BOĞA SPERMASININ SULANDIRILMASI VE DONDURULMASI AŞAMALARI Dr Decuadro-Hansen IMV Technologies Fransa
Giriş Spermanın ilk dondurulup saklanması 1945 de bildirildikten sonra, birçok memeli türünden sperma başarılı bir şekilde dondurulmuştur. O zamandan beri dişilerin dondurulmuş spermayla yapay döllenmesinden milyonlarca buzağı üretilmiştir.genetik olarak üstün ırkların yaygınlaşması için boğa spermasının dondurulması ve çözülmesi ile yapılan suni tohumlama uygulamasının yapılması gereklidir. Böylelikle binlerce sığır üreticisinin boğa/genetik sistemine girmesi sağlanmış olur. Aksi takdirde maliyetleri karşılamaları olanaksınızdır. Suni tohumlama merkezleri, dondurma ve çözme işleminde canlı spermatozoa sayısını yüksek tutulmasını sağlamak amacıyla geliştirilmiştir. Ayrıca tohumlama için, yüksek sayıda viable (canlı) spermalar sağlıklı boğalardan doğru şekilde alınarak doldurulmaktadır. Sperma dondurulmasında spermatozoaların depolanması sıfırın altındaki sıcaklıklarda yapılmaktadır. Bu sıcaklığı sağlayan kriyojen genellikle sıvı azottur (-196 C). Eğer spermatozoa dondurma ve çözme sürecinin ardından hayatta kalırsa, sıvı azotun içinde çok uzun süre saklanabilir. Çünkü spermatozoanın bu derecedeki metabolik aktivitesi yok denecek kadar azdır. Dondurma ve çözme sürecinde spermatozoanın fertilitesini en yüksek düzeyde tutmak için için dondurarak saklamada en iyi şartların sağlanması gerekmektedir. Son elli yıldaki çalışmalar yüzlerce türden alınan spermaların dondurma ve çözme şartlarını optimize etmiştir. Bununla birlikte çeşitli türlerden alınan spermalar, spesifik sperma büyüklüğü, şekil, membran lipidi, protein yapısı ve metabolik ihtiyaçları gibi hücrelerin dondurulup saklanması için kendi eşşiz özelliklerine göre özel şartlara ihtiyaç duymaktadır. Dondurarak saklamayı geliştirmek için yapılan başarılı araştırmalara rağmen bazı spermatozoalar dondurma ve çözme aşamalarında ölmektedirler. Dondurma ve çözme sırasındaki hücre ölümlerinin sebepleri tamamen anlaşılamamıştır. İki bilinen sperma ölümü ve zarar görmesi şunlardır: a) Spermatozoada buz kristalleri oluşumu (hücre içi buz oluşumu), hızlı soğutma yapılırken sperm membranına geri dönüşümü olmayan zararlar verilmesi. b) Yüksek konsantrasyonlu çözücü kullanıldığında, düşük oranlarda soğutma ve çözme yapılması sonucunda hücreye su kaybettiren katmanların oluşumu (çözücü etkileri). Her dondurma prosedürünün amacı, hücre içi buz oluşumundan veya hipertonik solüsyondan kaynaklanan hücre ölümlerini minimuma indirmektir. Kriyoprezervasyon laboratuarı tarafından üretilen spermanın kalitesi, soğutma hızı, dengelenme (equilibration) süresi, dengenme süresi x çözdürme oranı, çözdürme oranı x dondurma oranı, dondurma hızı x gliserol seviyesi, gliserol seviyesi x çözdürme oranı gibi farklı üretim prosedürlerinin kendi aralarındaki etkileşimlerine göre kontrol edilmektedir. Bu etkileşimlere göre kriyoprezervasyon sürecindeki belli bileşenlerin etkisi spermanın viabilitesinde (canlılık) yanlış yönlendirici olabilir. Bu nedenle mükemmel denilebilecek sulandırıcı ve işleme protolü yoktur. Kabul edilebilir canlılık kriterlerini ve son çözme ve taşıma protokollerini, uygulama tavsiyeleriyle birlikte kullanarak işleme protokolünün kalitesini sürekli gözlemlemek, her suni tohumlama laboratuarının kendi sorumluğundadır. Suni tohumlamanın en önemli avantajlarından biri hijyenik güvenliktir. Boğa spermasının bakteriyolojik kalitesiyle ilgili birçok çalışma, spermanın çoğu zaman steril olmaktan uzak ve genelde bakteri ve mantar gibi sığır çevresinde sıklıkla bulunabilen birçok mikrobiyal ajan tarafından kontamine edildiğini göstermiştir. Mikrobiyal kontaminasyon seviyesi spermanın
