ANKARA ÜNIVERSITESI FEN BILIMLERI ENSTITÜSÜ DOKTORA TEZI NOHUTLARDA KÖK ÇÜRÜKLÜGÜNE SEBEP OLAN FUNGUSLAR ARASINDAKI GENETIK FARKLILIGIN MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE INCELENMESI Harun BAYRAKTAR BITKI KORUMA ANABILIM DALI ANKARA 2006 Her hakki saklidir
ÖZET Doktora Tezi NOHUTLARDA KÖK ÇÜRÜKLÜGÜNE SEBEP OLAN FUNGUSLAR ARASINDAKI GENETIK FARKLILIGIN MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE INCELENMESI Harun BAYRAKTAR Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Anabilim Dali Danisman: Prof. Dr. F. Sara DOLAR Ülkemizdeki nohut üretimi farkli biotik ve abiotik streslerden dolayi istenilen düzeyde olmamaktadir. Biotik hastalik etmenleri arasinda ise basta Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in sebep oldugu Fusarium solgunlugu olmak üzere diger kök patojenleri önemli bir yer tutmaktadir. Bu sebeple Türkiye nin 15 farkli ilinde 2001-2002 yillarinda yapilan survey sonucunda, nohutlarda solgunluk ve kök çürüklügüne sebep oldugu tespit edilen fungus izolatlari patojenisite testi, Random amplified polymorphic DNA (RAPD) ve Inter simple sequence repeats (ISSR) yöntemleri kullanilarak karakterize edilmistir. Yapilan survey sonucunda Fusarium oxysporum, F. solani, F. equiseti, F. semitectum, F. acuminatum, Macrophomina phaseolina ve Rhizoctonia solani nohutlarda solgunluk ve kök çürüklügüne neden olan hastalik etmenleri olarak saptanmistir. Elde edilen kök patojenleri arasinda en yaygin patojenin F. oxysporum oldugu ve bunu F. solani ve M. phaseolina nin takip ettigi görülmüstür. Hassas nohut çesitleri kullanilarak toplam 144 izolatin virulenslikleri belirlenmis ve bu fungus türlerindeki intra ve inter spesifik polimorfizimler 30 RAPD ve 20 ISSR primeri kullanilarak incelenmistir. Elde edilen verilerin Dice in benzerlik katsayisi kullanilarak yapilan UPGMA (Unweighed Pairgroup Method with Arit h metic Average) cluster analizi sonucunda 74 F. o x y s p o r u m izolati arasinda genel olarak 3 ana grubun bulundugu 25 F. solani izolatinin ise 2 farkli gruba ayrildigi tespit edilmistir. Ayrica nohutlarda hast aliga sebep olan diger patojenler arasindaki genetik varyasyon her iki yöntem kullanilarak arastirilmis ve cluster analizi ile birbirlerinden ayri olarak gruplandirilmislardir. Moleküler yöntemler kullanilarak yapilan analizler sonucunda morfolojik kriterler kullanilarak ayirt edilemeyen izolatlar dendogramdaki dagilimlarina göre yeniden siniflandirilmislardir. RAPD, ISSR ve RAPD+ISSR verilerinin kombine edilmesiyle elde edilen dendogramlar arasinda ise yüksek bir korelasyonun oldugu ve her iki yöntemin fungus populasyonlari arasindaki genetik varyasyonu incelemek için oldukça faydali oldugu tespit edilmistir. 2006, 90 sayfa Anahtar Kelimeler : Nohut, genetik farklilik, kök çürüklügü, RAPD, ISSR i
ABSTRACT Ph.D. Thesis INVESTIGATION OF GENETIC DIVERSITY BETWEEN THE FUNGI CAUSING ROOT ROT IN CHICKPEA BY MOLECULAR TECHNIQUES Harun BAYRAKTAR Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Plant Protection Supervisor: Prof. Dr. F. Sara DOLAR Chickpea production is not at t he desired level because of biotic and abiotic factors i n Turkey. Fusarium wilt, caused by Fusarium o x y s p o r u m f. sp. c i c e r i s and other root rot pathogens are important biotic disease agents. I n t h i s s t u d y, fifteen provinces of Turkey were surveyed for fungal pathogens, causing wilt and root rot on chickpea in 2001 and 2002. The fungal species obtained were characterized with pathogenicity test, Random amplified polymorphic DNA (RAPD) and Inter simple sequence repeats (ISSR) assays. As a r e s u l t o f t h e s u r v e y, Fusarium oxysporum, F. solani, F. semitectum, F. acuminatum, F. equiseti, Macrophomina phaseolina and Rhizoctonia solani were detected as pathogens, causing wilt and root rot on chickpea. F. oxysporum was the most widespread pathogen among root rot pathogens, followed by F. solani and M. phaseolina. The virulence spectrum of a total 144 isolates was determined on susceptible chickpea cultivars, and intra and inter specific polymorphisms among these fungal species were investigated using 3 0 RAPD and 2 0 ISSR primers. UPGMA (Unweighed Pairgroup Method with Arith metic Average) cluster analysis of the data from DNA amplification of RAPD and ISSR using Dice s coefficient showed 3 major groups a m o n g 74 isolates o f F. o x y s p o r u m and also, clustered 25 isolates of F. solani into 2 different groups. In addition, genetic variation among other pathogens causing disease on chickpea plants was analyzed using both techniques and grouped separately from each other with cluster analysis. The isolates that were not eas i l y separable using morphological characteristics were classified again according to their branching in dendrograms. The results showed that there was a high correlation between dendrograms obtained from the data of RAPD, ISSR and combined RAPD+ISSR and both techniques were useful to study genetic variation among fungal populations. 2006, 90 pages Key Words: Chickpea, genetic diversity, root rot, RAPD, ISSR i i
TESEKKÜR Nohutlarda kök çürüklügüne sebep olan funguslar arasindaki genetik farkliligin incelenmesi amaciyla gerçeklestirilen bu çalismanin her safhasinda yakin ilgi ve destegini benden esirgemeyerek benim bu alanda yetismem ve gelismemde büyük katkisi olan basta danisman hocam sayin Prof. Dr. F. Sara DOLAR a, fungus izolatlarinin teshisinde büyük emegi olan ve beni degerli bilgileriyle yönlendiren Prof. Dr. Salih MADEN e ve moleküler teknikler konusunda bilgilerini benimle paylasan Prof. Dr. Mahinur AKKAYA ya, tesekkürlerimi sunarim. Ayrica moleküler teknikler ile ilgili çalismalara baslamamda bü yük katkisi olan ve degerli bilgilerini benimle paylasan sayin Teresa MILAN ve Juan GIL- LIGERO a (Cordoba Üniversitesi, Ispanya), fungus izolatlarinin temininde yardimci olan Prof. Dr. Gülay TURHAN (Ege Üniversitesi), Dr. Steiner S T E N Z E L (Bonn Üniversitesi, Almanya ) v e Prof. Dr. Çetin SENGONCA ya (Bonn Üniversitesi, Almanya ), tezim sirasindaki çalismalarda beni destekleyen ve yardim eden Dr. Fikret DEMIRCI, Aras. Gör. Muharrem TÜRKKAN ve Göksel ÖZER e, birlikte çalistigim tüm arkadaslarima v e çalismalari m süresince her zaman yakin ilgi ve desteklerini benden esirgemeyerek bana sabir gösteren degerli aileme tesekkürlerimi bir borç biliyorum. Bu tez çalismasi Ankara Üniversitesi Bilimsel Arastirma Projeleri (Proje no: 20030711072) ve Devlet Planlama Teski lati (DPT -YUUP GENPRO DP2004K120657) tarafindan saglanan finansal kaynaklar ile desteklenmistir. Harun BAYRAKTAR Ankara, Temmuz 2006 iii
IÇINDEKILER ÖZET...... i ABSTRACT...... i i TESEKKÜR...... i i i SIMGELER DIZINI...... i v SEKILLER DIZINI...... v ÇIZELGELER DIZINI...... vi 1. GIRIS...... 1 2. KAYNAK ÖZETLERI...... 6 2.1 Nohut Kök ve Kök Bogazi Hastaliklari Üzerine Yapilan Çalismalar... 6 2.2 Kök Patojenleri Arasindaki Genetik Farkliligin Incelenmesi Için Yapilan Moleküler Çalismalar...... 1 0 2.2.1 Kök patojenleri arasindaki genetik farkliligin RAPD yöntemi ile incelenmesi...... 1 0 2.2.2 ISSR ile ilgili moleküler çalismalar... 2 1 3. MATERYAL ve YÖNTEM... 2 7 3.1 Hastalikli Bitki Materyalinin Temini... 2 7 3.2 Funguslarin Elde Edilmesi ve Saklanmasi... 2 8 3.3 Funguslarin Teshisi...... 2 9 3.4 Elde Edilen Kök Patojenlerinin Patojenisite T estleri... 2 9 3.5 Hastalik Reaksiyonlarinin Degerlendirilmesi... 3 0 3.6 DNA Izolasyonu...... 3 1 3.7 Fungus Izolatlarinin Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Yöntemi ile analizi...... 3 2 3.8 Fungus Izolatlarinin Inter Simple Sequence Repeat s (ISSR) Polymorphism Yöntemi ile Analizi...... 3 3 3.9 Agaroz Jel Elektroforezi... 3 4 3.10 Verilerin Analizi ve Degerlendirilmesi...... 3 5 4. ARASTIRMA BULGULARI... 3 6 iv
4.1 Türkiye deki Nohut Kök Hastaliklarinin Durumu ve Patojenisite Testleri... 3 6 4.2 Nohut Kök Patojenleri Arasindaki Genetik Farkliligin Moleküler Yöntemlerle Tespiti...... 4 3 4.2.1 Ön denemeler...... 4 3 4.2.2 Moleküler yöntemlerle Fusarium oxysporum izolatlari arasindaki genetik farkliligin tespit edilmesi... 4 5 4.2.2.1 F. oxysporum izolatlari arasindaki genetik farkliligin RAPD ile analizi... 4 5 4.2.2.2 F. oxysporum izolatlari arasindaki genetik farkliligin ISSR ile analizi... 4 9 4.2.2.3 F. oxysporum izolatlari arasindaki genetik farkliligin RAPD+ISSR ile analizi...... 5 3 4.2.2.4 RAPD ve ISSR yöntemleri ile elde edilen polimorfizim seviyelerinin karsilastirilma si... 5 5 4.2.3 Moleküler yöntemlerle Fu s a r i u m solani izolatlari arasindaki genetik farkliligin tespit edilmesi...... 5 5 4.2.3.1 F. solani izolatlari arasindaki genetik farkliligin RAPD ile analizi... 5 5 4.2.3.2 F. solani izolatlari arasindaki genetik farkliligin ISSR ile analizi... 5 9 4.2.3.3 F. solani izolatlari arasindaki genetik farkliligin RAPD+ISSR ile analizi... 6 2 4.2.3.4 RAPD ve ISSR yöntemleri ile elde edilen polimorfizim seviyelerinin karsilastirilmasi... 6 4 4.2.4 Moleküler yöntemlerle farkli kök patojenleri arasin daki genetik farkliligin tespit edilmesi...... 6 4 4.2.4.1 Nohut kök patojenleri arasindaki iliskinin RAPD analizi ile incelenmesi... 6 4 4.2.4.2 Nohut kök patojenleri arasindaki iliskinin ISSR analizi ile incelenmesi... 6 8 4.2.4.3 RAPD ve ISSR yöntemleri ile elde edilen polimorfizim seviyelerinin karsilastirilmasi... 7 2 5. TARTISMA ve SONUÇ...... 7 3 KAYNAKLAR...... 8 1 ÖZGEÇMIS...... 9 0 v
SIMGELER DIZINI AG A n o s t o m o s i s G r u b u AFLP A m p l i f i e d f r a g m e n t l e n g t h p o l y m o r p h i s m b p Baz çifti (base pair) C s a n t i g r a t d e r e c e CTAB hexadecyl -trimethyl -a m m o n i u m b r o m i d e DNA deoxyribonucleic acid d N T P d e o x y n u c l e o t i d e 5 t r i p h o s p h a t e EDTA ethylene diamine tetra acetic acid IGS Intergenic spacer ISSR Inter -simple sequence repeat I T S I n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r kb kilo baz K C l Potasyu m k l o r ü r K H 2 P O 4 Potasyum dihidrojen fosfat K N O 3 P o t a s yum nitrat M molar mg miligram MgCl 2 Magnezyum klorü r MgSO 4 M a g n e z y u m s ü l f a t m l m i l i l i t re m M m i l i m o l a r µ g mikrogram µ l mikrolitr e µ M mikromolar MP -PCR Microsatellite-primed PCR m t DN A mitochondrial DNA NaCl Sodyum klorü r ng nanogram NTSYS Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis PCR P o l i m e r a z z i n c i r r e a k s i y o n u ( P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ) PDA Patates Dekstroz Agar P D B Patates D e k s t r o z Broth P S A Patates Sakkaroz Agar RAMS R a n d o m a m p l i f i e d m i c r o s a t e l l i t e -t e c h n i q u e RAPD Random amplified polymorphic DNA rdna r i b o s o m a l D N A R F L P R e s t r i c t i o n F r a g m e n t L e n g t h P o l y m o r p h i s m r p m d a k i k a d a d e v i r SDS S o d i u m d o d e c y l s u l p h a t e SNA Sentetik Nutrient Agar SSR S i m p l e s e q u ence repeat TAE T r i s -a c e t a t e -EDTA Ta a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e T m m e l t i n g t e m p e r a t u r e Tris -HCl T r i s -hydroxymethyl amino methane U Ü n i t e U P G M A Unweighted pair group method using arithmetic averages V Volt VCG Vegetative compatibility group vi
SEKILLER DIZINI Sekil 3.1 2001 ve 2002 yillarinda hastalikli nohut bitkilerinin toplanmasi i ç i n s u r v e y yapilan iller....... 2 7 Sekil 4.1 Kök patojenlerinin nohut bitkilerinde sebep oldugu simptomlar... 4 2 Sekil 4.2 Farkli dntps (a: mm), MgCl 2 (b: mm) ve annealin g sicakliklarinin (c: C) Fusarium oxysporum izolatlarinin PCR amplifikasyonuna etkisi... 4 4 Sekil 4.3 Fusarium oxysporum izolatlarinin a, O P K-12 b, O P A-9 ve c, O P A-4 primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen RAPD profilleri... 4 6 Sekil 4.4 Fusarium oxys p o r u m izolatlarindan elde edilen RAPD verisinin UPGMA analizi ile olusturulan dendogram...... 4 8 Sekil 4.5 Fusarium oxysporum izolatlarinin a, (GA) 8 T b, (AC) 9 RY ve c, ( A G ) 8 T primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen ISSR profilleri... 5 0 Sekil 4.6 Fusarium oxysporum izolatlarindan elde edilen ISSR verisinin UPGMA analizi ile olusturulan dendogram...... 5 2 Sekil 4.7 Fusarium oxysporum izolatlarindan elde edilen RAPD+ISSR verilerinin UPGMA analizi ile olusturulan dendogram...... 5 4 Sekil 4.8 Fusarium solani izolatlarinin a, O P K-1 2 b, OPA-9 ve c, O P K-4 primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen RAPD profilleri... 5 7 Sekil 4.9 Fusarium solani izolatlarindan elde edilen RAPD verisinin UPGMA analizi ile olusturulan dendogram...... 5 8 Sekil 4.10 Fusarium solani izolatlarinin a, (AG) 8 G b, (GA) 8 C ve c, (AC) 8 Y A primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen ISSR profilleri... 6 0 Sekil 4.11 Fusarium solani izolatlarindan elde edilen ISSR verisinin UPGMA analizi ile olusturulan dendogram... 6 1 Sekil 4.12 Fusarium solani izolatlari ndan elde edilen RAPD+ISSR verilerin i n UPGMA analizi ile olusturulan dendogram... 6 3 Sekil 4.13 Farkli kök patojenlerinin a, OPK-7 b, OPK- 1 9 v e c, OPA -1 8 primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen RAPD profilleri... 6 6 Sekil 4.14 Onbir farkli fungus türüne ait RAPD verisinin UPGMA analizi ile olusturulan dendogram... 6 7 Sekil 4.15 Farkli kök patojenlerinin a, (GA) 8 T b, (AG) 8 G ve c, ( A C ) 8 T primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen ISSR profilleri... 7 0 Sekil 4.16 Onbir farkli fungus türüne ait IS SR verisinin UPGMA analizi ile olusturulan dendogram... 7 1 Sekil 4.17 Onbir farkli fungus türünü n RAPD ve ISSR analizlerine ait kofenetik matriks degerleri arasindaki korelasyon egrisi...... 7 2 vii
