EGE ÜNĐVERSĐTESĐ FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ (DOKTORA TEZĐ)

EGE ÜNĐVERSĐTESĐ FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ (DOKTORA TEZĐ) ASMA ( Vitis vinifera L. ) da GENOM HARĐTALAMASI: ÖNEMLĐ MORFOLOJĐK KARAKTERLERE VE FUNGAL KÖKENLĐ HASTALIKLARA YÖNELĐK AFLP ve SSR LĐNKAGE GRUPLARININ OLUŞTURULMASI Zir.Yük.Müh. Burçak ĐŞÇĐ Bilim Dalı Kodu: 501. 01. 02 Sunuş Tarihi: 02. 03. 2007 Tez Danışmanı: Prof. Dr. Ahmet ALTINDĐŞLĐ Bornova- ĐZMĐR

III Sayın Burçak ĐŞÇĐ tarafından DOKTORA TEZĐ olarak sunulan Asma ( Vitis vinifera L. ) da Genom Haritalaması: Önemli Morfolojik Karakterlere ve Fungal Kökenli Hastalıklara Yönelik AFLP ve SSSR Linkage Gruplarının Oluşturulması başlıklı bu çalışma E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Eğitim ve Öğretim Yönetmeliği ile E.Ü. Fen Bilimleri, Enstitüsü Eğitim ve Öğretim Yönergesi nin ilgili hükümleri uyarınca tarafımızdan değerlendirilerek savunmaya değer bulunmuş ve 02 / 03 / 2007 tarihinde yapılan tez savunma sınavında aday oybirliği ile başarılı bulunmuştur. Jüri Üyeleri: Jüri Başkanı: Prof.Dr.Ahmet ALTINDĐŞLĐ Üye: Prof. Dr. Gökhan SÖYLEMEZOĞLU Üye: Prof.Dr. Sebahattin ÖZCAN Üye: Doç.Dr. Sacide PEHLĐVAN Üye: Doç.Dr. Serdar KARA

V ÖZET ASMA (Vitis vinifera L.) da GENOM HARĐTALAMASI: ÖNEMLĐ MORFOLOJĐK KARAKTERLERE VE FUNGAL KÖKENLĐ HASTALIKLARA YÖNELĐK AFLP VE SSR LĐNKAGE GRUPLARININ OLUŞTURULMASI ĐŞÇĐ, Burçak Doktora Tezi, Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı Tez Yöneticisi: Prof.Dr. Ahmet ALTINDĐŞLĐ Mart 2007, 211 Sayfa Bu araştırmada, Melezleme Yoluyla Külleme ve Mildiyö ye Dayanıklı ve Standart Özelliklere Sahip Yeni Üzüm Çeşitlerinin Elde Edilmesi konulu, Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü nce yürütülen proje (Proje Kod No: Tagem/IY/96/06/04/013) kapsamında 1992-1993 yılında Italia ve Mercan üzüm çeşitlerinin melezlenmesi yoluyla geliştirilen F 1 lerin genom haritasının çıkarılması amaçlanmıştır. Çalışmada kodominant markörlerden SSR (Simple Sequence Repeats) ve dominant markörlerden AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) den faydalanılmıştır. Genom haritalaması için çift yönlü yalancı melez tekniği kullanılmıştır. Çalışmada, hastalıklara dayanım ve diğer morfolojik özellikler bakımından açılım gösteren F 1 popülasyonundan seçilen 60 adet F 1

bitkisi ile melezleme için kullanılan Đtalia ve Mercan üzüm çeşitleri analiz edilmiştir. Elde edilen amplifikasyon ürünleri SSR için gümüş boyama, AFLP için radyoaktif işaretleme sonucunda var ve yok şeklinde değerlendirildikten sonra χ 2 testleri sonucunda 1:1 ve 3.1 dağılım gösteren polimorfik lokuslar tespit edilmiştir. Haritalamanın yapılmasında Mapmaker/Exp 3.0 paket programında 3.0 LOD değeri kullanılmıştır. Ana ve babaya ait 2 ayrı genetik bağlantı haritası bulunmuştur. Harita anaya ait 6, babaya ait 1 bağlantı grubu içermektedir. Bağlantı gruplarına yerleşen lokusların incelenen hastalıklara dayanım ve morfolojik karakterlere olan bağlantıları regresyon ve varyans analizleri yapılarak belirlenmiştir. Anahtar sözcükler: Vitis vinifera L., asma, SSR, AFLP, haritalama

VII ABSTRACT GENOME MAPPING IN GRAPE (Vitis vinifera L.): ESTABLISHMENT OF AFLP AND SSR LĐNKAGE GROUPS TOWARDS TO SIGNIFICANT MORPHOLOGICAL CHARACTERS AND FUNGAL DISEASES ĐŞÇĐ, Burçak PhD. In, Horticulture Supervisor: Prof.Dr. Ahmet ALTINDĐŞLĐ March 2007, 211 pages This research aims establishment of genome map for F 1 s developed by means of crossbreeding of Italia and Mercan grape varieties in 1992 and 1993, within the scope of project carried out by Tekirdağ Viniculture Research Institute entitled Producing New Grape Types with Standart Specifications and Resistant against Downy Mildew and Powdery Mildew, by Means of Crossbreedding Method (Project Code No. Tagem/ IY/96/06/04/013). The study used co-dominant marker SSR (Simple Sequence Repeats) and dominant marker AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). Double-pseusotestcross mapping technique has been used for genome mapping. The study analyzed 60 F 1 plant selected from

F 1 population as well as Italia and Mercan grape varieties used for crossbreeding, ranging with regards to resistance diseases and other morphological characteristics. Amplification products have been evaluated as available and not available at the end of silver staining for SSR and radioactive marking for AFLP; polymorphic loci were determined ranging between 1:1 and 3:1 at the end of χ 2 tests. 3.0 LOD value was used in Mapmaker/Exp 3.0 package program for mapping 2 separate genetic linkage maps have been observed in female and male parents. The map included 6 linkage groups for female parent and 1 linkage group for male parent. Resistance of the loci, as settled on linkage groups, against socalled diseases, and their linkage to morphological characters have been analyzed an determined. Key words: Vitis vinifera L., grape, SSR, AFLP, mapping

IX TEŞEKKÜR Değerli fikirlerinden hep yararlandığım Sayın Hocam Prof. Dr. Ahmet ALTINDĐŞLĐ ye, doktora çalışmamı maddi olarak destekleyen eş danışmanım Sayın Prof. Dr. Gökhan SÖYLEMEZOĞLU (A.Ü.Z. F. Bahçe Bitkileri Bölümü) na; Çalışmamın başlangıcından itibaren her aşamasında büyük desteğini gördüğüm, benden ilgisini ve bilgisini esirgemeyen Sayın Hocam Doç.Dr. Ali ERGÜL (A.Ü. Biyoteknoloji Enstitüsü) e; Yardıma ihtiyaç duyduğumda hep yanımda olan Arkadaşım Dr. Zeliha YAŞA GÖKBAYRAK (18 Mart Ü.Z.F. Bahçe Bitkileri Bölümü) ve Sayın Tekniker Mehmet TÜRKOĞLU (A.Ü.Z.F.Bahçe Bitkileri Bölümü) na; Tez izleme komitemde yer alan Prof. Dr. Đbrahim KISMALI (E.Ü.Z.F.Bahçe Bitkileri Bölümü) ya; Tez jürimde yer alan, çok değerli hocalarım Prof. Dr. Sebahattin ÖZCAN (A.Ü.Z. F. Tarla Bitkileri Bölümü), Doç.Dr.Sacide PEHLĐVAN (Gaziantep Ü.Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji A.B.D.) ve Doç.Dr. Serdar KARA (E.Ü.Z.F.Bahçe Bitkileri Bölümü) ya; Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri ve Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü öğretim üyeleri, öğretim elemanları ve personeline, Hayat kaynağım sevgili annem Nermin ĐŞÇĐ ve babam Dursun ĐŞÇĐ ye yaşamımın her aşamasında bana göstermiş oldukları sevgi ve anlayış için TEŞEKKÜR EDERĐM

XI ĐÇĐNDEKĐLER SAYFA NO ÖZET...V ABSTRACT...VII TEŞEKKÜR...IX ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ...XIII ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ...XV KISALTMALAR VE SĐMGELER DĐZĐNĐ...XVII 1. GĐRĐŞ...1 2. ÖNCEKĐ ÇALIŞMALAR...10 2.1. Genetik markör tipleri...20 2.2. Asmada genom haritası...28 3. MATERYAL VE METOT...65 3.1. Materyal...65 3.2. Metot...87 3.2.1.DNA ekstraksiyonu (izolasyonu)...88 3.2.2. PCR Uygulaması...93 3.2.3. SSR tekniği...102 3.2.4. AFLP tekniği...106

ĐÇĐNDEKĐLER (devam) 3.3. Moleküler bağlantı analizi ve kantitatif karakter lokus (QTL) haritalama...112 3.4. Kantitatif karakter analizi...113 4. BULGULAR...114 4.1. Fenotipik analiz...114 4.2. Moleküler analiz...124 4.3. Genetik bağlantı analizi...133 4.4. Kalitatif karakter analizi...142 5. TARTIŞMA VE SONUÇ...146 KAYNAKLAR...157 EKLER...180 ÖZGEÇMĐŞ...211

XIII ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ Şekil Sayfa No 2.1. Bir genetik harita hazırlığında genel olarak takip edilen yöntem ve ıslah çalışmaları ile entegrasyonu...17-18 3.1. Đtalia üzüm çeşidi (Ana)...67 3.2. Mercan üzüm çeşidi (Baba)...68 3.1. AFLP tekniğinin şematik gösterimi...99-100 4.1. Agaroz jel (%1.5) de Italia x Mercan populasyonunda elde edilen DNA ların görüntüleri...129 4.2. Mercan üzüm çeşidine (baba ebeveyn) ait bağlantı grubu...136 4.3. Italia üzüm çeşidine (ana ebeveyn) ait bağlantı grupları...137

XV ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ Çizelge Sayfa No 2.2. Moleküler markörlerin genel özelliklerinin ve kullanımlarının karşılaştırılması...26-27 3.1. Çalışmada kullanılan SSR primerlerine ait bilgiler...95-96 3.2. Çalışmada kullanılan AFLP primerlerine ait bilgiler...101 3.3. AFLP primer kombinasyonları...102 3.4. SSR tekniği için PCR çoğaltma öğeleri konsantrasyon ve miktarları...104 3.5. Primerlerin PCR daki döngü koşulları...104 3.6. AFLP tekniği için PCR çoğaltma öğeleri konsantrasyon ve miktarları...109-110 4.1. Italia x Mercan populasyonunda yapılan morfolojik ve hastalıklara dayanım özeliklerine yönelik analiz sonuçları...117-122 4.2. Italia x Mercan populasyonunda incelenen fenotipik özelliklere ait istatistiksel değerlendirmeler...123-124 4.3. Italia, Mercan ve Italia x Mercan F 1 lerine ait DNA ların saflık ve miktar değerleri...126-128 4.4. Primerler lokusları hakkında bilgi...131-132 4.5. Açılım gösteren lokuslar hakkında bilgi...133

ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ (devam) 4.6. Italia x Mercan a ait genetik haritaların karşılaştırılması...138 4.7. Italia çeşidinde bağlantı gruplarına yerleşen markörler ve uzaklıkları...140 4.8. Mercan çeşidinde bağlantı grubuna yerleşen markörler ve uzunlukları...140 4.9. Italia ve Mercan çeşitlerinde bağlantı analizi sonuçları...141 4.10. Binary lojistik regresyon analizi sonuçları...143-144 4.11. Hastalığa dayanım karakterleri sonuçları...145

KISALTMALAR VE SĐMGELER DĐZĐNĐ AFLP :Amplified Fragment Length Polymorphism (Çoğaltılan parça uzunluğu farklılığı) ANOVA :Varyans Analizi BC :Backcross bp :Base pair (Baz çifti) cm :Santi Morgan CTAB :Hekzadesil Trimetil-Amonyum Bromür DNA :Deoksiribo Nükleik Asit dntp :Deoksi-Nüklezid Trifosfat EDTA :Etilen Diamine Tetra Asetik Asit LOD :Maximum Likelihood Odds Value M :Mol MAS :Marker Assited Selection MgCl2 :Magnezyum Klorür mm :Milimol NIL :Nearly Isogenic Lines µl :Mikrolitre PCR :Polymerase Chain Reaction (Polimeraz zincir reaksiyonu) PVP :Polyvinylpyrrolidone RAPD :Random Amplified Polymorphism DNA (Rastgele çoğaltılmış DNA farklılığı) RFLP :Restriction Fragment Length Polymorphism (Kesilmiş parça uzunluğu farklılığı)

KISALTMALAR VE SĐMGELER DĐZĐNĐ (devam) RNase rpm OIV SSR TBE TE :Ribonükleaz :Dakikadaki dönüş sayısı :Organisation Internationale de la Vigne et du Vin. :Simple Sequence Repeats (Basit dizi tekrarları) :Tris-Borik Asit-EDTA Çözeltisi :Tris-EDTAÇözeltisi

1 1. GĐRĐŞ Sağlıklı asma (Vitis vinifera L.) yetiştirme ve değişik amaçlara göre kaliteli üzüm elde etme sanatı olan bağcılık ileri bir tarım uygarlığının göstergesidir. Asma kültürü tahıl kültürü kadar tarım biliminin eski bir uğraş alanı olmuştur. Dünya üzerinde asma bitkisinin görülmesi ve bağcılıkla uğraşan ülkelerde asma kültürünün gelişmesinin prehistorik devirlere rastladığı bilinmektedir (Fidan, 1985). Asma bitkisinin yetiştiriciliği Kuzey Yarımkürede 20-52. ve Güney Yarımkürede 20-40. enlem dereceleri içindeki ülkelerde ekonomik olarak gerçekleştirilmektedir. Ülkemiz, bu enlem dereceleri arasında yer alan dünyanın en elverişli iklim kuşağında yer alması nedeniyle; asmanın gen merkezi ve ilk kültüre alındığı coğrafyanın merkezi konumundadır. Küçük Asya olarak ifade edilen Türkiye, çok köklü bir bağcılık kültürü ile zengin bir asma gen potansiyeline sahiptir. Anadolu da asmanın en önemli türü olan Vitis vinifera L. (2n=38) ile bağcılık ve şarapçılığın M.Ö. 6000-5000 yıllarından beri yapılmakta olduğu bilinmektedir.

2 Yapılan arkeolojik kazılar ve çeşitli tarihi belgelerden elde edilen sonuçlar ışığında Anadolu da Nevali Çori (ĐÖ 8400-8200) ve diğeri Canhasan III (Karaman Canhasan köyü) olan Neolitik her iki iskanda sadece yabani üzüm çekirdekleri tespit edilirken; Neolitik dönemin ardından Kalkolitik dönemde (ĐÖ 4800-3000) iskan görmüş höyük kazılarında (Korucutepe-Elazığ-Aşağı Đçme köyü; Kurbanhöyük- Şanlıurfa-Cümcüme köyü; Oylumhöyük-Kilis-Oylum köyü) ele geçen üzüm çekirdeklerinin çoğunluğu yaban asma ürünü olmalarına karşın, Hassekhöyük te (Şanlıurfa-Siverek-Yukarı Tillakin köyü) asmanın kültüre alındığını gösteren üzüm çekirdekleri bulunduğu belirlenmiştir (Doğer, 2004). Tarihin her devrinde birçok medeniyete beşiklik vazifesi görmüş olan Anadolu da asmanın meyvesi olan üzüm halkın beslenmesinde ve toplumsal yaşamında önemli bir yer almıştır. Üzümün çok farklı şekillerde değerlendirilebilir olması da bunda önemli bir etkendir. Üzüm, yaş sofralık olarak tüketiminin yanı sıra kurutularak da değerlendirilmekte; ayrıca; şarap, pekmez, sirke gibi ürünlerin elde edilmesi içinde kullanılmaktadır.

3 Asmanın çok yüksek adaptasyon yeteneğine sahip olması nedeniyle ülkemizde diğer birçok kültür bitkisini yetiştirilemediği iklim ve toprak koşullarında yetiştirilmekte, böylece bu yörelerdeki toprakların değerlendirilmesine de olanak sağlamaktadır (Kısmalı, 1995). Dünya üzerinde çok farklı iklim koşullarına adapte olabilmiş olan asmanın yüksek oranda ve sürekli olarak yabancı döllenmesi sonucunda ortaya çıkan heterozigotik kalıtsal yapı tohumdan elde edilen fertler arasında büyük genetik farklılık ortaya çıkmasına neden olmuştur. Türlerin çoğaltılmasında vegetatif yöntemler benimsenmiş ve kökeni çok eski tarihlere dayanan çeşitlerin günümüze kadar korunması bu şekilde sağlanmıştır. Türkiye, kültür asması (Vitis vinifera L.) ve bağcılık kültürünün anavatanı olması nedeniyle zengin bir gen potansiyeline sahiptir. Dünyada 30.000 civarında isimlendirilmiş üzüm çeşidi bulunduğu bilinmektedir. Bunlardan 15.000 inin genotipik olarak farklı olabileceği düşünülmektedir (Allewerdt and Possingham, 1988). Tarım ve Köyişleri Bakanlığınca yapılan çeşit belirleme çalışmalarında ülkemizde 1200 üzüm çeşidi veya tipinin mevcut olduğu belirtilmektedir. Fakat bunlardan bir kısmının aynı isim altındaki farklı çeşitler olabileceği

4 gibi, aynı çeşide farklı isimler verilmiş olmasının da yüksek bir olasılık olduğu bilinmektedir. Aynı zamanda yıllardır yetiştiriciliği yapılan çeşitlerin bir kısmında meydana gelen mutasyonlarda, çeşitli değişikliklerin meydana gelmesine yol açar. Binlerce yıldır insanlar farklı kıtalara göç etmektedirler. Bu sırada yanlarında götürdükleri asma bitkisinin çoğu, uzun zaman içinde gerçek isimlerini kaybetmiş ve orijin bölgelerinden çok farklı isimlerle anılır olmuştur. Doğal seleksiyonla ortaya çıkmış bireylerin korunması, bunlardan daha üstün özellikleri taşıyanların ortaya çıkarılması, ya da istenen özelliklerin bir bitkide toplanması ancak belirli ıslah yöntemlerini uygulamakla elde edilebilir. Çok eski çağlardan beri diğer kültür bitkilerinde olduğu gibi, bağcılıkta da ıslah çalışmaları; yazılı belgelere göre ilk olarak Columella tarafından gerçekleştirilmiştir. M.Ö. 50 yıllarında Columella asmalarda üretimin daima en iyi omcalardan çubuk alınarak yapılması gerektiği fikrini savunmuş ve uygulamalarında bu şekilde yapılmasını önermiştir. Bu nedenle Columella bugünkü seleksiyon ıslahının temelini atan kişi olarak tanımlanabilir (Gülcan ve Đlter, 1975).

5 Asma ıslah çalışmaları, başlangıçta filokseraya yüksek düzeyde dayanımlı, geniş adaptasyon yeteneğine sahip ve Vitis vinifera L. ile iyi uyuşan, yüksek oranda köklenen Amerikan türlerini belirlemek ve bu türler arasında amaca en uygun olanlarını seçmek veya bu türler arasında ve bu türlerle Vitis vinifera L. arasında melezlemeler yapmak suretiyle istenilen karakterlerin kombine edildiği yeni asma anaçları elde etmek amacıyla gerçekleştirilmiştir. Külleme, mildiyö ve kurşuni küfe dayanıklı ve vinifera nın verim ve kalite özelliklerini taşıyan çeşitlerin elde edilmesi konularına öncelik verilerek başlatılmış olan çalışma konularına zaman içerisinde ek olarak verimin arttırılması, kalitenin yükseltilmesi, erkenci ve geçci çeşitlerin elde edilmesi, kuraklık ve soğuk gibi stres koşullarına dayanıklılık konularında yeni çeşitler elde etmeyi amaçlayan çalışmalarda eklenmiştir. Bunun yanında günümüzde tüketici taleplerindeki değişime paralel olarak, daha üstün nitelikli yeni çekirdeksiz sofralık üzüm çeşitlerinin elde edilmesi günümüz ıslah programlarının başlıca hedefini oluşturmaktadır. 1924 yılında Fransa da başladığı kabul edilen melezleme yoluyla yeni çeşit ıslah çalışmaları, 1940 lardan sonra ağırlıklı olarak yeni

6 sofralık, kısmen de şaraplık üzüm çeşitlerinin ıslahına yönelik olarak hız kazanmış ve bu çalışmaların sonucunda değişik ülkelerden elde edilen onlarca yeni çeşidin eklenmesiyle hem dünyanın, hem de ülkemizin asma gen potansiyeli daha da zenginleşmiştir. Günümüzde standartlar arasında yer alan ve üretimi yapılan üzüm çeşitlerinin çoğu tabi popülasyon içerisinden asma bitkisini kültüre alanlar tarafından seçilmiş ve sonraki nesillere belirli yönde ıslah edilerek aktarılmış çeşitlerdir. Günümüze kadar ulaşan çeşitlerin bir kısmı kontrollü melezlemelerle elde edilirken büyük bir kısmı da seleksiyonlar sonucunda elde edilmiştir. Asmalarda istenilen özelliklere yönelik çeşitlerin geliştirilmesi uygun ebeveynlerin melezlenerek elde edilecek F 1 popülasyonlarından yapılan seleksiyonlara dayanmaktadır. Geleneksel ıslah çalışmaları oldukça uzun ve yoğun bir emek gerektirmektedir. Asmanın bazı çok yıllık meyve türlerine göre daha kısa (3-5 yıl) gençlik kısırlığı (yenice safhası) na sahip olmasına rağmen seleksiyon işlemi F 1 bitkilerinin fenotipleri ve genotipleri arasındaki korelasyonun kurulmasındaki

7 belirsizlik nedeniyle ilk yıllarda yapılamamaktadır (Reisch et al., 1994). Islahın seleksiyon kriterlerini oluşturan verim, kalite, çekirdeksizlik, olgunlaşma zamanı, tane rengi, salkım şekli, anacın gelişme kuvveti, abiotik ve biotik stres koşullarına dayanıklılığın belirlenmesi gibi özelliklerin tespiti uzun yıllar almaktadır. Amaca uygun F 1 lerin seleksiyonunun uzun yıllar alması, melezleme ıslahının en önemli dezavantajını oluşturmaktadır. Kendileme depresyonu, somatik mutasyonlar ve himeyreler bu süreçte karşılaşılan diğer problemler arasında gösterilmektedir. Uygun genetik stokların eksikliği ve asma genomu hakkındaki bilgilerin sınırlı olması da asmanın melezleme ıslahı çalışmalarında en önemli problemleri arasındadır. Bu olumsuz koşulları en aza indiren yeni tekniklerin ıslah çalışmalarında kullanılmaya başlamasıyla; biyoteknolojinin yarattığı olanakların asma ıslahında kullanılmaya başlaması ile birlikte, günümüzde çok daha kısa sürede etkin sonuçlar alınabilmekte ve böylece ıslah kavramı önemli bir değişim süreci içerisine girmektedir. Bu doktora çalışmasında, Melezleme Tekniği Đle Külleme ve Mildiyöye Dayanıklı Standart Özelliklere Sahip Yeni Üzüm Çeşitlerinin

8 Elde Edilmesi konulu ülkesel proje kapsamında Italia x Mercan çeşitlerinin melezlenmesinden elde edilen F 1 popülasyondan seçilen bireyler kullanılarak, 35 adet vegetatif ve generatif karakter ile Külleme (Uncinula necator), Mildiyö (Plasmopara viticola) ve Kurşuni Küf (Botrytis cinerea Pers.) gibi hastalıklara dayanım özelliklerini içeren asmanın genom haritasının çıkartılması amaçlanmıştır. aracılığıyla; Çalışma sonucunda ortaya çıkartılacak genom haritası a) Asma genomunu daha iyi tanımayı sağlayacak moleküler markörlerin geliştirilmesi, b) Moleküler markörlerin 38 adet vejetatif ve generatif karakterle, külleme, mildiyö ve kurşuni küf gibi hastalıklara dayanım özelliklerini kontrol eden gen/genlere bağlanması, c) Araştırmada incelenecek olan kalitatif ve kantitatif özellikleri kontrol eden gen / bölgelerin kromozom üzerindeki muhtemel yerlerinin belirlenmesi ile

9 d) Genom haritasının çıkarılmasından sonra, asma ıslah çalışmalarında çok erken dönemlerde arzu edilen özelliğe göre seleksiyon imkanı sağlayacak markörlerin tespiti bu markörlerin dünyanın herhangi bir yerinde oluşturulan F 1 populasyonlarında da denenmesi suretiyle, genom haritalarının birbirine bağlanması amaçlanmıştır.

10 2. ÖNCEKĐ ÇALIŞMALAR Asma (Vitis vinifera L.), Rhamnales takımına bağlı, dünya üzerinde yetiştiriciliği yapılan en eski türler içinde, son derece köklü bir kültüre sahiptir. Rhamnales takımın üç familyasından yalnızca Vitacea familyasına ait bitkiler, bilinen anlamda asmaları tanımlamaktadır. Kültür asmalarının tümü Vitis cinsine aittir. Vitis cinsi, kromozom sayısı 2n=38 olan Euvitis ve 40 olan Muscadinia diye adlandırılan iki seksiyondan (alt cins) oluşmaktadır. Euvitis, ürününden yararlanılan ve anaç olarak kullanılan 50 dolayında tür ile bu türlere ait binlerce varyete ve kültür çeşidine sahiptir (Winkler et al.,1974). Büyük Rus bitki genetikçisi N.I.Vavilov, tarım bitkilerinin yabanıl akrabalarının tarımı geliştirecek genlerin kaynağı olduğunu ileri sürmüştür. Maksimum varyabilitenin, gen merkezinde bulunduğunu; bundan uzaklaştıkça varyabilite ve dominant gen sayısının azaldığını bildirmiştir. Hastalık ve zararlılara karşı dayanıklılığın, Amerikan asmalarında ise filoksera ve mildiyöye karşı dayanıklılığın, belirli bölgelerde bulunabileceğini ileri sürmektedir (Demir ve Turgut, 1999).