alınma aşamasındaki koşullara bağlı olduğu gibi sperma sulandırıcısının da mikrobiyal kalitesine de bağlıdır. Memeli spermatozoası için kryoprezervasyon teknikleri gelişmesinden beri, gliserol, yumurta sarısı veya süt en yagın kullanılan dondurma sulandırıcılarıdır. Boğa spermetozoası kriyoprezervasyonunda kullanılan sulandırıcıların içinde genelde %20 oranında oranında yumurta sarısı bulunur. Böylelikle yumurta sarısından kaynaklı mikrobiyal kontamininasyon riski oluşur. IMV boğa sperması dondurmada yeni bir konsept sunmaktadır; Suni tohumlama merkezlerinde yaygın olarak kullanılan yumurta sarısı içermeyen steril sulandırıcı Bioxcell. Bu belgenin amacı Bioxcell kullanarak sığır sperması sulandırma ve dondurma prosedürlerini tarif etmektir. Sperma özellikleriyle laboratuar değerlendirmelerin asıl amacı fertilite ve gebelik sonuçlarının öngörülmesidir. Sulandırıcı hazırlanması; Donmuş spermayla Bioxcell protokolü 1-100 ml konsantre sulandırıcıyı 32-34 C su banyosuna 10 dakika süreyle yerleştirin. 2-400 ml bidistile aprojen steril suyla ve ya dengiyle dolu erlenmayeri 32-34 C deki su banyosuna yerleştirin. 3-100 ml konsantre sulandırıcıyı 400ml bidistile aprojen steril suya ve ya dengine koyun. Şişeyi son solusyonla iki kere durulayın.
4- Solüsyonu homojenize edin, sulandırıcı kullanıma hazırlanmıştır. 5- Sperma sulandırıcılarının hazırlandıktan sonraki 6 saat içinde kullanılmaları tavsiye edilir. Hazırlandıktan sonra Bioxcell sulandırıcı -20 C dondurulabilir. (Başka bir kullanım için saklanmak istenirse bu işlemin sulandırıcı hazırlandıktan hemen sonra yapılması önerilir.) Dondurulacaksa solüsyonu 100ml lik eşit kısımlara ayırın. Çözdürme hızlı yapılmalıdır.(şişeleri 32-34 C deki banyosuna 15 dakika batırın.) Sulandırıcıyı çözdükten sonra homojenize ediniz ve tekrar dondurmayınız. Kullanıcı talimatları; 1- Tek aşamalı sulandırma protokolü (32-34 Cde) 1a) Oda sıcaklığında sperma paketlemesi - Sperma analizinden sonra 1/1 oranında Bioxcell ile 32-34 C de ön sulandırma yapın - Tüpü bir kere homojenize edin. - Ön sulandırılmış spermayı 32-34 C deki su banyosunda 10 dakika inkübe edin.
- Ön sulandırılmış spermayı sulandırıcıya ekleyerek son sulandırmayı yapın. Homojenize etmeyin. - Sulandırılmış sperma biberonlarını oda sıcaklığında (20 C) 10 ila15 dakika bekletiniz. - Spermayı 20 C de homojenize edip paketleyiniz.
- Payetleri dikey olarak plastik bir kaba yerleştirin ve kabı +4 C deki soğuk kabine koyun. Payetler, 20 C den +4 C ye 1 ila 1 buçuk saatte düşmesi için soğuktan korunmalıdır. Payetlerin sayısı kullanılan kabın tipine göre ayarlanmalıdır. Örneğin: 65mm lik goblete 300 küçük payet. - Spermayı 3 ila 5 saat ışıktan uzak dinlendirin. - Payetleri soğuk dolaptaki dondurma raflarına yerleştirin. - Dondurun. Dondurma makinenizin soğuk kabine yakın olması gerektiğini unutmayın.