ÇIZELGELER DIZINI Çizelge 1.1 Türkiye de 2000-2004 yillari aras indaki toplam nohut ekim alani, üretim ve verim degerleri... 2 Çizelge 3.1 Moleküler çalismalarda kullanilmak amaciyla farkli arastiricilardan temin edilen fungus izolatlari... 2 8 Çizelge 3.2 RAPD analizinde kullanilan primerler... 3 3 Çizelge 3.3 ISSR analizi nde kullanilan primerler ve annealing (Ta) sicakliklari... 3 4 Çizelge 4.1 Nohut surveyi yapilan iller, bu illerden elde edilen kök çürüklügü ve solgunluk etmenleri ve bu etmenlerden elde edilen izolat sayilari... 3 7 Çizelge 4.2 Nohutlarda hastaliga sebep olan fungus izolatlarinin toplandigi iller ve virulenslik dereceleri... 3 8-4 1 v i i i
1. GİRİŞ Nohut (Cicer arietinum L.) Güney ve Batı Asya, Hindistan, Etiyopya ve Kuzey Afrika ülkelerinde yaygın olarak kullanılan bir besin maddesi olup leucine, histidine, iso-leucine, lysine, fenilalanin, threonine ve valine gibi aminoasitlerce oldukça zengindir. (Eser ve Soran 1978, Muehlbauer 1993, Akem 1999). İnsan beslenmesinde yaygın olarak kullanılan nohut bitkisi tanelerinde yüksek oranda protein (% 18-31) içermesinden dolayı özellikle gelişmiş ülkelerde hayvan beslenmesinde ve yeşil gübre olarak da kullanılmaktadır. Ayrıca nohut baklagillerin genel bir özelliği olarak köklerinde bulunan Rhizobium spp. bakterileri ile ortak yaşam sürerek havanın azotunu tespit etmekte ve bulunduğu toprağı azot bakımından zenginleştirmektedir. Nohut, bu özelliği sebebiyle özellikle gelişmekte olan ülkelerdeki geleneksel ürün yetiştirme sistemlerinde oldukça önemli bir yer tutmakta ve toprak koşullarında oluşturduğu bu fiziksel, kimyasal ve biyolojik iyileşmeler nedeniyle ekim nöbetinde kendisinden sonra gelen kültür bitkileri için daha iyi bir gelişme ortamı sağlamaktadır (Eser ve Soran 1978). Ayrıca ülkemizde yemeklik olarak kullanılmasının yanısıra kuruyemiş sanayisinde önemli bir yer tutmaktadır. Türkiye gibi sıcak iklime sahip bölgelerde Kabuli olarak bilinen büyük taneli ve bej renkli nohutlar üretilmekte iken yarı kurak tropik bölgelerde Desi olarak isimlendirilen küçük, köşeli, siyah, kahverengi, sarı veya yeşil renkli nohutlar yetiştirilmektedir (Muehlbauer and Singh 1987). Dünyadaki nohut üretiminin % 97 si gelişmekte olan ülkelerde gerçekleşmekte olup 2004 de dünyada 10.380.739 hektar alanda nohut ekimi yapılarak 8.572.356 ton ürün elde edilmiştir. Ülkemiz ise dünyada nohut üretimi açısından yılda 5.770.000 ton üretim yapan Hindistan ın arkasından ikinci sırada yer almaktadır (Anonymous 2005). Ülkemizde 2004 yılı verilerine göre toplam nohut ekim alanı 630.000 ha, üretim 650.000 ton verim ise 1031 kg/ha dır (Çizelge 1.1). Ayrıca 2003 yılında 189.600 ton nohut ihraç edilerek ekonomiye 82.552.000 dolarlık bir katkı sağlamıştır. Bununla birlikte 2003 yılında 1
41 ton nohut ithal edilmiştir. Nohut ülkemizde 2004 yılı kayıtlarına göre ekim alanı ve üretim miktarı olarak da baklagiller arasında birinci sırayı almakta ve onu sırasıyla kırmızı mercimek ve kuru fasulye takip etmektedir (Anonymous 2005). Çizelge 1.1 Türkiye de 2000-2004 yılları arasındaki toplam nohut ekim alanı, üretim ve..verim değerleri (Anonymous 2005) Yıllar 2004 2003 2002 2001 2000 Hasat Edilen Alan (Ha) 630.000 630.000 660.000 645.000 636.000 Üretim Miktarı (Ton) 650.000 600.000 650.000 535.000 548.000 Verim(kg/ha) 1031 952 984 829 861 İnsan beslenmesinde önemli bir bitkisel protein kaynağı olan nohut (Cicer arietinum L) ülkemizde geniş ekim alanına sahip olmasına rağmen verim düzeyi istenilen miktarlarda değildir. Üretimdeki başlıca azalış nedenleri ise bölgesel çeşitlerin hastalıklara hassasiyeti, çevresel stres, kuraklık, hastalıklar, zararlılar ve hatalı ürün yönetimidir. Bu güne kadar 55 farklı ülkeden 67 fungus, 3 bakteri, 22 virus ve mikoplazma ve 80 nematod olmak üzere 172 patojenin nohutta hastalığa sebep olduğu ancak bunlardan bir kısmının ekonomik öneme sahip olduğu bildirilmiştir (Nene et al. 1996). Üretim azalışındaki en önemli nedenlerin başında Ascochyta yanıklığı, solgunluk ve kök çürüklüğü hastalıkları gelmektedir (Soran 1977, Haware et al. 1986, Maden 1987, Dolar 1996, Nene et al. 1996). Bu hastalıklardan özellikle toprak kökenli olan patojenler ile mücadelenin oldukça zor olması nedeniyle büyük ekonomik kayıplar meydana gelmektedir. Dünyada nohut ekimi yapılan tüm alanlarda özellikle Fusarium oxysporum f. sp. ciceris, Fusarium solani ve Rhizoctonia solani nin neden olduğu solgunluk ve kök çürüklüğü hastalıkları önemli problemlere sebep olmaktadır (Trapero-Casas and Jimenez-Diaz 1985, Haware et al. 1986, Jimenez-Diaz et al. 1991). Ayrıca bölgelere bağlı olarak Fusarium moniliforme, Sclerotinia sclerotiorum, Macrophomina phaseolina nın (Syn: Rhizoctonia bataticola) nohutta önemli zararlara sebep olduğu bildirilmiştir (Abou-Zeid and Hallila 2
2003, Singh et al. 2003). Ülkemizde de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris, F. solani, F. acuminatum, F. moniliforme, F. sambucinum, F. equiseti, Rhizoctonia solani, Macrophomina phaseolina ve Cylindrocarpon tonkinense nohutlarda solgunluk ve kök çürüklüğüne neden olan etmenler olarak saptanmıştır (Soran 1977, Dolar 1996, Dolar and Nirenberg 1998). Tüm dünyada bu patojenlerle mücadele yöntemi olarak dayanıklı nohut çeşitlerinin geliştirilmesi önerilmektedir. Ancak dayanıklılık bölgesel olarak değişkenlik göstermekte bu sebeple ıslah materyallerinin farklı üretim bölgelerinde test edilmesi gerekmektedir. Dayanıklı nohut çeşitlerinin mevcut olmamasının yanısıra önerilen tohum ilaçlamaları da hastalıkları engellemede yetersiz kalmaktadır. Ayrıca bu kimyasalların maliyetinin yüksek olması bunların yaygın kullanımını engellemektedir (Nene and Haware 1980, Jimenez-Diaz et al. 1989, Bhaduoria et al. 2003). Bitki patojeni fungusların teşhisleri onların kültürel ve morfolojik özellikleri dikkate alınarak yapılmaktadır. Bu klasik tekniklerle bazı hastalıkların teşhisi yüksek oranda doğru bir şekilde yapılabilmesine karşın birçok hastalık etmeninin tanısı ya çok zaman almakta yada şüpheli sonuçlar vermektedir. Özellikle saf kültürlerde incelenen fungal yapıların morfolojisine dayanan teşhis oldukça yorucu ve çok fazla zaman alıcı olmasının yanı sıra bu özellikler kullanılarak teşhislerin yapılmasında uzman kişilere ihtiyaç duyulmaktadır (Niessen and Vogel 1997). Ayrıca patojenlerin kültürel özelliklerinin substrat tipi, kültür aktarmaları ve inkübasyon koşullarından çok fazla etkilenmesinden dolayı teşhiste güçlüklerle karşılaşılmaktadır (Rutherford et al. 1995, Yoder and Christianson 1998). Özellikle Fusarium türlerinin kültürel ve morfolojik özelliklerinin kültür koşullarına bağlı olarak yüksek derecede değişkenlik göstermesinden ve bu cinsin sınıflandırılmasında farklı taksonomik sistemlerin kullanılması nedeniyle teşhiste büyük zorluklarla karşılaşılmaktadır. Taksonomik sınıflandırmada görülen bu farklılık Fusarium cinsinin Nelson et al. (1983) 30, Booth (1971) 51, Gerlach and Nirenberg (1982) ise 101 tür ve varyete altında sınıflandırılmasıyla da açıkça ortaya konmaktadır. Ayrıca Fusarium ların 3
ırk ve formae speciales ayırımı için kullanılan vejetatif uyum grupları, mikotoksin profili, spesifik ikincil metabolitleri üretme kabiliyeti ve patojenisite testleri gibi morfolojik olmayan parametreler ise her zaman güvenilir olmamaktadır (Edel et al. 1995, Voigt et al. 1995). Çünkü böyle testler izolatların seçimi (tipi, virulentliği, sporodochium tipi), kültürlerin saklanma koşulları, ürün tipi, inokulum konsantrasyonu, inokulasyon teknikleri, test edilecek çeşitlerin seçimi, bitkinin yaşı ve çevresel koşullar (sıcaklık, ışık, nem) gibi çeşitli faktörlerden etkilenmektedir (Armstrong and Armstrong 1981). Hastalıkların skala kullanılarak değerlendirilmesi ise değerlendirme yapan kişiye göre değişmekte ve sonuçların elde edilmesi için haftalarca beklenmesi gerekmektedir. Özellikle farklı araştırıcılar tarafından kullanılan skalaların ayırım sınırlarında görülen farklılıklar ise ırk ayırımında karmaşaya neden olmaktadır (Moricca et al. 1998, Sharma et al. 2004). Ayrıca toprakta, tohumda ve aynı bitki köklerinde birden fazla patojen bir arada bulunabilmekte bu ise hastalıktan sorumlu esas patojenin tespitini zorlaştırmaktadır. Bu sebeple hastalıktan sorumlu olan esas patojenlerin diğerlerinden hızlı ve güvenilir bir şekilde ayırımının yapılmasına ihtiyaç duyulmaktadır. Klasik yöntemlerle yapılan teşhislerin hem zaman alıcı olması hem de bazı fungus teşhislerinde zorluklarla karşılaşılmasından dolayı morfolojik karakterler kullanılmadan patojenlerin tespit ve ayırımını sağlayan basit, hızlı ve güvenilir metotlar için sürekli bir talep olmuştur. Bu güne kadar fungus genomundaki moleküler farklılığı araştırmak amacıyla DNA fingerprinting, Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), nüklear veya mitokondrial DNA nın Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) analizi, Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), farklı ribozomal spacer bölgelerinin DNA sekans analizi gibi birçok farklı yöntem kullanılmıştır. Ancak bu yöntemlerin bir kısmında sekans bilgisine ihtiyaç duyulması bir kısmının ise çok fazla emek ve iş gücü gerektirmesi sebebiyle çok yaygın bir kullanım alanı bulamamışlardır. Moleküler yöntemler kullanılarak fungal hastalık etmenlerinin belirlenmesi ile ilgili çalışmalara ise ülkemizde yeni yeni başlanmaktadır. Patojenlerin populasyon biyolojilerinin 4
araştırılmasında moleküler tekniklerin kullanılabilirliğinin tespit edilmesi patojenlerin tanısını pratikleştirdiği gibi bu patojenlerin genetik yapılarındaki varyasyonun belirlenmesi ileride konukçuda bulunan dayanıklılık genlerinin belirlenerek etkili bir ıslah programının hazırlanmasında ve hastalık kayıplarının azaltılmasında önemli rol oynayacağını göstermektedir. Bu çalışmada Türkiye nin önemli nohut ekim alanlarında görülen solgunluk ve kök çürüklüğü etmenlerinin coğrafik dağılımı ve virulenslikleri klasik yöntemler kullanılarak tespit edilmiştir. Ayrıca nohut ekimi yapılan alanlarda yaygın olan ve ekonomik kayıplara neden olan başta solgunluk etmeni Fusarium oxysporum olmak üzere yine nohutlardaki diğer kök çürüklüğü etmenlerinin genetik yapısındaki intra ve interspesifik polimorfizimlerin ortaya konulmasında RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ve ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) tekniklerinin kullanılabilirliği araştırılmıştır. 5
2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Nohut Kök ve Kök Boğazı Hastalıkları Üzerine Yapılan Çalışmalar Nohutlarda görülen kök ve kök boğazı hastalıkları genelde düşük rakımlı bölgelerde sıcak ve kuru sezonlarda önemli zararlara sebep olmakta ve tek bir bitki birden fazla patojen tarafından enfekte edilebilmektedir. Bu güne kadar dünyanın farklı yerlerinde 50 den fazla patojenin nohutlarda hastalığa sebep olduğunun bildirilmesine rağmen ekonomik önemde zarar yapan birkaç önemli toprak patojeni bulunmaktadır. Bunlar arasında Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in sebep olduğu Fusarium solgunluğu, Verticillium solgunluğu (Verticillium dahliae), kuru kök çürüklüğü (Macrophomina phaseolina, Syn: Rhizoctonia bataticola), kök boğazı çürüklüğü (Sclerotium rolfsii), ıslak kök çürüklüğü (Rhizoctonia solani), siyah kök çürüklüğü (F. solani), Phytophthora kök çürüklüğü (Phytophthora megasperma), Pythium kök ve tohum çürüklüğü (Pythium ultimum), kök dibi çürüklüğü (Operculella padwickii) ve Sclerotinia sclerotiorum un sebep olduğu gövde çürüklüğü hastalıkları yer almaktadır (Nene and Reddy 1987). Nohutlarda solgunluğa sebep olan Fusarium oxysporum f. sp. ciceris ilk kez Hindistan da 1940 yılında Padwick tarafından tanımlanmıştır. Daha sonra Burma, Kaliforniya, Etiyopya, Malavi, Meksika, Pakistan, Bangladeş, Peru, Tunus, İran, Suriye, Türkiye ve Sovyetler Birliğindeki nohut ekim alanlarında da görülmüştür (Westerlund et al. 1974, Trapero-Casas and Jimenez-Diaz 1985, Nene et al. 1996). Kuru kök çürüklüğüne sebep olan Macrophomina phaseolina ilk kez Hindistan da Mitra (1931) tarafından bildirilmiş ve bu tarihten itibaren Hindistan, İran, Lübnan, Meksika, Suriye, Türkiye, USA, Avustralya, Etiyopya ve Pakistan nın farklı bölgelerinden bu hastalık rapor edilmiştir (Westerlund et al. 1974, Nene and Reddy 1987). 6
Westerlund et al. (1974) Fusarium oxysporum f. sp. ciceris ve Rhizoctonia solani nin Kaliforniya daki ekim alanlarında solgunluk ve kök çürüklüğüne neden olan önemli patojenler olduğunu bildirmişlerdir. Soran (1977) solgunluk ve kök çürüklüğü belirtileri gösteren nohut bitkilerinden yaptığı izolasyonlar sonucunda bu belirtilere neden olan etmenlerin Fusarium oxysporum, F. acuminatum ve Pythium ultimum olduğunu bulmuştur. Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in neden olduğu solgunluğun Hindistan, İran, Pakistan, Nepal, Burma, İspanya ve Tunus ta nohutlarda % 10-40 arasında ürün kaybına neden olan önemli bir hastalık olduğu tespit edilmiştir ( Nene et al. 1984, Kaiser et al. 1994). Haware and Nene (1982) Hindistan ın farklı bölgelerindeki nohut alanlarından izole ettikleri Fusarium oxysporum f. sp. ciceris izolatlarını 10 farklı nohut çeşidiyle test ederek bunların hastalığa karşı gösterdikleri reaksiyonlarda farklılık olduğunu tespit etmişlerdir. Ayrıca yapılan bu reaksiyon testi sonucunda Hindistan da patojenin 1, 2, 3 ve 4 olmak üzere en az 4 farklı ırkının bulunduğunu bildirmişlerdir. Cabrera de la Colina et al. (1985) İspanya nın Andalucia bölgesinden elde edilen 54 Fusarium oxysporum f. sp. ciceris izolatı ile 8 farklı kabuli tipi nohut çeşidi kullanarak yaptıkları reaksiyon denemesi sonucunda bu bölgede 0, 1 ve 5 nolu ırkların bulunduğunu bildirmişlerdir. Fusarium oxysporum f. sp. ciceris izolatları solgunluk veya sararmaya sebep olmalarına göre iki grup içine alınmakta ve her iki hastalıkta vasküler enfeksiyonlar sonucu meydana gelmektedir. Bu patotiplerin nohut bitkisindeki patojenisite derecelerinde de farklılık görülmekte olup solgunluğa sebep olan patotiplerin sararmaya sebep olan patotiplerden çok daha önemli epidemilere sebep olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca Kuzey İspanya da kök ve 7