11 Vavilov, sayısız üzüm varyasyonunun bulunuşundan dolayı, asmanın anavatanı olarak Güney Kafkasya ve Kuzey Doğu Anadolu yu kabul etmektedir (Fidan, 1985; McGovern et al., 1996; Fatahi et al.,2003). Asma (Vitis vinifera L.) dünyada yetiştiriciliği yapılan kültür bitkileri içinde üretim hacmiyle ilk sıralarda yer almaktadır. Ekonomik anlamda bağcılık, dünyada Kuzey Yarımkürede 20-52. ve Güney Yarımkürede 20-40. enlem dereceleri içindeki ılıman iklim kuşağı ülkelerinde gerçekleştirilmektedir (Kısmalı, 1980). Asmanın meyvesi olan üzümden elde edilen ürünlerin çeşitliliği ve zenginliği (sofralık, şarap, kurutmalık, meyve suyu, pekmez, köfter vb.) üretim alanlarının bu denli büyük olmasına ve asma üzerinde çok fazla araştırma yapılmasına sebep olmuştur (Ağaoğlu, 1999). Yüksek oranda heterozigotik kalıtsal yapıya sahip olan asmada türlerin çoğaltılmasında vegetatif yöntemler kullanılmaktadır; kökeni çok eski tarihlere dayanan çeşitlerin günümüze kadar korunmaları bu şekilde sağlanmıştır. Floksera zararlısının tüm dünya topraklarına yayılmasıyla

12 birlikte bu bulaşık yerlerde eski bağcılık yapılamaması nedeniyle, farklı toprak tiplerine uygun anaç elde etmek, verimli melezler yetiştirmek için, melezleme yoluna başvurulmuştur. Çok çeşitli hastalık etmenlerinin giderek yaygınlaşmasıyla; mevcut genetik potansiyel üzerinde ıslah çalışmalarının başlaması zorunluluğu ortaya çıkmıştır. Tüm bitkilerde olduğu gibi asma ıslahında amaç, verimi arttırmak, kaliteyi yükseltmek, asmanın genetik yapısını insanların gereksinimlerini karşılayacak biçimde değiştirmek ve iyileştirmek; yani hastalık ve zararlılar ile çevre koşullarına dayanıklılık elde etmektir. Üzümlere erkencilik kazandırmak ve ya bahsi geçen pek çok özelliğin hepsini bir araya toplamak, ayrıca bir bölgedeki dejenere olmuş ya da hastalıklı bir çeşidi saflaştırmakta ıslah çalışmalarının amaçlarından olabilir. Son yıllarda ıslah programlarında çok iri ve kaliteli çekirdeksiz çeşitlerin elde edilmesi hedeflenmiştir. Moleküler markör sistemlerini temel alan haritalama çalışmalarıyla çekirdeksiz üzüm çeşitlerinin erken seleksiyonu için çalışılmaktadır (Meredith, 2001). Ayrıca don, yüksek

13 kireç ile bor, ağır metal toksitesi gibi abiyotik stres kaynaklarından meydana gelen problemlerinin çözümünde genetik kontrol mekanizmalarının açığa çıkarılması yeni çalışma konularını oluşturmaktadır. Vegetatif yolla çoğaltılma, asmada ıslah çalışmalarının genellikle klon seleksiyonu yöntemiyle yapılabilmesini olası kılmaktadır. Asmada bazı durumlarda varyasyon yaratma zorunluluğu doğmakta ve kombinasyon ıslahı, mutasyon ıslahı, türlerarası melezleme ıslahı, poliploidi ıslahı yöntemlerine de başvurulmaktadır (Gülcan ve Đlter, 1975). Çeşit geliştirmede ele alınan karakterlerin nesilden nesile aktarılan karakterler olması yani kalıtsal özellik göstermesi gerekmektedir. Bütün canlılarda hayatsal olayların şifresinin taşındığı DNA bir hücrenin kontrol merkezi ve ya kütüphanesi olarak tanımlanırken; DNA bir canlının fenotipi, metabolik yetenekleri, makromoleküler bileşenleri ve morfolojik değişikliklerini tayin etmektedir (Hartl, 1994).

14 Lodhi (1994), Vitis türleri, çeşitleri ve diğer Vitis cinsleri arasında DNA kapsamını belirlemek amacıyla gerçekleştirdiği bir çalışmada, Vitis türleri arasında istatistik öneme sahip olmayan farklılıklar bulmuştur. Vitis türlerinin ortalama kromozom büyüklüğünün 0.85-1.07 m arasında olduğunu ifade etmektedir. Asma (Vitis vinifera L.), 483 Mbp/1C DNA lık bir genoma sahiptir (Arumuganathan and Earle, 1991). Asmanın toplam genomik DNA kapsamının bilinmesi, evrimsel ilişkiler kurmak, genom haritalamak ve ekolojik veya çevresel adaptasyon çalışmaları ile gen klonlamak açısından önemlidir. Son 20 yılda biyokimya alanındaki gelişmeler, tarımsal uygulamalarda DNA teknolojisinin kullanımı ile gelişen tarımsal biyoteknoloji, bitki biyolojisi; yetiştiricilik ve ıslahı ile ilgili çalışan pek çok araştırmacı için yeni ve oldukça geniş bir çalışma alanı oluşturmuştur. Yapılan ilk çalışmalarda, enzimlerin (izoenzimler) veya depo proteinlerinin markör olarak kullanılabileceği ortaya konulurken;

15 daha sonra DNA nın kendisinin doğrudan markör olarak kullanılma fikri ortaya çıkmıştır. Kalıtım şekilleri, morfolojik (çiçek rengi gibi), biyokimyasal (izoenzimler gibi) ve DNA düzeyinde (moleküler markörler) izlenebilen karakterlere genetik markörler ismi verilir. DNA markörleri, teorik olarak genomun her noktasını temsil etme yeteneğine sahiptirler ve sonsuz sayıdadırlar. Bu karakterlerin markör (işaret) olarak isimlendirilmelerinin nedeni, çalışılan organizmadaki ilgilenilen diğer özelliklerin genetiği hakkında, dolaylı da olsa, bilgi sağlamalarıdır. Moleküler markörler DNA nın aktif bölgelerinden (genler) veya herhangi bir genetik kodlama fonksiyonuna sahip olmayan DNA dizilerinden geliştirilebilirler. Moleküler markörlerin dünyada ve ülkemizde kullanım alanlarının başında bitki tür ve çeşitlerinin genetik olarak ismine doğruluğunun araştırılması çalışmaları gelmektedir. Markörlerin en etkili kullanıldığı alan ise karmaşık kalıtıma sahip olan ve birden çok gen tarafından idare edilen kantitatif karakterlerin ıslahı olmuştur. Şekil

16 2.1 de bir genetik harita hazırlığında genel olarak takip edilen yöntem ve ıslah çalışmaları ile entegrasyonu görülmektedir. entegrasyonu; Moleküler DNA markörleri tekniklerinin bitki ıslahına 1.) Arzulanan genlerin çeşitler veya türler arasındaki hareketini hızlandırmış, 2.) Akraba yabani türlerden yeni genlerin aktarılmasına izin vermiş, 3.) Çok gen tarafından idare edilen karmaşık karakterlerin analizini mümkün kılmış, 4.) Genlerin klonlanması çalışmalarını kolaylaştırarak hızlandırmış ve 5.) Birbiriyle çaprazlanamayan bitkiler arasındaki genetik ilişkileri açığa çıkarmıştır.

17 Şekil 2.1. Bir genetik harita hazırlığında genel olarak takip edilen yöntem ve ıslah çalışmaları ile entegrasyonu. PROBLEMĐN TANIMLANMASI Karakterlerin önem derecesi Zorluk/gözlem masrafı Stratejik avantajı MOLEKÜLER ÇEŞĐTLĐLĐK ANAÇ SEÇĐMĐ FENOTĐPĐK FARKLILIKLAR Đzoenzim, RFLP ler ve RAPD ler için test etmek Đlgilenilen bölgeleri veya tüm genomu yaklaşık 20 cm sıklıkta Anaçlar arasında belirgin zıtlıklar (dayanıklılık veya hassaslık gibi) Karakterlerin doğru kapsayan denetlenebilir ölçümünde tarla moleküler polimorfizmler metodolojisinin kullanımı Diğer karakterler AÇILIM POPÜLASYONLARI Geri melez Katlanmış haploid F 2, F 3 aileleri Rekombinant kendilenmiş hatlar (RKH)

18 Şekil 2.1.devam GENOTĐPĐK TANIMLAMA FENOTĐPĐK Đzoenzimler, RFLP ler, DEĞERLENDĐRME RAPD ler ve diğer markörlerde bilinen farklılıkların tespiti için açılım popülasyonundaki tüm Karakterlerin tekrarlamalı sera ve tarla denemelerinde ölçülmesi bireylerin test edilmesi ĐSTATĐSTĐKĐ KORELASYONLAR MAPMAKER, JOINMAP, LINKAGE ANOVA, MAPMAKER QTL, QTL Stat DENEMELERĐN ĐSPATI Denemelerin farklı germplasm içeren melezlemelerde tekrarlanması ISLAH UYGULAMALARI Markör Yardımıyla Seleksiyon (MYS) Tekrarlanan genom seleksiyonu Tek parça transferleri Farklı QTL seleksiyonu Đstenmeyen gen aktarımının (linkage drag) önlenmesi veya azaltılması Kaynak: Özcan ve ark., (2001).

19 Kantitatif özellikleri kontrol eden genleri taşıyan bölgeler kantitatif özellik gen bölgeleri (quantitative trait loci, QTL) olarak adlandırılır. Genetik yada moleküler markörler kullanılarak QTL lerin yerlerini belirlemek ve genom içinde dağılımını ortaya çıkarmak ve haritalamak mümkündür. Tarımsal önemi olan kalıtımsal özellikler için QTL lerin yerlerinin tayini seçilimin etkinliğini arttırır ve bu süreç, gelecekteki genetik manipülasyonlara (yönlü değişikliklere) ve organizmalar arasında gen transferlerine kapı açar. Moleküler markörların bulunması ve onlardan türetilen kromozom haritaları, kantitatif özelliklerin genetik kontrolüne ve onun parçalara ayrılmasına olanak sağlamıştır. Kantitatif özellikler çok sayıdaki genden etkilendiği için, genetikçiler bu genlerin genom içerisinde nerede olduklarını bilmek isterler. Uygun bir populasyonda QTL (Kantitatif Özellik Lokus) analizi olarak bilinen yöntemin uygulanmasıyla, belirli kromozom bölgesindeki ilgili genlerin yerleri saptanabilir, etkilerinin büyüklüğü tahmin edilebilinir, gen etkisinin eklemeli veya dominant olup olmadığı belirlenebilir. Üstün çeşitleri elde

20 etmek için ıslah programlarındaki genlerin düzenlenmesinde bunlar başlangıç adımlarıdır (Asins, 2002). 2.1.Genetik markör tipleri Protein ya da DNA'da bulunan polimorfizme dayanan "moleküler markörler"in geliştirilmesi; taksonomi, filojeni, ekoloji, genetik ve bitki ıslahında araştırmaları büyük oranda kolaylaştırmıştır. Genom haritalarının hazırlanmasında DNA nın temel alınması; kalıtım bilgisinin elde edilmesinde markörler açısından sınırsız bir potansiyel kaynak olması; haritalar üzerindeki spesifik bazı markörlerin fonksiyonel genlerin kendisi olmasından ötürü, doğrudan belirli genlere ulaşmayı temin etmesi gibi iki önemli avantaj sağlamaktadır. Markörler 3 ana başlık altında toplanmaktadırlar. 1.) Morfolojik markörler; analizlerinin kolay olmasına rağmen sayılarının az oluşu, çevre ve diğer lokuslardan etkilenmeleri nedeniyle fazlaca kullanılmazlar.

21 2.) Protein markörleri; çevreden ve diğer lokuslardan etkilenmezler, çabuk güvenilir ve tekrarlanabilirdirler; fakat çok az sayıdadırlar. 3.) DNA markörleri; farklı geneotiplere ait DNA nükleik asit diziliş farklılığını çeşitli şekillerde ortaya koyarlar. Đki alt grup altında incelenirler; 3.1.) DNA melezleme markörleri 3.1.1.) RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 3.2.) Polimeraz zincir reaksiyonuna dayanan markör teknikleri 3.2.1.) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 3.2.2.) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 3.2.3.) STS (Sequence-Tagged Sites) 3.2.4.) SSR (Simple Sequence Repeat) 3.2.5. SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions)

22 3.2.6. ASAP (Allele Spesific Associated Primers) 3.2.7. SPAR (Single Primer Amplification Reaction) Bir moleküler markörde aşağıda belirtilen özelliklerin olması istenir: 1. Yüksek derecede polimorfik davranış, 2. Kodominant kalıtım, 3. Genomda sıkça bulunma, 4. Genomda düzgün dağılım, 5. Seçici nötr davranış (pleitropik etkisi yok), 6. Kolay ulaşım (satın alma veya hızlı işlemler sonucunda), 7. Kolay ve hızlı değerlendirme (otomasyona uygun işlemle), 8. Yüksek tekrarlanabilirlik, 9. Laboratuvarlar arası kolay veri alışverişi (Tanskley, 1993, Weising et al., 1995). Çizelge 2.2 de Moleküler markörlerin genel özelliklerinin ve kullanımlarının karşılaştırılması görülmektedir.

23 Bitki ıslahında DNA markör sistemimin seçimi; araştırmanın amacına, populasyonun yapısına, çalışılan türün genomik çeşitliliğine, markör sisteminin bulunma durumuna, DNA ekstraksiyonun süresi, analiz için gerekli DNA miktarı, klonlama ve dizi belirlemesinin gerekliliği, elde edilen genetik bilginin potansiyel kullanım düzeyi, genetik bilgi tipi, allel varyasyonunun açıklanma durumu (dominantkodominant), elektroforez sisteminin otomasyonu, genetik haritaların kullanım potansiyeli ve tekniğin uygunluğu, analiz için gerekli zaman ve birim maliyetine bağlı olarak değişir (Staub et al., 1996). Bu çalışmada kodominant markörler olan SSR ve dominant markör olan AFLP kullanılmıştır. SSR (Simple Sequence Repeat) ökaryotik genomlar boyunca dağılmış, tekrarlı nükleotid dizileridir (1-6 nükleotid). Yüksek yapılı bitkilerin genomlarında çok yaygın olarak bulunurlar. Bitki genomlarında yüksek oranda polimorfizm gösterirler. Teknik olarak hızlı ve kolaydırlar. Bu markörlar kullanılarak elde edilen polimorfizm, çoğaltılmış bölgedeki tekrarlı nükleotid dizilerinin sayısındaki farklılıktan kaynaklanır. SSR ları çevreleyen korunmuş DNA dizileri

24 primer olarak kullanılarak PCR metodu vasıtasıyla bir lokustaki farklı alleller tespit edilebilinir (Öner, 2003). SSR markörler asma ıslahında; Vitis cinsinde evrimsel gelişimin moleküler analizi, Vitis vinifera L. çeşitlerinin ve Amerikan asma anaçlarına ait gen kaynaklarının belirlenmesi, çeşitler, ekotipler, klonlar, melezleme sonucu elde edilen çeşitlerin tanımlanması ile sinonim ve homonimlerin tespit edilmesi, orijin belirleme, melezleme ıslahında hibrit bitki tanısı, pedigri analizi ve genetik haritalama ile markör yardımı ile seleksiyon gibi değişik amaçlara yönelik olarak kullanılmaktadır (Karaağaç, 2006). SSR markörler genetik haritalamalar için en ideal markörlerdir, şu ana kadar 600 dan daha fazla asmaya ait mikrosatellit markör tespit edilmiştir ( Riaz et al., 2004; Adam-Blondon et al., 2004). AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Restriksiyon enzimleri ile kesilmiş olan DNA nın selektif amplifikasyonudur. Genomik DNA ilk önce birisi altı, diğeri dört taban tanıyan iki kesim enzimi tarafından kesilir. Kesilen bu parçaların uçlarına nükleotid dizilişi sentetik olan DNA lar eklenir. Eklenen sentetik DNA nın nükleotid

25 dizilişinide taşıyan başlatıcı DNA lar kullanılarak spesifik DNA çoğaltımı sağlanır. Üretilen parçacıklar bir baz uzunluğu farklılığını bile ayırt edebilen poliakriamid jel üzerinde dizilendirilir. DNA'nın poliakrilamid jelde analizi genellikle örnek başına 50-100 band verir. Minimum primer testi ile çok sayıda markör üretmesi ve yüksek çözünürlüğü, bu teknolojiyi genetik markör olarak çekici kılmaktadır. Tekrar edilebilirliği ve polimorfizm oranı yüksektir. RAPD ve RFLP tekniklerinin kombinasyonu olan bir uygulamadır (Özcan ve ark., 2001). AFLP markörler asma ıslahında; gen kaynaklarının belirlenmesi, çeşitler, klonlar, melezleme sonucu elde edilen çeşitlerin tanımlanması, genetik haritalama ile markör yardımı ile seleksiyon gibi değişik amaçlara yönelik olarak kullanılmaktadır. Her bir markör sistemi avantaj ve dezavantajlara sahiptir ve bu nedenle kullanım potansiyeli değerlendirmek çok önemlidir. Çalışmada kullanılan SSR ve AFLP markör sistemleri QTL, MAS ve karşılaştırmalı haritalamada en etkin olarak kullanılan markör sistemleridir.

26 26 Çizelge2.2. Moleküler markörlerin genel özelliklerinin ve kullanımlarının karşılaştırılması. RFLPS RAPD DAF STS (CAPS) SSRS AFLP SAMPLS REMAP SNPS PRENSĐP Endonükleaz kesimleme, sothern blot hibiridizasyonu Tesadüfi primerler ile DNA amplifikasyonu Tesadüfi primerler ile DNA aplifikasyonu Saptanan polimorfizm tipi Baz değişikliği Baz değişikliği Baz değişikliği PCR ürünlerinin endonükleaz kesimlemesi Baz değişikliği Spesifik primerler kullanılarak basit dizi tekrarlarının aplifikasyonu Tekrarlı dizilerin uzunluğunda değişiklik Endonükleaz kesimleme, adaptör kullanımı ve selektif primerler AFLP ile aynı işaretlenen primer, SSR kombinasyonudur. Her iki/bir retrotransposon ve 1 SSR primeri kullanılarak DNA amplifikasyonu Baz değişikliği Baz değişikliği Uzunlukta değişim Dizi bilgi ihtiyacı Hayır Hayır Hayır Evet Evet Hayır Hayır Evet Evet Saptama metodu Evet/Hayır Hayır Evet/Hayır Evet/Hayır Evet/Hayır Evet/Hayır Evet/Hayır Hayır Hayır (radyoizotop) Dizi analizi Tek baz değişikliği Üretkenlik Yüksek Düşük Düşük Yüksek Yüksek Yüksek Yüksek Yüksek Yüksek Saptanan lokus sayısı 1-5 1-10 20-30 1-4 1-3 >70 50 3-5 1 (biallelik) Kalıtım Kodominant Dominant Dominant Kodominant Kodominant Genellikle dominant Teknik zorluk Dominant/kodominant Kodominant Dominant Orta Düşük Orta Düşük Düşük Orta/yüksek Orta/yüksek orta Orta/yüksek

27 27 Çizelge2.2.devam RFLPS RAPD DAF STS (CAPS) SSRS AFLP SAMPLS REMAP SNPS Otomasyon mümkünlüğü _ + + + + + + Komputasyon mümkünlüğü + + + ++ +++ +++ +++ +++ +++ Maliyet Orta Düşük Orta Orta/yüksek Başlangıçta yüksek Yüksek Yüksek Düşük Yüksek Çeşit tanımlama ile genetik çeşitlilik + ++ ++ + +++ +++ +++ ++ ++ Kullanım:1. çeşit tanımlama ile genetik + ++ ++ + +++ +++ +++ ++ ++ 2. kantitatif gen etiketleme ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ + + 3. QTL haritalama ++ + ++ ++ ++ _ + 4. MAS + _/+ _ ++ ++ ++ ++ + ++ Karşılaştırmalı haritalama ++ + _ ++ ++ ++ ++ _ ++ Kaynak. Gupta et al., (2002).

28 2.2. Asmada genom haritası Asma çok yıllık bir bitkidir ve yabancı tozlanma görülür. Diğer çok yıllık bitkilere göre daha kısa gençlik kısırlığı dönemine sahip olmalarına rağmen, ürün alabilmek için 2-5 yıllık bir sürenin geçmesi gerekir. Asmalarda seleksiyon, fide döneminin erken aşamalarında fenotip ve genotip arasındaki belirsizliği nedeniyle yapılamamaktadır. Kendilenme depresyonu ve somatik mutasyonlar ile himeyrelerin görülmesi gibi problemlerede sahip olan asmada bu problemi aşmanın en etkin yolu; moleküler markörler kullanarak çevresel varyansı azaltmak suretiyle kalıtım derecesini araştırmaktır. Asmada çeşit geliştirme uygun ebeveynleri melezleyerek F 1 eldesini gerektirir. Ebeveynler yüksek oranda heterozigottur. Bu sebeple döller de heterozigottur. Döl bazı lokuslarda bir F 2 gibi davranırken (3:1) bazı lokuslarda ise bir geri melezleme populasyonu (1:1) gibi davranır. Üstün özellikli genotiplerin seçimi bu tür populasyonlarda yapılır.

29 Bitki boyu, çiçeklenme zamanı, kardeşlenme, verim ve verim unsurları, kalite, bazı hastalık zararlılara karşı dayanıklılık gibi birçok karakter kantitatif olarak idare edilmektedirler. Kantitatif özellikler çok sayıdaki genden etkilenmektedirler. Bu genlerin genom içerisinde nerede olduklarını bilmek bitki ıslahı çalışmaları açısından oldukça önemlidir. Son yıllarda DNA markörlerinin geliştirilip ıslahta kullanılması ile birlikte güçlü biyometrik metodların varlığı, bitkilerde QTL haritalamada önemli gelişmelere yol açmıştır (Asins, 2002). Kantitatif karakterlerin bir den fazla lokustaki genler (QTL) tarafından idare edilmeleri, her bir lokusun etki derecesinin farklı olması ve çevre şartlarından fazla etkilenmeleri nedeniyle klasik metodlarla ıslah çalışmalarında belirlenmeleri ve aktarılmaları oldukça zor ve uzun yıllar gerektiren bir olaydır. Oysa moleküler markörler ile yapılan detaylı genetik haritalar sayesinde özellikle katlanmış haploid ve rekombinant kendilenmiş hatlar gibi homozigot popülasyonların farklı çevre şartlarında yetiştirilmeleri sonucu her bir lokusun etki derecesi belirlenebilmiş ve bu lokusların 10-30 cm (Paterson et al., 1988; Lander and Botstein, 1989) gibi bir aralığa sahip muhtemel yerleri

30 kromozomlar üzerinde tespit edilmiştir. Sonuçta QTL ler gibi karmaşık karakterlerin başarılı şekilde transferleri ve etki derecelerinin belirlenmesi moleküler markörler sayesinde nispeten daha kolay bir şekilde gerçekleşmiştir (Özcan ve ark., 2001). QTL analizinin en belirgin uygulamaları ıslah ve ıslah öncesi çalışmalar ile QTL klonlamada markörler aracılığıyla seleksiyondur. QTL analizinin temel amacı, QTL i dar kromozomal bölgelere yerleştirmektir. Bu amaçla deneme şeklinin, açılım populasyonunun tipinin, büyüklüğünün, sayısının, DNA markörlerinin bilgi sağlama düzeyi ile polimorfikliği, bağlantı haritasının kurulması ve QTL analizinin yapılması için istatistiksel metodolojilerin hepsinin birlikte değerlendirilmesi gerekir. Başarı, bilginin sağlandığı QTL analizinin güvenilirliği ve doğruluğuna dayanır. (Asins, 2002). QTL haritalaması için bir popülasyonun geliştirilmesi için ilgili özelliği işaret edilen; farklılıkları gösteren iki ebeveyn hat melezlenir. Daha sonra ilgili özellikler için açılma gösteren hatlar veya teksel bitkilerin bir setini elde etmek için uygun bir tarzda döllerin ilerletilmesi

31 sağlanır. Örneğin, hastalıklara hassas ile hastalıklara dayanıklı bir hattın melezlenmesi gibi; tipik bir QTL popülasyonu, her birinin hem fenotipik özellik ve hem de moleküler markörler için değerlendirmesi yapılan 100 ile 300 hat veya bireyden oluşmaktadır. Eğer daha önce üzerinde çalışılmamış bir organizmanın ilk genetik haritasının yapılması amaçlanıyorsa, F 2 ve geri melez popülasyonları geniş aralıklara sahip markörlerle bu amaca kolayca hizmet ederler. Eğer detaylı bir genetik haritada yakın bulunan markörlerin sırası ve mesafeleri belirlenmek isteniyorsa F 2 ler arası melezlemeler (intemated) yoluyla üretilmiş popülasyonlar en uygun tercihtir. Çevreden fazlaca etkilenen kompleks yapıya sahip fenotiplerin genetik analizinde ise rekombinant kendilenmiş ve katlanmış haploid popülasyonlar tekrarlanabilir araştırmalara fırsat tanımaları ve genetik olmayan faktörlerin veri üzerindeki etkilerini en aza indirmeleri nedeniyle idealdirler. Genotipler arasında fenotipik özelliğin farklı olması yanında, bir haritalama popülasyonunun ebeveynlerinde, kromozomal

32 rekombinasyonun izlenebilmesi için genotipik düzeyde yeterli derecede polimorfik olması gereklidir. Bazı kültürü yapılan bitkilerde nispeten az genetik polimorfizm mevcuttur. Bu durumlarda, kültürü yapılan bir çeşit, polimorfizm seviyesini arttırmak için yabani akrabalarıyla melezlenebilinir. Yüksek düzeydeki heterozigotluk, asmada her çeşidin aslında bir F 1 olması nedeniyle genetik çalışmaları büyük oranda kolaylaştırmıştır. Döl, heterozigot bütün lokuslar açısından açılım gösterecektir. Genetik olarak iki çeşit veya bitki arasındaki kontrollü melezleme çift yönlü yalancı melezleme tekniği olarak ifade edilir (Grattapaglia et al., 1992; Hemmat et al., 1994; Weeden et al., 1994). Yalancı melezleme populasyonu, heterozigot bir birey (+/-) ile homozigot resesif bir bireyin (-/-) melezlenmesi ile elde edilmektedir. Bu tür melezlemelerde, dominant markörler en az kodominant markörler kadar değerlidir çünkü 1:1 dağılımda fenotip genotipe eşittir (Luo et al., 2002). Bu durumda yapılan bağlantı analizi, iki genetik harita ile sonuçlanır: bir tanesi dişi ebeveyn, diğeri baba ebeveyn içindir. Bu iki harita daha sonra kodominant markörler (izoenzimler, RFLP, mikrosatelitler) veya daha az

33 etkin olan RAPD veya AFLP (3:1 açılım gösteren) markörler kullanılarak tek bir harita haline getirilebilir (Lodhi et al., 1995). Başarılı bir haritalama için populasyon seçimi son derece önemlidir. Haritanın ekonomik önemi markör-karakter ilgisine bağlı olduğundan ebeveyn olarak seçilen genetik stoklarda mümkün olduğunca kalitatif kalıtıma sahip morfolojik karakterler bulunmalıdır (Staub et al., 1996).Genomun belirli bir bölgesindeki QTL sadece; a.) Ebeveynler QTL bakımından polimorfikse, yani onlar fenotipik farklılığı oluşturan iki farklı allele sahipse, b.) Ebevenynler, QTL içeren kromozom bölgesindeki bir markör tarafından polimorfikse, c.) Markör ve QTL arasında linkage dengesizliği varsa, yani aynı ebeveneyn kaynaktan markör ve QTL allelleri beraberce kalıtımla eğiliminde iseler ortaya çıkabilirler.