1b) +4 C de sperma paketlemesi - Sperma incelendikten sonra 1/1 oranındaki Bioxcell le 32-34 C de bir ön sulandırma yapın. - Tüpü bir defa homojenize edin. - Ön sulandırılmış spermayı 32-34 C deki su banyosunda 10 dakika inkübe edin. - Ön sulandırılmış spermayı sulandırıcıya ekleyerek son sulandırmayı yapın. Homojenize etmeyin. - Sulandırılmış spermayı içeren biberonu, su banyosundan 32 C de belli bir seviyedeki su dolu plastik kaba yerleştirin. (Su seviyesi sulandırılmış sperma seviyesinden yukarıda olmamalıdır.) Sonra kabı +4 C deki soğuk kabine koyun. Suya bir termometre koyulması önerilir. Suyun sıcaklığı 12-14 C ye çıktığında suya buz küpleri ekleyebilirsiniz. 4 C lik sıcaklığa 1-1,5 saatte ulaşılır. - Sulandırılmış spermayı 3 ila 5 saat ışıktan uzakta dinlendirin. - Spermayı soğuk dolapta payetlere doldurun.
- Payetleri raflara yerleştirin. - Dondurun. 2- İki aşamalı sulandırma için protokol (32-34 C ve +4 C) - Sperma incelendikten sonra 1/1 oranında Bioxcell ile sulandırın (32-34 C). - Tüpü bir kere homojenize edin. - Ön sulandırma yapılmış spermayı 32-34 C lik su banyosuna 10 dakika yerleştirin ve 20 ila 25 ml Bioxcell i 32-34 C de ekleyin. - Seyreltilmiş sperma içeren biberonları 32-34 C deki su banyosundaki suyla doldurulmuş plastik kaba yerleştirin. Suya bir termometre yerleştirilmesi tavsiye edilir. - Sonra biberonları +4 C deki soğuk kabine 1-1,5 saatliğine yerleştirin. (Sıcaklık 12-14 C ye ulaştığında buz küpleri ekleyebilirsiniz).
- Son sulandırmayı +4 C de yapın - Spermayı 3 ila 5 saat ışıktan uzakta equilibre edin. - Spermayı +4 C payetlere doldurun. - Payetleri raflara yerleştirin. - Dondurun Sulandırıcı hazırlanması; TAZE SPERMA İLE BIOXCELL PROTOKOLÜ 1. Şiseyi 100 ml konsantre sulandırıcının bulunduğu 32-34 C deki su banyosuna 10 dakika yerleştirin. 2. 400 ml iki kere distile edilmiş aprojen steril suyla ve ya dengiyle dolu erlenmayeri 32-34 C de su banyosuna yerleştirin. 3. 100 ml konsantre sulandırıcıyı 400ml iki kere distile edilmiş aprojen steril suya ve ya dengine koyun. Şişeyi son solusyonla iki kere durulayın. 4. Solüsyonu homojenize edin, sulandırıcı kullanıma hazırlanmıştır. 5. Sperma diluasyon sulandırıcılarının hazırlandıktan sonraki 6 saat içinde kullanılmaları tavsiye edilir. Hazırlandıktan sonra Bioxcell sulandırıcı -20 C de dondurulabilir. (Başka bir kullanım için saklanmak istenirse bu işlemin sulandırıcı hazırlandıktan hemen sonra yapılması önerilir.) Dondurmak istenirse solüsyonu 100ml lik eşit kısımlara ayırın. Çözdürme hızlı yapılmalıdır.