kök boğazı çürüklüğü nedeniyle oluşan sararmaların F. eumartii, F. solani ve bazen de nonvasküler F. oxysporum patojenleri ile oluştuğu bildirilmiştir (Trapero-Casas and Jimenez-Diaz 1985). Maden (1987) Türkiye nin farklı illerinden temin edilen nohut tohumlarında yaptığı incelemeler sonucunda tohumların Ascochyta rabiei, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, F. moniliforme, F. solani, F. equiseti, F. sambucinum, Macrophomina phaseolina ve Verticillium dahliae ile bulaşık olduğunu bulmuştur. Bu funguslardan F. oxysporum tohumlarda % 50 oranında tespit edilmiştir. Phillips (1988) California da nohut ekimi yapılan alanlardan alınan hastalıklı bitki örneklerinde Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in yeni bir ırkını bulmuş ve buna ırk 6 adını vermiştir. Jimenez-Diaz et al. (1989) Kuzey İspanya bölgesindeki önemli nohut alanlarında 1979-1981 yıllarında yaptıkları surveylerde bu bölgede Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in 0, 5 ve 6 nolu ırkı ile F. eumartii ve F. solani nin önemli olduğunu ve bunların % 32-54 oranında enfeksiyon yaptıklarını bildirmişlerdir. Ayrıca bu hastalıklarla en uygun mücadele yönteminin dayanıklı çeşitlerin kullanımı olduğunu belirtmişlerdir. Rhizoctonia solani nin Arjantin, Şili, Hindistan, İran, Meksika, Pakistan, ABD ve Türkiye de nohutlarda kök boğazında koyu kahverengi kök çürüklüğüne ve üst kısımlarında sararma ve solgunluğa neden olduğu araştırıcılar tarafından saptanmıştır. (Nene and Reddy 1987, Dolar 1996). Etiyopya da nohudun önemli solgunluk ve kök çürüklüğü hastalıkları olan Fusarium oxysporum f. sp. ciceris, Rhizoctonia bataticola, R. solani, F. solani, Sclerotium rolfsii 8
arasında en fazla ürün kaybını Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in meydana getirdiği tespit edilmiştir (Beniwal et al. 1992). Dolar (1996) Ankara ilindeki nohut ekim alanlarında Ascochyta yanıklığının yanısıra Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in oldukça yaygın olduğunu saptamıştır. Bunlara ilaveten Rhizoctonia solani, F. acuminatum, F. moniliforme, F. solani, F. equiseti, F. sambucinum ve Macrophomina phaseolina nın da bu alanlarda kök çürüklüğü ve solgunluğa sebep olduğunu gözlemlemiştir. Ülkemizde Ankara daki farklı nohut ekim alanlarından toplanan enfekteli bitkilerden izole edilen 31 Fusarium oxysporum f. sp. ciceris izolatı 10 farklı nohut çeşidinde test edilmiş ve bu bölgede patojenin 0, 2 ve 3 nolu ırklarının bulunduğu belirlenmiştir (Dolar 1997). Demirci vd. (1999) Doğu Anadolu da geliştirilen Aziziye 94 nohut çeşidinde, solgunluk ve kök çürüklüğü etmenleri olarak Fusarium solani f. sp. pisi, F. oxysporum f. sp. ciceris, F. acuminatum, F. avenaceum, F. equiseti, F. proliferatum, Macrophomina phaseolina ve Rhizoctonia solani yi (AG-5) tespit etmişlerdir. Bu izolatlar içerisinde Fusarium solani f. sp. pisi ve Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in diğer etmenlerden daha yaygın olduğunu da saptamışlardır. Mısır da farklı bölgelerde yetiştirilen nohut bitkilerinde görülen en önemli kök çürüklüğü ve solgunluk patojenlerinin Sclerotinia sclerotiorum, F. solani, F. oxysporum f. sp. ciceris, F. moniliforme ve R. solani olduğu ve bunların tarla koşullarında % 3.3-10.2 arasında enfeksiyon yaptığı Abou-Zeid and Hallila (2003) tarafından bildirilmiştir. Aynı araştırıcılar Mısırda Fusarium solani nin sebep olduğu siyah kök çürüklüğünün ve S. sclerotiorum un neden olduğu gövde çürüklüğünün Fusarium oxysporum f. sp. ciceris den daha önemli olduğunu belirtmişlerdir. 9
Shrivastava and Agrawal (2003) Hindistan ın Madhya Pradesh bölgesinde nohutlarda görülen en önemli hastalığın F. oxysporum f. sp. ciceris olduğunu ve % 10-20 oranında enfeksiyon yaptığını saptamışlardır. Sulama yapılan yerlerde ise S. rolfsii nin fidelerde % 90 a kadar varan ölümlere neden olduğu bildirilmiştir (Gupta and Babbar 2003). Singh et al. (2003) Hindistan ın Punjab bölgesinde nohudun en önemli hastalığının Fusarium oxysporum f. sp. ciceris ve Rhizoctonia bataticola olduğunu ve bu patojenlerin her yıl büyük ürün kayıplarına sebep olduğunu bildirmişlerdir. Sreekar et al. (2003) fide dönemindeki nohut bitkilerinin genelde Sclerotium rolfsii ye karşı yüksek derecede hassas olduğunu ancak ileriki dönemlerde Fusarium oxysporum f. sp. ciceris ve Rhizoctonia spp. in daha önemli hale geldiğini bildirmişlerdir. 2.2 Kök Patojenleri Arasındaki Genetik Farklılığın İncelenmesi İçin Yapılan..Moleküler Çalışmalar 2.2.1 Kök patojenleri arasındaki genetik farklılığın RAPD yöntemi ile incelenmesi Genetik marker olarak kullanılabilen amplifikasyon ürünleri oluşturmak için kısa, rasgele sentezlenen 9-10 bp lik oligonükleotit primerler ile gerçekleştirilen RAPD yöntemi ilk kez 1990 yılında Williams et al. tarafından bulunmuş olup bu tarihten itibaren birçok canlıdaki genetik farklılığı ortaya koymak için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu yöntemde amplifikasyonlar total genomik DNA üzerinde gerçekleştiği için RAPD analizi tek bir genetik bölge içindeki varyasyondan ziyade tüm genomdaki genetik varyasyonun değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır. Amplifikasyon koşullarına bağlı olarak farklı DNA ürünleri meydana gelmekte ve her amplifikasyon ürünü genomik DNA ile kullanılan primerler arasındaki kısmi sekans benzerliklerini göstermektedir (Welsh and McClelland 1990, Williams et al. 1990). 10
Crowhurst et al. (1991) Fusarium solani ye ait izolatların mating type karakterlerine bağlı olarak ayrılmasının bu türe ait izolatların genom organizasyonunu yansıtıp yansıtmadığını belirlemek amacıyla RAPD yöntemini kullanmışlardır. 14 primer ile gerçekleştirilen bu RAPD analizi sonucunda F. solani f. sp. cucurbitae ırk 1 ve 2 ye ait 21 izolat mating type ayırımına benzer şekilde iki gruba ayrılmıştır. Klasik yöntemlerle ayrılamayan 4 izolat ise RAPD tekniği ile mating type olarak ayrılabilmiştir. Ayrıca bu araştırıcılar RAPD tekniğinin izolatların mating type olarak ayrılmasının yanısıra türe veya ırka spesifik hibridizasyon probu oluşturmak için kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Fusarium oxysporum f. sp. pisi nin 4 ırkı arasındaki genetik değişkenliği RAPD yöntemi ile araştıran Grajal-Martin et al. (1993) seçilen 14 primer ile ırk 2 yi temsil eden izolatları ırk 1, 5 ve 6 izolatlarından ayırmayı başarmışlardır. Duncan et al. (1993) RAPD analizinin Avustralya daki farklı konukçulardan elde edilen Rhizoctonia solani izolatlarının hem pektik zymogram gruplarına göre ayrılmasında hem de farklı coğrafik bölgelerden elde edilen bu gruplar içerisindeki varyasyonun ortaya konulmasında oldukça etkili olduğunu bildirmişlerdir. Pamuklarda solgunluğa neden olan Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum un 46 izolatının 5 farklı pamuk çeşidinde yapılan patojenisite testi sonucunda 3 ırka ayrıldığını belirten Assigbetse et al. (1994) 11 farklı primer ile yapılan RAPD analizi sonuçlarının patojenisite sonuçlarına benzediğini bildirmişlerdir. Kelly et al. (1994) Fusarium oxysporum f. sp. ciceris ve diğer Fusarium türleri arasındaki ilişkiyi RAPD analizi ile incelemişler ve Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in 0, 1B, 1C ırklarını sararma 1A, 2, 3, 4, 5 ve 6 nolu ırklarını ise solgunluğa sebep olmalarına göre iki gruba ayırmışlardır. Yapılan RAPD analizleri sonucunda Fusarium oxysporum f. sp. ciceris izolatlarını diğer nohut patojenlerinden ayırmayı da başarmışlardır. Aynı araştırıcılar 1998 yılında yaptıkları bir diğer çalışmada ırk 5 e spesifik olan 1.6 kb büyüklüğünde bir RAPD 11
fragmentini klonlayarak sekans analizi yapmışlardır. Elde edilen bu primer (wilt 1/2) ile yapılan PCR analizi sonucunda amplifiye edilen 1.5 kb büyüklüğündeki bir fragmentin enfekteli ancak belirti göstermeyen nohut bitkilerinde solgunluğa sebep olan Fusarium oxysporum f. sp. ciceris izolatlarının sararmaya sebep olan Fusarium oxysporum f. sp. ciceris izolatlarından ve diğer fungus türlerinden ayırımını mümkün kıldığını bildirmişlerdir. Ancak bu primerin, kök ve gövde dokularından elde edilen DNA da Fusarium oxysporum f. sp. ciceris tespitini sağladığı halde aynı enfekteli bitkilerin yaprak dokularında fungusun varlığını tespit etmekte yetersiz olduğunu belirtmişlerdir. Manulis et al. (1994) karanfillerde solgunluğa sebep olan Fusarium oxysporum f. sp. dianthi nin patojenik ve non patojenik izolatlarını ayırmak için yaptıkları RAPD analizinde kullanılan 30 primerden 22 sinin bu izolatların ayırımını sağladığını bildirmişlerdir. Ayrıca bu primerlerden bazılarının 1.4 kb büyüklüğünde bir fragmenti amplifiye ederek ırk 2 ve ırk 4 izolatlarının birbirinden ayırmasını sağladığını tespit etmişlerdir. İspanya ve Hindistan daki nohut ekim alanlarından elde edilen Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in 7 farklı ırkını ayırmak için mitokondrial DNA (mt DNA) daki RFLP polimorfizimlerinden yaralanan Perez-Artes et al. (1995) 40.5 kb büyüklüğündeki mt DNA nın 8 farklı restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesilmesi sonucu elde edilen RFLP polimorfiziminin Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in ırklarını ayırmak için yeterli olmadığını bu sebeple mt DNA nın patojenik farklılıktan sorumlu olamayabileceğini bildirmişlerdir. Yang et al. (1995) RAPD analizi ile Rhizoctonia solani izolatlarının pektik zymogram gruplarına göre ayrılabildiğini ancak patojenisite ve coğrafik dağılım açısından herhangi bir ilişkinin bulunamadığını bildirmişlerdir. Farklı coğrafik bölgelerden elde edilen F. moniliforme izolatlarını gibberellin üretimi ve genetik akrabalık bakımından inceleyen Voight et al. (1995) gibberellin üreten tüm 12
izolatların ayni RAPD profili gösterdiğini tespit etmişlerdir. 51 primer kullanılarak yapılan RAPD analizi ile gibberellin üreten tüm izolatlar grup C (mating populasyonu) içerisinde yer alırken gibberellin üretmeyen izolatlar (A, B, D, E, F) arasında büyük polimorfik farklılıkların olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca RAPD verilerine dayanılarak yapılan filogenetik analiz ile test edilen tüm Fusarium izolatlarının birbirinden ayrılması sağlanmıştır. Finlandiya ve Norveç deki hastalıklı conifer fidelerinden elde edilen Rhizoctonia solani nin tek nükleuslu izolatları, RAPD analizi sonucunda elde edilen verinin UPGMA analizi ile bir gruba (% 75 benzerlik) ayrılır iken iki nükleuslu izolatları farklı bir grubu (%10-25 benzerlik) oluşturmuştur (Lilja et al. 1996). Schilling et al. (1996) başak yanıklığına sebep olan Fusarium culmorum ve F. graminearum un ITS sekanslarının türe özgü primerler hazırlamak için yeterince polimorfik olmaması sebebiyle bu izolatların spesifik tespiti için SCARs a dayalı bir PCR denemesi geliştirmiştir. RAPD analizi ile F. graminearum ve F. culmorum izolatlarından elde edilen 410 bp ve 470 bp büyüklüğündeki fragmentlerin klonlanmasıyla hazırlanan SCARs primerleri bu fungusların test edilen diğer fungus türlerinden ayırımını sağlamıştır. Achenbach et al. (1997) soya fasulyesinde ani ölüme sebep olan Fusarium solani f. sp. phaseoli izolatları arasındaki genetik ilişkiyi araştırdıkları çalışmalarında 28 S ribozomal DNA sı üzerinde bulunan D2 bölgesinin bu formae speciales içindeki izolatların ayırımı için yeterli sekans varyasyonu içermediğini ancak tür seviyesinde ayırımı sağladığını bildirmişlerdir. Buna karşın aynı araştırıcılar tüm genomun incelenmesine olanak sağlayan RAPD yöntemi ile ani ölüm sendromuna sebep olan F. solani f. sp. phaseoli izolatlarını non patojenlerden ayırmayı başarmışlardır. Fusarium acuminatum, F. sporotrichioides ve F. tricinctum arasındaki taksonomik ilişkiyi araştırmak için yapılan isozyme ve RAPD analizi sonucunda klasik yöntemlerle yapılan 13
sınıflandırmada bazı hataların olduğu ve bu sebeple Fusarium un Gibbosum ve Sporotrichiella seksiyonlarının yeniden revize edilerek F. acuminatum izolatlarının iki farklı türe ayrılması gerektiği bildirilmiştir (Altomare et al. 1997). Huang et al. (1997) İsrail ve USA da mısır bitkisinde önemli bir hastalık olan Fusarium moniliforme nin 43 izolatından 10 primer kullanılarak elde edilen 48 polimorfik bandın değerlendirilmesi ile 32 RAPD haplotipinin ortaya çıktığını bildirmişlerdir. Ayrıca 2 vejetatif uyum grubunun (VCG) aynı haplotipi paylaşması dışında RAPD ve VCG ayırımının uyum içerisinde olduğu görülmüştür. Aynı tarladaki 6 mısır hattından elde edilen 63 izolatın 42 VCG ve 37 RAPD haplotipine ayrıldığı ve mısır hatlarındaki genetik farklılığın % 81 olduğu yine bu çalışma ile tespit edilmiştir. Ayrıca RAPD analizinin VCG testine göre daha basit olduğunu ve aynı VCG na giren bazı izolatlar arasındaki moleküler varyasyonu belirlemek için daha faydalı olduğu bu araştırıcılar tarafından bildirilmiştir. Fernandez et al. (1997) Fransa nın Algeria bölgesinde Bayound hastalığı olarak isimlendirilen ve palmiye bitkisinde vasküler solgunluğa sebep olan Fusarium oxysporum f. sp. albedinis izolatları arasındaki genetik ilişkiyi araştırmak için vejetatif uyum testi, mtdna RFLP ve RAPD yöntemlerini kullanmışlardır. Farklı coğrafik bölgelerden elde edilen 98 izolatın vejetatif olarak uyumlu olduğu ve tek bir gruba ayrıldığı tespit edilmiştir. Ayrıca bu izolatlardan 73 tanesinin mtdna sında genetik varyasyon tespit edilememiş ve tüm izolatlar aynı mtdna RFLP grubuna ayrılmıştır. RAPD analizi ile elde edilen 43 bandın değerlendirilmesi ise bu izolatların genetik olarak yakından ilişkili olduğunu (0.032) ancak izolatlar arasında coğrafik olarak bazı faklılıkların bulunduğunu göstermiştir. Yoder and Christianson (1998), Discolor seksiyonunda bulunan altı Fusarium türüne ait 67 izolat üzerinde yaptıkları RAPD ve PCR çalışmasında farklı türe ait olan bu izolatlardan altısının birbirine çok fazla benzediğini ve bunlardan elde edilen RAPD bantlarının aynı türün farklı izolatları ile elde edilen bantlardan farklı olduğunu tespit etmişlerdir. Ayrıca farklı kültür koleksiyonlarında F. graminearum olarak saklanan ve farklı taksonomistler 14