34 QTL analizi için haritalama popülasyonundaki her bir hattın ilgili özelliğinin doğru tahminlerinin elde edilmesi gerekmektedir. Çoğu özellik için bu durum, her hat için çok sayıdaki bitkinin ölçümlenmesi ve tesadüfi dağılımlı tekerrürlü desenlerin kullanımını kapsamaktadır. Değerlendirme yöntemleri ve büyüme koşulları, tüm popülasyonun mümkün olduğu kadar üniform olması gerektirir. QTL i dar kromozomal bölgelere yerleştirmek analizinin temel amacıdır. Bu amaçla deneme şeklinin, açılım populasyonunun tipinin, büyüklüğünün, sayısının, DNA markörlerinin bilgi sağlama düzeyi ile polimorfikliği, bağlantı haritasının kurulması ve QTL analizinin yapılması için istatistiksel metodolojilerin hepsinin birlikte değerlendirilmesi gerekir (Asins, 2002). Poligenik karakterler ortalama, varyans, standart sapma ve ortalamanın standart hatası gibi istatistik yöntemler kullanılarak analiz edilebilinir. Bu tür istatistik yöntemleri belirleyicidir, bir popülasyon hakkında yorum yapmak için kullanılabilir, ya da çeşitli veri setlerini karşılaştırmak ve kıyaslamak için kullanılabilir. Fenotipik veriler genellikle dikkatle incelenmekte ve onlar QTL

35 saptaması için moleküler markör verileri ile birleştirilmeden önce, çok sayıda analiz yapılmaktadır. 1. Frekans Dağılımı Popülasyonun dağılım frekansının normal dağılışa uygun olup olmadığı kontrol edilmelidir. Özellik normal dağılım göstermiyorsa, daha normal bir dağılımı elde etmek için transformasyon dikkate alınmalıdır. 2. Fenotipik Verilerin Varyans Analizi (ANOVA) Đlgili özellik bakımından genotipler arasında istatistiki olarak önemli farklılık var mıdır, incelenmelidir. Đstatistiki farklılık önemli değilse QTL analizi, hatlar arasında küçük farklılıklar nedeniyle sınırlı değerlere sahip olacaktır. 3. Kalıtım Derecesi Tahminleri Bir QTL çalışmasındaki daha yüksek kalıtım derecesi, fenotipik varyansın daha büyük bit yüzdesinin QTL ler tarafından açıklanabileceği

36 anlamına gelmektedir. Her hangi bir özellik için daha yüksek kalıtım derecesi tahmini, çevresel etkilerden ziyade genlerden kaynaklanan değişkenliğin olduğunu göstermektedir. 4. Korelasyon Analizleri Ele alınan iki özellik birbiriyle bir hayli ilişkili ise, aynı QTL lerin her iki özelliği etkilediğini gösterebilir. Diğer taraftan da bu sonuç, aynı genlerden ziyade bağlı QTL lerin özelliklerle beraber olduğunu düşündürebilir. 5. Ortalama Hesabı Fenotipik analizlerin son kısmı, her bir özellik için hatların ortalama değerlerinin belirlenmesidir. Popülasyon bir çok lokasyon veya yılda değerlendirilirse, veriler genellikle muhafaza edilmekte ve her bir çevre için ayrı ayrı analiz edilmektedir.

37 Moleküler Markör Değerlendirilmesi Moleküler markörler kromozom bölümlerinin belirlenmesi ve linkage haritaları oluşturulması için DNA zincirine bağlı olarak belirlenen işaretlerdir. Faydalı olabilmeleri için, bir markör lokusunun özgün bir haritalama popülasyonunda polimorfik olması zorunludur. Đki yada daha fazla ayırt edilebilir allellik formlarının bulunması gerekir. Bitki QTL çalışmalarında kullanılan markör tipleri SSR, RFLP, AFLP ve RAPD gibi markörlerdir. Bir QTL çalışmasında hangi markörü seçmiş olursak olalım esas amaçlar; a.) Genomu tamamen kaplamalı yani her bir kromozomun tüm bölgesinde bulunan markörleri içermelidir. b.) Yaklaşık 15-20 cm aralıklı markörlerle bir genom haritası geliştirilmelidir. Daha yoğun bulunan markörlerle çok az ilave bilgiler sağlanmaktadır.

38 Ebeveynlerin Gözden Geçirilmesi Bir QTL çalışması için gereksinim duyulan polimorfik markörlerin miktarı, bitki türünün genom boyutuna, markörler arasındaki ortalama boşluğa ve çalışmanın amaçlarına bağlı olmaktadır. Markörler Đçin Popülasyonun Değerlendirilmesi Polimorfik markörler belirlendikten sonra, onlar haritalama popülasyonunun her bir hat veya bireyini değerlendirmek için kullanılmaktadır. Daha sonra skorlama işlemi gerçekleştirilmektedir. Açılma Çarpıklığı Markör verileri elde edilince, onlar genel olarak Mendel Kalıtımıyla beklenen oranlardan, gözlenen açılma oranlarının saptanması olan açılma çarpıklığının kanıtlanması için analiz edilmektedir. Beklenen oranlar kullanılan markör tipi ve popülasyonun tipine bağlı olarak değişecektir. Gözlenen verilerin beklenen oranlardan önemli derecede farklı olup olmadığını belirlemek için, bir khi-kare testi yapılması

39 gerekmektedir. Khi-kare kuramsal dağılışlar ile örneklem dağılışlarının karşılaştırılmasında, sayımla belirtilen grupların karşılaştırılmasında, sayımla belirtilen gruplarda ilişki kontrolünde kullanılır. Biyolojik olaylarda bir özellik kurumsal olarak genetik kurallar içinde belirli oranlarda ortaya çıkar. Ancak gözlenen değerler ile beklenen değerler arasında sapma her zaman beklenir. Khi-kare testi, farklılığın rastlantı sınırlarını belirler (Öner, 2003). Linkage Haritalaması Tüm markörlerden elde edilen skorlar, linkage haritalama programına alınabilen formatta bir veri dosyasında toplanmaktadır. Linkage için en uygun yazılım programlarıyla veriler değerlendirilir. Büyük haritalama populasyonlarının farklı markör sistemleri ile karakterize edilmesinden dolayı günümüzde harita oluşturma, bilgisayar programlarıyla gerçekleştirilmektedir. JoinMap (Stam, 1993), Gmendel (Echt et al., 1992), MapManager (Manly and Eliot, 1991), Mapmaker (Lander et al., 1987) ve Linkage 1 (Suiter et al., 1983) gibi bilgisayar paket programları haritalamada genetik bilginin analizinde kullanılır.

40 QTL i Ortaya Çıkarmanın Esası Kantitatif özellik lokus (QTL) analizleri, kalitatif özellikleri etkileyen genleri tanımak ve yerlerini belirlemek için fenotipik verileri ve DNA markörlerini birleştiren bir yöntemdir. QTL in ortaya çıkabilmesi için hem QTL hem de yakın bir markör, polimorfik olmak zorundadır. QTL lerin bulunması, ilgili özelliği kontrol eden polimorfik genlerle polimorfik markörlerin birbirleri ile olan ilişkisi esasına dayalıdır. QTL Analizi Đçin Veri Yapısı QTL analizinde kullanılan her bir veri seti, haritalama popülasyonunun her bir birey veya hattı için fenotipik özelliklerin bir veri setini ve moleküler markör skorlarının bir setini içerecektir. Bir moleküler markör ve özellik arasında bir beraberliğin var olup olmadığını belirlemenin en temel yolu, tek yönlü varyans analizi yapmaktır (ANOVA).

41 Tek Faktör ANOVA dan Elde Edilen Sonuçlar Aşağıdaki bilgiler QTL i ortaya çıkartmak için ANOVA yönteminden elde edilmektedir. 1.) QTL Popülasyonunun Kaba Bir Tahmini: Bir QTL, belirli bir kromozom bölgesinde bir çok önemli marköre yakın lokalize olduğunu göstermektedir. 2.) Đstatistiki Önemliliğin Ölçüsü (P-Değeri): Markör, özellik için varyasyonla beraber değilse, P değeri, elde edilen bu ekstrem sonuçların olasılığını göstermektedir. 0.01 lik P değeri bu sonuçların, markör-özellik beraberliğinin yokluğunda elde edilebileceği olasılığını belirtmektedir. Daha düşük P değeri, gerçekten bir QTL in markör bölgesinde mevcut olma olasılığını artırmaktadır. Bağlı markörlerin P değeri 0.01 den daha az olmadıkça, bu QTL pek çok araştırıcıya güven vermeyecektir. 3.) % R 2 Değeri: bu değer, bir özelliği etkilemedeki bir QTL in nispi önemini göstermektedir. Bir markör tarafından açıklanan özellik için toplam fenotipik varyans yüzdesidir.

42 4.) Elverişli Allellerin Kaynağı (A ebeveyni veya B ebeveyni): Markör sınıfları için ortalama değerler mukayese edilmekte ve en elverişli ortalamanın arzu edilen QTL allelinin kaynağı olduğu dikkate alınmaktadır. 5.) Eklemeli ve Dominant Etkilerin Tahminleri: Dominant etkiler heterozigotların bulunduğu popülasyonlarda, örneğin bir F 2 popülasyonunda tahminlenebilir. Her bir markör lokusundaki heterozigotluğun oranı % 50 olarak belirlenmektedir. Basit Đnterval Haritalama Tek faktörlü ANOVA yöntemiyle bir QTL in varlığı, kromozom haritası üzerinde sadece 20 cm veya daha fazla mesafede olan markör pozisyonlarında test edilebilinir. Bu nedenle, QTL pozisyonu ve etkileri kesin olmayan bir şekilde belirlenmektedir. Bu suretle, bir QTL in çoğu olasılıkla pozisyonu ve etkilerinin boyutu tek faktörlü ANOVA analizinden daha doğru bir şekilde tahminlenmektedir. Her bir test pozisyonunda basit interval haritalama sistemi, bir QTL in o pozisyondaki var olduğu olasılığı gösteren bir LOD skoru

43 hesaplanmaktadır. LOD skorları kromozom haritası boyunca işaretleme yapmakta ve bir eşik seviyesini aşanlar, o kromozom bölgesinde bir QTL in varlığını açıklamaktadır. Asmada Günümüze Kadar Yapılan Genetik Haritalama Ve QTL Analizi Çalışmaları Lodhi et al. (1995) tarafından geniş oranda RAPD markörler kullanılarak asma ile gerçekleştirilmiş ilk genom haritasını gerçekleştirmiştir. Cayuga White x Aurore interspesifik hibrid çeşitlerinin çift yönlü yalancı melezleme tekniği kullanılarak oluşturulan F 1 populasyonunda asmada moleküler markörler kullanılarak yapılan ilk gerçek haritalama çalışmasında 422 RAPD ile 16 RFLP ve izoenzim markörleri kullanılmıştır. Araştırıcılar bu haritanın hibrit bitkilerin gelişmenin erken dönemlerinde markör aracılığıyla seleksiyon programlarında kullanılabileceğini ileri sürmektedirler. Kullanılan toplam 443 markör ile Cayuga White x Aurore bağlantı haritalarının orta derecede doygun olduğu bildirilmektedir.

44 Ye et al. (1995) asmalarda külleme (Uncinula necator) hastalığına karşı dayanım haritasını oluşturmak için Horizon ve Illinois 547-1; iki interspesifik hibritinde RAPD primerlerinden yararlanmışlardır. Elde edilen F 1 populasyonunda, incelenen 327 RAPD primerinden 90 adedi ile 504 adet skorlanabilen ve açılım gösteren DNA parçası çoğaltılmış ve haritalamada kullanılmıştır. Bunlardan 42 adedi Horizon çeşidinde 19 bağlantı grubunda 1099 cm lık ve 48 adedi de Illinois 547-1 çeşidinde 20 bağlantı grubunda 1059 cm lık alana yayıldığı bildirilmektedir. Çalışmada 4 yıl boyunca gerçekleştirilen arazi gözlemleri sonucunda; incelenen bireylerde 3 yıllık arazi gözlemlerinin değerlendirilmesi ile dayanıklı 547-1 çeşidinde 10 numaralı bağlantı grubunda bir bölgenin, küllemeye dayanımı etkileyen bir QTL taşıdığı sonucuna ulaşmışlardır. Striem et al. (1996) 82 bireyden oluşan bu populasyonda çekirdeksizlik karakteri ile ilgili 7 özellik analiz edilmiştir. Early Muscat ve Flame Seedless çeşitleri arasında yapılan melezleme sonucunda elde edilen bu bireylerde bir çekirdeğin ortalama taze ağırlığı, tanedeki çekirdeklerin toplam taze ağırlığı, çekirdeğin kapsam algısı, görsel

45 değerlendirilen çekirdek büyüklüğü kategorileri, tohum kabuğunun sertlik derecesi, endospermin gelişme derecesi ve embriyonun gelişme derecesini içeren özellikler analiz edilmiştir. 160 RAPD primeri kullanılarak gerçekleştirilen çalışmada 110 adedi belirgin bant deseni elde edilmiştir. Đncelenen 12 markör bir çekirdeğin ortalama taze ağırlığı ve tanedeki çekirdeklerin toplam taze ağırlığı ile önemli korelasyon göstermiştir. 4 markör, 9 adet çekirdekli bireyi tanımlamıştır. Ayrıca, 3 markör, 21 adet çekirdekli ve 4 görülebilen çekirdek izine sahip bireylerin tanımlanmasını sağlamıştır. Araştırmacılar bu sonuçların ön seleksiyon amaçlı kullanılabileceği ifade etmektedirler. Bu işlem ile populasyon büyüklüğü %44 oranında azaltılabilmiştir. Bouquet and Danglot (1996) çekirdeksizliğin birbirinden bağımsız kalıtım gösteren 3 adet tamamlayıcı resesif gen ile 1 adet dominant gen (sdi, seed development inhibitor) tarafından kontrol edildiğine dair bir model ileri sürmüştür. Lahogue et al. (1998) asmada çekirdeksizlik karakterini kodominant SCAR markörlerle tanımlamıştır.

46 Dalbó (1998) külleme ve siyah çürüklük hastalıklarına dayanımın kalıtımını çalışmak için Ye et al. (1995) ın oluşturduğu Horizon x Illinois 547-1 populasyonunu kullanmıştır. Her iki ebeveyne ait genetik haritalar çıkarılmış ve 20 adet bağlantı grubu belirlenmiştir. Çalışmada RAPD primerleri temel oluştururken, ek olarak 30 mikrosatelit ve 4 STS (Sequence Tagged Sites) markörü sonuçlarına göre 10 adet homolog bağlantı grubu tespit edilmiştir. Birbirlerinden ortalama uzaklığı 7.5 cm olan 451 markör haritalar üzerine yerleştirilmiştir. Küllemeye dayanım QTL inin bulunduğu bağlantı gruplarında aynı zamanda siyah çürüklük için de QTL bulunmuştur. Islah programında kullanılma amacıyla, küllemeye dayanımda görev alan en güçlü QTL (547-1 çeşidinde 10. bağlantı grubu) seçilmiştir. Bu QTL e yakından bağlı bir RAPD markörü (CS25b) ve bir AFLP markörü (AfAA6), CAPS markörlerine dönüştürülerek aynı dayanım kaynağının kullanıldığı farklı melezlerde QTL açılımı takip edilmiştir. Bütün melezlerde, küllemeye duyarlı bireylerin yüzdesinin, bu markörler esas alınarak yapıldığında önemli ölçüde azaltılabileceği sonucuna varılmıştır

47 Grando et al. (2000) Moscato bianco ve Vitis riparia arasındaki melezleme ile elde ettikleri 90 bitkilik populasyonda, polimorfizm ve moleküler karakterlerin açılımını test etmek amacıyla mikrosatelit ve RAPD markörleri kullanmışlardır. RAPD markörlerinin açılımı haritalama için daha az yararlı olurken, allel açılım oranları Mendel değerlerine yakın olan VVMD6 ve VVMD7 lokusları dışındaki tüm lokuslar bağımsız şekilde kalıtım göstermiştir. Dalbó et al. (2000) Horizon ve Illinois 547-1 in melezlenmesi ile oluşturulan F 1 bitkilerinde gerçekleştirdikleri genetik haritalama çalışmasında 277 RAPD, 25 mikrosatelit, 4 CAPS ve 12 AFLP markörü kullanmış ve asmalarda cinsiyeti kontrol eden tek bir lokusun bir mikrosatelit (VVS3) ve bir RAPD (GY104i) markörü ile yakından bağlantılı olduğu bulunmuştur. Horizon ait haritada 153 markör 1199cM, Đllinois e ait haritada ise 153 markör 1470 cm de yer almış, her haritada 20 adet bağlantı grubu tepit edilmiştir. Bazı rekombinantların varlığına rağmen VVS3, Vitis ıslah programlarında erkek tiplerin çıkartılması amacına yönelik olarak en fazla kullanılma olanağına sahip olmuştur.

48 Buck and Zyprian (2000) fungal hastalıklara dayanıklı Regent ve duyarlı Lemberger çeşidi arasındaki melezleme sonucunda elde edilen 150 bireylik popülasyondan seçtikleri 47 birey üzerinde genom haritası çıkarmak için RAPD markörlerini test etmişlerdir. Araştırıcılar 11 bağlantı grubu ortaya çıkarılmışlardır. Kozma (2000) Vitis amurensis hibritleri, Vitis vinifera çeşitleri ve Franko-Amerikan hibritlerinin kullanıldığı bu çalışmada, fungal hastalıklara dayanımı araştırmıştır. Franko-Amerikan hibritleri ile Doğu Asya V. amurensis hibritlerinin dayanım ıslahı çalışmaları için iyi bir kaynak olabileceği araştırıcı tarafından belirtilmiştir. Doğal ve yapay enfeksiyonun yapıldığı çalışmada, külleme ve mildiyöye dayanımın dominant karakterde olduğu tespit edilmiştir. Dayanım derecesi ebeveynin genetik kaynağına göre değişmiştir. Ren et al. (2000) Summit (beyaz) x Noble (kırmızı) üzüm çeşitlerini kullanarak elde edilen F 1 lerde, tane rengine yönelik markör tespit etmeye çalışmışlardır. Toplam 350 adet RAPD primeri, 7 şer bireyden oluşan kırmızı ve beyaz DNA havuzunda polimorfizm

49 açısından incelenmiştir. F 1 populasyonunda tane rengine yönelik açılım kırmızı rengin tek bir dominant gen tarafından kontrol edildiğini göstermiştir. Hedef gene bağlı 2 RAPD markörü tespit edilmiştir. Sonuçlar RAPD markörünün tane rengine yönelik erken seleksiyonda güvenilir olduğunu göstermiştir. RAPD-PCR tekniği ve BSA yöntemi tane rengi karakterini etiketlemek için kullanılmıştır. Milutinovic et al. (2000) renkli meyve suyuna sahip çekirdeksiz bir çeşit elde etmek amacıyla yapılan melezlemede (Evita x Beogradska Besemena) kalıtım şeklini incelenmiş ve tane rengi ile meyve suyu rengi için tek gen kalıtımının olduğu gözlenmiştir. Verim ve salkım ağırlığı için, düşük verim ve salkım ağırlığına sahip ebeveynin (Evita) dominantlığı saptanmıştır. Bunun yanında tane ağırlığı için düşük tane ağırlıklı ebeveynin (Evita) kısmi dominantlığı belirlenmiştir. Çekirdeksizliğin monogenik kalıtımın dışında bir kalıtıma sahip olduğu belirtmektedir. Walker and Yin (2000) V. rupestris x M. rotundifolia melezi olan 200 F 1 bireyde Xiphinema index e (kamalı nematod) karşı taramış

50 ve 70 adedini dayanıklı bulunmuştur. Analiz edilen (OPA-12) primeri dayanım ile bağlantılı bulunmuştur. OPA-12 ürünü klonlanmış ve bir SCAR markörüne dönüştürülmüştür. Adam-Blondon et al. (2001), Lahogue et al. (1998) tarafından bulunan sdi genine bağlı RAPD markörleri, Sultana kökenli kısmen çekirdeksiz iki genotipin melezlenmesi ile elde edilen populasyonda BSA yöntemi ile araştırılmıştır. OPC-08 ve OPP-18, RAPD markörleri sadece çekirdeksiz genotiplerde bulunmuş ve bu karakter ile bağlantılı bir majör lokusun varlığı gösterilmiştir. OPC-08 RAPD markörü SCAR markörüne (SCC8) dönüştürülmüştür. Georgiady et al. (2001) Vitis e ait bir genomik harita çıkartılması için F 1 in kendilenmesi ile oluşturulan 1000 bireylik F 2 populasyonu oluşturmuştur. Yaklaşık 700 AFLP ve SSR markörleri kullanılarak asmada ekonomik anlamda öneme sahip birçok özelliğin birden fazla gen grubu tarafından kontrol edildiği poligenik karakterleri daha iyi anlamak için; bu populasyondan seçilen ve vegetatif olarak çoğaltılan 300 bireyde hastalığa dayanım, genel bitki gelişmesi ve şekli ile meyve verimi ve

51 kalitesi gibi kantitatif karakterlerin haritalanması çalışmasını yapmışlardır. Blondon et al. (2001) PCR temelli, RAPD markör sisiteminden geliştirilmiş olan SCP18 ile çekirdeksizlik tespit edilebilmektedir. Çekirdeksiz x çekirdeksiz ve çekirdekli x çekirdekli bireylerden meydana getirilmiş bir popülasyonda seçilen 81 adet, çekirdekli ve çekirdeksiz bireyde çekirdeksizliği tespit için, Lahogue et al. (1988) tarafından geliştirmiştir, sdi, ana lokuslarda incelemişlerdir. Araştırma sonucunda SCP18, SSC8 nin çekirdeksiz x çekirdeksiz lerde erken dönemde çekirdeksizliği tespit etmede yararlı bir şekilde kullanılabileceğini belirtmektedirler. Reisch (2001) Küllemeye karşı Horizon ( hassas) ve Illinois 547-1 (Vitis rupestris x V. cinerea) (dayanıklı) bireylerin melezlerinden oluşturduğu popülasyonu 8 yıl boyunca gözlemlemiş ve bu popülasyon içinden seçtiği 272 bireylerle kurduğu yeni plantasyonda, AFLP markör sistemini kullanarak gerçekleştirdiği BSA analizi sonuçlarına göre,

52 küllemeye dayanıklı lokus tespit etmiştir. 2001 yılından beri sürdürülen çalışmalara halen devam edilmektedir. Pauquet et al. (2001) AFLP markörlerini kullanarak yaptıkları çalışmada, Cabernet Sauvignon çeşidini duyarlı kontrol çeşit olarak kullanılmışlardır. 157 bireyden oluşan BC 5 populasyonu üzerinde 13 AFLP markörü 22 adet Run1 taşıyan genotip ile 16 duyarlı genotip üzerinde daha da ileri düzeyde araştırılmıştır; 3 markör sadece dayanıklı genotiplerde bulunmuştur. Araştırmacılar daha büyük popülasyonlarla çalışılması gerekliliğini bildirmektedirler. Callahan et al. (2002) 418 AFLP, 32 ISSR, 23 RAPD markörü ve 18 SSR markörü kullanılarak V. rupestris A. de Serres (2n=38) x M. rotundifolia Cowart (2n=40) hibridine ait genetik bağlantı haritasını, yalancı melezleme stratejisi kullanılarak çıkartılmıştır. Ebeveynler için oluşturulan haritalarda 19 bağlantı grubu tespit edilmiştir.

53 Ageoerges et al. (2002) tarafından küllemeye dayanım ile ilgili QTL araştırılmıştır. Yapılan bu kapsamlı araştırmada Syrah ve Grenache arasında yapılan melezleme ile elde edilen populasyonda halen tane gelişimi ve olgunlaşmasında görev alan genlerin saptanmasına yönelik olarak çalışmalara devam etmektedirler. Araştırıcılar ilk sonuçların 3 yıl içerisinde alınabileceğini ifade etmektedirler. Donald et al. (2002) tarafından yapılan çalışmada RFLP ve AFLP markörleri run-1 lokusuna bağlantı açısından taranmıştır. Đncelenen markörlerden 3 markörün sadece dayanıklı genotiplerde bulunmuş olması, küllemeye dayanıklı asma çeşitlerinin markör aracılığıyla seleksiyonu için bir olanak sağlayabileceğini belirtmektedirler. Araştırıcılar, daha büyük populasyonlar üzerinde araştırmaların devam edilmesi gerekeceğini ifade etmektedirler. Doligez et al. (2002) 301 markörün; 250 AFLP, 44 SSR, 3 izoenzim, 2 RAPD, 1 SCAR ve 1 fenotipik markör-tane rengi kullanılmasıyla, iki kısmen çekirdeksiz genotipin melezlenmesinden elde edilen 139 bireylik F 1 populasyonu üzerinde genetik haritalama

54 yapmışlardır. Araştırma sonucunda 20 bağlantı grubu haritalanmış ve 1002 cm lık alan kapsanmıştır. Tane rengi için majör gen, hem babaya ait haritada hem de birleştirilmiş haritada tespit edilmiştir. Luo et al. (2002) Vitis quinquangularis (83-4-96) ile Vitis vinifera L. (Muscat Rose) arasındaki melezleme ile oluşturulan 80 bireylik F 1 hibrit populasyonunda, ön çalışmalar sonucunda 280 RAPD primerini incelenmişlerdir. 39 primerin polimorfik bant deseni verdiği tespit edilmişlerdir; bu primerler ile DNA çoğaltımı gerçekleştirilmiştir. 1:1 veya 3:1 oranında açılım gösteren 90 adet RAPD markörünün ebeveynelere ait bağlantı haritalarının çıkartılmasında kullanılabileceği bildirilmiştir. Halen araştırıcılar çalışmalarına devam etmektedir. Zavala et al. (2002) 50 SSR, 150 AFLP ve 30 RAPD markörleri ile, Ruby Seedless x Thompson Seedless melezlenmesi sonucu elde edilmiş olan 127 bireylik bir populasyonda sofralık üzüm ıslahı için bir bağlantı haritası hazırlanmışladır. Ebeveynlere ait sadece sırasıyla 13 ve 11 bağlantı grubu oluşturulmuştur, araştırmacılar bunu kullanılan markör sayısının az olmasının neden olduğunu belirtmektedirler. Bu çalışmanın

55 ikinci kısmında çekirdeksizliğe bağlı markörler tanımlanmıştır. 350 RAPD primer testinden sonra 10 adet aday markör tespit edilmiştir. Araştırıcılar, döllerde çekirdeksizlik karakterini izlemede faydalı yeni SCAR markörlerini geliştirmeyi hedeflemektedirler. Zyprian et al. (2002) Lemberger ve Regent çeşitlerinin melezlenmesiyle elde edilen populasyonda fungal hastalıklara (Uncinula necator ve Plasmopara viticola) ve bazı karakterlere yönelik QTL analizi yapılmışlardır. Araştırıcılar harita tabanlı klonlama yaklaşımını kullanarak ilgili genlerin izole edilmesi için çalışmaktadırlar. Riaz and Walker (2003) Vitis rupestris x Muscadinia dan meydana gelmiş F2 popülasyonundan oluşturulmuş popülasyonda SSR, AFLP ve ESTP markör sisitemleri incelenmiştir. Orijinal haritalama popülasyonu 181 bireyden meydana gelmektedir. Bu popülasyonda 210 SSR, 63 ESTP ile test edilmiş; 127 SSR ve 14 ESTP de polimorfizm saptanmıştır. 54 EcoRI ve MseI kombinasyonu ile oluşturulan 216 AFLP markörünün sonuçlarına göre; SSR markörlerin hem referans haritada

56 hem de orijinal haritada yaygın olarak kullanılabileceği sonucuna varılmıştır. Doligez et al. (2003) iki kısmen çekirdeksiz genotip (Dattier de Beyrouth x 75 Pirovano) x (Alphonse Lavallée x Thompson Seedless) arasındaki melezleme sonucunda elde edilmiş tam akraba döllerde bazı kalite ile ilişkili özelliklere yönelik QTL leri 300 AFLP lokusu ile 182 SSR lokusun genotipi çıkarılarak araştırmışlardır. Kozma Jr. and Dula (2003) iki hibrit ailesinde (Muscadinia x V. vinifera BC 4 x Franco-American hibrit x V. vinifera x V. amurensis ve Muscadinia x V. vinifera BC 4 x (V. amurensis x V. vinifera) BC 2 ) külleme dayanımını inceledikleri çalışma sonucunda Muscadinia dan gelen külleme dayanımından sorumlu Run1 geninin mildiyö dayanımı ile bağlantılı olduğunu belirlemişlerdir. Araştırıcılar ebeveynlerinden daha fazla mildiyöye dayanıklı hibritler elde etmiştir. Grando et al. (2003) üç moleküler markör tipinin kullanılarak, çift yönlü yalancı melezleme stratejisi izlenerek oluşturulmuş şaraplık

57 çeşit Moscato bianco (Vitis vinifera L.) ve bir Vitis riparia bitkisinden elde edilen 81 F 1 bitkisinde, ana ebeveyne ait haritada 20 bağlantı grubuna 338 markör yerleşirken (1,639 cm), baba ebeveynde ise 19 bağlantı grubuna 429 lokus yerleştiğini tespit etmişlerdir (1,518 cm). 21 SSR ve 19 AFLP lokusu ile, 14 adet homolog bağlantı grubu bulunmuştur. Marino et al. (2003) Vitis vinifera Muscato bianco x V. riparia populasyonunda SSR ve AFLP markörleri kullanarak yapraklarda mildiyöye dayanım ve tanede aroma bileşikleri için QTL analizi yapmışlardır. Ana ebeveyn haritası 403 SSR ve AFLP markörleri ile 21 bağlantı grubundan (1128 cm) ve baba ebeveyn haritası 502 SSR ve AFLP markörleri ile 20 bağlantı grubundan (1143 cm) oluşmuştur. Mejia and Hinrichsen (2003) 127 bireylik Ruby Seedless x Sultanina F 1 populasyonunda çekirdeksizlik ile ilişkili bir SCAR markör geliştirmek amacıyla, 336 adet RAPD primeri test etmiştir. Sadece çekirdeksiz genotiplerde bulunan, WF27-2000 adı verilen bir RAPD markörü klonlanmış, dizisi belirlenmiş ve bir SCAR markörüne

58 dönüştürülmüştür. Bu marköre dayalı seleksiyonun populasyonda incelenecek birey sayısını azaltmada faydalı olabileceğini ifade edilmektedir. Merdinoğlu et al. (2003) 151 RAPD, 13 ISSR ve 208 SSR primeri kullanarak Muscadiniya üzümlerine mildiyö dayanımı kazandıran gene bağlı moleküler markörleri tanımlamak amacıyla BSA metodunu kullanmışlardır. Varyans analizi sonucunda 1 RAPD, 4 ISSR ve 8 SSR ın dayanım üzerine önemli etkide bulunduğunu belirlemişlerdir. Bunlardan 12 adedi aynı bağlantı grubunda 45 cm lık bir bölge içine yerleşmiştir. Dayanım QTL in varlığı aralık (interval) haritalama ile doğrulanmıştır. Bu sonuçlar; Rpv1 (Plasmopara viticola dayanım geni) olarak isimlendirilen bu QTL in muscadinia üzümlerinde dayanım sağlayan gen olduğunu düşündürmektedir. Rpv1, ayrıca külleme dayanım geni Run1 e yakından bağlantılı bulunmuştur. Regner et al. (2003) 160 SSR ve 190 RAPD markörü kullanılarak 70 bireylik bir Welschriesling x Sirius (KI.K1977) populasyonunu külleme ve mildiyöye tolerans açısından, araştırmışlardır.