(Şişeleri 32-34 C deki su banyosuna 15 dakika batırın.) Sulandırıcıyı çözdükten sonra homojenize ediniz ve tekrar dondurmayınız. Kullanıcı talimatları; 1) Bir aşamalı sulandırma protokolü (32 34 C de) 1 a) Oda sıcaklığında sperma paketleme (20 C) - Sperma analizinden sonra 1/1 oranında Bioxcell ile sulandırın (32-34 C). - Tüpü bir kere homojenize edin. - Ön sulandırılmış spermayı 32-34 C deki su banyosunda 10 dakika inkübe edin. - Ön sulandırılmış spermayı sulandırıcıya ekleyerek son sulandırmayı yapın. Homojenize etmeyin. - Sulandırmış sperma içeren biberonları oda sıcaklığında 20 C 10-15 dakika bırakın. - Homojenize edin ve spermayı 20 C de paketleyin - Payetleri dikey olarak plastik bir kaba koyunuz ve plastik kabı +4 C deki soğuk kabine yerleştiriniz. Payetler 20 C den +4 C ye 1-1,5 saatte düşebilmesi için soğuktan korunmalıdır. Payet sayısı kullanılan kabın tipine göre ayarlanmalıdır. Örneğin 65 mm goblet için 300 küçük payet - Spermayı 3 ila 5 saat ışıktan uzakta equilibre edin. - Spermayı +4 C deki termostatik kabinde depolayın. Depolama (sulandırma ve suni tohumlama arasındaki süre) 72 saati aşmamalıdır. 1b) +4 C de sperma paketleme - Sperma incelendikten sonra 1:1lik Bioxcell le 32-34 derecede bir ön sulandırma yapın. - Tüpü bir defa homojenize edin. - Ön sulandırılmış spermayı 32-34 derecedeki su banyosunda 10 dakika inkübe edin. - Ön sulandırılmış spermayı sulandırıcıya ekleyerek son sulandırmayı yapın. Homojenize etmeyin. - Sulandırılmış spermayı içeren şişeyi su banyosundan 32 derecede belli bir seviyedeki su dolu plastik kaba yerleştirin. (su seviyesi sulandırılmış sperma seviyesinden yukarıda olmamalıdır.) Sonra kabı +4 derecedeki soğuk dolaba koyun. Suya bir termometre koyulması önerilir. Suyun sıcaklığı 12-14 dereceye çıktığında suya buz küpleri ekleyebilirsiniz. 4 derecelik sıcaklığa 1, 1 buçuk saatte ulaşılır. - Sulandırılmış spermayı 3 ila 5 saat ışıktan uzakta dinlendirin. - Spermayı soğuk dolapta payetlere paketleyin. - Spermayı +4 C deki termostatik kabinde depolayın. Depolama (sulandırma ve suni tohumlama arasındaki süre 72 saati aşmamalıdır) 2- İki aşamalı sulandırma için protokol (32-34 C ve +4 C) - Sperma incelendikten sonra 1:1 oranında Bioxcell ile sulandırın (32-34 C). - Tüpü bir kere homojenize edin.
- Ön sulandırma yapılmış spermayı 32-34 C lik su banyosuna 10 dakika yerleştirin ve 20 ila 25 ml Bioxcell 32-34 C de ekleyin. - Seyreltilmiş sperma içeren biberonları 32-34 C deki su banyosundaki suyla doldurulmuş plastik kaba yerleştirin. Suya bir termometre yerleştirilmesi tavsiye edilir. - Sonra biberonları +4 C deki soğuk kabine 1-1,5 saatline yerleştirin. (Sıcaklık 12-14 C ulaştığında buz küpleri ekleyebilirsiniz). - Son sulandırmayı +4 C de yapın - Sulandırılmış spermayı 3 ila 5 saat ışıktan uzakta dinlendirin. - Spermayı +4 C de payetlere doldurun. - Spermayı + 4 C de termostatik kabinde depolayın. Depolama (sulandırma ve suni tohumlama arasındaki süre) 72 saati aşmamalıdır. ÖNEMLİ NOT - Taze sperma +4 C de termostatik kabinde depolanmalıdır. - Sulandırma ve suni tohumlama arasındaki süre 72 saati aşmamalıdır. - Spermayı suni tohumlamadan önce ısıtmayın. - IMV taze sperma payetleri kullanın. Dr G.D. Hansen IMV Technologies