tarafından F. sulphureum, F. crookwellense ve F. venenatum olarak teşhis edilen ATCC 20334 izolatı üzerinde yaptıkları moleküler ve morfolojik çalışmalar ile bunun aslında F. venenatum olduğunu bildirmişlerdir. Migheli et al. (1998) farklı coğrafik bölgelerdeki hastalıklı karanfil bitkilerinden elde edilen 72 Fusarium spp. izolatını RAPD ve patojenisite testleri ile incelemişlerdir. Patojenisite testlerinde Fusarium oxysporum f. sp. dianthi olarak tespit edilen izolatlar üzerinde 10 primer ile yapılan RAPD analizinde 0.3-4.0 kb arasında değişen büyüklerde toplam 72 polimorfik band değerlendirilmiş ve 60 F. oxysporum f. sp. dianthi izolatı üç gruba ayrılmıştır. Patojenisite testinde ırk 4 olarak ayrılan izolatlar birinci grubu oluştururken ırk 2, 5 ve 6 ikinci grubu, ırk 1 ve 8 ise üçüncü grubu oluşturmuştur. Ayrıca RAPD analizi ile patojen F. oxysporum f. sp. dianthi izolatlarının patojen olmayan izolatlardan ve diğer Fusarium türlerinden ayırt edilebildiğini ancak RAPD verileri ile izolatların coğrafik dağılımı arasında bir ilişki bulunamadığını belirtmişlerdir. PDA ortamında benzer koloni morfolojisi gösteren Fusarium avenaceum ile F. tricinctum un nüklear 5.8S ITS bölgelerindeki RFLP farklılıklarının bu iki türün izolatlarını ayırmak için yeterli polimorfizim oluşturmadığı belirten Turner et al. (1998) RAPD profillerinin bu iki türün birbirinden ayrılmasını sağladığını bildirmişlerdir. Elde edilen bu RAPD profiline dayanılarak hazırlanan primer çifti (JIAf,r) ile yapılan PCR analizi sonucunda test edilen bütün F. avenaceum izolatlarından 220 bp büyüklüğünde bir fragmenti amplifiye ederek çapraz reaksiyonlar olmadan F. avenaceum un, F. tricinctum ve incelenen diğer buğday patojenlerinden ayrılması sağlanmıştır Chiocchetti et al. (1999) enfekteli fesleğen bitkilerinden izole edilen 52 Fusarium oxysporum izolatını patojenisite ve RAPD analizine tabii tuttukları çalışmaları sonucunda patojenisite testinde Fusarium oxysporum f. sp. basilici olarak teşhis edilen izolatların RAPD analizi ile patojen olmayan Fusarium oxysporum izolatları ve diğer Fusarium türlerinden ayrılabildiğini bildirmişlerdir. 15
Hernandez et al. (1999) 15 farklı primer ile farklı coğrafik bölgelerden elde edilen 35 Fusarium oxysporum izolatı üzerinde RAPD tekniği ile çalışmalar yapmışlardır. Bu çalışmalarında kullanılan primerlerden hiçbirinin tüm F. oxysporum f. sp. dianthi izolatlarında ortak olan bir amplifikasyon bandı oluşturmadığını bildirmişlerdir. Ancak bu primerlerden sadece OPA-17 primerinin F. oxysporum f. sp. dianthi izolatlarının kendi içinde 4 farklı gruba ayrılmasını ve ayrıca bu izolatların F. oxysporum un diğer formae speciales lerinden ve yakın olarak ilişkili diğer türlerden ayırımını sağladığını tespit etmişlerdir. Farklı konukçulardan elde edilen 27 F. oxysporum ve dört farklı türe (F. avenaceum, F. equiseti, F. graminearum ve F. redolens ) ait olan 9 Fusarium izolatını RAPD, rdna RFLP ve isozyme analizi ile inceleyen Huhtala et al. (1999) 3 primerle gerçekleştirilen RAPD analizi sonucunda her izolattan 300-2000 bp arasında 2-10 fragmentin amplifiye olduğunu bildirmişlerdir. Bu fragmentlerden elde edilen parsimony ağacı ile tüm izolatlar birbirinden ayrılmış ve F. oxysporum izolatları kendi arasında 7 farklı grup içerisinde toplanmıştır. Ayrıca F. oxysporum izolatlarının gruplandırılmasında konukçu ve coğrafik orjin bakımından bazı ilişkilerin bulunduğu ve isozyme analizi sonuçlarının RAPD analizi sonuçlarına benzediği görülmüştür. Araştırıcılar ITS bölgesinin RFLP analizi ile F. oxysporum, F. avenaceum, F. equiseti, F. graminearum ve F. redolens türlerinin birbirinden ayrılabildiğini ancak bu yöntemin intraspesifik polimorfizimlerin incelenmesinde yetersiz olduğunu bildirmişlerdir. Garcia-Pedrajas et al. (1999) hastalık ile bulaşık topraklardan Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in solgunluğa sebep olan patotiplerinin direkt olarak tespitini sağlayan bir Nested- PCR metodu geliştirmek amacıyla Kelly et al. (1994, 1998) tarafından tespit edilen 1.618 bp büyüklüğündeki bir RAPD fragmentinin sekansından yararlanmışlardır. Bu araştırıcılar WiltNF-1/WiltNR-1 ve WiltNF-2/WiltNR-2 primerleri ile yaptıkları PCR analizi sonucunda oluşan 605 bp büyüklüğündeki bir fragmentin toprak örneklerinde bulunan 16
Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in solgunluğa sebep olan izolatlarının spesifik olarak belirlenmesini sağladığını bulmuşlardır. RAPD, ERIC (Enterobacterial repetitive intergenic consensus) ve REP-PCR (Repetitive extragenic palindromic) yöntemlerini kullanarak 11 farklı AG ye ait Rhizoctonia solani izolatları arasındaki genetik farklılığı araştırdıkları çalışmalarında Toda et al. (1999) 0.2-5.56 kb arasında değişen büyüklüklerde ortalama 23 fragment amplifiye etmiş ve 41 Japon izolatı arasında 7 farklı grup tespit etmişlerdir. Vakalounakis and Fragkiadakis (1999) solgunluk belirtisi gösteren hıyar bitkilerinden izole edilen 106 Fusarium oxysporum izolatını patojenisite, VCG ve genetik farklılıkları bakımından incelemişlerdir. Patojenisite testleri ile bu izolatlardan 68 tanesi F. oxysporum f. sp. radicis-cucumerinum, 32 tanesi F.oxysporum f. sp. cucumerinum, 6 tanesi ise avirulent olarak belirlenmiştir. RAPD analizi ile bu izolatlar Fusarium oxysporum un diğer formae specialeslerinden ve avirulent izolatlarından ayrılırken F. oxysporum f. sp. radiciscucumerinum izolatları tek, F.oxysporum f. sp. cucumerinum izolatları ise iki farklı RAPD grubuna ayrılmıştır. Ayrıca daha önceki çalışmalarda F. oxysporum f. sp. cucumerinum olarak teşhis edilen 4 izolatın F. oxysporum f. sp. radicis-cucumerinum olarak sınıflandırılması gerektiğini bildirmişlerdir. Chakrabarti et al. (2001) Hindistan da bulunan Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in ırklarını ayırmak için basit bir metot geliştirmişler ve bunun için nüklear ribozomal DNA üzerinde bulunan ITS1-5.8S-ITS2 ve IGS bölgelerini farklı restriksiyon enzimleri ile kesmişlerdir. Yapılan enzim kesimi sonucunda ITS bölgelerinin Fusarium oxysporum f. sp. ciceris izolatları içerisinde yüksek derecede korunmuş olduğunun buna karşın IGS bölgesinin bu patojenin 1, 2, 3 ve 4 nolu ırklarının üç farklı gruba ayrılmasını sağladığını tespit etmişlerdir. Ayrıca IGS bölgesinin EcoRI enzimi ile kesimi sonucunda ırk 1 ve 4 benzer profiller oluşturur iken ırk 2 ve 3 ün birbirlerinden oldukça farklı profiller verdiği gözlemlenmiştir. 17
De Haan et al. (2000) 10 mer lik oligonükleotit primerlerini kullandıkları RAPD analizde 609 ve 1169 bp büyüklüğünde iki fragmenti amplifiye ederek Fusarium oxysporum f. sp. gladioli ırk 1 izolatlarını ırk 2 ve diğer test edilen Fusarium türlerinden ayırmayı başarmışlar ve bu RAPD profillerini kullanarak ırka spesifik primerler hazırlamışlardır. Soya fasulyesinde hipokotil çürüklüğü ve yaprak yanıklığına sebep olan Rhizoctonia solani izolatlarını ayırmak için 35 polimorfik markerı değerlendiren Fenille et al. (2002) RAPD analizi ile AG-1 IA, AG-2-2 IIIB, ve AG-4 HGI anastomosis gruplarını sebep oldukları hastalık simptomlarına göre 3 farklı gruba ayırmıştır. ITS 1 ve 2 bölgelerinin nükleotit sekansı ve uzunluklarından yararlanılan bir diğer çalışmada ise Fenille et al. (2003) % 84.3-100 benzerlik ile hipokotil çürüklüğü ve yaprak yanıklığına sebep olan anastomosis gruplarını birbirinden ayırmayı başarmıştır. Freeman and Maymon (2000) karantina listesinde olan Fusarium oxysporum f. sp. albedinis in patojen ve patojen olmayan farklı F. oxysporum izolatları ile diğer Fusarium spp. türlerinden ayrılmasında RAPD ve türe spesifik PCR yöntemlerinin güvenilirliğini karşılaştırmışlardır. Spesifik PCR yöntemi ile elde edilen 400 ve 204 bp büyülüğündeki fragmentler F. oxysporum f. sp. albedinis izolatlarının diğer izolatlardan kesin olarak ayrılmasını sağlamıştır. RAPD analizinde ise bazı patojen ve saprofit Fusarium türleri ile F. oxysporum f. sp. albedinis izolatlarının benzer bir genomik yapıya sahip olduğu görülmüştür. Hindistan da yaygın olan Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in 4 ırkı arasındaki genetik farklılığı araştırmak için microsatellit markerlar (Barve et al. 2001) kullanılmıştır. Microsatellit lokuslarına komplemantar olan 13 oligonükleotit prob ve 11 restriksiyon enzimi ile gerçekleştirilen DNA fingerprinting analizinde ırk 1 ve 4 izolatları arasında % 76.6 oranında bir genetik benzerliğin olduğu görülmüştür. Bu grup ile ırk 2 izolatları arasında % 67.3, ırk 3 izolatları arasında ise % 26.7 oranında bir genetik benzerlik olduğu tespit edilmiştir. Farklı enzim-prob kombinasyonlarında yapılan bu hibridizasyon analizi 18
sonucunda ırk 1, 2 ve 3 izolatlarına spesifik olan hibridizasyon bantları tespit edildiği halde ırk 4 e spesifik bir bant tespit edilememiştir. Ayrıca bu araştırıcılar genetik farklılığın tespit edilmesinde düşük G+C içeriğine sahip olan [(AGT) 5, (ATC) 5 ve (GATA) 4 ] problarının daha faydalı olduğunu ve enzim kesiminde 4 baz kesici enzimlerin 5 ve 6 baz kesici enzimlere göre daha fazla polimorfizim oluşturduğunu bildirmişlerdir. Jimenez-Gasco et al. (2001) Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in ırklarını ayırmak için 60 izolat ve 40 primer kullanarak gerçekleştirdikleri çalışmalarında 0, 1B/C, 5 ve 6 nolu ırklara karşı spesifik RAPD markerlarını tespit etmişlerdir. Bunun yanı sıra elde edilen 160 bandın cluster analizi ile Fusarium oxysporum f. sp. ciceris izolatlarını 3 gruba ayırmışlardır. Sararmayı teşvik eden izolatlar (ırk 0 ve ırk 1B/C) kendi arasında iki gruba ayrılmış, solgunluğu teşvik eden izolatlar (ırk 1A, 2, 3, 4, 5 ve 6) ise üçüncü grubu oluşturmuştur. Bu çalışmada elde edilen ırka spesifik RAPD markerları, bu fungusun direkt olarak tespitini sağlayan spesifik primerler oluşturmak için kullanılmıştır. SCAR analizi ile elde edilen bu primerlerden Foc0-12f/ Foc0-12r primeri 1.5 kb büyüklüğünde bir fragmenti amplifiye ederek Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in patojen izolatlarının patojen olmayan izolatlardan ve diğer formae speciales lerden ayrılmasını sağlamıştır. Ayrıca bu araştırıcılar SCAR analizi ile oluşturulan diğer klonlardan elde edilen primerlerin 0, 1A, 5 ve 6 nolu ırkların spesifik olarak tespitini mümkün kıldığını bildirmişlerdir (Jimenez-Gasco et al. 2003). İspanya da fasulyelerde solgunluğa sebep olan Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli nin 43 izolatı RAPD analizi ile 4 farklı gruba ayrılarak patojenin yüksek derecede virulent olan izolatları için spesifik olan bir RAPD markerı tespit edilmiştir (Alves-Santos et al. 2002). Araştırıcılar bu RAPD markerını klonlayarak hazırladıkları SCAR primerlerinin 609 bp büyüklüğünde bir fragmenti amplifiye ederek yüksek derecede virulent olan izolatların patojenlerden olmayan izolatlardan ayrılmasını ve simptom göstermeyen bitki dokusundan patojenin direkt olarak tespitini mümkün kıldığını bildirmişlerdir. 19
RAPD ve AFLP teknikleri ile 4 ırkı temsil eden 43 Fusarium oxysporum f. sp. ciceris izolatları arasındaki genetik farklılığı araştıran Sivaramakrishnan et al. (2002) 20 farklı primer ile gerçekleştirilen RAPD analizinde her bir izolat için 0.5-3 kb arasında değişen büyüklüklerde 3-6 fragmentin amplifiye olduğunu tespit etmişlerdir. Elde edilen benzerlik indeksine göre bu izolatlar 4 gruba ayrılmıştır. Buna göre ırk 1 ve ırk 2 izolatları tek başlarına iki farklı gruba ayrılırken ırk 3 ve ırk 4 birlikte üçüncü grubu oluşturmuştur. Patojenin bilinen ırklarına benzerlik göstermeyen 6 izolat ise dördüncü grubu oluşturmuştur. Aynı araştırıcılar AFLP analizi ile izolatlar arasında benzer bir dağılımın olduğunu tespit etmişlerdir. Her iki yöntem ile ırk 1 ve ırk 2 izolatları kesin olarak birbirinden ayrıldığı halde ırk 3 ve 4 nolu izolatların birbirinden ayrılamadığını ancak AFLP yönteminin izolatlar arasındaki polimorfizimin ortaya çıkarılmasında daha etkili olduğunu bildirmişlerdir. Brezilya da soya fasulyesinin en önemli patojenlerinden olan Macrophomina phaseolina izolatları arasındaki ilişkiyi incelemek için RAPD ve PCR-RFLP yöntemlerini kullanan Almeida et al. (2003) tarafından UPGMA analizi ile 55 izolat, % 70 benzerlik seviyesinde üç farklı gruba ayrılmıştır. Aynı çalışmada farklı konukçulardan elde edilen diğer M. phaseolina izolatları % 55 benzerlik ile 6 farklı gruba ayrılmıştır. ITS bölgesinin PCR- RFLP si ile elde edilen 260 bp büyüklüğündeki fragmentin enzim kesimi ise izolatlar arasında herhangi bir polimorfizim oluşturmamıştır. Cramer et al. (2003) fasulye ve şeker pancarı bitkilerinde solgunluğa sebep olan Fusarium oxysporum izolatlarını patojenisite testi ve RAPD analizi ile incelemişlerdir. 12 primer ile elde edilen 105 polimorfik markerın UPGMA analizi kullanılarak değerlendirilmesi sonucunda kofenetik korelasyon katsayısını r=0.98 olarak bulmuşlar ve incelenen tüm izolatlar arasında yüksek bir genetik varyasyonun olduğunu tespit etmişlerdir. Ancak izolatların patojenisite sonuçları ile dendogramdaki dağılımları arasında ilişki kurmak için RAPD analizinin çok fazla uygun olmadığını belirtmişlerdir. 20