59 7 RAPD markörünün küllemeye dayanımla önemli derecede bağlantılı olduğunu bulmuştur. Araştırmacılar Gr. Veltliner x Seyyal=KI.K1979 popülasyonunuda elde edilen bu markörlerle incelenmiştir; ancak RAPD markörleri arasında herhangi bir ortaklık sağlanamadığını tespit etmişlerdir. Araştırıcılar populasyondaki birey sayısı ile markör sayısının arttırılmasının gerekli olduğu sonucuna ulaşmışlardır. Zyprian et al. (2003) Gf.Ga-47-42 ve Villard blanc, fungusa dayanıklı iki hattın melezlenmesi ile elde ettikleri populasyonu külleme ve mildiyö hastalıklarına karşı analiz etmişlerdir. Bu çalışma sonucunda elde edilen haritanın daha önceki çalışmalarında kullandıkları Regent x Lemberger populasyonuna ait harita kadar doygun olmamakla birlikte Gf.Ga-47-42 x Villard blanc genetik haritasının, fenotipik karakterlere ait QTL lerin genetik bölgelerinin korelasyonu çalışmasında kullanılabileceği görüşünü bildirmektedirler. Her iki haritayı kullanarak fungal patojenlere dayanımla ilgili genetik faktörlerin karşılaştırmasını yapabileceklerini dile getirmektedirler.

60 Madini et al. (2003) V. vinifera L. ve V. riparia Michx. a ait hastalığa dayanım ve kalite amaçlı ıslah çalışmalarında kullanılmak üzere QTL bilgilerinin üretimine yönelik olarak 350 AFLP ve mikrosatelit markörüne dayalı olarak gerçekleştirilen çalışma sonucunda, her iki haritanın yaklaşık 1150 cm ı kapsadığı belirlenmiştir. Fischer et al. (2003) Lemberleng (ana) ve Regent (baba) bireylerinden geliştirdikleri melezleme popülasyonunda üzüm tanesinin önemli özelliklerininin QTL analizi için AFLP, SSR gibi markörler kullanarak yaptıkları çalışmada Mapmaker ve Joinmap programları kullanılarak LOD8 de incelenmiştir. LOD skorlarının profilleri incelenmiştir. Adam-Blondon et al. (2004) Syrah ve Grenache melezi olan populasyonda 346 adet SSR markörü kullanarak gerçekleştirdikleri haritalama çalışmasında, toplamda 310 markörde başarı elde etmiştir. Đki ebeveyn için en az birisi için bu markörlerin %84.4 ü polimorfik olduğu belirlenmiştir. 177 adet markör Syrah ta 19 bağlantı grubu oluşturduğunu tespit etmişlerdir ve toplam 1,172 cm lık alanı kapsamaktadır. Grenache

61 haritasında 178 markör 18 bağlantı grubuna yerleşmiştir ve 1,306 cm lık alanı kapsamaktadır. Bağlantı grubu başına ortalama 6,5 yeni markör bulunmuştur. Doucleff et al. (2004) yalancı melezleme stratejisi kullanarak Vitis rupestris x V. arizonica melezlenmesinden elde edilen 116 bireylik populasyonda 410 AFLP, 24 ISSR, 32 RAPD, 9 SSR kullanarak bir genetik harita çıkarmışlardır. Đncelenen 475 adet DNA markörü sonucunda, ana ebeveyne ait haritada 17 bağlantı grubu (756 cm), baba ebeveynde ise 19 bağlantı grubu (1,082 cm) bulunmuştur. Orta derecede doygun olan bu haritanın kamalı nematoda (Xiphinema index) ve asma vebasının (Pierce s disease) taşıyıcısı olan Xylella fastidiosa ya dayanım genlerinin veya QTL lerin tespitinde başlangıç oluşturabileceği ifade etmişlerdir. Sevini et al. (2004) yoğun bir aromaya sahip V. Vinifera cv. Moscato bianco ile önemli fungal hastalıklara dayanıklı V.riparia arasında yapılan melezleme ile elde edilen 81 bireylik bir populasyonda SSR, AFLP ve SSCP markörleri kullanarak tane aromasını belirleyen ana

62 bileşiklerin (terpenler) genetik kontrolünü araştırmışlardır. Karakter analizi MapQTL 4,0 yazılım programı ile belirlemişlerdir. Monoterpenlerin tanedeki miktarlarına yönelik ilk QTL ler tanımlanmıştır. Bu populasyonda konuya yönelik çalışmalara devam edilmektedirler. Fischer et al. (2004) 185 AFLP, 137 RAPD, 85 SSR ve 22 SCAR veya CAPS markörünü kullanarak, Regent x Lemberger populasyonunda 153 bireyde fungal hastalıklara dayanıma yönelik haritalama yapmışlardır. Ana ebeveynde küllemeye dayanım için 1 adet QTL ve mildiyöye dayanım için birden fazla QTL saptanmıştır. Olgunlaşma zamanı, tane büyüklüğü ve koltuk sürgünü büyümesine yönelik başka QTL ler bulunmuştur. Riaz et al. (2004) mikrosatelit markörleri kullanılarak Riesling x Cabernet Sauvignon populasyonunda, 153 bitkide bir çerçeve haritası çıkaran 20 bağlantı grubu bulmuşlardır. Markörler arası ortalama 11,0 cm uzaklıkla toplam 1,728 cm lık bir kısım kapsanmıştır.

63 Fanizza et al. (2005) sofralık üzümlere (Vitis vinifera) ait 184 bireyden oluşan bir popülasyonda 203 AFLP ve 110 SSR markörü kullanarak meyve ürün kompanentleri bakımından QTL ilişkiyi araştırmıştır. Tane ağırlığı ve salkımdaki tane sayısı arasında negatif bir ilişki olduğu, bu indirekt etkinin salkım ağırlığını etkilediği bildirmektedir. Bu negatif ilişki QTL ler ile tespit edilmemiştir, fakat gelecek çalışmalarda çekirdeksizliği tespit etmek için kullanılabileceği bildirilmektedir. Zyprian et al. (2005) fungal hastalıklara dayanım ve tat bileşiklerine yönelik çalışmalar yapmışlardır. Gf.Ga.47-42 ve Villard blanc arasında yaptıkları melezlemede, populasyondan elde edilen sonuçları, Regent çeşidine ait genetik bilginin QTL ilişkisi ile karşılaştırmışlardır. Regent te saptanan külleme hastalığına dayanım markörleri yeni bir melezlemede test edilmiştir. Dayanımın yanında tat bileşiklerinin Gf.Ga 47-42 ıslah hattından elde edildiğini ve Villard blanc ın daha natürel beyaz şarap verdiğini ifade etmektedirler.

64 Doligez et al. (2006) 46, 95, 114, 139 ve 153 bireyden oluşan 5 farklı popülasyonda 502 SSR ve 13 diğer PCR temelli markör gibi geniş bir markör setiyle LOD 2.0 de haritalama gerçekleştirmişlerdir. Popülasyondaki birey sayısı ve markör etkinliği analiz edilmiştir. Kosambiye göre ortalama 1,647 cm uzaklıkta 19 bağlantı grubu tespit edilmiştir. Mandl et al. (2006) 92 bireylik Welschriesling x Sirius kullanılarak çift yönlü yalancı melez tekniği ile elde edilmiş melezlerde 237 SSr, 14 RAPD markörü kullanarak haritalama yapmışlardır. 20 bağlantı grubu tespit emişlerdir. Mapmaker 3.0 kullanılarak gerçekleştirilen çalışmada VVS2 ve VMC 6g1 markörü Mg-QTL ile yüksek oranda bağlantılı bulunmuştur. Dünyada gerçekleştirilen bu araştırmaların asmada genetik ilerlemeye büyük fayda sağladığı ve hız kazandırdığı gözlemlenmektedir. Ülkemizde de bu alanda öncü ve ileri çalışmalar planlanmalı ve gerçekleştirilmelidir. Sonuçlandırdığımız bu çalışma bu gerçeğin gerekliliği sonucunda ortaya çıkmıştır.

65 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal Bu çalışma ile, Melezleme Yoluyla Külleme ve Mildiyö ye Dayanıklı ve Standart Özelliklere Sahip Yeni Üzüm Çeşitlerinin Elde Edilmesi konulu asma ıslahında karşılaşılan sorunların çözümüne yönelik olarak, Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü nce yürütülen proje (Proje Kod No: Tagem/IY/96/06/04/013) kapsamında 1992-1993 yılında Italia ve Mercan üzüm çeşitlerinin melezlenmesi yoluyla geliştirilen F 1 popülasyonu kullanılarak genom haritasının çıkarılması amaçlanmıştır. T.C. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsünce Italia ve Mercan üzüm çeşitlerinin melezlenmesi yoluyla geliştirilen F 1 popülasyonu içerisinden tespit edilen 60 adet F 1 bitkisi, melezleme için kullanılan Đtalia ve Mercan ile iki referans çeşitten (Cabernet Sauvignon ve Merlot) alınan çelikler, Ankara Üniversitesi

66 Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü serasında 40 cm çapındaki saksılara, toprak:perlit:turba, 1:1:1 harç kullanılarak dikilmiştir. Araştırmanın laboratuar çalışmaları Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarım Biyoteknolojisi Bahçe Bitkileri Birimi Laboratuvarında gerçekleştirilmiştir. Italia üzüm çeşidi, Prof. Pirovano tarafından 1911 yılında Đtalya da Bicane x Muscat Hamburg melezi olarak elde edilmiştir (Çelik, 2002). Đri ve konik piramit salkım şekline sahip, taneleri oval ve iri, 1-2 çekirdeğe sahip, sofralık bir üzüm çeşididir. Hafif misket aromasına sahip; kuru maddesi % 15-16, yüksek verimli, beyaz, orta geççidir. Đtalia üzümü uzun yola dayanıklı olma özelliklerinden dolayı da pazarlarda en çok aranan beyaz bir üzüm çeşididir. Marmara, Ege, Đç ve Güneydoğu Anadolu da yetiştirilmektedir (Şekil 3.1.).

67 Şekil 3.1. Đtalia üzüm çeşidi (Ana) Mercan üzümü, konik salkımlı, yuvarlak ve beyaz taneli, tatlı, sulu, 2-3 çekirdekli bir çeşittir. Eylül ortasında olgunlaşan Mercan

68 üzümü şıralık olarak değerlendirilen bir üzüm çeşidi olup Amasya da yöresel olarak yetiştirilmektedir (Odabaş ve ark., 2002) (Şekil 3.2.). Şekil 3.2. Mercan üzüm çeşidi (Baba) Italia x Mercan kombinasyonundan elde edilmiş; bu araştırma için seçilen F 1 ler de vegetatif, generatif (çiçek, salkım, meyve) ve

69 hastalıklara dayanım özelliklerini içeren toplam 38 adet karakter incelenerek, bu özellikler ile asmanın genomik haritasını çıkarmak suretiyle ilişkilendirilmesi hedeflenmiştir. Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü nce incelenen vegetatif, generatif ve hastalıklara dayanımla ilgili 38 adet karakter aşağıda sunulmuştur. A. Vegetatif Özellikler 1. Sürgün ucunda antosiyan yoğunluğu (OIV 003, UPOV 5) (Anonymous. 1983) Bu özellik çiçeklenmeden önce 10 adet sürgün ucunda gözlemlenmiştir.

70 0 Yok 2 Çok Zayıf 3 Zayıf 5 Orta 7 Yoğun 9 Çok Yoğun 2. Dinlenme halindeki kışlık gözlerin soğuğa dayanımları (Anonymous. 1983, Anonymous. 1995) Bu özellik vejetasyon döneminde incelenmiştir. 1 % 0-25 ölü (Sürmeyen göz) - Dayanıklı 2 % 26-50 - Yarı Dayanıklı 3 % 51-75 - Yarı Hassas 4 % 76 - Çok Hassas 3. Gözlerin patladığı dönem (OIV 301, UPOV 1) (Anonymous. 1983) Bu özellik gözlerin %50 sinde koruyucu tüylerin göründüğü dönemde incelenmiştir.

71 1. Çok erken 3. Erken 5. Orta 7. Geç 9. Çok geç 4. Genç yaprak üst yüzey rengi (OIV-051-1, UPOV-24) (Anonymous. 1983) Bu özellik çiçeklenme öncesi 10 sürgünde sürgün ucundaki ilk üç yaprakta gözlemlenmiştir. 1. Yeşil-Sarı 2. Kahverengi-Yeşil 3. Bakır kırmızısı 5. Genç yaprak üst yüzey tüylülüğü (Galet, 1979) Bu özellik çiçeklenmeden önce 10 sürgünde incelenmiştir. 1. Tüysüz 2. Tüylü

72 3. Örümcek ağı gibi tüylü 4. Kalın ve diken gibi tüylü 5. Đnce hav (yün) gibi tüylü 6. Genç yaprak alt yüzey rengi (OIV-051-1) (Anonymous. 1983) Bu özellik çiçeklenme öncesi 10 sürgünde sürgün ucundaki ilk üç yaprakta gözlemlenmiştir. 1. Yeşil-Sarı 2. Kahverengi-Yeşil 3. Bakır kırmızısı 7. Yaprak alt yüzey tüylülüğü (Galet, 1979) Bu özellik çiçeklenme öncesi 10 sürgünde sürgün ucundaki ilk üç yaprakta gözlemlenmiştir. 1. Tüysüz 2. Tüylü 3. Örümcek ağı gibi tüylü 4. Kalın ve diken gibi tüylü 5. Đnce hav (yün) gibi tüylü

73 8. Yaprak üst yüzey görünümü (Anonymous. 1995) Bu özellik çiçeklenme öncesi 10 sürgünde 4-6. boğumlardaki olgun yapraklarda incelenmiştir. 1. Yağımsı 2. Parlak 3. Mat 9. Yaprak formu (Galet, 1979) Bu özellik çiçeklenme öncesi 10 sürgünde 4-6. Boğumlardaki olgun yapraklarda incelenmiştir. 1. Düz 2. Đç bükey 3. Dış bükey 10. Yaprak şekli (Galet, 1979) Bu özellik olgun yaprakta 10 sürgünde sürgünün 1/3 nün uç kısmından alınan yapraklar dikkate alınarak çiçeklenme öncesi incelenmiştir.

74 1. Yürek şekilli 2. Beşgen şekilli 3. Üçgen şekilli 4. Yuvarlak şekilli 5. Böbrek şekilli 6. Yuvarlağımsı böbrek şekilli 7. Yuvarlağımsı konik şekilli 11. Yaprak üst yüzeyinin yapısı (Galet, 1979) Bu özellik olgun yaprakta 10 sürgünde sürgünün 1/3 uç kısmından alınan yapraklar dikkate alınarak çiçeklenme öncesi incelenmiştir. 1. Kabarık 2. Düz 3. Kıvrımlı (dalgalı) 12. Yaprak sap cebinin şekli (OIV 080, UPOV-42) (Anonymous. 1983, Anonymous. 1995) Bu özellikte tane tutumundan ben düşmeye kadar ki dönemde 10 sürgünde, sürgünün 1/3 kısmından alınan yapraklarda incelenmiştir.

75 1. U- Şekilli 2. V- Şekilli 3. Birbiri üstüne binmiş 13. Olgun yaprakta cep genişliği (Galet, 1979) Bu özellikte tane tutumundan ben düşmeye kadarki dönemde 10 sürgünde sürgünün 1/3 uç kısmından alınan yapraklarda incelenmiştir. 1. Geniş 2. Orta geniş 3. Kapalı 14. Olgun yaprakta dişlilik durumu (OIV 079, UPOV 40) (Anonymous. 1989) Bu özellik 10 sürgünde salkımın üzerindeki sürgünün 1/3 uç kısmından alınan yapraklardan incelenmiştir. 1. Sivri 2. Dış bükey 3. Đç bükey 4. Orak şeklinde

76 15. Yaprak sapı rengi (Anonymous. 1995) Bu özellik 10 sürgünde salkımın üzerindeki sürgünün 1/3 uç kısmından alınan yapraklardan incelenmiştir. 1. Yeşil 2. Kahverengi-Yeşil 3. Kırmızı 16. Yaprak sapı tüylülük durumu (Galet, 1979) Bu özellik 10 sürgünde salkımın üzerindeki sürgünün 1/3 uç kısmından alınan yapraklardan incelenmiştir. 1. Tüysüz 2. Tüylü 3. Örümcek ağı gibi tüylü 17. Sürgün (1 yıllık dal) rengi (OIV 103, UPOV-18) (Anonymous. 1983) Bu özellik dinlenme döneminde yapraklar döküldükten sonra ortalama 10 boğum arasında sürgünlerin ortasında gözlem yapılmıştır.

77 1. Sarı 2. Sarı-Kahverengi 3. Koyu kahverengi 4. Kırmızımsı kahverengi 5. Mor B. Generatif (Çiçek, Salkım ve Meyve) Özellikler 1. Çiçek tipi (OIV 151, UPOV 56) Çiçeklenme döneminde incelenmiştir. 1. Hermafrodit 2. Morfolojik erdişi fizyolojik erkek 3. Morfolojik erdişi fizyolojik dişi 4. Erkek 5. Dişi 2. Çiçeklenme zamanı (Anonymous. 1995) Çiçeklerin %50 nin açtığı dönem, çiçeklenme dönemi olarak kabul edilmiştir. 1. Erkenci

78 2. Orta erkenci 3. Orta mevsim 4. Orta geç 5. Geççi 3. Sürgün başına düşen salkım sayısı (OIV 201) (Anonymous. 1983) Bu özellik meyve olgunlaşma zamanında incelenmiştir. 4. Meyvenin olgunlaşma zamanı (Anonymous. 1995). Bu özellik 10 sürgün üzerindeki tüm salkımlarda ortalama her salkımdan 5 tane alınarak refraktometre yardımıyla belirlenmiştir. % 18 Kuru maddeye ilk ulaşanlar Erkenci % 14-18 Kuru madde Orta mevsim % 12 Kuru madde Geçci 5. Salkımdaki tane sayısı (OIV 205) (Anonymous. 1983) Bu özellik 10 sürgünde, olgunluk zamanında tüm salkımlarda gözlemlenmiştir.

79 6. Tane şekli (UPOV 64, OIV 223) (Anonymous. 1983) Bu özellik olgunluk zamanında 10 adet salkımda salkım ortasından alınan 10 tanede gözlemlenmiştir. 1. Basık 6. Küt- kalın yumurta 2. Hafif basık 7. Ters yumurta 3. Yuvarlak 8. Silindirik 4. Kısa eliptik 9. Orak şekilli 5. Yumurta şeklinde 7. Tek tane ağırlığı (OIV 503) (Anonymous. 1983) Bu özellik 5 salkımdaki tüm tanelerin ortalama ağırlığı şeklinde hesaplanmıştır. 8. Tane etinin yapısı (OIV 234, 235 ve UPOV 72) (Anonymous. 1983) Bu özellik 10 salkımda ve her salkımın orta kısmından alınan 10 tanede incelenmiştir. 1. Çok yumuşak

80 2. Yumuşak 3. Orta 4. Sert 5. Çok sert 9. Tane kabuğunun yapısı (Anonymous. 1995) Bu özellik olgun tanelerde 10 adet salkımda ve her salkımın ortasından alınan 10 tanede gözlemlenmiştir. 1. Yumuşak 2. Yarı yumuşak 3. Gevrek 4. Yarı sert 5. Sert 10. Salkım uzunluğu (OIV 203) (Anonymous. 1983). Bu özellik olgunluk döneminde 10 sürgünde bulunan tüm salkımlarda incelenmiştir. 1. Çok kısa <11.0 cm 2. Kısa 11.0-17.4 cm

81 3. Orta 17.5-22.4 cm 4. Uzun 22.5-30.0 cm 5. Çok uzun > 30 cm. 11. Salkım ağırlığı (g) (Anonymous. 1995) Bu özellik olgunluk döneminde 10 sürgünde bulunan tüm salkımlarda incelenmiştir. 1. Çok küçük <50 g 2. Küçük 50-125 g 3. Orta küçük 126-250 g 4. Orta iri 251-500 g 5. Đri 501-1000 g 6. Çok iri >1000 g 12. Salkım sıklığı (OIV 204, UPOV 59) (Anonymous. 1983) Bu özellik olgunluk döneminde 10 sürgünde bulunan tüm salkımlarda incelenmiştir. 1. Çok gevşek 2. Gevşek 3. Orta

82 4. Sık 5. Çok sık 13. Salkım sapı rengi (OIV 207, UPOV 51) (Anonymous. 1983). (Salkım sapında kahverengileşme) Bu özellik olgunluk döneminde 10 sürgündeki tüm salkımlarda gözlemlenmiştir. 1. Zayıf 2. Orta 3. Kuvvetli 14. Tane etinin sululuğu (OIV 232, UPOV-73). (Anonymous. 1983). belirlenmiştir. Bu özellik olgunlukta 10 salkımdan alınan 10 adet tanede 1. Sulu değil 2. Sulu

83 15. Salkım şekli (Galet, 1979) Bu özellik olgunlukta 10 sürgün üzerindeki tüm salkımlarda gözlemlenmiştir. 1. Silindirik 2. Silindirik-Kanatlı 3. Konik 4. Konik-kanatlı 5. Kanatlı 6. Omuzlu 16. Tane etinin kabuktan ayrılma durumu (OIV 237) (Anonymous. 1983) 1. Ayrılıyor 2. Ayrılmıyor 17. Tanedeki aroma (koku) (OIV 237) (Anonymous. 1983) Bu özellik olgunlukta 10 salkımın ortasından alınan 10 tanede gözlemlenmiştir. 1. Yok (Nötr)

84 2. Az 3. Orta 4. Çok 18.Tane şeklinin bir örnekliği (OIV 222, UPOV 63) (Anonymous. 1983) incelenmiştir. Bu özellikte olgunlukta 10 salkımın ortasından alınan 10 tanede 1. Bir örnek 2. Bir örnek değil C. Hastalık Ve Zararlılara Dayanım Özellikleri 1. Külleme (Uncinula necator ) ye dayanım (Eibach, 1994) Bu özellik 20 yapraktan elde edilen değerlerin ortalaması şeklinde belirlenmiştir. 1. Enfeksiyon yok 3. Küçük noktalar şeklinde nekrozlar; hastalıklı alanlar sınırlı

85 5. Nekrozların çapı 2-5 cm e ulaşmış, hastalıklı alanlar tamamen sınırlı 7. Geniş ve yoğun şekildeki hastalıklı alanlar; bu alanların bir kısmının sınırları halen belirli 9. Sınırsız ve çok yoğun hastalıklı alanlar; yaprağın tamamı hastalıklı 2. Kurşuni küf (Botrytis cinerea Pers.) e dayanım (Anonymous. 1995). Bu özellik hasat döneminde tüm salkımlarda gözlemlenmiştir. 1. Salkımda %10 zararlanmış taneler -dayanıklı 2. Salkımda %11-20 zararlanmış taneler -kısmen dayanıklı 3. Salkımda %21-30 zararlanmış taneler -kısmen duyarlı 4. Salkımda %31-40 zararlanmış taneler -duyarlı 5. Salkımda >%40 zararlanmış taneler -çok duyarlı

86 3. Mildiyö ye (Plasmopara viticola) dayanım (OIV 452) (Anonymous. 1983) belirlenmiştir. Bu özellik 20 yapraktan elde edilen değerlerin ortalaması şeklinde 1. Çok düşük - Belirti yok yada çok küçük nokta şeklinde nekrotik lekeler 2. Düşük - 1 cm den küçük çaplı lekeler 3. Orta - 1-2 cm çaplı küçük lekeler, etmenin sporları ve düzensiz misel oluşumu 4. Yüksek - Geniş lekeler ve yoğun bir spor oluşumu ve misel oluşumunun gözlemlenmesi, yaprak dökümü 5. Çok yüksek - Çok geniş lekelerin oluşumu, tüm yaprak alanının etmenle kaplanmış olması, yoğun bir spor oluşumu ve misel gelişimi, çok erken yaprak dökümü.

