. Çocuklarda ve gençlerde 400ng/l den yüksek bulundu. Yaşlı kişilerdeki sonuçlar ise anlamlı bir şekilde daha düşük olarak 270ng/l nin altında görüldü. Tablo 4 : Yaşa bağlı olrak Biotin konsantrasyonu(helbich- Endermann, 1999 atfen) Plazma Biotin konsantrasyonu Çocuklar 420 ±230 n=20; 13-14 yaş Yetişkinler 460 ±380 n=35; 21-35 yaş Yaşlılar 270 ±100 n=33 ; RIDASCREEN Biotin tstinin çapraz reaksiyon verdiği benzer yapıda olan maddeler araştırıldı.biositin hariç( protein bağlı biotin), biotine benzer anlamlı bir çapraz reaksiyon görülmedi. 10
Tablo 5: Çapraz reacksiyon (Helbich Endermann, 1999) Madde % Çapraz reaksiyon Biotin 100 Biocytin 83 Biotin-d-sulfoxid 34.7 Biotin-I-sulfoxid * 24.5 Biotinsulfon 28.2 bisnorbiotin 5.5 Biotin-I-sulfoxid % 3.3 biotin ile kontamine olur.biotin-i-sulfoxid olarak ölçülemez. Test sonuçlarının tekrar üretebilirlik araştırması intra ve inter test olarak tespit edildi. Tablo 6: Inter test değişimi Inter test değişimi OD VK Serum 1 0.181 %8.8 Serum 2 1.215 % 7.3 Serum 3 1.439 %7.5 Tablo 7 :Intra test değişimi (n= 24) Intra test değişimi OD VK Serum 1 0.193 % 6.4 Serum 2 1.215 % 5.7 Serum 3 1.439 %5.6 11
12
13