Jana et al. (2003) aralarında nohutun da bulunduğu farklı konukçulardan elde edilen 43 Macrophomina phaseolina izolatı ile farklı formae speciales ve ırka ait 22 Fusarium izolatını 210 RAPD markerı kullanarak incelemişlerdir. Yapılan bu çalışma ile M. phaseolina izolatlarından 0.3-3.5 kb büyüklüğünde değişen 2-8 band amplifiye edilmiş ve bu izolatlar 5 farklı gruba ayrılmıştır. Nohuttan elde edilen izolatlar ise 3 farklı grupta yer almıştır. Ayrıca tek bir RAPD primeri ile M. phaseolina izolatlarının tüm Fusarium izolatlarından ayrılabildiğini ve bu tek primer metodunun en azından cins seviyesinde spesifik markerlar geliştirilmesi için faydalı olacağını bildirmişlerdir. Üniversal çeltik primerleri kullanılarak yapılan bir diğer çalışmada ise nohuttan elde edilen M. phaseolina izolatları, soya fasulyesi ve pamuktan elde edilen izolatlardan tamamen ayrı olarak gruplanmış ancak bu izolatlar arasında spesifik bir gruplanmanın olmadığı gözlemlenmiştir (Jana et al. 2005). Justesen et al. (2003) farklı tarla ve çeşit farklılığı ile ürün rotasyonunun patates gövde ve yumrularındaki R. solani populasyonuna etkisini RAPD ve ITS sekansı ile incelemişlerdir. Yapılan bu çalışma ile elde edilen tüm izolatların AG-3 grubuna ait olduğu ve populasyon gen akışında yumruların gövdeden daha önemli rol oynadığı tespit edilmiştir. Ayrıca ürün rotasyonu veya patates çeşidinin populasyon yapısında etkili olmadığı görülmüştür. 2.2.2 ISSR ile ilgili moleküler çalışmalar Inter simple sequence repeats (ISSR) tekniği genomik DNA üzerinde bulunan microsatellit tekrarlanma bölgelerinin amplifikasyonuna dayanan bir PCR yöntemidir. DNA ın farklı uçlarındaki iki microsatellit tekrar bölgesi arasında bulunan ve amplifikasyon mesafesinde olan DNA segmentinin amplifikasyonuna dayanmaktadır. Bu teknikte farklı büyüklüklerdeki ISSR sekanslarının amplifikasyonu için çok sayıda genomik lokusu hedef alan 16-25 bp büyüklüğündeki primerler kullanılmaktadır. 2, 3, 4 veya 5 li microsatellit tekrarlarından oluşan bu primerler, 5 veya 3 uçlarına 1-4 adet çapa eklenerek (anchored) veya eklenmeden de (unanchored) kullanılabilmektedir. Enzim kesimi ve ligasyon gibi 21
işlemlere gerek olmayan ISSR yönteminde, RAPD primerlerine (10 bp) göre daha uzun olan (16-25 bp) ve bu sebeple daha yüksek annealing sıcaklıklarının (45-60 C) kullanımına olanak sağlayan microsatellit primerler daha fazla polimorfizimin oluşmasına olanak sağlamaktadır. RAMS (Random amplified microsatellite-technique), MP-PCR (Microsatellite-primed PCR) gibi farklı isimlerde verilen bu yöntemde elde edilen PCR ürünleri elektroforetik olarak agaroz jelde ayırıma tabii tutulmaktadır (Meyer et al. 1993, Zietkiewicz et al. 1994, Hantula et al. 1996). Coniferler de kansere neden olan Gremmeniella abietina var. abietina populasyonları arasındaki genetik varyasyonu RAMS tekniği ile inceleyen Hantula and Muller (1997) üç primer ile dört farklı amplifikasyon ürününün oluştuğunu ve bu polimorfik bantların Gremmeniella izolatlarının Kuzey Amerika, Asya, Avrupa ve Kuzey Amerika-Avrupa grupları olarak farklı gruplara ayrılmasını sağladığını bildirmişlerdir. Aynı teknik kullanılarak yapılan başka bir çalışmada ise Hantula et al. (2000) çilek bitkisinde meyve ve taç çürüklüğüne sebep olan Phytophthora cactorum izolatları arasında genetik olarak fark bulunmadığını tespit etmişlerdir. Ayrıca RAMS markerları ile bu fungusun Kuzey Amerika ve Avrupa dan elde edilen çilek izolatları arasında genetik varyasyon tespit edilmesine karşın farklı konukçulardan elde edilen izolatları arasında kesin bir genetik ayırımın bulunmadığı bu çalışma ile tespit edilmiştir. Tuber ve Glomales e ait türler arasındaki intra ve interspesifik farklılıkları inceleyen Longato and Bonfante (1997) microsatellit primerlerin yakın olarak ilişkili olan türlerin ayrılması için oldukça faydalı olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca microsatellit primerlerin türe spesifik markerlar elde etmek için PCR-RFLP ve RAPD yöntemlerine kıyasla daha basit, hızlı ve kullanılabilir oldukları bu çalışmada tespit edilmiştir. Barnes et al. (2001) farklı konukçularda solgunluk ve kansere sebep olan Ceratocystis fimbriata izolatlarına spesifik primerler oluşturmak için ISSR-PCR yöntemini kullanmışlardır. Bu amaçla CMW 4822 ve CMW4835 izolatları 7 ISSR primeri 22
kullanılarak amplifiye edilmiştir. Amplifikasyon sonucu oluşan bantlar (200-2600 bp) klonlanarak microsatellit bölgelerine bitişik sekansları hedef alan primer çiftlerini hazırlamak için kullanılmıştır. Bu primer çiftleri ile elde edilen verilerin cluster analizi sonucunda coğrafik bölge ve konukçu bakımından Ceratocystis fimbriata izolatları birbirinden ayrılabilmiştir. RAM-PCR ve RAPD analizleri ile elde edilen verilerin bireysel olarak veya birleştirilmesiyle oluşturulan dendogramların 57 Geotrichum candidum izolatının ayrılmasını sağladığını ve izolatlar arasında yüksek bir genetik farklılığın olduğu Gente et al. (2002) tarafından bildirilmiştir. Grunig et al. (2001) ağaç köklerinde endofitik olarak bulunan Phialocephala fortinii ve spor vermeyen Tip 1 izolatlarını ISSR analizi ile incelemişlerdir. Bu izolatlardan 0.32-4.1 kb arasında değişen büyüklüklerde 92 fragment amplifiye edilmiş ve bunların % 92.4 ünün polimorfik olduğu tespit edilmiştir. Bu araştırıcılar P. fortinii izolatlarında yüksek bir intraspesifik varyasyonun olduğunu ve ISSR analizinin tür veya taksona spesifik markerlar geliştirmek ve populasyon genetiğinin incelenmesi için oldukça faydalı olabileceğini bildirmişlerdir. Soya fasulyesinde kahverengi gövde çürüklüğüne sebep olan Phialophora gregata izolatları ile yapılan ISSR ve AFLP analizlerinde elde edilen toplam 121 fragmentten % 54 nün polimorfik olduğu ve ISSR analizinin genetik farklılığı tespit etmede AFLP yönteminden daha hassas olduğu Meng and Chen (2001) tarafından bildirilmiştir. Shukla et al. (2001) insanlarda ve hayvanlarda hastalığa sebep olan Leptospira nın serovarlarını ayırmak için gerçekleştirdikleri ISSR analizinde kullanılan 6 primerden sadece (AG) 8 T primerinin iki patojen olmayan Leptospira türünde 1000 bp büyüklüğündeki fragmentin amplifikasyonunu sağladığını tespit etmişlerdir. Ayrıca patojen ve patojen 23
olmayan Leptospira türlerinin ayırımında primerin 3 uçunda bulunan Timin bazının önemli bir rol oynadığını bildirmişlerdir. Botryosphaeria nin Hyala ve Brunnea seksiyonlarına ait 10 farklı türü ISSR yöntemi ile inceleyen Zhou et al. (2001), beş primer ile bu izolatlardan 0.2-1.65 kb arasında değişen büyüklüklerde toplam 171 fragmentin amplifiye olduğunu tespit etmişlerdir. Ayrıca elde edilen verinin cluster analizi sonucunda benzer morfolojik yapıya veya ITS sekansına sahip olan fungusların ayrımında ISSR analizinin faydalı olduğu belirtilmiştir. Entomopatojen bir fungus olan Nomuraea rileyi izolatları arasındaki filogenetik ilişkiyi araştırmak için ISSR analizinden yararlanılmıştır (Han et al. 2002). Oniki microsatellit primer kullanılarak 83 polimorfik bandın değerlendirildiği bu çalışmada farklı bölgelerden elde edilen N. rileyi izolatları diğer Nomuraea türlerinden ayrılarak birkaç farklı grup içerisinde toplanmıştır. Ancak coğrafik bölge ve konukçu dağılımı bakımından izolatlar arasında bir ilişki gözlenmemiştir. Rastık fungusları olarak bilinen 7 Ustilago spp. (U. avenae, U. bullata, U. hordei, U. kolleri, U. nigra, U. nuda ve U. tritici) arasındaki filogenetik akrabalığı ISSR ve AFLP yöntemlerini kullanarak araştıran Menzies et al. (2003) U. bullata ya ait izolatlar dışındaki diğer türlere ait izolatlar arasındaki moleküler farklılığın çok düşük düzeyde olduğunu tespit etmişlerdir. ISSR ve AFLP yöntemleri ile U. bullata, U. nuda ve U. tritici izolatlarının kesin olarak ayırımı sağlandığı halde U. avenae ve U. kolleri izolatları arasında herhangi bir moleküler farklılık tespit edilememiştir. Ayrıca U. hordei ve U. nigra türleri arasında önemli bir genetik varyasyon gözlenmemiştir. Bu sebeple Menzies et al. (2003) U. avenae ve U. kolleri nin monofiletik olduğunu ve U. hordei ve U. nigra gibi tek bir tür olarak sınıflandırılmaları gerektiğini bildirmişlerdir. Mishra et al. (2003) farklı coğrafik bölgelerden elde edilen Fusarium culmorum populasyonlarındaki genetik yapıyı incelemek için ISSR markerlarından faydalanmışlardır. 24
ISSR analizi ile elde edilen 30 polimorfik (% 80) bandın değerlendirilmesi sonucu 75 F. culmorum izolatı 7 farklı grup içerisinde 59 genotipe ayrılmıştır. Ayrıca ISSR analizi ile F. culmorum izolatlarında görülen farklılığın klonal olmayıp rekombinasyon sonucu oluşmuş olabileceğini bildirmişlerdir. Bir başka çalışmada ise Mishra et al. (2004) Kanada nın farklı bölgelerinden elde edilen F. graminearum populasyonlarındaki genetik yapıyı incelemiştir. Sekiz ISSR primerinden elde edilen 158 polimorfik bandın değerlendirildiği bu çalışmada 70 F. graminearum izolatı arasında 4 farklı grubun bulunduğu tespit edilmiştir. Ayrıca bu gruplandırma ile populasyonların coğrafik dağılımı arasında kısmen de olsa bir benzerlik olduğu ve populasyonlar arasındaki varyansın % 2.77, populasyonlar içindeki varyansın ise % 97.23 arasında değiştiği tespit edilmiştir. Coniferler de filiz yanıklığına sebep olan Sirococcus conigenus izolatları arasındaki genetik farklılığı ISSR ve ITS bölgelerinin sekans analizi ile inceleyen Smith et al. (2003) test edilen izolatları % 10 benzerlikle 2 farklı gruba ayırmıştır. Yedi ISSR primeri ile elde edilen 78 fragmentin UPGMA analizi sonucunda çam ve ladin ağaçlarından elde edilen izolatlar bir grupta yer alır iken köknardan izole edilen izolatlar diğer grupta yer almıştır. Lu et al. (2004) 12 farklı ağaç türünde endofitik olarak bulunan farklı Colletotrichum ve Glomerella izolatlarını ISSR ve RAPD analizi ile karşılaştırmışlardır. BBD(AAC) 5 ve BDB(ACA) 5 primerleri kullanılarak yapılan ISSR analizinde 0.15-4.08 kb büyüklüğünde, RAPD analizinde ise 0.1-2 kb büyüklüğünde fragmentler amplifiye edilerek her iki yöntemde de test edilen izolatlar 8 farklı gruba ayrılmıştır. Ancak konukçu spesifikliği ile izolatların dağılımı arasında bir ilişki tespit edilememiştir. Endofitik Guignardia mangiferae izolatları arasındaki fenotipik ve genotipik varyasyonu araştıran Rodrigues et al. (2004), ISSR yöntemiyle elde edilen gruplanma ile konukçu spesifitesi ve coğrafik dağılımı arasında bir ilişki tespit edememişlerdir. Ancak araştırıcılar ISSR yönteminin fungus izolatlarının ayırımı ve populasyon yapısının incelenmesi için oldukça faydalı olduğunu bildirmişlerdir. 25
Fusarium oxysporum f. sp radicis-lycopersici ve f. sp. lycopersici nin vejetatif uyum grupları arasındaki genetik farklılığı ortaya koymak için RAPD ve microsatellit primerlerinden yararlanan Balmas et al. (2005a) her iki yöntem arasındaki korelasyon katsayısını r=0.77 olarak bulmuşlardır. Citrus türlerinde hastalığa sebep olan Phoma tracheiphila nın 36 İtalyan izolatını 12 RAPD (92 marker) ve 7 microsatellit primeri (56 marker) kullanarak inceleyen Balmas et al. (2005b) bu izolatların genetik olarak homojen olduğunu ve test edilen tüm primerlerle aynı amplifikasyon ürününü oluşturduklarını belirtmişlerdir. Ancak bu izolatların diğer Phoma türlerinden ayrımı bu yöntemlerle sağlanabilmiştir. Hindistan ve ABD de yetiştirilen soya fasulyesi ve pamuk bitkilerinde kömür çürüklüğüne sebep olan Macrophomina phaseolina populasyonlarındaki genetik farklılığı incelemek için basit sekans tekrarlarından (microsatellit marker) yararlanan Jana et al. (2005) böyle microsatellitlerin populasyon araştırmalarında ve spesifik markerların tespit edilmesinde oldukça faydalı olduğunu bildirmişlerdir. (ACTG) 4, (GACAC) 4 ve (CAC) 5 primerleri kullanılarak yapılan ISSR analizi ile test edilen izolatlar arasında 250-3500 bp arasında değişen büyüklüklerde polimorfizim görülmüştür. Bu çalışma ile soya fasulyesi izolatları iki gruba ayrılmış pamuktan elde edilen izolatlar ise tek grup içerisinde toplanmıştır. 26
3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1 Hastalıklı Bitki Materyalinin Temini Çalışmalarda materyal olarak 2001-2002 yıllarında Türkiye de nohut ekiminin yoğun olduğu farklı illerden toplanan ve hastalık belirtisi gösteren nohut bitkilerinden elde edilen fungus izolatları kullanılmıştır (Şekil 3.1). Ayrıca farklı araştırıcılar tarafından temin edilen ve patojenisiteleri belirlenen bazı izolatlar referans olarak bu çalışmaya dâhil edilmiştir (Çizelge 3.1). Şekil 3.1 2001 ve 2002 yıllarında hastalıklı nohut bitkilerinin toplanması için survey..yapılan iller Nohutun farklı vejetasyon dönemlerinde Ankara, Eskişehir, Kırşehir, Konya, Kayseri, Burdur, Denizli, Kütahya, Uşak, Antalya, K. Maraş, Adıyaman, Diyarbakır, Amasya ve Tokat olmak üzere 15 ilde surveyler yapılmıştır. Bu surveyler esnasında her ilde en az 10 km aralıkla farklı tarlalardan 5-10 adet bitki örneği alınmıştır. Gezilen tarlalarda sararmış, solgun, ölü görülen bitkiler toplanmış ve izolasyon amacıyla kese kağıtlarına konularak laboratuara getirilmiştir. 27