87 3.2. Metot Bu araştırmada, Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü nce 1986 yılında başlatılan Melezleme Yoluyla Külleme ve Mildiyö ye Dayanıklı ve Standart Özelliklere Sahip Yeni Üzüm Çeşitlerinin Elde Edilmesi konulu uygulama projesi kapsamında, 1992-1993 yılında Italia x Mercan üzüm çeşitlerinin melezlenmesiyle elde edilen F 1 popülasyonu kullanılmıştır. Italia x Mercan üzüm çeşitlerinin melezlenmesi sonucunda, bu kombinasyondan elde edilmiş olan ve 1997 yılından itibaren her türlü kalitatif ve kantitatif özellikler yönünden değerlendirilebilecek düzeydeki toplam 331 adet F 1 bitkisinin oluşturduğu popülasyondan vegetatif, generatif ve hastalıklara dayanım yönünden yapılan gözlem ve analizler sonucunda bu projede incelenmesi öngörülen özelliklere göre açılım gösteren 60 adet F 1 ile ana ve baba ebeveynler genom haritasının çıkarılması için kullanılmıştır. Çalışmada kullanılan 2 adet referans çeşit Cabernet Sauvignon ve Merlot, Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi

88 Bahçe Bitkileri Bölümü Aşağı Uygulama Bağındaki koleksiyon parselinden alınmıştır. Asmanın yukarıda açıklanan kalitatif ve kantitatif özelliklerini içeren genom haritasının çıkarılmasında yararlanılacak SSR (Simple Sequence Repeats) ve AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) markörlerin eldesi amacıyla kullanılan DNA ekstraksiyon (izolasyon) yöntemi, SSR ve AFLP teknikleri ile; moleküler bağlantı analizi ve kantitatif karakter lokusu analizine yönelik ilgili yöntemler aşağıda açıklanmıştır. 3.2.1. DNA ekstraksiyonu (izolasyonu) DNA ekstraksiyonu (izolasyonu) için Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü ndeki denemeye alınan 2 ebeveyn (Đtalia, Mercan) ve bunların melezlenmesiyle elde edilen 60 adet F 1 ile, A.Ü.Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Aşağı Uygulama Bağı koleksiyonundan 2 referans çeşide (Cabernet Sauvignon ve Merlot) ait alınan çelikler, Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri

89 Bölümü serasında 40 cm çapındaki saksılarda, toprak:perlit:turba (1:1:1) karışımı içerisinde yetiştirilmiş ve bu çeliklerden süren, genç yaz sürgünleri üzerinde yer alan, sürgün ucundaki yarı açılmış genç yapraklar ekstraksiyon işlemi için kullanılmıştır. Asmalarda polifenol ve polisakkaritlerin yüksek oranda bulunması nedeniyle elde edilen DNA nın kalitesi ve saflığı istenilen oranlarda olmamaktadır. Saf ve yeterli DNA ekstraksiyonu için, DNA yı polisakkaritlerden arındıran CTAB metodunu (cetyl-trimethylammonium bromide) esas alan, bir çoğu bitkilerde ilk DNA ekstraksiyon metodu olan Dellaporta et al., 1983 e ve Doyle and Doyle 1987; Doyle and Doyle 1991 in metodlarından modifiye edilen izolasyon yöntemleri kullanılmaktadır (Ergül, 2000). Bu çalışmadaki DNA ekstraksiyonu Lodhi et al. (1994) ve Lefort et al. (1998) dan modifiye edilen yönteme göre gerçekleştirilmiştir.

90 Bu yönteme göre; 0,5 g yarı açılmış sürgün uçları, steril havanlar içerisine konulur üzerine sıvı azot ilavesi yapılır. Daha sonra havan eli yardımıyla iyice parçalanır. Đyice ezilmiş bu örnekler 1,5 µl lik ependorf tüpleri içerisine 0,1 g olacak şekilde tartılıp, aktarılır, Her bir ependorf tüpüne 1 ml DNA ekstraksiyon tampon çözeltisi ilave edilir. Örnekler bu çözelti içerisinde homojenize edilir, 1 ml DNA ekstraksiyon tampon çözeltisi ilave edilmiş tüpler çözeltinin iyice karışması için birkaç kez çalkalanıp, 65 0 C deki su banyosunda 15 dakika bekletilir, Su banyosundan çıkarılarak oda sıcaklığına kadar soğuması sağlanan tüplerin üzerine 0,5 ml kloroform : isoamil alkol (24:1) çözeltisi ilave edilir. Örnekler 30 dakika buz üzerinde bekletilir, Buz üzerinden alınan örnekler 14.000 rpm de 4 dakika oda sıcaklığında santrifüj edilir,

91 1,5 µl lik yeni ependorf tüplerine santrifüjlenmiş tüplerin içerisindeki üstteki sıvı kısım 0,8 ml olacak şekilde aktarıldıktan sonra, üzerine 1 ml % 95 lik soğuk ethanol (-20 0 C) ilave edilir ve tüpler 20 0 C derin dondurucuya yerleştirilerek 1 gün bekletilir, Bu aşamada ependorf tüpleri içerisinde DNA sarmalları görülmektedir. 1 gün derin dondurucuda belletilen örnekler 14.000 rpm de 3 dakika santrifüj edilir, Sıvı kısım ependorf tüplerinden uzaklaştırılıp, çökelti % 70 lık 4 0 C lik ethanolle yıkanır. Bu işlemin yapılmasından sonra içerisinde DNA bulunan ependorf tüpleri oda koşullarında 20-30 dakika ağızları açık bırakılarak kurutulur ve ethanolün tamamen DNA dan uzaklaşması sağlanır. Bu şekilde elde edilen DNA lar, 100 λ TE içerisinde çözülür, 1 gün boyunca + 4 0 C buzdolabında TE çözeltisi içinde iyice çözülmeleri için bekletilen örnek tüplerinin her birinin üzerine 2 µl RNAase-A ilave edildikten sonra 37 0 C de 15 dakika süreyle etüvde bekletilir.

92 Çözeltiler: DNA ekstraksiyon tampon çözeltisi; 50 mm Tris-HCl, ph 8,0 50 mm EDTA (Etilen Diamine Tetra Asetik Asit), ph 8,0 0,4 M LiCl 1 % CTAB(Hekzadesil Trimetil-Amonyum Bromür), (ağırlık/hacim) 2 % PVP 0,5 ml TWEEN 20 (% 0,5) 10 λ 2- Mercaptoethanol içerir. ( Mercaptoethanol kullanım öncesinde DNA ekstraksiyon çözeltisine ilave edilir). Kloroform : isoamil alkol: 24:1 (hacim:hacim) LiCl: 0,4 M TE çözeltisi : 10 mm Tris-HCl ve 1 mm EDTA karışımı (ph 8,0) RNase A (Sigma R6513): 10 mg/ml DNA ekstraksiyonu sırasında santrifüj aşamasında RC5C sorvall santrifüj aletinde SS-34 rotoru kullanılmıştır.

93 3.2.2. PCR uygulaması Đlgili DNA ekstraksiyon yöntemine göre izole edilen DNA ların SSR (Simple Sequence Repeats) ve AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) tekniklerine uygun çoğaltımı PTC-100 MJ Research Type Thermocycler da gerçekleştirilmiştir. Bütün denemelerde 25 µl SSR için, 10 µl AFLP toplam hacim olacak şekilde PCR çoğaltımları sağlanmıştır, tekniklere ait çoğaltma ve PCR döngü koşulları aşağıda bildirilmektedir. SSR (Simple Sequence Repeats) Markörlerin Geliştirilmesinde Kullanılan Primerler PCR la çoğaltılmış mikrosatellit markörler, özel lokusa sahip ve yüksek miktarda polimorfik olmanın avantajına sahiptirler. SSR markörleri asma ıslahında; Vitis cinsinde evrimsel gelişimin moleküler analizi, Vitis vinifera L. çeşitlerinin ve Amerikan asma anaçlarının moleküler analizi, orijin belirleme, melezleme ıslahında hibrit bitki tanısı,

94 pedigri analizi ve genetik haritalama ile markör yardımı ile seleksiyon gibi değişik amaçlara yönelik olarak kullanılmaktadır (Karaağaç, 2006). (AT) n,, (GT) n, (ATT) n veya (GACA) n gibi ard arda tekrarlanan ikili, üçlü, dörtlü ve beşli nükleotid küme dizileri halinde DNA uzantıları olan, ökaryotiklerde yaygın olarak bulunan ve ard arda dizili tekrarların tekrar sayısındaki varyasyondan dolayı oldukça polimorfik olan; codominant markörlerden SSR (Simple Sequence Repeats) primerlerin bu çalışma için seçiminde asma için yayımlanan, tüm SSR primer dizilerine ulaşılabilen Yunan Vitis veribankasından faydalanılmıştır (Leford and Poubelakis-Angelakis., 2000a;2000b; Sefc et al., 2001). Pratik açıdan mikrosatellit markörlerin, tekrarlanabilirliği ve standardizasyonunun çok kolay olması sebebiyle farklı laboratuarlar arasındaki verilerin transferi ve karşılaştırılması olanağı mevcuttur (Sefc et al., 2001). DNA ya uygun çoğaltma ve PCR döngü koşulları belirlenmiştir (Bowers et al., 1996; Sefc. et al., 1999; Thomas and Scott, 1993;

95 Thomas et al., 1998). Çizelge 3.1 de çalışmada kullanılacak olan 20 adet SSR (Simple Sequence Repeats) primerlerine ait baz dizileri ile anneling (Tm) değerleri verilmektedir. Araştırma için seçilen 20 SSR (Simple Sequence Repeats) RAFFI MISKCIYAN primerleri, IDT (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, ABD) firmasından temin edilmiştir. Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan SSR primerlerine ait bilgiler. Primer 5-3 Primerlere ait baz dizileri Tm (C 0 ) Referans VVMD32 VVMD28 VVMD36 VVS3 VVS5 VVMD31 VVMD26 F TAT GAT TTT TTA GGG GGG TGA GG 56,0 R GGA AAG ATG GGA TGA CTC GC 56,4 F AAC AAT TCA ATG AAA AGA GAG AGA GAG A 56,5 R TCA TCA ATT TCG TAT CTC TAT TTG CTG 55,4 F TAT AAT AAT AAT AGG GGG ACA CGG G 56,0 R GCA ACT GTA AAG GTA AGA CAC AGT CC 59,3 F TGC CCT ATC AAT TAG TTC ACC TA 54,8 R TCG ACT TTG ATA TAT TGA TGA TT 49,2 F ATT GAT TTA TCA AAC ACC TTC TAC AT 53,0 R TAG AAA GAT GGA AGG AAT GGT GAT 55,4 F CAG TGG TTT TTC TTA AAG TTT CAA GG 55,0 R CTC TGT GAA AGA GGA AGA GAC GC 58,5 F GAG ACG ACT GGT GAC ATT GAG C 58,8 R CCA TCA CCA CCA TTT CTA CTG C 57,1 Bowers et al. (1996) Bowers et al.(1999) Bowers et al.(1999) Thomas and Scott (1993) Thomas and Scott (1993) Bowers et al.(1999) Bowers et al. (1996)

96 Çizelge 3.1.devam VVMD5 F CTA GAG CTA CGC CAA TCC AA 55,2 Bowers et al.(1996) VVS1 VrZAG21 VrZAG79 VVMD6 VVS4 VVMD7 VrZAG29 VrZAG112 VVS2 VVS29 VrZAG67 VVMD17 R TAT ACC AAA AAT CAT ATT CCT AAA 47,5 F ACA ATT GGA AAC CGC GTG GAG 59,7 R CTT CTC AAT GAT ATC TAA AAC CAT G 51,4 F TCA TTC ACT CAC TGC ATT CAT CGG C 61,3 R GGG GCT ACT CCA AAG TCA GTT CTT G 60,9 F AGA TTG TGG AGG AGG GAA CAA ACC G 62,6 R TGC CCC CAT TTT CAA ACT CCC TTC C 63,5 F ATC TCT AAC CCT AAA ACC AT 49,2 R CTG TGC TAA GAC GAA GAA GA 52,7 F CCA TCA GTG ATA AAA CCT AAT GCC 55,5 R CCC ACC TTG CCC TTA GAT GTT A 58,0 F AGA GTT GCG GAG AAC AGG AT 57,1 R CGA ACC TTC ACA CGC TTG AT 56,7 F ATA ACC AGG ACA AGT TAT TCA AGC C 57,0 R ACC CAA TTG ACC ATC TTT TAT GCT G 57,8 F CGT TTA AAG CCA GCT GAA TCT TGG G 60,3 R TGG CTC CAT ACT GCT TCA CGT AGG C 64,2 F CAG CCC GTA AAT GTA TCC ATC 54,3 R AAA TTC AAA ATT CTA ATT CAA CTG G 50,7 F CCC CAA GGC TCT GAA AAC AAT 54,7 R TGC AAA CGA AAT AAA GCT TCC A 54,4 F ACC TGG CCC GAC TCC TCT TGT ATG C 64,2 R TCC TGC CGG CGA TAA CCA AGC TAT G 65,5 F TGA CTC GCC AAA ATC TGA CG 53,6 R CAC ACA TAT CAT CAC CAC ACG G 53,4 Thomas and Scott (1993) Sefc et al. (1999) Sefc et al. (1999) Bowers et al. (1996) Thomas and Scott (1993) Bowers et al. (1996) Bowers et al. (1999) Sefc et al. (1999) Thomas and Scott (1993) Thomas and Scott (1993) Sefc et al. (1999) Bowers and Meredith (1997)

97 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Markörlerin Geliştirilmesinde Kullanılan Primerler DNA yı sıklıkla kesebilen dört nükleotidi tanımlayan Msel gibi bir enzim ile kesimlenen DNA nın, altı nükleotidi tanımlayabilen EcoRI gibi ikinci bir enzim ile kesildiği ve kesilmiş DNA parçalarına bu iki enzime özel ve sentezlenmiş olan adaptörlerin bağlandığı AFLP tekniğine özel primer kombinasyonları bu çalışma için seçilmiştir (Vos et al., 1995). AFLP tekniği, RAPD VE RFLP tekniklerinin kombinasyonu olan bir uygulamadır. AFLP tekniğinin polimorfizm oranı çok yüksektir. Çok sayıda lokusu aynı anda ve etkili bir şekilde tarar. Bu teknik asma tür, anaç ve çeşitlere ait genetik ilişkilerin ortaya çıkarılması, ekotip ve klonal polimorfizmin belirlenmesi ve genetik haritalama çalışmalarında yaygın bir şekilde kullanılmaktadır (Vos et al., 1995; Staub. and Serquen. 1996; Mueller. and Wolfenbarger. 1999). Şekil 3.3. de AFLP tekniğinin şematik gösterimi sunulmaktadır. Çizelge 3.2 de bu çalışma için planlanmış selektif AFLP primerlerine ait

98 bilgilere yer verilmektedir. Çalışmada kullanılan AFLP primerlerine ait 24 kombinasyon Çizelge 3.3 de görülmektedir. AFLP Primerleri; RAFFI MISKCIYAN; IDT (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, ABD) firmasından temin edilmiştir. AFLP primerlerinin işaretlenmesi için kullanılan radyoaktif (γ 33 P) ise; IZOTOP ( INSTITUTE of Isotopes Co., Ltd., Budapest) firmasından temin edilmiştir.

99 Şekil 3.3. AFLP tekniğinin şematik gösterimi. 5 aaaaa aaaaaa GAATTC aaaa aaaaaaaaa TTAA a a aaaaaaaaa 3 3 aaa aaaaaaaa CTTAAG aaa aa aa aaaaa AATT aaaa aaaaaaa 5 EcoR1 Mse1 aaaatt aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa T Aa a aa a a G aaaaa aaaaaaaa aaaaaaaaa AAT a aa EcoR1adaptörü Mse1 adaptörü Primer +1 5...A a aaaaaattcn aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa NTTA aaa aaa aattaagn aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa NAAT aaa aa aa C...5 Primer +1

100 Şekil 3.3. devam EcoR1 primer+ A ve Mse1 primer +C ile ön seçilimli çoğaltım Primer +3 5...AAC aa a AATTCT aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa CTTA aa a a TTAAGA aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa GAAT a a a AAC...5 Primer +3 Primer +3 ler ile seçici çoğaltım aaa AATTCTTG aaaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaa AACTTA a a a aaa TTAAGAAC aaaaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaa TTGAAT aa a Aaaaaa EcoR1 adaptör sekansı Aaaaaa Mse 1 adaptör sekansı Sekanslama jeli Kaynak: Malyshev. and Kartel. (1997); Özcan ve ark.., (2001)

101 Çizelge 3.2. Çalışmada kullanılan AFLP primerlerine ait bilgiler. Primer Primerlere ait baz dizileri Tm Bases 5-3 sıcaklıkları (C 0 ) EcoR1 CTC GTA GAC TGC GTA CC 17 MseI GAC GAT GAG TCC TGA G 16 AFLPa GAC TGC GTA CCA ATT CAT 50,5 18 AFLPc GAC TGC GTA CCA ATT CTC 50,8 18 AFLPd GAC TGC GTA CCA ATT CTG 51,2 18 M/SEL1 GAT GAG TCC TGA GTA ACA A 49,4 19 M/SEL2 GAT GAG TCC TGA GTA ACA C 50,1 19 M/SEL4 GAT GAG TCC TGA GTA ACA T 49,2 19 M/SEL5 GAT GAG TCC TGA GTA ACT A 48,1 19 M/SEL6 GAT GAG TCC TGA GTA ACT C 49,5 19 M/SEL7 GAT GAG TCC TGA GTA ACT G 49,8 19 M/SEL8 GAT GAG TCC TGA GTA ACT T 49,1 19 ESEL22 GAC TGC GTA CCA ATT CAC 51,4 18 ESEL32 GAC TGC GTA CCA ATT CAG 51,2 18

102 Çizelge 3.3. AFLP primer kombinasyonları. AFLPa+M/SEL6 ESEL22+ M/SEL1 ESEL32+ M/SEL1 AFLPa+ M/SEL2 ESEL22+ M/SEL2 ESEL32+ M/SEL2 AFLPc+ M/SEL2 ESEL22+ M/SEL3 ESEL32+ M/SEL3 AFLPc+ M/SEL5 ESEL22+ M/SEL4 ESEL32+ M/SEL4 AFLPc+ M/SEL7 ESEL22+ M/SEL5 ESEL32+ M/SEL5 AFLPd+ M/SEL2 ESEL22+ M/SEL6 ESEL32+ M/SEL6 AFLPd+ M/SEL4 ESEL22+ M/SEL7 ESEL32+ M/SEL7 AFLPd+ M/SEL6 ESEL22+ M/SEL8 ESEL32+ M/SEL8 3.2.3. SSR Tekniği Mikrosatelit lokuslarına yönelik PCR amplifikasyon koşulları: 5-10 ng DNA, 50 ng her bir primer, 1 mm dntp, 1,5 mm MgCl 2, 1x reaksiyon buffer ve su olmak üzere toplam 25 µl hacminde gerçekleştirilecektir (Çizelge 3.4). PCR program olarak ise şu şekilde uygulanacaktır. 1. 94 0 C- 3 dk 2. 94 0 C- 1dk 3. * 55 0 C- 1 dk 4. 72 0 C- 2 dk ( 2,3,4 aşamaları 10 döngü) 5. 94 0 C- 1 dk 6. 50 0 C- 2 dk 7. 72 0 C- 2 dk ( 5,6,7 aşamaları 20 döngü)

103 8. 72 0 C- 10 dk * : Sıcaklık primerin Tm sine bağlı olarak 50-60 0 C arasında değişecektir (Çizelge 3.5). Aşağıda çalışmada kullanılan SSR primerlerinin orijinleri görülmektedir. VVS1, VVS2, VVS3, VVS4, VVS5; V.vinifera cv Sultana. VVMD5, VVMD6, VVMD7; V.vinifera cv Pinot noir. VrZAG67, VrZAG79, VrZAG112; V.riparia. VVMD28, VVMD31, VVMD36; V.vinifera cv Pinot noir (Grando et al., 2002).

104 Çizelge 3.4. SSR tekniği için PCR çoğaltma öğeleri konsantrasyon ve miktarları. PCR Çoğaltma öğeleri Kullanılan konsantrasyon PCR da kullanılan miktar (µl) DNA 10 ng 5,0 10Xbuffer 1X 1,25 MgCl 2 1,5 mm 0,8 DNTP 1 mm 0,8 Primer F 50 ng 0,8 Primer R 50 ng 0,8 Taq 0,5 U 0,05 Su 10,5 Toplam 25 Çizelge 3.5. Primerlerin PCR daki döngü koşulları. Ön Denatürasyon Primer Yeni denatürasyon bağlanma iplikçik yazılımı 94 0 C- 3 dk 94 0 C- 1 dk * 55 0 C- 1 dk 72 0 C- 2 dk Son yazılım 72 0 C- 10 dk Toplam döngü sayısı 30 * : Sıcaklık primerin Tm sine bağlı olarak 50-60 0 C arasında değişecektir.

105 Agaroz jel elektroforezi SSR-PCR tekniği ile elde edilen çoğaltma ürünleri % 3 lük agaroz jelde test edilmiştir. Agaroz jele yüklenen ürünler, yatay elektroforezde 1x TBE (Tris, Borik asit, EDTA) tampon çözeltisi içerisinde 100 V da yaklaşık 2,5-3 saat koşturulduktan sonra, etidium bromid (0.01 mg/ml) ile boyanarak; UV altında (λ=302 nm) gözlemlenmiştir (Sambrook et al., 1989). 60 adet F 1, 2 ebeveyn, 2 referans çeşit ve 1 negatif kontrol; toplam 65 adet bireyde, 20 adet SSR primerlerinin kullanılmasıyla elde edilip agaroz jelde kontrol edilmiş bu çoğaltma ürünleri (bantlar) genom haritasının çıkarılması amacıyla, % 6 lık poliakrilamid jelde sekanslanmıştır. Poliakrilamid jel elektroforezi ve jel boyama Genom haritasının çıkarılması amacıyla kullanılan SSR markörlerin sonuçlarının değerlendirilmesi için standart sekans jeli

106 (%6 lık poliakrilamid, 19:1 akrilamid: bis; 8 M üre, 0,5x TBE (Tris, Borik asit, EDTA) buffer) kullanılmıştır. Sekanslama öncesinde, poliakrilamid jele yüklemeden önce SSR markörlerine ait PCR ürünleri eşit hacimde yükleme boyası (loading buffer; %98 farmamide, 10 mmol/l EDTA, %0,05 bromofenol mavisi ve xylene cyanol) ile 94 0 C de 3 dakika denatüre edilip, hemen buz üzerine alınmıştır. Denatüre edilmiş her bir reaksiyondan 10µl olacak şekilde % 6 lık poliakrilamid jele yükleme gerçekleştirilmiş ve 80 W da 2-2,5 saat süreyle elektroforez edilmiştir. 33x41 cm boyutundaki dizi analizi jel tankında (dikey elektroforez) elektroforez edilen bantların görüntülenmesi amacıyla ise gümüş boyama (silver staining) (Promega, Madison, Wis., USA) uygulanmıştır. 3.2.4. AFLP tekniği Genom haritası çıkarılması amacıyla kullanılan AFLP tekniğinde EcoR1 / Mse1 yöntemi uygulanmıştır.

107 EcoR1 / Mse1 yöntemi dikkate alınarak gerçekleştirilecek protokol aşamaları: 1. Kesimleme (Digestion) DNA (500 ng), Mse1 restriksiyon enzimi (5 u / 9 µl), EcoR1 restriksiyon enzimi (10 u/µl), 10 x reaksiyon buffer ını içeren toplam 40 µl lik karışım 37 0 C de 16 saat süre ile inkübasyon edilmiştir. 2. Adaptör takılması ( Ligation) Kesimleme yapılan karışıma Mse1 (50 pmol /µl) ve EcoR1 (5 pmol/ µl) adaptörleri; 10 mm ATP, Ligasyon buffer ve T4 ligaz (1 u/ µl) eklenerek 37 0 C de 6 saat bekletilmiştir. Mse1 adaptörü : 5 GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5 EcoR1 adaptörü :5 CTCGTAGACTGCGTACC CTGACGCATGGTTAA-5

108 3. Ön Amplifikasyon ( Pre- amplifikasyon) Adaptör takılmış DNA (1:10 seyreltilmiş), Msel1 ve EcoR1 preamplifikasyon primerleri (50 ng/µl), dntp (4 mm toplam), DNA polimeraz (5 u / µl), 10 x reaksiyon buffer ve su içeren karışımla aşağıda verilen PCR koşulları gerçekleştirilmiştir. 94 0 C de 30 sn 56 0 C de 60 sn 72 0 C de 60 sn olarak toplam 20 döngü. Preamplifikasyon Mse1 primeri: 5 - GAC GAT GAG TCC TGA GTA A-3 Preamplifikasyon EcoR1 primeri: 5 - CTC GTA GAC TGC GTA CAT GCA-3 4. Selektiv Aşaması Preamplifikasyonda çoğaltılmış DNA (1:50 seyreltilmiş), Msel1 ve EcoR1 selektif primerlerinin 24 değişik kombinasyonu (50 ng/ µl),

109 dntp (4 mm toplam), DNA polimeraz ( 5u/ µl), 10x reaksiyon bufferi ve su içeren karışımda aşağıda belirtilen PCR döngüleri gerçekleştirilmiştir (Çizelge 3.6). 94 0 C de 30 sn 65 0 C de 30 sn 72 0 C de 60 sn döngüleri takiben 65 0 C de 30 sn den başlanarak ve her döngüde 2 0 C sıcaklık düşürülerek toplam 8 döngü (65 0 C de 60 sn, 61 0 C de 60 sn gibi) 56 0 C de 30 sn olarak 23 döngü şeklinde uygulanmıştır. Çizelge 3.6. AFLP tekniği için PCR çoğaltma öğeleri konsantrasyon ve miktarları. PCR Çoğaltma öğeleri Kullanılan konsantrasyon PCR da kullanılan miktar (µl) DNA 30 ng 2,5 10Xbuffer 1X 1 MgCl 2 25 mm 1,5 DNTP 25 mm 0,08 Primer EcoR1(γ 33 P) 111 KBq 0,25 Primer M/SEL 25ng 0,75 Taq 0,5 U 0,3

110 Çizelge 3.6. devam Su 3,62 Toplam 10 Selektif EcoR1 ve Mse1 primerleri: Preamplifikasyonda kullanılan Msel1ve EcoR1 primerleri baz alınarak ve primerleri 3 uçlarına 1-3 baz eklenerek bu değişik restriksiyon enzimlerin ilavesi ile 24 yeni selektif primer kombinasyonu oluşturulmuştur. Örneğin; AT, TG, AC, TC, TT - EcoR1 selektif primerleri CAA, CAC, CAG, CAT, CTA - Mse1 selektif primerleri Poliakrilamid jel elektroforezi ve jel boyama Genom haritasının çıkarılması amacıyla kullanılan AFLP markörlerin sonuçlarının değerlendirilmesi için standart sekans jeli

111 (%6 lık poliakrilamid, 19:1 akrilamid: bis; 8 M üre, 0,5x TBE (Tris, Borik asit, EDTA) buffer) kullanılmıştır. Sekanslama öncesinde, AFLP markörlerine ait PCR ürünleri eşit hacimde yükleme boyası (loading buffer; %98 farmamide, 10 mmol/l EDTA, %0,05 bromofenol mavisi ve xylene cyanol) ile 94 0 C de 3 dakika denatüre edilip, hemen buz üzerine alınmıştır. Denatüre edilmiş her bir reaksiyon 10µl olacak şekilde % 6 lık poliakrilamid jele yüklenmiş ve 80 W da 3 saat süreyle elektroforez edilmiştir. 33x41 cm boyutundaki dizi analizi jel tankında (dikey elektroforez) elektroforez edilen bantların görüntülenmesi amacıyla poliakrilamid jel, Whatman kağıdına aktarılıp, vakumlu kurutucuda 1 saat kurutulduktan sonra, X-ray filme transfer edilmiştir (Kodak Biomax MS Film, MS-2 Size: 35cmx43 cm).

112 3.3. Moleküler bağlantı analizi ve kantitatif karakter lokus (QTL) haritalama Araştırmada kullanılan 20 adet SSR primerine ait poliakrilamid jel, genom haritasının çıkarılması amacıyla görsel olarak polimorfizm var (1), ya da yok (0) şeklinde değerlendirilmesi amacıyla scanerda taranmış ve bilgisayar ortamındaki bu jel datalarındaki veri değerlendirmeleri, Microsoft Excel Programına girilmiştir. 20 adet SSR primerinden VVMD31 SSR primeri polimorfizm göstermemiş ve değerlendirmelere alınmamıştır. Çalışmada kullanılan bazı SSR primerlerlerine ait poliakrilamid jel görüntüleri Ek 1 de görülmektedir. 24 adet AFLP primerine ait X-ray filmleri genom haritasının çıkarılması amacıyla görsel olarak polimorfizm var (1), ya da yok (0) şeklinde değerlendirilmiş ve bu primerler ait veriler Microsoft Excel Programına girilmiştir. Araştırmada kullanılan bu 24 adet AFLP primer kominasyonlarının bazılarına ait X-ray film görüntüleri Ek 2 de görülmektedir.

113 Microsoft Excel Programın girilen veriler, bağlantı analizlerinin yapılması amacıyla MAPMAKER/EXP 3.0 (Lander et al., 1987) paket programında kullanılmıştır. Bağlantı gruplarının ve markörler arası uzaklıkların belirlenmesinde LOD 3 değerleri ile 25 cm maksimum uzaklık değerleri kullanılmıştır. Genetik bağlantı analizi ile bağlantı çıkarıldıktan sonra bu harita üzerindeki markörlerle kantitatif karakterler arasındaki ilişkileri belirlemek amacı ile QTL haritalama çalışmaları yapılmıştır. 3.4. Kantitatif karakter analizi Bağlantı analizi sonucunda ana ve baba ebeveynde bağlantı gruplarına yerleşen markör lokusları üzerinde Binary Logistik Regresyon ve tek yönlü Anova istatistikî analizleri (Minitab 13.1, p 0.05) yapılarak markör karakter bağlantısı ortaya çıkarılmıştır.

114 4. BULGULAR 4.1. Fenotipik Analiz Çalışmada kullanılan F 1 popülasyonu Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü tarafından Italia x Mercan üzüm çeşitlerinin melezlenmesi ile oluşturulmuştur. Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsünce bu F 1 popülasyonunda gerçekleştirilmiş olan morfolojik analiz sonuçları Çizelge 4.1 de verilmiştir. Bu veriler daha sonra QTL analizinde kullanılmıştır. Popülasyonda gerçekleştirilen morfolojik analizlerde, Çizelge 4.1 de görülen popülasyonun dinlenme halindeki kışlık gözlerin soğuğa dayanımı (A2), genç yaprak üst yüzey tüylülüğü (A5), genç yaprak alt yüzey rengi (A6), yaprak üst yüzey tüylülüğü (A7), yaprak üst yüzey görünümü (A8), yaprak üst yüzey yapısı (A11), yaprak sapı cebinin şekli (A12), olgun yaprakta dişlilik durumu (A14), çiçek tipi (B1), salkım sapı rengi (B13) ve tane etinin kabuktan ayrılma durumu (B16) özellikleri açısından açılım göstermediği belirlenmiştir.

115 Sürgün başına düşen salkım sayısı (B3) ve salkımdaki tane sayısı (B5) hakkında bilgi yoktur. Gözlerin patladığı dönem (A3), tarih olması nedeniyle değerlendirmeye alınamamıştır. QTL analizi, geriye kalan 24 morfolojik ve hastalığa dayanım karakterleri üzerinde yapılmıştır. Popülasyonda incelemeye alınan bu 24 adet morfolojik ve hastalıklara dayanım özelliklerine yönelik istatistiksel değerlendirmeler Çizelge 4.2 de verilmiştir. Bu çizelgede yer alan değerlendirme sonuçları, popülasyonun incelenen karakterler açısından nasıl davrandığını görebilmek açısından son derece önemlidir. Çizelge 4.1 ve Çizelge 4.2 incelendiğinde anlaşılacağı gibi, generatif özelliklere ait değerler, populasyonun ancak üçte birlik bir kısmından temin edilmiştir. Bu kadar geniş bir veri kaybı, markörkarakter bağlantısının kurulmasında büyük bir engel teşkil etmektedir. Đncelen karakterlerde, değerlendirme skalalarında izlendiği gibi popülasyon genellikle dar sınırlar içerisinde dağılım göstermektedir. Örneğin tane şekli, sürgün rengi, yaprak şekli, sürgün ucunda antosiyanin

116 yoğunluğu gibi karakterler oldukça dar alanlarda farklılık göstermektedir. Kantitatif karakterlere ait değerlerin normal bir dağılım göstermelerinin istenmesi en tipik özelliğidir. C1, C2, C3 özellikleri bakımından lokusların (0:1) karşılaştırılmasında t-testi kullanılmadan önce C1, C2, C3 özelliklerinin normal dağılım gösterip göstermediği Anderson- Darling normallik testi (Minitab 13.1, p 0.05) ile analiz edilmiştir. Yapılan testler sonucunda söz konusu özelliklerin normal dağılım göstermediği görülmüştür. Dolayısıyla C1, C2, C3 özellikleri önce logaritmik transformasyona tabi tutulmuş, sonra t-testi uygulanmıştır.

117 117 Çizelge 4.1. Italia x Mercan populasyonunda yapılan morfolojik ve hastalıklara dayanım özelliklerine yönelik analiz sonuçları. A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 B1 B2 B3 B4 Đtalia 1 1 13.Nis 1 2 1 5 3 2 2 1 2 3 2 2 3 3 1 3 18,8 Mercan 5 1 18.Nis 2 5 1 5 3 1 2 1 2 2 2 2 3 2 1 2 21,2 1 5 1 16.Nis 1 3 1 5 3 1 2 2 2 2 2 3 2 2 1 3 4 5 1 16.Nis 2 2 1 5 3 1 2 2 2 1 2 3 2 2 7 5 1 18.Nis 1 2 1 5 3 1 4 1 2 3 2 2 3 3 1 3 11 5 1 13.Nis 1 5 1 5 3 2 4 2 2 2 2 2 3 3 19 5 1 13.Nis 2 5 1 5 3 2 2 1 2 3 2 2 2 3 1 1 46 5 1 18.Nis 1 5 1 5 3 2 4 1 2 2 2 2 3 3 23,2 47 3 1 16.Nis 1 5 1 5 3 1 2 1 2 2 2 3 1 1 1 2 69 3 1 13.Nis 1 5 1 5 3 2 2 1 2 3 2 2 2 2 1 3 19 71 5 1 16.Nis 2 5 1 5 3 2 3 1 2 2 2 2 2 2 1 3 78 5 1 13.Nis 2 5 1 5 3 1 2 1 2 2 2 3 3 2 1 2 19,8 84 5 1 13.Nis 2 5 3 2 4 1 2 2 2 3 3 2 1 3 89 5 1 18.Nis 1 5 1 5 3 1 2 1 2 2 2 2 3 2 1 3 21,6 97 5 1 16.Nis 2 5 1 5 3 1 3 1 2 2 2 2 2 2 1 3 98 1 1 16.Nis 1 5 1 5 3 3 2 1 2 2 2 2 2 2 1 4 21,4 101 5 1 16.Nis 2 5 1 5 3 1 3 1 2 2 2 2 2 2 1 2 106 3 1 16.Nis 2 5 1 5 3 1 2 1 2 2 2 3 2 3 1 3 22,2 112 5 1 18.Nis 1 5 1 5 3 3 3 1 2 2 2 2 2 2 1 2 119 5 1 22.Nis 1 5 1 5 3 1 2 1 2 2 2 2 2 2 1 3 132 3 1 16.Nis 1 5 1 5 3 1 2 1 2 2 2 1 2 3 143 3 1 13.Nis 2 5 1 5 3 2 2 1 2 2 2 2 2 2 149 5 1 18.Nis 3 5 1 5 3 2 3 1 2 2 2 3 3 2 3 3 152 5 1 18.Nis 1 5 1 5 3 2 3 1 2 2 2 3 2 3 1 1

118 118 Çizelge 4.1. devam A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 B1 B2 B3 B4 163 3 1 16.Nis 1 5 1 5 3 2 3 1 2 3 2 2 3 3 1 2 174 5 1 13.Nis 1 5 1 1 5 3 3 1 2 3 2 2 3 2 187 5 1 18.Nis 2 5 1 5 3 3 4 1 2 2 2 2 2 3 1 2 192 5 1 13.Nis 2 5 1 5 3 1 3 1 2 2 2 2 2 3 1 2 22,6 193 3 1 13.Nis 1 5 1 5 3 1 3 1 2 2 2 2 1 3 1 1 195 5 1 18.Nis 2 5 1 5 3 1 4 1 2 2 2 3 2 2 1 3 20,2 223 5 1 16.Nis 1 5 1 5 3 2 3 1 2 2 2 2 1 2 1 2 225 5 1 13.Nis 2 5 1 5 3 2 2 1 2 2 2 2 2 1 2 228 3 1 16.Nis 2 5 1 5 3 1 4 1 2 2 2 2 2 2 1 1 230 5 1 16.Nis 2 5 1 5 3 1 3 1 2 3 2 2 3 3 1 1 237 3 1 16.Nis 1 5 1 5 3 2 2 1 2 3 2 2 2 3 1 4 254 3 1 13.Nis 1 5 1 5 3 1 2 1 2 3 2 2 2 3 1 3 23,2 255 5 1 16.Nis 2 5 1 5 3 1 3 1 2 2 2 3 2 3 1 2 22 256 5 1 18.Nis 1 5 1 5 3 1 4 1 2 2 2 2 2 3 1 2 257 5 1 13.Nis 2 5 1 5 3 1 3 1 2 2 2 2 1 2 1 2 20,2 258 5 1 18.Nis 2 5 1 5 3 1 2 1 2 2 2 3 2 2 1 2 260 5 1 27.Nis 2 5 1 5 3 1 2 1 2 2 2 2 2 2 1 3 261 5 1 21.Nis 1 5 1 5 3 1 4 1 2 2 2 2 2 3 1 4 21,2 262 3 1 16.Nis 1 5 1 5 3 1 4 1 2 2 2 2 2 3 1 2 21,8 263 5 1 18.Nis 2 5 1 5 3 3 4 1 2 3 2 2 3 2 1 4 264 5 1 18.Nis 2 5 1 5 3 3 2 1 2 2 2 3 2 2 1 2 21,4 266 5 1 18.Nis 2 5 1 5 3 3 3 1 2 3 2 2 3 2 1 2 22,6 267 3 1 16.Nis 1 3 1 5 3 3 3 1 2 3 2 2 3 2 1 2 16,6 270 5 1 16.Nis 2 5 1 5 3 1 2 1 2 2 2 2 3 2 22 271 5 1 16.Nis 2 5 1 5 3 1 4 1 2 2 2 2 2 3 1 2 23,5

119 119 Çizelge 4.1. devam A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 B1 B2 B3 B4 272 5 1 13.Nis 2 5 1 5 3 3 3 1 2 3 2 2 2 3 1 3 283 5 1 13.Nis 2 5 1 5 3 1 2 1 2 2 2 2 3 3 1 1 289 5 1 13.Nis 2 5 1 5 3 3 3 1 2 2 2 2 3 2 1 2 295 5 1 18.Nis 2 5 1 5 3 3 3 1 2 3 2 2 2 2 1 3 307 5 1 16.Nis 2 5 1 5 3 3 3 1 2 2 2 2 2 2 1 3 311 5 1 16.Nis 1 5 1 5 3 2 2 1 2 2 2 2 3 2 1 1 314 3 1 16.Nis 1 5 1 5 3 3 3 1 2 2 2 2 3 2 1 4 318 3 1 13.Nis 2 5 1 5 3 1 3 1 2 2 2 2 1 2 1 2 21,4 327 5 1 18.Nis 2 5 1 5 3 3 2 1 2 2 2 2 2 2 1 4 22,4 328 5 1 18.Nis 2 5 1 5 3 3 4 1 2 3 2 2 2 2 1 2 329 5 1 16.Nis 2 5 1 5 3 1 3 1 2 3 2 2 3 3 1 2 331 5 1 16.Nis 2 5 1 5 3 1 3 1 2 3 2 2 3 2 1 3 22 419

120 120 Çizelge 4.1. devam B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 C1 C2 C3 Đtalia 4 11,26 3 3 4 5 3 1 1 4 2 4 1 9 4 0,4 Mercan 3 2,6 2 3 3 3 4 2 2 1 1 1 1 4 1 0,25 1 4 1 0,2 4 6 3 0 7 9 1 0,1 11 1 1 3 19 7,2 3 1,2 46 3 3,9 2 4 2 2 5 2 1 1 1 3 2 2,2 1 0,7 47 1 1 0,25 69 3 2,8 2 4 2 2 4 2 1 3 1 1 2 5 1 0,35 71 8 1 0,7 78 2,6 1,8 1 0,55 84 9 1 0,75 89 1,9 9 1 0,55 97 2,4 4 1,15 98 3 2,5 2 4 2 3 4 2 1 3 1 3 2 5 1 0,95 101 7 0,45 106 3 3,7 2 2 2 2 2 2 9 1 0,7 112 7 3 1,15 119 3,9 1 0,9 132 9 0,15 143 5,3 1 0,05 149 9 0,4 152 8,1 1 0,25 163 9 1 0,1

121 121 Çizelge 4.1. devam B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 C1 C2 C3 174 187 9 1 0,75 192 3 3,8 2 4 2 2 4 2 1 1 1 2 9 1 0,25 193 5 1 0,65 195 3 2,5 3 5 1 2 4 2 1 1 1 1 1 1 1 0,4 223 9 1 0,05 225 9 2 0,75 228 9 1 0,6 230 9 4 0,65 237 9 1 0,5 254 3 2,7 4 4 2 2 2 2 2 3 1 2 2 2,2 1 0,4 255 3 4,4 4 4 2 2 1 1 9 1 0,35 256 9 1 0,5 257 3 3,7 4 4 2 2 3 2 2 3 1 3 2 7 3 0,35 258 1,7 1 0,35 260 9 5 0,3 261 3 3,3 4 4 2 3 4 2 2 1 1 1 1 5 1 0,55 262 3 3,6 4 4 2 2 3 2 2 1 3 1 5 1 0,3 263 9 1 0,55 264 3 3,5 4 4 3 3 4 2 2 4 1 3 1 7 1 0,65 266 3 3,6 4 4 2 2 4 2 2 4 1 1 1 9 1 0,5 267 3 4 4 2 3 3 2 2 3 1 1 1 1,8 1 0,4 270 3 2,5 4 4 4 2 2 1 1 3 1 0,15 271 4 3,2 4 4 3 3 3 2 2 1 1 2 1 9 0,19

122 122 Çizelge 4.1. devam B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 C1 C2 C3 272 9 1 0,7 283 9 1 1 289 9 1 1,05 295 9 1 1,2 307 3 1 1,25 311 9 1 1 314 9 5 0,6 318 3 3,1 4 4 2 2 2 2 2 1 1 2 4 1,4 327 3,5 3 0,7 328 9 1,4 329 3,7 0,75 331 3 3,9 4 4 3 3 3 2 2 4 1 2 2 9 1 0,45 419

123 Çizelge 4.2. Italia x Mercan populasyonunda incelenen fenotipik özelliklere ait istatistiksel değerlendirmeler Kodu Karakter Gözlem Sayısı Ort.± S.S. Minimum Değer Maksimum Değer A1 Sürgün ucunda antosiyanin yoğunluğu 59 4,46 ± 0,971 1 5 A4 Genç yaprak üst yüzey 59 1,61 ± 0,526 1 3 rengi A9 Yaprak formu 59 1,75 ± 0,843 1 3 A10 Yaprak şekli 59 2,85 ± 0,761 2 4 A13 Olgun yaprakta cep 59 2,25 ± 0,477 1 3 genişliği A15 Yaprak sapı rengi 58 2,19 ± 0,438 1 3 A16 Yaprak sapı tüylülük 59 2,25 ± 0,604 1 3 durumu A17 1 yıllık dal rengi 59 2,36 ± 0,517 1 3 B2 Çiçeklenme zamanı 52 2,42 ± 0,871 1 4 B4 Meyvenin olgunlaşma 21 21,44±1,596 16,6 23,.5 zamanı B6 Tane şekli 18 3,06 ± 0,236 3 4 B7 Tek tane ağırlığı 20 3,24 ± 0,637 1,9 4.4 B8 Tane etinin yapısı 18 3,39 ± 0,916 2 4 B9 Tane kabuğunun yapısı 18 3,94 ± 0,539 2 5 B10 Salkım uzunluğu 16 2,13 ± 0,500 1 3 B11 Salkım ağırlığı 16 2,38 ± 0,500 2 3 B12 Salkım sıklığı 17 3,41 ± 0,870 2 5 B14 Tane etinin sululuğu 17 1,71 ± 0,470 1 2 B15 Salkım şekli 12 2,58 ± 1,240 1 4

124 Çizelge 4.2. devam B17 Tanede aroma 17 1,77 ± 0,903 1 3 B18 Tane şeklinin bir örnekliği 15 1,53 ± 0,516 1 2 C1 Küllemeye dayanım 58 6,54 ± 2,871 1 9 C2 Kurşuni küfe dayanım 50 1,46 ± 1,073 1 5 C3 Mildiyöye dayanım 59 0,63 ± 0,471 0 3 4.2. Moleküler Analiz DNA izolasyonu Çalışmadaki DNA ekstraksiyonu Lodhi et al., (1994) ve Lefort et al., (1998) in DNA izolasyon yöntemlerinden modifiye edilerek gerçekleştirilen ekstraksiyon prosedürüne göre yapılmıştır. Belirtilen yönteme göre Italia, Mercan, Italia x Mercan F 1 lerine ve referans çeşitlere (Cabernet Sauvignon ve Merlot) ait DNA ların saflık ve miktar değerleri NanoDrop ND1000 ile belirlenmiştir (Çizelge 4.3.).

125 DNA ların miktar tayininde absorbsiyon temeline dayanan spektrometrik yöntemler kullanılır. Ölçümlerde 260 nm de absorbsiyon değeri (A 260 ); oldukça saf olarak izole edilen nükleik asitlerin mikrogram düzeyinde miktarların belirlenmesinde kullanılır. Sadece A 260 değeri DNA ve RNA yı tam olarak ayırt etmediği için proteinlerin absorbsiyon özelliği gösterdiği 280 nm deki ölçüm değerleri de önemlidir. 260 ve 280 nm dalga boylarında okunan değerler arasındaki oran nükleik asitlerin saflığı hakkında bilgi vermektedir. Moleküler düzeyde yapılan çalışmalarda saflaştırılmış DNA da A 260/280 oranının 1.8-2.0 arasında olması istenmektedir. Çalışmada elde edilen DNA ların saflıklarının 1.79 1.99 arasında değiştiği Çizelge 4.3. de görülmektedir.

126 Çizelge 4.3. Italia, Mercan ve Italia x Mercan F 1 lerine ait DNA ların saflık ve miktar değerleri. Genotip DNA Miktarı (ng/ul) DNA saflığı (260/280) Italia 1824,41 1,87 Mercan 1378,06 1,89 F1 1134,47 1,86 F4 1289,36 1,92 F7 1469,24 1,9 F11 945,72 1,84 F19 1823,04 1,87 F46 1671,34 1,89 F47 19,41 1,83 F69 1325,82 1,87 F71 950,3 1,79 F78 1299,8 1,88 F84 1295,44 1,93 F89 1370,77 1,81 F97 1195,56 1,84 F98 2036,81 1,9 F101 1943,94 1,9 F106 1355,24 1,9 F112 1892,81 1,91 F119 1230,84 1,86 F132 811,71 1,85 F143 1793,91 1,87 F149 758,69 1,99

127 Çizelge 4.3. devam. Genotip DNA Miktarı (ng/ul) DNA saflığı (260/280) F152 1815,21 1,88 F163 1942,49 1,91 F174 1356,82 1,9 F187 1290,49 1,86 F192 1638,28 1,88 F193 1369,58 1,9 F195 1636,95 1,47 F223 2734,53 1,89 F225 1665,12 1,87 F228 1177,32 1,87 F230 1835,62 1,89 F237 1394,34 0,99 F254 1379,25 1,74 F255 1789,36 2,19 F256 1623,55 1,88 F257 342,33 1,81 F258 703,81 1,84 F260 2477,15 1,92 F261 987,65 1,23 F262 2858,99 1,9 F263 869,74 1,64 F264 1610,59 1,86 F266 1609,64 1,83 F267 1168,51 1,85 F270 1609,42 1,84 F271 1522,65 2,77

128 Çizelge 4.3. devam. Genotip DNA Miktarı (ng/ul) DNA saflığı (260/280) F272 952,44 1,99 F283 1856,94 1,89 F289 1156,84 1,9 F295 1294,4 1,91 F307 1470,36 1,89 F311 891,52 1,86 F314 1594,55 1,87 F318 1720,81 1,9 F327 1393,7 1,89 F328 1592 1,87 F329 2806,3 1,94 F331 1544,99 1,91 F419 1672,77 1,88 DNA moleküllerinin analizinde kullanılan en basit, hızlı ve rutin olarak uygulanabilen elektriksel bir alanda, DNA ların jel üzerindeki göçüne dayanan yöntemdir. Agaroz jel elektroforez yöntemi; çalışmada ekstrakte edilmiş olan DNA ların görsel olarak saptanabilmesi amaçlı kullanılmıştır. Şekil 4.1 de %1.5 luk agaroz jel kullanılarak elektroforez edilmiş DNA ların görüntüleri görülmektedir.

129 Şekil 4.1. Agaroz jel (%1.5) de Italia x Mercan populasyonunda elde edilen DNA ların görüntüleri. PCR Uygulamaları Araştırmada 20 adet SSR ve 24 adet AFLP primeri kullanılmıştır. Kullanılan 20 adet SSR primerinden 19 tanesi ve 24 adet AFLP pirimeri; toplamda 44 adet primerden 43 ü en az bir adedi polimorfizim göstermiştir. SSR primerlerinden VVMD31 nin polimorfizm göstermediği tespit edilmiştir. Test edilen 19 adet SSR primerlerden ile

130 test edilen 24 adet AFLP primerlerine ait DNA bant desenlerinin bazılarına ait görüntüler Ek 1 ve Ek 2 de görülmektedir. Polimorfik olduğu tespit edilen SSR ve AFLP primerlerinden elde edilen bantlardan toplamda 818 adedinin popülasyonda polimorfizm gösterdiği tespit edilmiştir. SSR primerleri için bu sayı 47 iken, AFLP primerleri için bu sayının 771 olduğu belirlenmiştir. 19 adet lokus ise Mendel dağılımına uygun açılım göstermediği için bağlantı analizi dışında tutulmuştur. Çizelge 4.4 de her iki primere ait lokuslar ve polimorfizmleri hakkında bilgi verilmektedir. Her iki primer lokusların polimorfik primer başına oranı 19,023 seviyesinde kalmıştır. SSR için polimorfik primer başına oran 2,470 iken AFLP için 32,125 seviyesinde olduğu belirlenmiştir (Çizelge. 4.5). Lokusların her bir bireyde var (1), yok (0) ya da çoğaltımın bireyde olmaması nedeniyle tespit edilemediği durumlarda (-) şeklinde değerlendirmesi yapılarak sonuçlar Microsoft Excel çalışma sayfasına girilmiştir. Lokusların varlığı/yokluğu durumlarının Mendel

131 dağılımlarına uyumlarını test etmek amacıyla χ 2 testi (p 0.05) yapılarak elde edilen lokuslardaki 1 ve 0 sayılarının 1:1 veya 3:1 dağılımlarına uygunluğu belirlenmiştir. Çizelge 4.4. Primerler lokusları hakkında bilgi. PRĐMER LOKUS SAYISI POLĐMORFĐK LOKUS SAYISI VVMD32 2 2 VVMD28 4 3 VVMD36 4 4 VVS3 2 1 VVS5 2 2 VVMD17 2 1 VVMD26 2 1 VVMD5 3 3 VVS1 3 2 VrZAG21 6 5 VrZAG79 2 2 VVMD6 5 5 VVS4 2 1 VVMD7 2 1 VrZAG29 4 4 VrZAG112 2 2 VVS2 4 4 VVS29 2 2 VrZAG67 2 2 VVMD31 Polimorfizm görülmedi SSR TOPLAM 55 47 AFLPa+M/SEL6 23 22 AFLPa+ M/SEL2 30 30 AFLPc+ M/SEL2 21 21 AFLPc+ M/SEL5 11 11 AFLPc+ M/SEL7 32 32 AFLPd+ M/SEL2 31 30 AFLPd+ M/SEL4 31 31 AFLPd+ M/SEL6 37 36 ESEL22+ M/SEL1 53 52

132 Çizelge 4.4.devam PRĐMER LOKUS SAYISI POLĐMORFĐK LOKUS SAYISI ESEL22+ M/SEL2 40 39 ESEL22+ M/SEL3 23 23 ESEL22+ M/SEL4 22 20 ESEL22+ M/SEL5 18 18 ESEL22+ M/SEL6 37 36 ESEL22+ M/SEL7 10 10 ESEL22+ M/SEL8 39 39 ESEL32+ M/SEL1 32 32 ESEL32+ M/SEL2 47 46 ESEL32+ M/SEL3 12 12 ESEL32+ M/SEL4 60 59 ESEL32+ M/SEL5 24 24 ESEL32+ M/SEL6 58 58 ESEL32+ M/SEL7 19 19 ESEL32+ M/SEL8 72 71 AFLP TOPLAM 782 771 Buna göre toplamda 818 adet lokustan 72 adedi ana ebeveynde (Italia) 1:1 açılım gösterirken, bu sayı baba ebeveynde (Mercan) 40 olmuştur. SSR primerleri bazında bu durumu incelediğimizde Italia da 1:1 açılım 12 adet lokusta gözlemlenmiş, AFLP pirmeri için ise 60 olarak elde edilmiştir. 3:1 dağılım gösteren heterozigotik lokus sayısı ise SSR için 4, AFLP için 73, toplamda 77 olarak tespit edilmiştir.