Çizelge 3.1 Moleküler çalışmalarda kullanılmak amacıyla farklı araştırıcılardan temin edilen.fungus izolatları İzolat ismi Fungus Türü Temin Edilen Kişi ve Kurum Ref-1 F. solani Dr. Steiner Stenzel Bonn Üniversitesi Ref-2 F. moniliforme Dr. Steiner Stenzel Bonn Üniversitesi Ref-3 F. moniliforme Prof. Dr. Gülay Turhan Ege Üniversitesi Ref-4 F. equiseti Dr. Steiner Stenzel Bonn Üniversitesi Ref-5 F. equiseti Prof. Dr. Gülay Turhan Ege Üniversitesi Ref-6 F. sambucinum Dr. Steiner Stenzel Bonn Üniversitesi Ref-7 F. subglutinans Dr. Steiner Stenzel Bonn Üniversitesi KA1 F. oxysporum f. sp. ciceris Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi KC7 F. oxysporum f. sp. ciceris Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi A4 F. oxysporum f. sp. ciceris Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi A6 F. oxysporum f. sp. ciceris Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi HAY5 F. oxysporum f. sp. ciceris Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi KC9 1 F. oxysporum f. sp. ciceris Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi KC6 2 F. oxysporum f. sp. ciceris Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi Ka2 F. oxysporum f. sp. ciceris Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi Ka4 F. solani Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi Ka8 F. solani Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi Hay6 F. solani Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi Ank-35 F. equiseti Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi Ank-37 F. moniliforme Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi Ank-38 F. acuminatum Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi Ank-39 C. tonkinense Prof. Dr. F. Sara Dolar Ankara Üniversitesi 3.2 Fungusların Elde Edilmesi ve Saklanması Nohutlarda hastalığa sebep olan fungal patojenlerin tespiti için farklı illerden toplanan hastalıklı nohut bitkilerinin kök ve kök boğazından 0.2-0.5 cm boyunda bitki parçaları kesilerek izolasyon yapılmıştır. Kesilen bu bitki parçaları yüzeysel dezenfeksiyon amacıyla % 1 lik sodyumhipoklorür de (NaOCl) 2 dakika tutulmuş ve bunu takiben 3 seri steril saf sudan geçirilmiştir. Daha sonra steril filtre kağıtları arasında kurutularak PDA (Potato 28
Dextose Agar, Merck) ortamı içeren petri kaplarına 5 er adet olacak şekilde konulmuştur. Fusarium türlerinin izolasyonu için ise PCNB ortamı kullanılmıştır. Bu petri kapları 23±1 C de 12 saat aydınlık (yakın ultraviole ışık) 12 saat karanlık periyot içeren inkübasyon odasında 7 gün süreyle geliştirilmiştir. Daha sonra gelişen fungusların her biri tek spor izolasyonu yapılarak saflaştırılmıştır. Elde edilen fungus izolatları Microbank tüplere (Pro- Lab, Diagnostics, Canada) alınarak -80 C de, ve kum kültürlere alınarak oda sıcaklığında saklanmıştır. 3.3 Fungusların Teşhisi Teşhisi yapılacak Fusarium spp. izolatları PSA (Patates Sakkaroz Agar: 500 ml Patates ekstraktı, 20 g Sakkaroz, 20 g Agar, 500 ml su) ve SNA (Sentetik Nutrient Agar: 1 g KH 2 PO 4, 1 g KNO 3, 0.5 g MgSO 4.7 H 2 O, 0.5 g KCl, 0.2 g Sakkaroz, 20 g Agar, 1000 ml su) ortamına aşılanmıştır. SNA ortamında 1 cm 2 lik steril filtre kağıtları aşılama yerinin her iki tarafına konularak sporulasyonun teşvik edilmesi sağlanmıştır. İzolatlar 23±1 C de 12 saat aydınlık (yakın ultraviole ışık) 12 saat karanlık periyot içeren inkübasyon odasında 7-15 gün süreyle geliştirilmiştir. Daha sonra Booth (1971), Anonymous (1996) teşhis anahtarlarına göre Fusarium türlerinin teşhisi yapılmıştır. Macrophomina ve Rhizoctonia türlerinin teşhisi ise PDA ortamı kullanılarak Sneh et al. (1991) ve Singleton et al. (1992) e göre yapılmıştır. 3.4 Elde Edilen Kök Patojenlerinin Patojenisite Testleri Patojenisite testleri 144 izolat ile hassas nohut çeşitleri (JG-62, ILC 482) kullanılarak Nene and Haware (1980) nin toprak inokulasyon metodu ile yapılmıştır. İnokulum için 45 g elenmiş kum ve 5 g nohut unu karışımı içeren 200 ml şişeler steril edildikten sonra PDA da geliştirilen 10 günlük fungus kültürlerinden alınan 0.7 cm çapındaki 5 adet disk ile inokule edilmişlerdir. Bu şekilde hazırlanan şişeler 12 saat aydınlık (ışık şiddeti 297 µmolesec -1 m -2 ) periyot ve 25±1 C sıcaklık içeren kontrollü koşullara sahip iklim odasına 29
yerleştirilmiştir. Şişelerde 14 gün süre ile geliştirilen fungus kültürleri, 600 g steril toprak harçı (bahçe toprağı: yıkanmış dere kumu: yanmış çiftlik gübresi, 1: 1: 1, v/v/v) içeren 13 cm çapındaki toprak saksıların her birine 50 g olacak şekilde karıştırılmış ve hafifçe sulandıktan sonra saksılar yukarıda belirtilen koşullara sahip iklim odasına yerleştirilmiştir. İnokulumun toprağı sarması için 5-6 gün beklenmiş ve % 1 lik sodyumhipoklorür (NaOCl) çözeltisinde 3 dakika süre ile tutularak yüzeysel dezenfeksiyon yapılan tohumlar her saksıya 5 adet olacak şekilde ekilmiştir. Kontrol saksılarına ise inokulum içermeyen 50 g nohut unu - kum karışımı ilave edilmiş ve aynı şekilde 5 adet tohum ekilmiştir. Denemeler 3 tekerrürlü olarak yürütülmüştür 3.5 Hastalık Reaksiyonlarının Değerlendirilmesi Hastalık değerlendirmesi inokulasyondan 3 hafta sonra başlanarak 6 hafta süreyle yapılmıştır. Değerlendirmede akropetal sararma ve nekrozun esas alındığı 0-4 skalası kullanılmıştır (Trapera-Casas and Jimenez-Diaz 1985). 0-4 Skalası 0 = % 0 1 = % 1 33 2 = % 34 66 3 = % 67 100 4 = Ölü Bitki Hassas nohut çeşidinde 3.1-4.0 skala değerine neden olan izolatlar yüksek virulant (YV), 1.1-3.0 skala değerine neden olan izolatlar orta derecede virülant (OV) ve 0.0-1.0 değerine neden olan izolatlar ise düşük virülant (DV) veya non patojen olarak değerlendirilmiştir. 30
3.6 DNA İzolasyonu Bu amaçla modifiye edilerek iki farklı DNA izolasyon yöntemi kullanılmıştır. DNA izolasyonu için fungus izolatları 100 ml PDB (Potato Dextrose Broth, Difco) ortamı içeren 250 ml lik erlenmayerlerde inkübatörlü orbital shaker (150 rpm) üzerinde (25±1 C) 7 gün süreyle geliştirilmiştir. PDB ortamında geliştirilen funguslar miracloth bezi kullanılarak süzülmüş ve sıvı nitrojen içeren porselen havanlarda iyice ezilerek 1.5 ml lik eppendorf tüplere aktarılmıştır. Sonra her tüpe 500 µl ekstraksiyon bufferı (200 mm Tris-HCl ph:8.5, 25 mm NaCl, 25 mm EDTA, % 0.5 SDS) konularak süspanse oluncaya kadar karıştırılmıştır. Daha sonra elde edilen ekstrakt nükleik asitleri parçalamak amacıyla 65 C de 1 saat inkübasyona bırakılmıştır. Bu inkübasyon periyodundan sonra eppendorf tüplere eşit hacimde fenol:kloroform (25:24 v/v, AppliChem Darmstadt, Germany) eklenerek 13.000 g de 1 saat santrifügasyona (Sigma 3K30) bırakılmıştır. Üstte toplanan sıvının 400 µl si yeni eppendorf tüplere aktarılarak üzerine 25 µl RNase A (10 mg/ml, AppliChem Darmstadt, Germany) ilave edilmiştir. 37 C de yarım saat inkübasyondan sonra 250 µl kloroform:isoamilalkol (24:1 v/v, AppliChem Darmstadt, Germany) eklenerek 15 dakika santrifüj edilmiştir. Üstte toplanan sıvı yeniden temiz eppendorf tüplere alınarak üzerine eşit hacim isopropanol eklenmiştir. Bir saat veya tüm gece -20 C de inkübasyondan sonra 5 dakika santrifüj uygulanarak tüpün dip kısmında toplanan DNA pelleti 100 µl % 70 lik ethanol ile yıkanarak ortam koşullarında kurutulmuştur (Reader and Broda 1985). Diğer DNA izolasyon yönteminde ise % 2 lik CTAB ekstraksiyon bufferı (CTAB: 2 g, 200 mm Tris-HCl ph:8.0, 0.7 M NaCl, 25 mm EDTA) kullanılmıştır. Yukarıdaki yöntemde belirtildiği gibi hazırlanan eppendorf tüplerine 500 µl ekstraksiyon bufferı konularak iyice süspanse oluncaya kadar karıştırılmış ve 30 dakika aynı sıcaklıkta inkübasyona bırakılmıştır. Santrifügasyon işlemlerinin 10000 g de 15 dakika yapılması dışında tüm işlemler yukarıdaki gibi gerçekleştirilmiştir (Anonymous 2003). Daha sonra elde edilen DNA pelleti 25-50 µl steril bi-destile (d 2 H 2 O) su ile süspanse edilerek -20 C de saklanmıştır. 31
Konsantrasyon tayininde elde edilen genomik DNA (2 µl DNA örneği, 2 µl yükleme bufferı, 6 µl d 2 H 2 O) % 0.8 lik agaroz jelde 100 V da 1 saat elektroforez yapılarak farklı konsantrasyonlarda seyreltilen λ DNA (MBI Fermentas GmbH, Germany) ile karşılaştırılmıştır. Daha sonra örnek DNA ları steril bi-d 2 H 2 O ile 25-50 ng / µl olacak şekilde seyreltilmiştir. 3.7 Fungus İzolatlarının Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Yöntemi ile Analizi Nohutlarda hastalığa sebep olan kök patojenleri arasındaki farklılığı araştırmak için yapılan RAPD analizinde OPK ve OPA primer (Operon Technologies, Alameda, CA, USA) setlerinden 30 farklı oligonükleotit primer kullanılmıştır (Çizelge 3.2). PCR amplifikasyonları için farklı dntps, Taq DNA polimeraz ve MgCl 2 konsantrasyonları denenerek uygun yoğunluklar belirlenmiştir. Bu çalışmada izolatların RAPD analizi modifiye edilerek Williams et al. (1990) yöntemine göre yapılmıştır. PCR reaksiyonları; 0.125 mm dntps, 0.32 µm primer, 1.5 mm MgCl 2, 10 mm Tris-HCl ph 8.8, 50 mm KCl, 0.8 % Nonident P40, 0.6 U Taq DNA polimeraz (MBI Fermentas GmbH, Germany) içeren 25 µl lik hacimlerde gerçekleştirilmiştir. DNA amplifikasyonu ise 94 C de 20 saniye, 36 C de 1 dakika, 72 C de 1 dakika 40 döngü ve en son döngüden sonra 72 C de 8 dakika olacak şekilde programlanan thermocyclerda (Techne Progene) gerçekleştirilmiştir. 32
Çizelge 3.2 RAPD analizinde kullanılan primerler Primer Kodu Primer sekansı 5 3 Primer Kodu Primer sekansı 5 3 OPA-1 CAGGCCCTTC OPK-2 GTCTCCGCAA OPA-2 TGCCGAGCTG OPK-3 CCAGCTTAGG OPA-3 AGTCAGCCAC OPK-4 CCGCCCAAAC OPA-4 AATCGGGCTG OPK-5 TCTGTCGAGG OPA-5 AGGGGTCTTG OPK-7 AGCGAGCAAG OPA-6 GGTCCCTGAC OPK-8 GAACACTGGG OPA-7 GAAACGGGTG OPK-9 CCCTACCGAC OPA-8 GTGACGTAGG OPK-10 GTGCAACGTG OPA-9 GGGTAACGCC OPK-11 AATGCCCCAG OPA-12 TCGGCGATAG OPK-12 TGGCCCTCAC OPA-16 AGCCAGCGAA OPK-14 CCCGCTACAC OPA-17 GACCGCTTGT OPK-15 CTCCTGCCAA OPA-18 AGGTGACCGT OPK-16 GAGCGTCGAA OPA-19 CAAACGTCGG OPK-17 CCCAGCTGTG OPK-19 CACAGGCGGA OPK-20 GTGTCGCGAG 3.8 Fungus İzolatlarının Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) Polymorphism.Yöntemi ile Analizi ISSR analizi ise modifiye edilerek Rathaparkhe et al. (1998) yöntemine göre gerçekleştirilmiştir. Amplifikasyon için farklı uzunluklarda (15-23 bp) tekrarlanan sekans dizilişlerine sahip olan ve 5 veya 3 çapalı primerler kullanılmıştır. Ayrıca her primer için uygun annealing sıcaklıkları tespit edilmiştir (Çizelge 3.3). PCR amplifikasyonları ise 0.2 mm dntps, 0.24 µm primer, 2.5 mm MgCl 2, 10 mm Tris- HCl ph 8.8, 50 mm KCl, 0.8 % Nonident P40, 1 U Taq DNA polimeraz (MBI Fermentas GmbH, Germany) içeren 25 µl lik hacimlerde 94 C de 30 saniye, primerlerin G+C 33
içeriğine bağlı olarak belirlenen annealing sıcaklığında (Ta) 30 saniye, 72 C de 2 dakika 35 döngü ve sonra 72 C de 10 dakika olacak şekilde gerçekleştirilmiştir. Çizelge 3.3 ISSR analizinde kullanılan primerler ve annealing (Ta) sıcaklıkları ISSR primerleri Primerlerin baz dizileri (Ta) % G+C (AG) 8 G 5 -AGA GAG AGA GAG AGA GG-3 52 C 52.9 (GA) 8 T 5 -GAG AGA GAG AGA GAG AT-3 50 C 47.1 (GA) 8 C 5 -GAG AGA GAG AGA GAG AC-3 50 C 52.9 (AC) 8 T 5 -ACA CAC ACA CAC ACA CT-3 50 C 47.1 (AG) 8 YT 5 -AGA GAG AGA GAG AGA GYT-3 52 C 47.2 (AG) 8 YC 5 -AGA GAG AGA GAG AGA GYC-3 55 C 52.8 (GA) 8 YT 5 -GAG AGA GAG AGA GAG AYT-3 53 C 47.2 (GA) 8 YC 5 -GAG AGA GAG AGA GAG AYC-3 54 C 52.8 (CA) 8 RT 5 -CAC ACA CAC ACA CAC ART-3 52 C 47.2 (AC) 8 YT 5 -ACA CAC ACA CAC ACA CYT-3 52 C 47.2 (AC) 8 YA 5 -ACA CAC ACA CAC ACA CYA-3 53 C 47.2 (ATG) 6 5 -ATG ATG ATG ATG ATG ATG-3 50 C 33.3 BHB(GA) 7 5 -BHB GAG AGA GAG AGA GA-3 53 C 51 (GC) 9 YR 5 -GCG CGC GCG CGC GCG CGC YR-3 55 C 95 (AC) 9 RY 5 -ACA CAC ACA CAC ACA CAC RY-3 54 C 50 (GA) 9 RY 5 -GAG AGA GAG AGA GAG AGA RY-3 54 C 50 (AT) 9 YR 5 -ATA TAT ATA TAT ATA TAT YR-3 36 C 5 (TG) 8 RT 5 -TGT GTG TGT GTG TGT GRT-3 53 C 47.2 (AG) 8 T 5 -AGA GAG AGA GAG AGA GT-3 50 C 47.1 (CT) 8 RG 5 -CTC TCT CTC TCT CTC TRG-3 54 C 52.8 Y=Primidin, R=Purin, B=C, G veya T H=A, C, veya T 3.9 Agaroz Jel Elektroforezi PCR ürünlerinin görsel hale getirilmesi amacıyla, amplifiye edilen DNA ürünleri % 1.4 lük agaroz jelde elektroforetik olarak ayrılmıştır. Agaroz jelin hazırlanmasında ve elektroforez tankında tampon çözeltisi olarak 1XTAE (40 mm Tris-acetate, 1mM EDTA) 34
tampon çözeltisi kullanılmıştır (Sambrook et al. 1989). Ayrıca tüm çalışmalarda elde edilen bantların molekül ağırlıklarının belirlenmesinde marker olarak GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus (MBI Fermentas GmbH, Germany) kullanılmıştır. Elektroforez işlemi 100 V da 2 saat süreyle gerçekleştirilmiştir. İşlem bittikten sonra agaroz jel ethidium bromide (1 mg/ml) ile boyanarak UV ışık altında incelenmiş ve bio-imaj bilgisayar sistemi (Syngene, Cambridge UK) kullanılarak kaydedilmiştir. 3.10 Verilerin Analizi ve Değerlendirilmesi Tüm PCR analizleri farklı zamanlarda en az iki kez tekrarlamış ve tekrarlanabilen bantlar değerlendirmeye alınmıştır. Daha sonra tüm izolatlar için primerler tarafından oluşturulan bantlar bir araya getirilmiş ve NTSYS ver. 2.02 (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis) software programına aktarılmıştır (Rohlf 1998). Her primer tarafından oluşturulan belirli moleküler ağırlığa sahip bantlar 0 (yok) ve 1 (var) olarak kodlanmış ve rectangular matriks verisi kullanılarak değerlendirilmiştir. Daha sonra SIMQUAL (Similarity for qualitative data) programı kullanılarak Dice ın metoduna (Sij=2a/(2a+b+c)) göre izolatlar arasındaki benzerlik matriksi oluşturulmuştur. Elde edilen benzerlik katsayısı ve UPGMA (Unweighed Pairgroup Method with Arithmetic Average) yardımıyla dendogram oluşturularak izolatlar arasındaki genetik akrabalık değerlendirilmiştir (Sneath and Sokal 1973). Yapılan cluster analizinin geçerliliği, benzerlik ve kofenetik matriks değerleri karşılaştırılarak test edilmiştir. İki matriks arasındaki ilişkinin derecesi Mantel testi kullanılarak belirlenmiştir. Ayrıca RAPD ve ISSR verilerileri kullanılarak oluşturulan dendogramlar arasındaki farklılığı değerlendirmek için her dendogramdan hesaplanan kofenetik matriks değerleri Mantel testi kullanılarak analiz edilmiştir. 35
4. ARAŞTIRMA BULGULARI 4.1 Türkiye deki Nohut Kök Hastalıklarının Durumu ve Patojenisite Testleri Nohutlarda kök çürüklüğü ve solgunluğa sebep olan funguslar arasındaki genetik farklılığı ve coğrafi dağılımı tespit etmek amacıyla yapılan bu çalışmada Türkiye deki toplam nohut ekim alanının yaklaşık % 70 ni temsil eden 15 farklı ilde survey yapılmıştır. Bu survey sonucunda 144 adet nohut kök patojeni izole edilmiştir. Klasik yöntemler kullanılarak yapılan teşhisler sonuncunda bu hastalık etmenlerinin Fusarium oxysporum, F. solani, F. equiseti, F. semitectum, F. acuminatum, Macrophomina phaseolina, ve Rhizoctonia solani olduğu tespit edilmiştir. Hastalık etmenlerinin survey yapılan illere göre dağılımı Çizelge 4.1 de verilmiştir. Bu çalışma sonucunda nohutlarda kök çürüklüğü ve solgunluğa sebep olan en yaygın fungusun % 72 oranında Fusarium oxysporum olduğu ve bunu F. solani ve Macrophomina phaseolina nın takip ettiği görülmüştür. Türkiye deki önemli nohut ekim alanlarından elde edilen ve klasik yöntemlerle teşhisi yapılan 144 izolatın patojenisite testi Nene and Haware (1980) nin toprak inokulasyon metodu esas alınarak hassas nohut çeşitleriyle yapılmıştır. Patojenisite testleri sonucunda hassas nohut çeşidinin 3.1-4.0 skala değeri almasına neden olan 26 izolat virülantı yüksek (YV), 1.1-3.0 skala değerine neden olan 104 izolat orta derecede virülant (OV) ve 0.0 1.0 değerine neden olan 14 izolat düşük virülant (DV) veya non patojen olarak değerlendirilmiştir. 36
Çizelge 4.1 Nohut surveyi yapılan iller, bu illerden elde edilen kök çürüklüğü ve solgunluk etmenleri ve bu etmenlerden elde edilen izolat sayıları Survey yapılan iller Tespit edilen kök patojenleri F. oxysporum F. solani F. equiseti F. semitectum F. acuminatum M. phaseolina R. solani İllere Göre Toplam Adıyaman 1 1 Amasya 2 2 Ankara 22 4 2 1 1 2 32 Antalya 1 1 Burdur 7 2 2 11 Denizli 14 3 1 2 2 22 Diyarbakır 13 3 1 17 Eskişehir 7 1 8 K. Maraş 17 3 1 21 Kayseri 1 1 Kırşehir 2 1 3 Konya 2 2 Kütahya 4 4 Tokat 3 2 5 Uşak 6 3 1 10 Diğer 4 4 Toplam izolat Sayısı 104 22 4 5 1 6 2 144 Bu izolatların illere göre dağılımı ve virulenslik dereceleri Çizelge 4.2 de verilmektedir. 37
Çizelge 4.2 Nohutlarda hastalığa sebep olan fungus izolatlarının toplandığı iller ve virulenslik dereceleri İzolat ismi a Alındığı il Tür Virulenslik derecesi b Adı-1 Adıyaman-Atatürk barajı F. oxysporum YV Ama-1 Amasya F. oxysporum OV Ama-2 Amasya F. oxysporum OV Ank-1 Ankara-Ayaş F. oxysporum OV Ank-3 Ankara-Akyurt F. oxysporum DV Ank-4 Ankara-Akyurt F. oxysporum YV Ank-5 Ankara-Akyurt F. oxysporum OV Ank-6 Ankara-Bala F. oxysporum DV Ank-7 Ankara-Bölüm F. oxysporum OV Ank-8 Ankara-Çubuk F. oxysporum OV Ank-9 Ankara-Çubuk F. oxysporum YV Ank-10 Ankara-Güdül F. oxysporum OV Ank-11 Ankara-Güdül F. oxysporum OV Ank-12 Ankara-Güdül F. oxysporum OV Ank-13 Ankara-Haymana F. oxysporum YV Ank-14 Ankara-Haymana F. oxysporum DV Ank-15 Ankara-Haymana F. oxysporum OV Ank-16 Ankara-Haymana F. oxysporum OV Ank-17 Ankara-Polatlı F. oxysporum OV Ank-18 Ankara-Sünlü çıkışı F. oxysporum OV Ank-19 Ankara-Şereflikoçhisar F. oxysporum OV Ank-20 Ankara-Şereflikoçhisar F. oxysporum OV Ank-21 Ankara-Şereflikoçhisar F. oxysporum OV Ank-22 Ankara F. oxysporum DV Ank-32 Ankara F. oxysporum OV Ank-25 Ankara-Bala F. solani OV Ank-26 Ankara-Bala F. solani OV Ank-27 Ankara-Haymana F. solani OV Ank-28 Ankara-Bölüm F. solani OV Ank-29 Ankara-Haymana F. semitectum OV Ank-30 Ankara-Haymana F. equiseti OV Ank-31 Ankara-Sünlü çıkışı F. equiseti YV Ank-33 Ankara-Güdül R. solani YV Ank-34 Ankara-Çubuk R. solani OV Ank-36 Ankara-Bölüm M. phaseolina OV Ant-1 Antalya F. solani YV 38
Çizelge 4.2 Nohutlarda hastalığa sebep olan fungus izolatlarının toplandığı iller ve virulenslik dereceleri (Devam) Bur-1 Burdur F. oxysporum OV Bur-2 Burdur F. oxysporum OV Bur-3 Burdur F. oxysporum OV Bur-4 Burdur F. oxysporum OV Bur-5 Burdur F. oxysporum OV Bur-6 Burdur F. oxysporum OV Bur-7 Burdur F. oxysporum OV Bur-8 Burdur-Tefenni F. solani OV Bur-9 Burdur-Tefenni F. solani DV Bur-10 Burdur-Bucak F. semitectum YV Bur-11 Burdur F. semitectum YV Dez-1 Denizli-Baklan F. oxysporum YV Dez-2 Denizli-Çameli F. oxysporum OV Dez-3 Denizli-Çameli F. oxysporum OV Dez-4 Denizli-Çameli F. oxysporum OV Dez-5 Denizli-Kale F. oxysporum OV Dez-6 Denizli-Kale F. oxysporum OV Dez-7 Denizli-Kale F. oxysporum OV Dez-8 Denizli-Kale F. oxysporum OV Dez-9 Denizli-Kale F. oxysporum OV Dez-10 Denizli-Tavas F. oxysporum OV Dez-11 Denizli-Tavas F. oxysporum OV Dez-12 Denizli-Tavas F. oxysporum OV Dez-13 Denizli F. oxysporum OV Dez-14 Denizli F. oxysporum YV Dez-16 Denizli-Çameli F. solani OV Dez-18 Denizli-Serinhisar F. solani OV Dez-19 Denizli-Serinhisar F. solani OV Dez-20 Denizli-Kale F. equiseti OV Dez-21 Denizli-Çameli F. semitectum OV Dez-22 Denizli-Tavas F. semitectum OV Dez-23 Denizli-Tavas M. phaseolina OV Dez-24 Denizli M. phaseolina YV Diyar-1 Diyarbakır-Çınar F. oxysporum DV Diyar-2 Diyarbakır-Çınar F. oxysporum OV Diyar-3 Diyarbakır-Çınar F. oxysporum DV Diyar-4 Diyarbakır-Çınar F. oxysporum OV Diyar-5 Diyarbakır-Çınar F. oxysporum OV Diyar-6 Diyarbakır-Çınar F. oxysporum OV Diyar-8 Diyarbakır-Ergani F. oxysporum OV Diyar-9 Diyarbakır-Hazro F. oxysporum YV Diyar-10 Diyarbakır-Silvan F. oxysporum OV 39
Çizelge 4.2 Nohutlarda hastalığa sebep olan fungus izolatlarının toplandığı iller ve virulenslik dereceleri (Devam) Diyar-12 Diyarbakır-Siverek F. oxysporum OV Diyar-13 Diyarbakır-Siverek F. oxysporum DV Diyar-15 Diyarbakır-Siverek F. oxysporum OV Diyar-16 Diyarbakır F. oxysporum OV Diyar-19 Diyarbakır-Çınar F. solani OV Diyar-20 Diyarbakır-Silvan F. solani OV Diyar-21 Diyarbakır-Silvan F. solani OV Diyar-22 Diyarbakır-Silvan M. phaseolina YV Esk-2 Eskişehir-Mihalıççık F. oxysporum OV Esk-3 Eskişehir-Mihalıcçık F. oxysporum YV Esk-4 Eskişehir-Mihalıcçık F. oxysporum OV Esk-5 Eskişehir-Merkez F. oxysporum DV Esk-6 Eskişehir-Seyitgazi F. oxysporum OV Esk-7 Eskişehir-Seyitgazi F. oxysporum OV Esk-8 Eskişehir-Seyitgazi F. oxysporum YV Esk-12 Eskişehir-Sivrihisar F. equiseti DV Km-1 K.Maraş-Afşin F. oxysporum DV Km-2 K.Maraş-Afşin F. oxysporum OV Km-3 K.Maraş-Afşin F. oxysporum OV Km-4 K.Maraş-Afşin F. oxysporum OV Km-6 K.Maraş-Afşin F. oxysporum OV Km-7 K.Maraş-Afşin F. oxysporum OV Km-8 K.Maraş-Afşin F. oxysporum OV Km-9 K.Maraş-Afşin F. oxysporum OV Km-10 K.Maraş-Çardak F. oxysporum YV Km-11 K.Maraş-Çardak F. oxysporum DV Km-13 K.Maraş-Pazarcık F. oxysporum OV Km-14 K.Maraş-Pazarcık F. oxysporum OV Km-15 K.Maraş-Pazarcık F. oxysporum OV Km-16 K.Maraş-Pazarcık F. oxysporum YV Km-17 K.Maraş-Pazarcık F. oxysporum OV Km-18 K.Maraş-Pazarcık F. oxysporum OV Km-19 K.Maraş-Pazarcık F. oxysporum YV Km-21 K.Maraş-Afşin F. solani OV Km-23 K.Maraş-Afşin F. solani OV Km-25 K.Maraş-Pazarcık F. solani OV Km-28 K.Maraş-Pazarcık M. phaseolina OV Kay-1 Kayseri M. phaseolina YV 40
Çizelge 4.2 Nohutlarda hastalığa sebep olan fungus izolatlarının toplandığı iller ve virulenslik dereceleri (Devam) Kır-1 Kırşehir F. oxysporum DV Kır-2 Kırşehir F. oxysporum OV Kır-3 Kırşehir F. solani YV Kon-1 Konya F. oxysporum OV Kon-3 Konya F. oxysporum YV Küt-1 Kütahya-Gediz F. oxysporum OV Küt-2 Kütahya-Gediz F. oxysporum OV Küt-3 Kütahya-Gediz F. oxysporum OV Küt 4 Kütahya-Gediz F. oxysporum OV Tok-1 Tokat F. oxysporum OV Tok-2 Tokat F. oxysporum OV Tok-3 Tokat F. oxysporum OV Tok-4 Tokat F. solani OV Tok-5 Tokat F. solani OV Uşk-1 Uşak-Karahallı F. oxysporum YV Uşk-2 Uşak-Sivaslı F. oxysporum OV Uşk-3 Uşak-Merkez F. oxysporum YV Uşk-4 Uşak-Banaz F. oxysporum YV Uşk-5 Uşak-Banaz F. oxysporum OV Uşk-6 Uşak-Sivaslı F. oxysporum OV Uşk-7 Uşak-Merkez F. solani OV Uşk-8 Uşak-Sivaslı F. solani OV Uşk-9 Uşak-Merkez F. solani OV Uşk-11 Uşak-Karahallı F. acuminatum OV Ç.I.beyaz Diğer F. oxysporum OV Ç 12 Diğer F. oxysporum DV Ova1 Diğer F. oxysporum YV Gergen 1 Diğer F. oxysporum OV İzolatlar toplandıkları illerin isimleri kısaltılarak kodlanmıştır; Adıyaman (Adı), Amasya (Ama), Ankara (Ank), Antalya (Ant), Burdur (Bur), Denizli (Dez), Diyarbakır (Diyar), Eskişehir (Esk), Kahraman Maraş (Km), Kayseri (Kay), Kırşehir (Kır), Konya (Kon), Kütahya (Küt), Tokat (Tok), Uşak (Uşk). b YV: Yüksek virülant, OV: Orta derecede virülant, DV: Düşük virülant Patojenisite testleri sonucunda izolatların sararma, solgunluk, kök çürüklüğü ve tohum çimlenmesinin engellenmesine neden oldukları görülmüştür (Şekil 4.1). 41
Şekil 4.1 Kök patojenlerinin nohut bitkilerinde sebep olduğu simptomlar (a:sararma,..b:.solgunluk, c: kök çürüklüğü, d: tohum çimlenmesinin engellenmesi) 42
4.2 Nohut Kök Patojenleri Arasındaki Genetik Farklılığın Moleküler Yöntemlerle.Tespiti 4.2.1 Ön denemeler Teşhis edilen fungus izolatlarının moleküler karakterizasyonu için farklı PCR koşullarında ön denemeler yapılmıştır. Bu amaçla farklı dntps, Taq DNA polimeraz ve MgCl 2 konsantrasyonlarında ön denemeler yapılmış ve en uygun olan miktarlar belirlenmiştir (Şekil 4.2). Ayrıca ISSR analizinde kullanılan primerler için annealing sıcaklıkları ayrı ayrı tespit edilmiştir (Şekil 4.2). Bu amaçla öncelikli olarak Wallace ((G+C)x4+(A+T)x2=Tm) formülü kullanılarak Tm (temperature melting) sıcaklıkları belirlenmiştir (Innis and Gelfand 1990). Ancak bu formülle hesaplanan Tm sıcaklılığının her primer için uygun olmadığı görülmüş ve bu sebeple her primer için farklı Ta (temperature annealing) sıcaklıkları denenerek uygun Ta sıcaklıkları tespit edilmiştir (Çizelge 3.3). Fungus izolatlarının ayırımında kullanılacak primerleri seçmek için ise her fungus türünü temsil eden belirli sayıda izolat alınarak tüm primerlerle test edilmiştir. Bu primerlerden PCR amplifikasyonlarında değerlendirilebilir bantlar veren primerler seçilerek diğer örneklerin test edilmesinde kullanılmıştır. Buna karşın amplifikasyon ürünü oluşturmayan veya zayıf amplifikasyon ürünü oluşturan primerler ise kullanılmamıştır. 43
a b c Şekil 4.2 Farklı dntps (a: mm), MgCl 2 (b: mm) ve annealing sıcaklıklarının (c: C).Fusarium oxysporum izolatlarının PCR amplifikasyonuna etkisi 44
4.2.2 Moleküler yöntemlerle Fusarium oxysporum izolatları arasındaki genetik..farklılığın tespit edilmesi 4.2.2.1 F. oxysporum izolatları arasındaki genetik farklılığın RAPD ile analizi Nohutlarda solgunluk ve sararma simptomlarına sebep olan Fusarium oxysporum izolatları arasındaki genetik farklılığı ortaya koymak için elde edilen 104 izolattan coğrafik bölge ve patojenisiteleri dikkate alınarak seçilen 67 izolat ve referans olarak kullanılan 7 izolat olmak üzere toplam 74 Fusarium oxysporum izolatı moleküler karakterizasyon için kullanılmıştır. Bu amaçla yapılan RAPD analizlerinde Operon firmasına ait OPK ve OPA kitlerine ait 30 primer kullanılmıştır (Çizelge 3.2). Bu primerlerden OPA-6 primeri bu izolatlar ile herhangi bir polimorfizim oluşturmamıştır. OPA-16, OPA-17, OPK-2, OPK-3 ve OPK-15 primerleri ise değerlendirilebilir bantlar oluşturmadıkları için kullanılmamıştır. Diğer 24 primer ise F. oxysporum izolatları arasında 0.2 (OPK-7) 3.2 kb (OPK-10, OPK-19) arasında değişen büyüklüklerde bantlar oluşturmuştur. RAPD analizi sonucunda F. oxysporum izolatlarından toplam 205 adet (8.54 fragment / primer) fragment amplifiye edilmiştir. Bunlardan 200 tanesinin (8.3 polimorfik marker / primer) F. oxysporum izolatları arasında polimorfik, 5 fragmentin ise monomorfik olduğu tespit edilmiştir. Elde edilen DNA fragmentlerindeki polimorfizim seviyesi ise % 97.5 olarak bulunmuştur (polimorfik band sayısı / toplam band sayısı x 100). Kullanılan primerler ile amplifiye edilen fragment sayısı ise 4 (OPK-4, OPK-9, OPK-10) 13 (OPA-3, OPK-7, OPK-8, OPK-12) arasında değişmiştir. F. oxysporum izolatları arasındaki intraspesifik farklılıkları araştırmak için OPK-12, OPA-9 ve OPA-4 primerlerinin oldukça faydalı olduğu görülmüştür (Şekil 4.3). Bu primerler sırasıyla izolatlar arasında polimorfik olan 13, 10 ve 8 fragmentin amplifiye olmasını sağlamıştır. 45
Şekil 4.3 Fusarium oxysporum izolatlarının a, OPK-12 b, OPA-9 ve c, OPA-4. primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen RAPD profilleri 46
UPGMA algoritması kullanılarak oluşturulan dendogramda ise farklı genotiplerde yer alan tüm olası çiftler arasındaki benzerlik katsayısının 0.2 0.98 arasında değiştiği görülmüştür. En yüksek benzerlik oranı Diyar-3 ile Diyar-4 (0.986), Ank-10 ile Ank-11 (0.985) ve Kon-1 ile Diyar-13 (0.987) izolatları arasında en düşük benzerlik ise Esk-7 ile Dez-8 (0.216) ve Küt-4 ile Km-19 (0.218) izolatları arasında tespit edilmiştir. Dendogramdan hesaplanan kofenetik matriks değeri ile benzerlik indeksinin karşılaştırılması sonucunda elde edilen matriks korelasyonu ise oldukça yüksek olup r= 0.961 olarak bulunmuştur. Oluşturulan bu dendogram ile F. oxysporum izolatları 3 ana gruba ayrılmış ve gerek gruplar arasında gerekse grup içerisinde yüksek bir polimorfizimin olduğu görülmüştür (Şekil 4.4). Grup 1 Amasya ili hariç diğer bölgelerden elde edilen toplam 41 izolattan (% 55.4) oluşmakta olup bu grup içerisindeki benzerlik indeksinin 0.403 (Km-7 ile Diyar-15) - 0.987 (Kon-1 ile Diyar-13) arasında değiştiği görülmüştür. Diyar-6, Diyar-15 ve Küt-4 izolatları ise bu gruba yüksek oranda benzerlik göstermekle beraber bu grup içerisinde ikinci bir alt grubu oluşturmuştur. OPA-4 primeri ile bu grubun tüm üyelerinden yaklaşık 1074 bp büyüklüğünde bir fragment amplifiye edilerek diğer gruplardan ayrılması sağlanmıştır. Grup 2 Ankara, Amasya, Kütahya, Denizli, K. Maraş ve Diyarbakır illerini temsil eden izolatlardan oluşmaktadır ve bunlar kendi arasında 4 alt gruba ayrılmıştır. Birinci alt grup 15 izolattan oluşmakta olup bu alt grup içerisindeki benzerlik indeksinin 0.65 (A6 ile Ank- 5) - 0.986 (Diyar-3 ile Diyar-4) arasında değiştiği görülmüştür. Küt-2, Diyar-8 ve Ama-1 izolatları ise bu grup içerisinde kendi başlarına birer alt grubu oluşturmuşlardır. Bu grupta OPA-9 primeri 700 bp büyüklüğünde bir polimorfik markerı amplifiye etmiştir. Grup 3 Ankara, Eskişehir, Tokat, Uşak, Burdur, Denizli, K. Maraş illerinden elde edilen 15 izolattan oluşmakta olup kendi içerisinde 4 alt gruba ayrılmıştır. Bu izolatlardan 10 tanesi birinci grubu oluşturmuş, Kc9 izolatı ise tek başına ikinci grubu oluşturmuştur. Esk-4, Dez-8 ve Km-19 izolatları ise ortalama 0.79 benzerlik indeksi ile üçüncü alt grubu oluşturmuşlardır. Ank-13 izolatı ise tek başına dördüncü alt grubu oluşturmuştur. 47