133 Çizelge 4.5. Açılım gösteren lokuslar hakkında bilgi. SSR AFLP GENEL 62 Bireyde Test Edilen Primer 20 24 44 Sayısı En Az Bir Potansiyel Polimorfik Lokus Gösteren Primer Sayısı 19 24 43 Polimorfik Primerlerin Test 95 100 97 Edilen Toplam Primerlere Oranı (%) Toplam Polimorfik Lokus Sayısı 47 771 818 Polimorfik Primer Başına Düşen 2,470 32,125 19,023 Polimorfik Lokus Sayısı 1:1 Açılım Gösteren Lokus Sayısı 23 89 112 1:1 Açılım Gösteren Lokusların Polimorfik Primer Başına Oranı 1,211 3,708 2,604 Açılım Gösteren Lokusların 1.068 17.522 18,591 Toplam Primer Başına Oranı 4.3. Genetik Bağlantı Analizi SSR ve AFLP analizi sonucunda elde edilen datalar için veri dosyaları oluşturulmuştur. Bu datalar için 3 ebeveynsel veri dosyası meydana getirilmiştir, 1) 1:1 açılan bantlar, Italia da var Mercan da yok,

134 2) 1:1 açılan bantlar, Mercan da var Italia da yok, 3) Her iki ebeveynde olan bantlar (dölde 3:1 açılım gösteren bantlar). Bir bantın çoğaltımı o lokusun bir bireyde heterozigot diğerinde homozigot resesif olduğu anlamına gelmektedir. Bantın her iki ebeveynde olması ve dölde açılım göstermesi ise ebeveynlerde heterozigotluğu göstermektedir. Her iki ebeveynde heterozigot olan bantlar ilk bağlantı analizinde kullanılmamıştır. Markörlerin isimlendirilmesinde primer isimleri kullanılmıştır. Harfler alfabetik sıraya göre ve en büyük bant büyüklüğünden en küçük bant büyüklüğüne doğru isimlendirilmiştir. Bağlantı gruplarının tespiti ve markörlerin yerlerinin belirlenmesi amacıyla MAPMAKER/EXP 3.0 (Lander et al., 1987) paket programında markörler arası maksimum uzaklık 25 cm ve LOD 3.0 Haldane (1919) haritalama fonksiyonu kullanılarak yapılmıştır. Bu LOD

135 3.0 değerine göre elde edilen harita temel harita olarak kabul edilmiş ve takip eden QTL analizi bu harita üzerinde yapılmıştır. Yalancı melezleme (pseudotestcross) populasyonlarında bağlantı fazı (coupling veya repulsion) bilinmediğinden her bir açılım gösteren lokus bir sessiz lokus (dummy locus) ile eşleştirilmiştir. Örneğin; Lokus 1 HHAHHHAAAAHAAHHHAA Lokus 1d AAHAAAHHHHAHHAAAHH A homozigot resesif (- / -) ve H heterozigot (+ / -) genotipleri göstermektedir. Her harf her bir F 1 in genotipini temsil etmektedir. Lokus 1d lokus 1 in tam zıttıdır. Bu düzenleme her bir ebeveyne ait coupling ve repulsion fazı ile karışık halde 2 bağlantı haritası vermiştir. Sadece bir tanesi daha ileri analizler için rastgele seçilmiştir. Bağlantı gruplarının tespitine yönelik analiz sonucunda ana ebeveyn (Italia) çeşidi 6 (maternal harita) ve baba ebeveyn (Mercan)

136 çeşidi (paternal harita) ise 1 bağlantı grubu vermiştir. Italia da açılım gösteren 72 adet lokustan sadece 14 tanesi bağlantı grupları üzerine yerleşmiştir (Şekil 4.3). Mercan çeşidinde ise 1:1 açılım gösteren 40 adet lokustan 2 adedi 1 bağlantı grubuna yerleştiği belirlenmiştir (Şekil 4.2). VVS1c 9,1cM VVS1d Bağlantı grubu 1 Şekil 4.2. Mercan üzüm çeşidine (baba ebeveyn) ait bağlantı grubu

137 VVS1a 15,5cM VVS1c VrZAG29a 3,7cM VrZAG29c AFLPa+Msel 6/17 25.5cM AFLPa+Msel 6/19 Bağlantı grubu 1 Bağlantı grubu 2 Bağlantı grubu 3 AFLPc+Msel 7/15 AFLPd+Msel6/30 AFLPc+Msel 2/12 11,2cM AFLPc+Msel 7/16 34,7cM 25.5cM 31,4cM AFLPd+Msel 6/32 AFLPc+Msel 2/14 34,7cM ESEL 22+Msel 5 AFLPc+Msel 2/3d Bağlantı grubu 4 Bağlantı grubu 5 Bağlantı grubu 6 Şekil 4.3. Italia üzüm çeşidine (ana ebeveyn) ait bağlantı grupları

138 Bağlantı gruplarının incelenmesi sonucunda ana ebeveyn Italia da elde edilen 6 bağlantı grubu üzerinde 14 adet markör lokusu yerleşirken, 1 bağlantı grubundan oluşan baba ebeveyn Mercanın bağlantı haritası ise sadece 2 adet markör lokusu içermektedir. Analiz sonucunda Italia x Mercan populasyonunda elde edilen genetik haritaların karşılaştırması Çizelge 4.6 te verilmiştir. Çizelge 4.6. Italia x Mercan a ait genetik haritaların karşılaştırılması Toplam Italia (ana) Mercan (baba) Kapsanan toplam uzaklık (cm) - 188 9,1 Haritalanan markör sayısı 16 14 2 Markörler arası ortalama uzaklık (cm) 8,985 13,420 4,550 Bağlantı grubu sayısı 7 6 1 En geniş bağlantı grubu (cm) 69,3 9,1 En geniş bağlantı grubundaki markör sayısı 3 2

139 Italia ya ait genetik haritada bulunan 14 lokus arasında ortalama 13,420 cm lık bir uzaklık bulunmuştur. Bu değer baba ebeveyn Mercan ın genetik haritası için 4,550 cm olarak saptanmıştır. En geniş bağlantı grubu Italia da üzerine 3 lokusun yerleştiği 69,3 cm lık 5. grup olmuştur. Mercan da ise tek bağlantı grubu 9,1 cm lık genişlik ile bağlantı grubunu 2 markör lokusundan meydana getirmiştir. Ebeveyn olarak kullanılan Italia ve Mercan çeşitlerinde bireysel bağlantı gruplarının analiz sonuçları Çizelge 4.7 ve 4.8 te verilmiştir. Ana ebeveyn Italia nın bağlantı haritasında en geniş aralık 34,7cM ile 5 numaralı bağlantı grubundan elde edilmiştir, en dar aralık ise 2. bağlantı grubu VrZAG29a ve VrZAG29c arasında 3,7 cm olarak belirlenmiştir. Mercan da ise tek bağlantı grubu 9,1 cm şeklinde olmuştur..

140 Çizelge 4.7. Italia çeşidinde bağlantı gruplarına yerleşen markörler ve uzaklıkları Markör Uzaklık cm Bağlantı Grubu No VVS1a 15,5 1 VVS1d VrZAG29a 3,7 2 VrZAG29c AFLPa+Msel 6/17 31,4 3 AFLPa+Msel 6/19 AFLPc+Msel 7/15 AFLPc+Msel 7/16 ESEL 22+Msel 5 11,2 31,4 4 AFLPd+Msel 6/30 AFLPd+Msel 6/32 AFLPc+Msel 2/3d AFLPc+Msel 2/12 AFLPc+Msel 2/14 34,7 5 34,7 27.5 6 Çizelge 4.8. Mercan çeşidinde bağlantı grubuna yerleşen markörler ve uzunlukları Markör Uzaklık cm Bağlantı Grubu No VVS2c 9,1 1 VVS2d

141 Italia ve Mercan çeşitlerinde bağlantı analizi sonuçların toplu gösterimi ise Çizelge 4.9 da verilmiştir. Çizelge 4.9 incelendiğinde, ana ebeveyne (Italia) ait genetik haritanın baba ebeveyne (Mercan) göre daha büyük olduğu görülmektedir. Çizelge 4.9. Italia ve Mercan çeşitlerinde bağlantı analizi sonuçları Italia Mercan Bağlantı grubu Toplam Markör Toplam Markör uzaklık sayısı uzaklık sayısı (cm) (cm) I 15,5 2 9,1 2 II 3,7 3 III 31,4 2 IV 42,6 3 V 69,3 3 VI 25,5 2 TOPLAM 188 19 9,1 2

142 4.4. Kantitatif Karakter Analizi Bu araştırmada 24 adet açılım gösteren morfolojik ve hastalığa dayanım karakterine ait veriler kantitatif karakter lokusu (QTL) analizi için kullanılmıştır. Bağlantı gruplarına yerleşen markörlerin karakterlere olan bağlılık durumlarını tespit etmek amacıyla istatistiki analizler Minitab 13.1 paket programında gerçekleştirilmiştir. Özelliklerin normal dağılım gösterip göstermediğini anlamak için Anderson-Darling normallik testi uygulanmış, yapılan testler sonucunda söz konusu özelliklerin normal dağılım göstermediklerinden dolayı, özellikler logaritmik transformasyona tabi tutulmuş, daha sonra t-testi uygulanmış, normal dağılım göstermeyen karakterlerde Binary Lojistik Regresyon (p 0.05) gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın sonucunda yeteri kadar doygun bir moleküler genetik harita elde edilememiş olmasından dolayı bu analiz yöntemleri seçilmiştir. QTL haritalama çalışmalarında bilim adamlarının hizmetine sunulmuş olan paket programlarından bu nedenle faydalanılamamıştır.

143 Binary lojistik regresyon yöntemine göre 12 adet markör lokusu 12 adet morfolojik karakter ile bağlantılı bulunmuştur (Çizelge 4.10). Çizelge 4.10. Binary lojistik regresyon analizi sonuçları Markör Karakter P ( 0.05) Odds Ratio ** VVS2c Salkım uzunluğu 0.027 0,00 1 **VVS2c Salkım ağırlığı 0,005 0,00 1 **VVS2d Yaprak şekli 0,028 2,23 1 ** VVS2d Olgun yaprakta cep genişliği 0,041 0,31 1 **VVS2d Salkım uzunluğu 0,027 0,00 1 **VVS2d Salkım ağırlığı 0,005 0,00 1 *VVS1c Yaprak sapı tüylülük durumu *VVS1c Sürgün (1yıllık dal) rengi *VVS1c Çiçeklenme zamanı *VrZAG29a Yaprak sapı tüylülük durumu 0,017 3,00 2 0.026 3,24 2 0,044 0,50 2 0,026 2,87 3 *VrZAG29a Tek tane ağırlığı 0,007 0,09 3 *VrZAG29c Yaprak sapı tüylülük durumu 0,010 3,43 3 *VrZAG29c Tek tane ağırlığı 0,018 0,13 3 *AFLPa+MSEL6/17 Yaprak şekli 0,045 0,49 5 *AFLPa+MSEL6/17 Salkım şekli 0,031 8,71 5 Bağlantı Grubu

144 Çizelge 4.10. devam Markör Karakter P ( 0.05) Odds Ratio Bağlantı Grubu *AFLPa+MSEL6/19 Tane şeklinin bir örnekliği *AFLPc+MSEL7/15 Meyvenin olgunlaşma zamanı *ESEL22+MSEL5/1 Sürgün 3 (1yıllık dal) rengi *AFLPd+MSEL6/30 Meyvenin olgunlaşma zamanı 0,005 0,00 5 0,035 2,11 7 0,046 0,35 8 0,047 0,51 9 *AFLPd+MSEL6/32 Yaprak şekli 0,018 0,43 9 *AFLPd+MSEL6/32 Tanedeki 0,036 0,00 9 aroma *AFLPc+MSEL2/14 Tane şeklinin bir örnekliği 0,014 18,00 11 *AFLPc+MSEL7/16 Sürgün 0,029 3,17 8 (1yıllık dal) rengi * AFLPc+MSEL7/16 Salkım şekli 0,029 0,24 8 *Italia moleküler bağlantı haritasında yer almaktadır. ** Mercan moleküler bağlantı haritasında yer almaktadır. Logaritmik transformasyona tabi tutulup, daha sonra t-testi uygulanmış, hastalığa dayanım karakterlerinin analiz sonuçları Çizelge 4.11 de verilmiştir.

145 Çizelge 4.11. Hastalığa dayanım karakterleri sonuçları Markör Karakter VrZAG29a Küllemeye dayanım VrZAG29c Küllemeye dayanım Bağlantı P ( 0.05) Grup Ort ± S.S. grubu ve uzeklık cm 0.011 1 0 0.011 1 0 0,434±0,708 0,974±0,803 0,444±0,695 0,983±0815 3 3,7cM Çalışmada hastalığa dayanım karakterleri (küllemeye dayanım (C1), kurşuni küfe dayanım (C2) ve mildiyöye dayanım (C3)) incelendiğinde kurşuni küf ve mildiyöye dayanıma bağlı hiçbir markör tespit edilememiştir. Buna karşılık küllemeye dayanımın kontrolü ile ilgili markörlerin Italia çeşidinde 3 nolu bağlantı grubunda bulunan lokusda olduğu tespit edilmiştir.

146 5. TARTIŞMA ve SONUÇ Modern bitki ıslahı uygulamalı bilim içerisinde dinamik bir alandır. Islahçı, genetik varyasyonları kullanarak yetiştirici ve tüketicilerin ilgilendiği karakterleri içeren yeni çeşitlerin geliştirilmesi için çalışır. Bitkilerdeki kalıtsal olan özellikler, o özelliği kontrol eden gen sayısına bağlı olarak kalitatif ve kantitatif karakterler olarak adlandırılmaktadır. Kalitatif karakterlerin kalıtımı genel olarak Mendel prensipleri ile kolaylıkla açıklanabilir. Kantitatif karakterler ise kültür bitkilerindeki verim ve kalite yada hastalıklara dayanım gibi fazla sayıda genin ortak faaliyeti sonucu ortaya çıkar. Çevre faktörlerinin etkisi altında kalan kantitatif karakterlerin kalıtımı ise bitki ıslahı açısından çok önemlidir (Asins, 2002). 75 yıldan daha uzun bir zamandır QTL tanımlanması için DNA markörlerin ve güçlü biyometrik metodların geliştirilmesi; bitkilerde QTL haritalaması için oldukça önemli gelişmelerin meydana gelmesine yol açmıştır. Bu anlamda moleküler markörler bitkilerin genetik yapısının araştırılması, kantitatif karakter lokuslarını (QTL) kapsayan

147 tarımsal açıdan önemli genlerin haritalanması, evrimsel ilişkilerin analizleri gibi pek çok konuda önemli ve güçlü araçlar olarak bilim dünyasına hizmet etmektedir (Asins, 2002). Biyoteknolojinin kullandığı en önemli araçlardan olan moleküler markörlerin kromozom üzerinde birbirlerine göre gerçek uzaklıklarının ortaya konmasıyla birçok bitki türünde fiziksel haritalar hazırlanmaktadır. Ayrıca bu markörler, rekombinasyon frekanslarına dayalı gen haritalama çalışmalarında da yoğun olarak kullanılmaktadır. Bu haritalar, daha önceki yıllarda yapılan çalışmalarda yalnızca morfolojik markörlerle hazırlanabilmekteyken, son yıllarda moleküler markörlerin yer almasıyla çok daha fazla sayıda markörü içerir duruma gelmiştir. Markörlerin kullanımı ile verim, kalite, bitki boyu, çiçeklenme zamanı gibi özelliklerle ilişkili olan, birçok gen tarafından yönetilen ve çevre koşullarından etkilenen Kantitatif Karakter Lokuslarının (QTL) haritalanması ve etkilerinin ortaya konmasıyla önemli mesafeler alınmıştır (Lamkey and Lee, 1993).

148 Çalışmada kullanılan DNA izolasyon yöntemi asma gibi fenolik maddece son derece zengin olan ve bu nedenle ekstraksiyonunda problem yaşanan türler için Lodhi et al. (1994) ve Lefort et al. (1998) dan modifiye edilen yönteme göre gerçekleştirilmiştir. DNA ekstraksiyon protokolü, uygulamadaki kolaylığı; DNA saflığının istenilen sınırlar içerisinde olması ve DNA nın uzun süre bozulmadan saklanabilmesi nedeniyle çalışmada sağlıklı bir şekilde kullanılmıştır. QTL haritalamalarında kullanılmakta olan bir kaç paket program mevcut olsa da, bunlar içinde aynı veriler ve aynı gen haritası kullanılarak yapılan QTL çalışmalarında bazı farklılıklar bulunabilmektedir. Ancak açıklanabilen varyans içerisinde büyük payları olan genlerin bulunup haritalanmasında farklılıklar görülmemektedir. Böyle durumlar genellikle farklı seçilen cofaktörler ve LOD değerlerinden kaynaklanmaktadır. Bu faktörler özellikle bir özelliğin şekillenmesine çok daha az etkisi olan genlerin ve kalıtım derecesi düşük olan özelliklerin tanımlanması için önem taşırlar.

149 Çalışmada kullanılan primerlerinin populasyonda yer alan genotiplerin üzerinde test edilmesi sonucunda Mendel dağılımına (1:1 ve 3:1) uygun olan markörler Mapmaker/Exp 3.0 (Lander et al. 1987) paket programı kullanılarak LOD 3.0, değerinde analiz edilip, bağlantı grupları oluşturulmuştur. Italia ve Mercan çeşidine ait elde edilen haritalarda LOD 3.0 de sırasıyla 6 ve 1 adet bağlantı grubu elde edilmiştir. Uygun istatistik programlarının kullanılması suretiyle bu markörlerin incelenen morfolojik ve hastalığa dayanım karakterleri ile olan muhtemel bağlantıları ortaya çıkarılmıştır. Bu populasyon için Mapmaker/Exp 3.0 (Lander et al. 1987) paket programda LOD 2.0 ve 4.0 değerlerinde ise Mercan (baba) da 1 ve Italia (ana) da 3 bağlantı grubu tespit edilmiştir. Italia da açılım gösteren 72 adet lokustan 6 tanesi bağlantı grupları üzerinde yerleşirken; Mercan da 40 adet lokustan sadece 2 adeti 1 bağlantı grubuna yerleştiği belirlenmiştir. Italia x Mercan populasyonunda incelenen toplam 38 adet karakterin polimorfizm durumları incelendiğinde; ana ve baba bireyin 11 adet karakter açısından aynı oldukları ve döl populasyonunun da 11 karakter bakımından açılım göstermediği anlaşılmaktadır. Ana ve baba

150 bireyin mümkün olduğunca çok sayıda morfolojik karakterler açısından farklılık göstermesi genel bir genetik haritalama çıkarılması amaçlandığında haritalama populasyonundan istenmektedir. Döl populasyonlarında yüksek düzeyde açılım gözlemek ancak bu şekilde mümkün olmaktadır. Haritalamada en temel amaç incelenen karakterlerle ilgili lokusları dar kromozomal bölgelere yerleştirmektir, böylece analizin güvenilirliğini ve doğruluğunu arttıracaktır. Bir haritalama çalışması planlanırken, deneme şekli, açılım populasyonunun tipi, büyüklüğü, birey sayısı ve DNA markörü tipi gibi temel konular üzerinde titizlikle durulmalıdır. Açılım oranının en yüksek düzeyde gerçekleşebilmesi için ana ve baba bireylerin incelenen karakter/karakterler açısından birbirinden farklı olması yani polimorfizm göstermesi en önemli kriterdir. Araştırmada kullanılan Italia x Mercan F 1 populasyonunda incelenen karakterlerin 1/3 lük kısmında polimorfizm göstermemesi bu çalışmada içerisindeki en önemli problem olmuştur. Yaşa 2004, 300 adet RAPD primeriyle aynı Italia x Mercan F 1 populasyonu incelemiş, test edilen RAPD primerleri bu populasyon

151 içinde çok düşük oranda (%37) polimorfizm tespit etmiştir. LOD 3.0 da Mercan ve Italia çeşidine ait elde edilen haritalarda sırasıyla 8 ve 6 adet bağlantı grupları üzerinde sayıları 2-3 arasında değişen markör bulmuştur. Haritalamada kabul edilen prensibe göre, aralarında 10 cm dan daha az mesafenin bulunduğu iki markör birbiri ile bağlantılı olduğu düşünülür (Borevitz and Chory, 2004; Kearsey and Farquhar, 1998). Bu bağlamda Italian çeşidinde sadece OPI4c ve OPI4d arasında (5.0 cm) ve OPD3a ve OPD4a arasında (9.2 cm) gerçek bir bağlantı tespit edilmiştir. Mercan çeşidinde ise sc10826b ile OPM2a arasında (6.8 cm) bir bağlantı gözlenmiştir. Regresyon ve anova testlerinde önem eşik değerinin (p) 0.05 olarak ele alınması ile daha fazla sayıda markör-qtl bağlantısı elde edilmiştir. Araştırıcı daha fazla sayıda ve daha fazla bilgi verici primerlerle yapılacak ileri analizlerle diğer bağlantı gruplarının daha detaylı tespit edilebileceğini bildirmektedir. Bir özelliği yönlendiren muhtemel QTL lerin tamamını bulup haritalamak oldukça güçtür. Bir özellik için bulunabilecek önemli QTL sayısının en fazla 12 olabileceğini bildirilmektedir. Ancak çok daha fazla ve güvenilir QTL bulabilme imkanı için de binlerle ifade edebilecek çok

152 sayıda genotipin kullanılması, çok lokasyonlu ve çok yıllık denemelerin kurulması, dolayısıyla çalışmanın büyüklüğü göz önüne alınması durumunda, bu işin çok masraflı olacağı bilinmektedir (Kearsy and Pooni, 1996). Bir haritalama çalışmasında karşılaşılabilecek olumsuzlukların ortadan kaldırılabilmesi için ana ve baba bireyin seçiminde daha fazla özen gösterilmesi gerekir. Đlk haritalama çalışmaları 50-80 bireylik populasyonlarda (Lodhi et al., 1995; Dalbó et al., 2000; Grando et al., 2000) Cayuga White ve Aurore gibi Amerikan genotiplerle, Çin in yabani türleri (Luo et al., 2001) veya çekirdeksizlik üzerine yoğunlaşan çeşitler ile (Doligez et al., 2002) başlamıştır. Bu araştırma sonuçlarından da anlaşılacağı gibi, kullanılan populasyonun ve markör sayısının az olması ile markörlerin polimorfikliğinin düşük olması elde edilen haritanın doygunluğunun düşük olmasına neden olmuştur.

153 Zavala et al. (2002), 50 SSR, 150 AFLP ve 30 RAPD markörleri ile, Ruby Seedless x Thompson Seedless melezlenmesi sonucu elde edilmiş olan 127 bireylik bir populasyonla gerçekleştirdiği çalışmasında ebeveynlere ait sadece sırasıyla 13 ve 11 bağlantı grubu tespit etmiştir. Araştırmacılar bunu kullanılan markör sayısının az olmasının neden olduğunu belirtmektedirler. Bir haritalama çalışmasında haploid kromozom sayısı kadar bağlantı grubunun çıkarılması istenir. Bu çalışmada hem ana hem de baba ebeveynlere ait haritalalarda arzu edilen haploid kromozom sayısı (n=19) kadar bağlantı grubu elde edilememiştir. Dişi ebeveyn olan Italia da 6, baba ebeveyn olan Mercan da ise 1 bağlantı grubunun elde edilmiştir. Bu bağlantı grupları üzerine yerleşen markör sayısının azlığı çalışmanın amacı kısmında belirtilen hedeflere ulaşılmasını bu aşamada güçleştirmiştir. Araştırmada incelenen populasyonun birey sayısının çok düşük olması polimorfizm oranı son derece yüksek SSR ve AFLP primerleri kullanılarak giderilmeye çalışıldıysada kullanılan primerlerinde sınırlı sayıda olması amaca ulaşmayı zorlaştırmıştır.

154 Italia x Mercan populasyonunda test edilen primerler % 97 oranında polimorfiklik göstermiştir. Polimorfik olduğu tespit edilen SSR ve AFLP primerlerinden elde edilen bantlardan toplamda 818 adedinin popülasyonda polimorfizm gösterdiği tespit edilmiştir. SSR primerleri için bu sayı 47 iken, AFLP primerleri için bu sayının 771 olduğu belirlenmiştir. 19 adet lokus ise Mendel dağılımına uygun açılım göstermediği için bağlantı analizi dışında tutulmuştur. Haritalamada genel prensip; iki markör arasında bağlantı olabilmesi için 10 cm dan az bir mesafenin bulunması gerekliliğidir (Kearsey and Farquhar, 1998). Italia ve Mercan da elde edilen bağlantı grupları bu kritere göre incelendiğinde; Italia çeşidinde sadece VrZAG29a ve VrZAG29c arasında 3,7 cm ve Mercan çeşidinde VVS2c ve VVS2d arasında 9.1 cm gerçek bir bağlantı olduğundan söz edilebilir. Bağlantı gruplarının daha detaylı tespit edilebilmesi için çok daha fazla sayıda primerlerle analiz edilmesi gerekmektedir. Çalışmada hastalığa dayanım karakterleri (küllemeye dayanım (C1), kurşuni küfe dayanım (C2) ve mildiyöye dayanım (C3))

155 incelendiğinde kurşuni küf ve mildiyöye dayanıma bağlı hiçbir markör tespit edilememiştir. Buna karşılık küllemeye dayanımın kontrolü ile ilgili markörlerin Italia çeşidinde 3 nolu bağlantı grubunda bulunan lokusda olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmanın ülkemizde asmada bu kapsamda gerçekleştirilen ilk çalışma olması yönünden son derece önemlidir. Fakat haritalama populasyonu olarak kullanılan Italia x Mercan populasyonun bir haritalama populasyonundan incelenen karakterler açısından beklenen polimorfizmi göstermemesi amaçlanan hedeflere ulaşılmasında yani markör-qtl ilişkisini açıklamak için yeterli olmamıştır. Genel olarak QTL çalışmaları markör destekli seleksiyonda (marker assisted selection, MAS) başarı ile kullanılmaları mümkündür. Bu yolla ıslah çalışmalarının erken evrelerinde seleksiyona geçilerek hem zamandan tasarruf edilmiş olur hem de populasyon küçültülerek başarı şansı artırılmış olacaktır. Ancak bunun için bazı şartların yerine getirilmiş olması gerekmektedir, yani özelliğin kolay araştırılabilir olması, yüksek kalıtım derecesi, yardımcı özellikler ile hedef özellikler

156 arasında yüksek koralasyon bulunmalıdır. Bunlara ek olarak fazla ve yeterli sayıda genotipin kullanılması, çok yıllık ve çok tekerrürlü denemelerden elde edilen veriler, genomu mümkün olduğunca fazla sayıda markörlerle kaplanması ve son olarak kullanılacak haritalama programının uygun olmasıdır (Haensel, 1976; Falconer and Mackey, 1996). Bu çalışmadan elde edilen tüm sonuçlar daha sonra gerçekleştirilecek olan yeni çalışmalara ışık tutacak çok önemli sonuçları içerisinde barındırmaktadır. Bunu takip edecek daha ileri çalışmalarda aynı populasyon üzerinde birey sayısının arttırılması ve hali hazırda bu çalışma için kullanılan primer sayılarının arttırılarak yeniden değerlendirilmesi suretiyle yukarıda belirtilen amaçlara ulaşmak mümkün olabilecektir. Bu şekilde, çalışma sonucunda elde edilen haritaların doygunluğu arttırılabilecek ve QTL bilgilerinin detaylandırılması ve daha güvenilir hale getirilmesi sağlanabilecektir.

157 KAYNAKLAR Adam-Blondon, A.-F., Lahogue-Esnault, F., Bouquet, A., Boursiquot, J.M. and This, P., 2001. Usefulness of Two SCAR Markers for Marker-Assisted Selection of Seedless Grapevine Cultivars. Vitis, 40(3): 147-155. Adam-Blondon, A.-F., Roux, C., Claux, D., Butterlin, G., Merdinoğlu, D. and This, P., 2004. Mapping 245 SSR Markers on The Vitis vinifera Genome: A Tool for Grape Genetics. Theor.Appl. Genet., 109(5): 1017-1027. Ageoerges, A., Albagnac, G., Doligez, A., Dosba, F., Nottenghem, J., Peros, J.P., Terries, N., Tesniere, C., This, J. P. and Torregrosa, L., 2002. Towards a Better Understanding of Berry Quality and Powdery Mildew Resistance in Grapevine. Genetic Determinism and Pathways. Plant Animal & Microbe Genome X Conference Abst. 12-16 Ocak 2002, San Diego, CA, ABD. Ağaoğlu, Y.S., 1999. Bilimsel ve Uygulamalı Bağcılık (Asma Biyolojisi). Kavaklıdere Eğitim Yayınları, No:1. 205 s, Ankara.

158 Alleweldt, G. and Possingham, J.V., 1988. Progress in Grapevine Breeding. Theor. Appl. Genet,. 75: 669-673. Arumuganathan, K. and Earle, E.D., 1991. Nuclear DNA Content of Some Important Plant Species. Plant Molecular Biology Reporter, 9(3): 208-218. Anonymous, 1983. Descriptors for Grape. International Board for Plant Genetic Sources. Secretariat, 93 p, Rome. Anonymous, 1989. Minimal Descriptor List for Grapevine Varieties. 49 p. Anonymous, 1995. Genetic Analysis in Vitis Using Molecular Markers. BARD project No: US 1888-90, 150 p. Asins, M.J., 2002. Present and Future of Quantitative Trait Locus Analysis in Plant Breeding. Plant Breeding, 121: 281-291. Blondon, A.F.A., Lahogue-Esnault. F., Bouquet. A., Boursiquot. J.M. and This. P., 2001. Usefulness of two SCAR Markers for Marker-Assisted Selection of Seedles Grapevine Cultivars. Viti,.40 (3): 147-155.

159 Borevitz, O.J and Chory, J., 2004. Genomics Tools for QTL Analysis and Gene Discovery. Current Opinion inn Plant Biology, 7: 132-136. Bouquet, A. and Danglot, Y., 1996. Inheritance of Seedlessness in Grapevine (Vitis vinifera L.). Vitis, 35: 35-42. Bowers, J.E., Dangl. G.S., Vignani. R. and Meredith, C.P., 1996. Isolation and Characterization of New Polymorphic Simple Sequence Repeat Loci in Grape (Vitis vinifera L.). Genome, 39: 628-633. Bowers, J.E., Dangl. G.S. and Meredith. C.P., 1999. Development and Characterization of Additional Microsatellite DNA Markers for Grape. Am J Enol Vitic, 50(30): 243-246. Buck, S. and Zyprian, E., 2000. First Approaches of Molecular Mapping in a Model Population Derived from The Crossing of The Grapevine Varieties Regent x Lemberger. Proc. of VII. International Symp. on Grapevine Genetics and Breeding, Montpellier, France, 6-10 Tem. 1998, Vol 2, Acta Horticulture, No:528: 203-207.

160 Callahan, M., Jin, Y., Gao, F. and Walker, M.A., 2002. A Genetic Map of Vitis rupestris x Muscadinia rotundifolia Locating Resistance to Xiphinema index, the Dagger Nematod. Plant Animal & Microbe Genome X Conference Abst. 12-16 Ocak 2002, San Diego, CA, ABD. Çelik, H., 2002. Üzüm Çeşit Kataloğu. Sun Fidan A.Ş. Mesleki Kitaplar Serisi:2. 137s. Dalbó, M.A., 1998. Genetic Mapping, QTL Analysis and Marker- Assisted Selection for Disease Resistance Loci in Grapes. Ph.D. Thesis, Cornell Univ., Ithaca, NY. Dalbó, M.A., Ye, G.N., Weeden, N.F., Steinkellner, H., Sefc, K.M. and Reisch, B.I., 2000. A Gene Controlling Sex ingrapevines Placed on a Molecular Marker- Based Genetic Map. Genome, 43; 333-340. Demir, Đ. ve Turgut, Đ., 1999. Genel Bitki Islahı. Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yayınları No:496. 451s. Doğer, E., 2004. Antik Çağ da Bağ ve Şarap. Đletişim Yayınları ISBN 975-05-0243-4, Đstanbul. 197s.

161 Doligez, A., Bouquet, A., Danglot, Y., Lahogue, F., Riaz, S., Meredith, C.P., Edwards, K.J. and This, P., 2002. Genetic Mapping of Grapevine (Vitis vinifera L.) applied to the detection of QTLs for seedlessness and berry weight. Theor. Appl. Genet., 105: 780-795. Doligez, A., Bouquet, A., Ballester, J., Farnos, M., Danglot, Y., Adam-Blondon, A., -F Roux, C., Domergue, P. and This, P., 2003. QTLs for Quality-Related Traits in Table Grapes. Plant Animal & Microbe Genome X Conference Abst. 12-16 Ocak 2002, San Diego, CA, ABD. Doligez, A., Bouquet, Adam-Blondon, AF., Cipriani, G., Laucou, V., Merdinoğlu, D., Meredith, C.P., Riaz, S., Roux, C., This, P., Di Gaspero, G., 2006. An Integrated SSR Map of Grapevine Based on Five Mapping Populations. Theor. Appl. Genet., 113 (3): 369-382. Donald, T., Pauquet, J., Pellerone, F., Adam-Blondon, A. -F, Bouquet, A., Thomas, M. and Dry, L., 2002. Identification and Local Mapping of Resistance Gene Analogs Linked to a

162 Powdery Mildew Resistance Locus in Grapevine. Plant Animal & Microbe Genome X Conference Abst., 12-16 Ocak 2002, San Diego, CA, ABD. Doucleff, M., Jin, Y., Gao, F., Riaz, S., Krivanek, A.F. and Walker, M.A., 2004. A Genetic Linkage Map of Grape, Utilizing Vitis rupestris and Vitis arizonica. Theor. Appl. Genet., 109: 1178-1187. Echt, C.S., Knapp, S. and Liu, B.H., 1992. Genome Mapping with Non-Inbred Crosses Using GMendel 2.0. Maize Genet. Coop. Nwsl., 66: 27-29. Eibach, R., 1994. Investigations About the Genetic Resources of Grapes with Regard to Resistance Characteristics to Powdery Mildew (Oidium tuckeri). Vitis, 33: 143-150. Ergül, A., 2000. Asmalarda (Vitis vinifera L.cvs.) Genomik DNA Parmak Đzi Analizi ile Moleküler Karakterizasyon. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı, Doktora Tezi, 86s.

163 Falconer, D. S. and Mackay, T. F. C., 1996. Introduction to Quantitative Genetics. 4th Edition. Longman Scientific Technical, New York. Fanizza,. G., Lamaj. F., Costantini.L., Chaabane. R. and Grando, M.S., 2005. QTL Analysis for Fruit Yield Components in Table Grapes (Vitis vinifera). Theor Appl. Genet., 111: 658-664. Fatahi, R., Ebadi, A., Bassil, N., Mehlenbacher, S.A and Zamani, Z., 2003. Characterization of Iranian Grapevine Cultivars Using Microsatellite Markers. Vitis, 42(4): 185-192 Fidan, Y., 1985. Özel Bağcılık. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yayınları: 930 Ders Kitabı No: 265. 401s. Fischer, B.M., Slakhutdinov, I., Akkurt, M., Eibach, R., Edwards, K.J., Töpher, R. and Zyprian, E.M., 2003. Molecular Mapping of (RegentxLemberger) and QTL- analysis of Agronomic Traits. Acta Horticultura, No: 603: 69-71 Fischer, B.M., Slakhutdinov, I., Akkurt, M., Eibach, R., Edwards, K.J., Töpher, R. and Zyprian, E.M., 2004. Quantitative Trait

164 Locus Analysis of Fungal Disease Resistance Factors on a Molecular Map of Grapevine. Theor. Appl. Genet., 108; 501-515. Galet, P., 1979. A Practical Ampelography. Cornell Univ. Press, Ithaca, NY. 248 p. Georgiady, M., DeScenzo, R., Cain, D.W. and Irelan, N., 2001. Linkage mapping and QTL mapping in grape. Plant and Animal Genome IX Conference Abst. 13-17 Ocak 2001, San Diego, CA, ABD. Grando, M.S., Frisinghelli, C. and Stefanini, M., 2000. Polymorhism and Distribution of Molecular Markers in a Segregating Population Derived from The Cross Moscato Bianco X Vitis riparia. Proc. of VII. International Symp. On Grapevine Genetics and Breeding, Montpellier, France, 6-10 Tem. 1998, Vol 2, Acta Horticulturae. No: 528, 209-213. Grando, S., Bellin. D., Edwards. K.J., Pozzi. C., Stefanini. M. And Velasko. R., 2002. Molecular Linkage Maps of Vitis vinifera L.

165 and Vitis riparia Mchx. Theoretical and Applied Genetics, 106 (7): 1213-224. Grando, M.S., Bellin, D. Edwards, K.J., Pozzi, C., Stefanini, M. and Velasco, R., 2003. Molecular Linkage Maps of Vitis vinifera L. and Vitis riparia Mchx. Theor. Appl. Genet., 106 (7): 1213-224. Geldermann, H., 1975. Investigations on Inheritance of Quantitative Characters in Animals by Gene Markers. I. Methods. Theor.Appl. Genet., 46: 319-330. Grattapaglia, D., Chapparro J., Wilcox, P., McCord, S., Werner, D., Amerson, H, McKeand, S., Bridgewater, F., Whetten, R., O'Malley, D, and Gupta, P.K., Varshney, R.K. and Prasad, M., 2002. Molecular Markers: Principles and Methodology. Molecular Techniques in Crop Improvement. Published by Kluwer Academic Publishers, The Netherlands. 38-39. Gülcan, R. ve Đlter, E., 1975. Bağcılıkta Islah Metodları. E.Ü.Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü. HaenselL, H., 1976. Heritabilitaet von Teileigenschaften und deren Korrelation zu Komplexeigenschaften ( Tafeln für indirekte

166 Selektion ). Ber. Arb. Tag. Gem. Saatzuchtleiter, Gumpenstein, pp. 3-10. Haldane, J.B.S., 1919. The Combination of Linkage Values, and The Calculation of Distance Between The Loci of Linked Markers. J. Genet., 8: 299-309. Hartl, D.L., 1994. Genetics, Third Edition. Jones and Bartlett Publishers Int., London. Hemmat, M., Weeden, N.F., Manganaris, A.G. and Lawson, D.M., 1994. Molecular Marker Linkage Map for Apple. J. Hered., 85: 4-11. Karaağaç, E., 2006. Gaziantep Đli Asma Gen Potansiyelinin SSR (Simple Sequence Repeats) Markörlerle Moleküler Analizi. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı. Doktora Tezi. 89s. Kearsy M.J., Pooni H.S., 1996. The Genetical Analysis of Quantitative Traits, Charpman & Hall. Kearsy M.J., Farquhar A.G.L., 1998. QTL Analysis in Plants; Where Are We Now?. Heredity, 137-142.

167 Kısmalı, Đ., 1980. Bağ Yetiştirme Tekniği I ve II. Ders Notları. E.Ü. Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü. Bornova-ĐZMĐR. Kısmalı, Đ., 1995. Ders Notları. E.Ü. Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü. Bornova-ĐZMĐR. Kozma, Jr, P., 2000. Winegrape Breeding for Fungus Disease Resistance. Proc. of VII. International Symp. on Grapevine Genetics and Breeding, Montpellier, France, 6-10 Tem. 1998, Acta Horticulturae, Vol 2, No. 528. Kozma, Jr, P. and Dula, T., 2003. Inheritance of Resistance to Downy Mildew and Powdery Mildew of Hybrid Familiy Muscadinia x V. vinifera x V. amurensis x Franco-American Hybrid. Proc. VIII th Int l. Congress on Grape. Acta Hort., 603: 457-463. Lahogue, F., This. P., Bouquet, A., 1998. Identification of a Codominant SCAR Marker Linked to The Seedlessness Character in Grapevine. Theor. Appl. Genet., 97: 950-959. Lahogue, F., This, P., Adam-Blondon, A-F. and Bouquet, A., 1998. Identification of Markers Linked to The Seedlessness Character

168 in Grapevine. Plant and Animal Genome VI Conference Abst., 18-22 Ocak 2003, San Diego, CA, ABD. Lander, E.S., Green, P., Abrahamson, J., Barlow, Daly, M.J., Lincoln, S.E. and Newberg, L., 1987. MAPMAKER, An Interactive Computer Package for Constructing Primary Genetic Linkage Maps of Experimental and Natural Populations. Genomics, 1: 174-181. Lander, E.S. and Botstein, D., 1989. Mapping Mendelian Factors Underlying Quantitative Traits Using RFLP Linkage Maps. Genetics, 121: 185-199. Lefort, F., Lall, M., Thompson, D. and Douglas G.C., 1998. Morphological Traits, microsatellite Fingerprinting and Genetic Relatedness of a Stand of Elite Oaks ( Q. robur L.) at Tullynally, Ireland. Silvae Genetica, 47: 5-6. Lefort, F. and Roubelakis-Angelakis, K.A., 2000a. The Greek Vitis Database, a Multimedia Web-Backed Genetic Database for Germplasm Management of Vitis Resources in Greece. J. Wine Res., 11 (3): 233-242.

169 Lefort, F. and Roubelakis-Angelakis, K.A., 2000b. Development of a database for Greek Grapevine Cultivars. Proceedings of the 9th Symposium Arts and Techniques of Viticulture and Enology in Northern Greece, (Ed). ETBA, Athens, Greece. Lodhi, M.A., 1994. Genetic Mapping and Genome Analysis of Grape (Vitis sp.). Ph.D. Thesis, Cornell University, 233 p., New York. Lodhi, M.A., Daly, M. A., Weeden, N.F. and Reisch, B.L., 1995. A molecular marker based linkage map of Vitis. Genome, 38: 786-794. Luo, S., He, P., Zheng, X. and Zhou, P., 2002. Inheritance of RAPD Markers in An Interspesifıc F 1 Hybrid of Grape Between Vitis quinquangularis ve V. vinifera. Scientia Horticulturae, 93: 19-28. Madini, A., Marino, R., Sevini, F., Di Gaspero, G., Velasco, R. and Grando, M.S., 2003. Mapping Defense-Related Genes and QTLs in Vitis.. Plant and Animal Genome XI Conference Abst. 11-15 Ocak 2003, San Diego, CA, ABD.

170 Mandl, K., Santiago, J.L., Hack, R., Fardossi, A. and Regner, F., 2006. A Genetic Map of Welschrieslingx Sirius for The Identification of Magnesium-Deficiency by QTL Analysis. Euphytica, 149 (1-2): 133-144. Manly, K.F. and Elliot, R.W., 1991. MapManager, a Microcomputer Program for Analysis of Data from Recombinant Inbred Strains. Mammalian Genome, 1: 123-126. Malyshev, S.V. and Kartel. N.A., 1997. Molecular Markers in Mapping of Plant Genomes. MolecularBiology, Vol.31 No:2: 197-208. Marino, R., Sevini, F., Madini, A., Vecchione, A., Perlot, I, Della Serra, A., Versini, G., Velasco, R., and Grando, M.S., 2003. QTL Mapping for Disease Resistance and Fruit Quality in Grape. ISHS VIII International Conference on Grape Genetics and Breeding. Acta Horticulturae, 603: 528-533. McGovern, P.E., Glusker, D.L., Exner, L.J. and Voigt, M.M., 1996. Neolithic resinated wine. Nature, 381: 480-481.

171 Meredith, C.P., 2001. Grapevine Genetics: Probing the Past and Facing the Future. Agriculturae Conspectus Scientificus, Vol.66, No:1, 21-25. Mejia, N. and Hinrichsen, P., 2003. A new, Highly Assertive Scar Marker Potentially Useful to Assist Selection for Seddlessness in Table Grape Breeding. Proc. VIII th Int l. Congress on Grape. Acta Hort., 603: 559-564. Merdinoğlu, D., Wiedeman-Merdinoğlu, S., Coste, P., Dumas, V., Haetty, S., Butterlin, G. and Greif, C., 2003. Genetic Analysis of Downy Mildew Resistance Derived from Muscadinia rotundifolia. ISHS Acta: VIII International Conference on Grape Genetics and Breeding. Horticulturae, 603: 451-456. Milutinovic, M., Nikolic, D., Avramov, L. and Rakonjac, V., 2000. Recombination of Some Characteristics in F 1 Generation of Grapevine. Proc. of VII. International Symp. on Grapevine Genetics and Breeding, Montpellier, France, 6-10 Tem. 1998, Vol 2, Acta Horticulturae, 528: 641-644.

172 Mueller, U.G. and Wolfenbarger. L.L., 1999. AFLP Genotyping and Fingerprinting. Tree, Vol: 14 (10): 389-394. Odabaş, F., Köse, B. ve Çelik, H., 2002. Amasya Đli Merzifon Đlçesinde Yetiştirilen Bazı Üzüm Çeşitlerinin Ampelografik Özelliklerinin Belirlenmesi Üzerine Bir Araştırma. Türkiye V. Bağcılık ve Şarapçılık Sempozyumu 5-9 Ekim, Nevşehir. Öner, C., 2003. Genetik Kavramlar. Palme Yayıncılık, 795s. Özcan, S., Gürel, E., Babaoğlu, M., 2001. Bitki Biyoteknolojisi (Genetik Mühendisliği ve Uygulamaları). S.Ü. Vakfı Yayınları, 456s. Paterson, A.H., Lander, E.S., Hewitt, J.D., Paterson, S., Lincoln, S.E., Tanksley S.D., 1988. Resolution of Quantitave Traits into Mendelian Factors by Using a Complete Map of Restriction Fragment Length Polymorphisms. Nature, 335: 721-726. Pauquet, L, Bouquet, A., This, P. and Adam-Blondon, A.-F., 2001. Establishment of a Local Map of AFLP Markers Around the Powdery Mildew Resistance Gene Runl in Grapevine and

173 Assessment of Their Usefulness for Marker Assisted Selection. Theor. Appl. Genet., 103: 1201-1210. Regner, F., Fradossi, A., Eisenheld, C., Stierschneider, I. and Haas, M., 2003. Genetic Analysis of a Segregating Population Derived by a Cross of Welschriesling x Sirius. Proc. VIII th Int l. Congress on Grape. Acta Hort., 603: 141-148 Reisch, B.L., Einset, J. and Pratt, C., 1994. Grapes. In: Janick, J., Moore, J.N. Eds. Advances in Fruit Breeding. Purdue Univ. Press, West Lafayette, USA. Reisch. B., 2001. Map-based Cloning of a Powdery Mldew esistance Locus in Vitis. Report to the American Vineyard Foundation. (Basılmamış) Ren, Z., Lamikanra, O. and Lu, J., 2000. Identification of a RAPD Marker Closely Linked to The Fruit Color in Muscadine Grapes (Vitis rotundifolia). Proc. of VII. International Symp. on Grapevine Genetics and Breeding, Montpellier, France, 6-10 Tem. 1998, Vol 2., Acta Horticulturae, 528: 263-266.

174 Riaz, S. and Walker. M. A., 2003. Extended Genetic Linkage Map of a Vitis rupestris and Muscadinia rotundifolia Population and Comparisons with the International Vitis vinifera Reference Map. Genetics, ASEV 54th Annual Meeting Reno, Nevada. Riaz, S., Dnagl, G.S., Edwards, K.J. and Meredith, C.P., 2004. A Microsatellite Marker Based Framework Linkage Map of Vitis vinifera L. Theor. Appl. Genet., 108: 864-872. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., 1989. Synthesis of Uniformly Labeled DNA Probes Using Random Oligonucleotide Primers. In: Molecular cloning. 2 nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. pp.10-13. Sederoff, R. 1992. Mapping in Woody Plants with RAPD Markers. In: Application of RAPD Technology and Plant Breeding. Plant Sci. Soc. of Am., Madison, WI, p. 37-40. Sefc, K.M., Regner. F., Turetschek. E., Gloessl. J. and Steinkellenr. H., 1999. Identification of Microsatellite Sequences in Vitis Riparia and Their Applicability for Genotyping of Different Vitis Species. Genome, 42: 367-373.

175 Sefc, K.M., Lefort, F., Grando, M.S., Scott, K.D., Steinkellner, H. and Thomas, M.R., 2001. Microsatellite Markers for Grapevine: A state of The Art. In Molecular Biology and Biotechnology ot the Grapevine. Roubelakis-Angelakis K.A. ed., 1-29, Kluwer Academic Publishers. The Netherlands. Sevini, F., Marino, R. and Grando, M.S., 2004. Mapping Candidate Genes and QTLs For Aroma Content in Grape. Proc. I st Int l. Symp. on Grapevine. Acta Hort., 652: 439-446. Stam, P., 1993. Construction of Integrated Genetic Linkage Maps by Means of a New Computer Package, JoinMap. Plant J., 3: 739-744. Staub, J.E. and Serquen. F.C., 1996. Genetic Markers, Map Construction, and Their Application in Plant Breeding. Hortscience, Vol: 31(5): 729-741. Striem, M.J., Ben-Hayyim, G. and Spiegel-Roy, P., 1996. Identifying Molecular Genetic Markers Associated with Seedlessness in Grape. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 121 (5): 758-763.

176 Suiter, K.A., Wendel, J.F. and Case, J.S. 1983. Linkage-1, A Pascal Computer Program for The Detection And Analysis of Genetic Linkage. J. Hered., 74: 203-204. Tanksley, S.D., 1993. Mapping Polygenes. Annu. Rev. Gent., 27: 205-233. Thomas, M.R. and Scott, N.S., 1993. Microsatellite Repeats in Grapevine Reveal DNA Polymorphisms when Analysed as Sequence-Tagged Sites (STSs). Theor Appl Genet., 86: 985-990. Thomas, M.R., Scott. N.S., Botta. R. and Kijas. J.M.H., 1998. Sequence-Tagged Site Markers in Grapevine and Citrus. Journal of the Japanese Society for Horticultural. Science. 67: 1189-1192. Vos, P., Hogers. R., Bleeker. M., Reijans, M., van De Lee, T., Hornes, M., et al., 1995. AFLP : A New technique for DNA Fingerprinting. Nucleic Acids Res., 23: 4407-4414. Yaşa, Zeliha., 2005. Asma (Vitis vinifera L.) da Önemli Vegetatif ve Generatif Karakterler ile Hastalıklara Dayanım Özelliklerine

177 Yönelik Genom Haritalaması. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı, Doktora Tezi, 123 s. Ye, G.N., Lodhi, M.A., Weeden, N.F. and Reisch, B.I., 1995. A RAPD Linkage Map for Grape and Identification of Major QTL for Powdery Mildew Resistance. BARD Project. Final BARD Report, US 1888-90. pp 54-67. Walker, M.A. and Jin, Y., 2000. Breeding Vitis rupestris x Muscadinia rotundifolia Rootstocks to Control Xiphinema index and Fanleaf Degeneration. Proc. of VII. International Symp. On Grapevine Genetics and Breeding, Montpellier, France, 6-10 Tem. 1998, Vol 2. Acta Horticulturae, 528: 511-515. Weeden, N.F., Hemmat, M, Lawson, D.M., Lodhi, M., Bell, R.L., Manganaris, A.G., Reisch, B.I., Brown, S.K. and Ye, G.-N., 1994. Development and Application of Molecular Linkage Maps in Woody Fruit Crops. Euphytica, 77: 71-75. Weising, K., Nybom, H., Wolff, K. and Meyer, W., 1995. DNA Fingerprinting in Plants and Fungi. CRC Pres, Inc. 322 p.

178 Winkler, A.J., Cook, J.A., Kliwer, W.M. and Lider, A., 1974. General Viticulture. Univ. Calif. Pres, Berkeley and Los Angeles, 710 p.j Zavala, K., Mejia, N., Sagredo, B. and Hinrichsen, P., 2002. Consruction of a Linkage Map for Apirenic Table Grapes and Identification of Markers Linked to Seedlessness. Plant Animal & Microbe Genome x Conference Abst. 12-16 Ocak 2002, Zyprian, E., Salakhutdinov, L., Fischer, B., Akkurt, M. and Töpfer, R., 2002. Molecular Mapping of Grapevine and QTL Analysis of Fungal Disease Resistances. Plant and Animal & Microbe Genome x Conference Abst. 12-16 Ocak 2002, San Diego, C A, ABD. San Diego, C A, ABD. Zyprian, E., Eibach, R. and Töpfer, R., 2003. Comparative Molecular Mapping of Fungal Disease Resistance and Agronomic Traits in Segregating Populations of Grapevine. Plant and Animal Genome XI Conference Abst. 11-15 Ocak 2003, San Diego, CA, ABD. Zyprian, E., Eibach, R., Akkurt, M. and Töpfer, R., 2005. Genetic Mapping of SSR Markers in Grapevine for The

179 Analysis of Disease Resistance and Flavor Compounds. Plant and Animal Genome XIII Conference Abst. 15-19 Ocak 2005, San Diego, CA, ABD.

180 EKLER EK 1. Araştırmada kullanılan bazı SSR primerlerine ait poliakrilamid jel görüntüleri. EK 2. Araştırmada kullanılan bazı AFLP primerlerine ait X- ray film görüntüleri.

181 EK 1. Araştırmada kullanılan bazı SSR primerlerine ait poliakrilamid jel görüntüleri. VVMD7 Primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü VVS1 Primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü VVMD32 Primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü

182 VVMD28 Primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü VVMD36 Primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü VVS3 Primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü

183 VVS5 Primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü VVMD31 Primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü VVMD36 Primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü

184 VVMD5 Primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü ZAG 21 Primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü ZAG 79 Primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü

185 ZAG 79 Primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü VVS4 Primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü ZAG 26 Primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü

186 ZAG 112 Primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü VVS2 Primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü

187 EK 2. Araştırmada kullanılan bazı AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri. AFLP a+ MSE 6 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri.

188 AFLP c+ MSE 7 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri.

AFLP c+ MSE 5 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri. 189

190 AFLP d+mse 4 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri.

AFLP d+ MSE 6 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri. 191

192 AFLP d+ MSE 2 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri.

AFLP a+mse 2 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri. 193

194 AFLP c+mse 2AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri.

ESEL 22+MSE 1 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri. 195

196 ESEL 22+MSE 2 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri.

ESEL 22+MSE 3 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri. 197

198 ESEL 22+MSE 4 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri.

ESEL 22+MSE 5 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri. 199

200 ESEL 22+MSE 6 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri.

ESEL 22+MSE6 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri. 201

202 ESEL 22+MSE 8 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri.

ESEL 32+MSE 1 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri. 203

204 ESEL 32+MSE 3 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri.

ESEL 32+MSE 4 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri. 205

206 ESEL 32+MSE 5 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri.

ESEL 32+MSE 6 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri. 207

208 ESEL 32+MSE 7 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri.

ESEL 32+MSE 2 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri. 209

210 ESEL 32+MSE 8 AFLP primerlerine ait X-ray film görüntüleri.