Tok-1 Km-6 Dez-5 Esk-8 Diyar-16 Dez-1 Dez-13 Km-9 Küt-1 Dez-6 Esk-6 Ank-9 Kon-1 Diyar-13 Ank-7 Dez-3 Ank-21 a4 Adı-1 Esk-3 Km-2 Uşk-5 Ank-6 Kır-1 Km-4 Ank-16 hay5 Esk-5 kc7 Ank-3 Bur-5 Dez-11 Ank-17 Esk-7 Km-7 Dez-4 Bur-3 Ank-20 Diyar-6 Diyar-15 Küt-4 Ank-12 Ank-11 Ank-10 Dez-12 Km-14 ka1 Diyar-3 Diyar-4 Ank-4 Km-1 Km-13 Ank-5 kc6 a6 Diyar-9 Küt-2 Diyar-8 Ama-1 Uşk-6 ova-1 gergen Bur-6 Uşk-3 Tok-2 Bur-2 Esk-2 Km-16 Dez-14 kc9 Esk-4 Dez-8 Km-19 Ank-13 Grup 1 Grup 2 Grup 3 0.35 0.51 0.67 0.83 0.99 Coefficient Şekil 4.4 Fusarium oxysporum izolatlarından elde edilen RAPD verisinin UPGMA analizi ile oluşturulan dendogram 48
F. oxysporum içerisinde tespit edilen gruplar içerisinde en fazla benzerlik gösteren grup 3 de ise OPA-9 primeri 1390 bp, OPA-4 primeri ise yaklaşık 1617 bp büyüklüğünde polimorfik markerlar sağlamıştır. RAPD analizi ile F. oxysporum izolatları üç gruba ayrılmasına rağmen izolatların bölgelere göre dağılımı ve virulenslik dereceleri ile dendogramdaki gruplanmaları arasında bir ilişki tespit edilememiştir. 4.2.2.2 F. oxysporum izolatları arasındaki genetik farklılığın ISSR ile analizi ISSR analizinde 5 veya 3 modifiye edilmiş, 2 veya 3 lü microsatellit tekrarları taşıyan 20 primer kullanılmıştır (Çizelge 3.3). Bu primerlerden (GC) 9 YR, (AT) 9 YR, (CT) 8 RG ve (CA) 8 RT primerleri ile herhangi bir polimorfizim elde edilememiş, (GA) 8 YT primeri ise temiz bantlar oluşturmadığı için değerlendirme dışı tutulmuştur. Yapılan ISSR analizi sonucunda 0.26 ((TG) 8 RT) - 5 ((AG) 8 YC) kb arasında değişen moleküler büyüklükte toplam 187 fragment amplifiye edilmiş ve bunlardan % 90.37 sinin polimorfik olduğu bulunmuştur. Onsekiz fragmentin ise F. oxysporum izolatları arasında monomorfik olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca primer başına düşen band sayısı 12.46, polimorfik band sayısı ise 11.26 olarak bulunmuştur. ISSR analizinde (GA) 8 T, (AC) 9 RY ve (AG) 8 T primerleri oldukça faydalı intraspesifik polimorfizim sağlamış ve bu izolatlardan sırasıyla 15 (0.3-3.1 bp), 15 (0.39-4.8 bp), 16 (0.3-3.4 bp) fragment amplifiye edilmiştir (Şekil 4.5). Elde edilen bu verilerin analizi sonucunda Dice ın benzerlik indeksinin 0.29 (Ova-1 ile Ank-5) - 1 (Ova-1, Gergen, ve Uşk-3) arasında değiştiği görülmüştür. Ayrıca Mantel testi ile hesaplanan orijinal benzerlik matriksi ve kofenetik benzerlik matriksi arasındaki korelasyon katsayısı ise r=0.985 olarak bulunmuş olup oldukça önemli olarak kabul edilmiştir. ISSR verisinden SAHN (Sequential agglomerative hierarchical nested cluster analysis) analizi ile oluşturulan dendogram ile F. oxysporum izolatları yaklaşık % 75 benzerlik oranı ile yine üç farklı gruba ayrılmıştır. 49
Şekil 4.5 Fusarium oxysporum izolatlarının a, (GA) 8 T b, (AC) 9 RY ve c, (AG) 8 T.primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen ISSR profilleri 50
ISSR analizi sonucunda gruplar içerisinde izolatların yerleşiminde farklılıklar görülmekle birlikte F. oxysporum izolatları RAPD analizindekine benzer bir dağılım göstermişlerdir. Bununla birlikte RAPD analizi ile kıyaslandığında gerek gruplar arasındaki gerekse gruplar içerisindeki benzerlik oranının daha yüksek olduğu tespit edilmiştir (Şekil 4.6). Grup 1 yine farklı bölgelerden 41 F. oxysporum izolatından oluşmuştur. Diyar 6, Diyar-15 ve Küt-4 izolatları RAPD analizindeki gibi bu grup içerisinde yer almakla beraber ortalama 0.911 benzerlik indeksi ile dendogramın farklı bir dalını oluşturmuşlardır. Grup içerisindeki benzerlik oranının ise 0.627 (Diyar-6 ile Bur-5) 0.992 (Dez-1 ile Dez-13) arasında değiştiği görülmüştür. Bu grupta (AC) 9 RY primeri 836 bp büyüklüğündeki fragmenti amplifiye ederek diğer gruplardaki izolatlardan ayrılmalarını sağlamıştır. Grup 2 ise RAPD analizinde aynı grupta yer alan izolatlardan oluşmuş ancak bu izolatların grup içerisindeki yerleşiminde farklılıklar görülmüştür. RAPD analizinde alt grup olarak ayrılan Küt-2, Ama-1 ve Diyar-8 izolatları ISSR analizinde alt gruba ayrılmayıp ana grup içerisinde yer almışlardır. Ayrıca grup içerisinde 0.791 (Küt-2 ile Ama-1) - 1 (Ank-10 ile Ank-11) arasında değişen oranlarda benzerlik görülmüştür. Bu grupta ise (AG) 8 T primeri 1700 bp, (GA) 8 T primeri 543 bp, (AC) 9 RY primeri ise 547 ve 1060 bp büyüklüğünde polimorfik markerlar sağlamıştır. Grup 3 de yine durum değişmemiş izolatların ağaç içerisindeki yerleşimleri dışında benzer bir dağılım görülmüştür. RAPD analizinde farklı alt grupları oluşturan KC9 ve Ank-13 biraz farklılık göstermekle beraber alt grup oluşturmadan aynı grup içerisinde yer almışlardır. Bu grup içerisindeki benzerlik oranı ise 0.748 (Esk-4 ile Km-19) 1 (Ova-1, Gergen, ve Uşk-3) olarak tespit edilmiştir. (AG) 8 T primeri 1045 bp, (GA) 8 T primeri 1090 bp büyüklüğündeki polimorfik markerlar ile bu grubun diğer gruplardan ayrılmasını sağlamışlardır. RAPD analizinde olduğu gibi ISSR analizinde de izolatların coğrafi dağılımı ve virulenslik dereceleri ile dendogramdaki yerleşimleri arasında bir ilişki tespit edilememiştir. 51
Tok-1 Küt-1 Km-6 Km-9 Dez-5 Diyar-16 Dez-1 Dez-13 Kon-1 Diyar-13 a4 Ank-21 Kır-1 kc7 Adý-1 Km-2 Km-7 Ank-20 Bur-5 Bur-3 Esk-7 Dez-6 Km-4 Ank-16 Esk-6 Ank-9 Esk-8 Esk-3 Ank-7 Dez-3 Dez-11 Ank-17 Uşk-5 Dez-4 Ank-6 Esk-5 Ank-3 hay5 Diyar-6 Diyar-15 Küt-4 Ank-12 Ank-11 Ank-10 Ank-4 Km-1 Ka1 kc6 Dez-12 Diyar-3 Diyar-4 Km-14 a6 Diyar-9 Km-13 Diyar-8 Ama-1 Küt-2 Ank-5 Uşk-6 ova-1 gergen Uşk-3 Esk-2 Bur-6 Km-16 Tok-2 Bur-2 Dez-14 Dez-8 Km-19 Esk-4 kc9 Ank-13 Grup 1 Grup 2 Grup 3 0.39 0.55 0.70 0.85 1.00 Coefficient Şekil 4.6 Fusarium oxysporum izolatlarından elde edilen ISSR verisinin UPGMA analizi ile oluşturulan dendogram 52
4.2.2.3 F. oxysporum izolatları arasındaki genetik farklılığın RAPD+ISSR ile analizi RAPD ve ISSR primerlerinin birlikte kullanılarak F. oxysporum izolatları arasındaki genetik farklılığın ortaya konulmasında toplam 392 (RAPD: 205, ISSR: 187 amplifikasyon ürünü) fragment değerlendirilmiştir. Yapılan bu analizde primer başına düşen band sayısı 10.05, polimorfik band sayısı ise 9.46 olarak bulunmuştur. Benzerlik oranının 0.282 (Bur-6 ile Ank-5) - 0.992 (Ank-10 ile Ank-11) arasında değiştiği, kofenetik korelasyon katsayısının ise r=0.983 olduğu tespit edilmiştir. RAPD+ISSR analizi ile oluşturulan dendogramda F. oxysporum izolatları ayrı ayrı olarak yapılan bireysel analizlerde olduğu gibi benzer bir dağılım göstermiş ve yaklaşık % 70 benzerlik ile üç gruba ayrılmıştır (Şekil 4.7). Grup 1, 0.592 (Diyar-15 ile Km-7) - 0.985 (Kon-1 ile Diyar-13) arasında değişen benzerlik indeksi ile test edilen F. oxysporum izolatları arasında en büyük grubu oluşturmuştur. Diyar 6, Diyar-15 ve Küt-4 izolatları RAPD ve ISSR analizindeki gibi bu grup içerisinde yer almakla beraber ortalama 0.88 benzerlik indeksi ile dendogramın farklı bir dalını oluşturmuşlardır. Grup 2 de ise Dice ın benzerlik katsayısının 0.70 (A6 ile Ama-1) 0.99 (Ank-10 ile Ank-11) arasında olduğu tespit edilmiştir. Ancak Küt-2, Diyar-8 ve Ama-1 izolatları ISSR analizinden farklı olarak bu grup içerisinde yer almakla beraber RAPD analizinde olduğu gibi grup içerisinde en fazla farklılık gösteren izolatlar olmuşlardır. Grup 3 de ise Kc9 ve Ank-13 izolatları bu grup içerisinde en fazla farklılık gösteren izolatlar olmuştur. Bu grup içerisindeki benzerlik oranının 0.69 (Kc9 ile Km-19) 0.974 (Gergen Uşk-3) arasında değiştiği tespit edilmiştir. 53
Tok-1 Km-6 Dez-5 Diyar-16 Küt-1 Dez-1 Dez-13 Km-9 Ank-9 Esk-8 Ank-7 Dez-3 Kon-1 Diyar-13 Ank-21 Kır-1 a4 Esk-3 Kc7 Adı-1 Dez-6 Esk-6 Km-4 Ank-16 Hay5 Km-2 Esk-5 Ank-3 Dez-11 Ank-17 Uşk-5 Ank-6 Dez-4 Km-7 Bur-5 Ank-20 Bur-3 Esk-7 Diyar-6 Diyar-15 Küt-4 Ank-12 Ank-11 Ank-10 Ank-4 Km-1 Dez-12 Km-14 Ka1 Diyar-3 Diyar-4 Kc6 Km-13 Ank-5 a6 Diyar-9 Küt-2 Diyar-8 Ama-1 Uşk-6 Ova-1 Gergen Uşk-3 Bur-6 Esk-2 Tok-2 Bur-2 Km-16 Dez-14 Esk-4 Dez-8 Km-19 Kc9 Ank-13 Grup 1 Grup 2 Grup 3 0.37 0.53 0.68 0.84 0.99 Coefficient Şekil 4.7 Fusarium oxysporum izolatlarından elde edilen RAPD+ISSR verilerinin UPGMA analizi ile oluşturulan dendogram 54
4.2.2.4 RAPD ve ISSR yöntemleri ile elde edilen polimorfizim seviyelerinin..karşılaştırılması Elde edilen bu dendogramlardan hangisinin F. oxysporum izolatları arasındaki genetik farklılığın ortaya konulmasında daha etkili olduğunu tespit etmek için kofenetik matriks değerleri MXCOMP algoritma programı kullanılarak Mantel testi ile karşılaştırılmıştır. Analiz sonucunda her iki yöntemin kofenetik matriks değerleri arasındaki korelasyon katsayısı r=0.966 olarak bulunmuştur. Bu ise RAPD ve ISSR analizi elde edilen dendogramlar arasında çok güçlü bir korelasyonun olduğunu göstermektedir. Her 3 dendogramdan elde edilen yüksek korelasyon katsayıları (0.961, 0.985 ve 0.983) RAPD ve ISSR yöntemlerinin tek başlarına veya birlikte kombine edilerek kullanılmasının F. oxysporum izolatları içerisindeki genetik varyasyonun ortaya konulmasında faydalı olacağını göstermektedir. 4.2.3 Moleküler yöntemlerle Fusarium solani izolatları arasındaki genetik farklılığın tespit edilmesi 4.2.3.1 F. solani izolatları arasındaki genetik farklılığın RAPD ile analizi F. solani, ülkemizde nohutta hastalığa sebep olan Fusarium solgunluk kompleksi içerisinde ikinci sırayı almıştır. Nohuttan izole edilen 25 F. solani izolatı arasındaki polimorfizimin belirlenmesi amacıyla 30 RAPD primeri kullanılmıştır (Çizelge 3.2.). Bu primerler 0.2 (OPK-7) - 3.4 (OPK-15) kb arasında değişen büyüklüklerde amplifikasyon ürünleri oluşturmuştur. RAPD analizi ile test edilen F. solani izolatlarından 239 tanesi polimorfik, 7 tanesi ise monomorfik olmak üzere toplam 248 band değerlendirilmiş ve elde edilen bu 248 DNA fragmentindeki polimorfizim seviyesi ise % 96.3 olarak bulunmuştur. Kullanılan primerler 55
izolatlar arasında polimorfik olan 6 (OPA-18, OPK-9) ile 16 (OPA-19, OPK-16) adet fragmenti amplifiye etmiştir Primer başına düşen toplam band sayısı 9.9, polimorfik band sayısı ise 9.56 olarak bulunmuştur. İzolatların ayırımında en iyi sonuçlar OPK-12, OPK-4 ve OPA-9 primerleri ile sağlanmıştır (Şekil 4.8). Elde edilen dendogram ile benzerlik matriksi arasındaki kofenetik korelasyon katsayısı r=0.995 olarak bulunmuştur. RAPD analizi sonucunda F. solani izolatları 2 ana gruba ayrılmış ve gerek gruplar arasında gerekse grup içinde yüksek bir polimorfizim olduğu tespit edilmiştir (Şekil 4.9). Grup 1 referans olarak kullanılan izolat ile birlikte Ankara, Uşak, Denizli ve Antalya dan elde edilen 11 izolatı içermektedir. Hay 6 izolatı bu grup içerisinde yer almakla beraber grup içerisinde en fazla polimorfizim gösteren izolat olmuştur. Bu grup içerisindeki benzerlik oranı ise % 50-97 arasında değişmiştir. OPK-12 primeri ile yapılan amplifikasyon sonucunda bu gruptaki tüm izolatlardan 1400 bp büyüklüğünde bir fragment elde edilmiştir. Ayrıca OPA-9 primeri ile 1390 bp, OPK-4 primeri ile 460 bp büyüklüğünde elde edilen fragmentler bu grup içerisinde yer alan F. solani izolatlarının diğer gruptan ayrılmasını sağlamıştır. Grup 2 ise 9 ilden (Ankara, Uşak, Denizli, Antalya, Burdur, Kırşehir, Tokat, Diyarbakır ve Kahraman Maraş) elde edilen toplam 15 izolattan oluşmuştur. Grup 2 içerisindeki benzerlik oranı (% 64-98) grup 1 e (%50-97) göre nispeten daha yüksek olarak bulunmuş ve en yüksek benzerlik oranının da Km-25 ile Diyar-21 izolatları arasında olduğu tespit edilmiştir. Güney Doğu Anadolu ve Karadeniz bölgelerinden elde edilen 5 izolat grup 1 içerisinde yer almamıştır. Bu grupta ise OPK-12 primeri 1340 bp büyüklüğündeki fragment ile bu grup üyelerinin grup 1 izolatlarından ayrılmasını sağlamıştır. 56
Şekil 4.8 Fusarium solani izolatlarının a, OPK-12 b, OPA-9 ve c, OPK-4 primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen RAPD profilleri 57
Ref-1 dez-16 dez-18 ka4 ant-1 ank-26 ank-25 Grup 1 usk-7 ka8 usk-8 hay6 dez-19 usk-9 bur-9 bur-8 kır-3 tok-4 km-23 km-25 diyar-21 Grup 2 diyar-20 km-21 tok-5 diyar-19 ank-27 ank-28 0.23 0.42 0.61 0.80 0.98 Coefficient Şekil 4.9 Fusarium solani izolatlarından elde edilen RAPD verisinin UPGMA analizi ile oluşturulan dendogram 58
4.2.3.2 F. solani izolatları arasındaki genetik farklılığın ISSR ile analizi ISSR analizinde kullanılan 20 primer (Çizelge 3.3) ile patojen kombinasyonuna bağlı olarak F. solani izolatlarından toplam 137 fragment amplifiye edilmiş ve bunlardan 124 tanesinin izolatlar arasında polimorfizim sağladığı tespit edilmiştir. Bunun yanısıra kullanılan primerler ile elde edilen polimorfizimin seviyesinin % 90.5 olduğu ve her primer başına düşen band sayısının 9.1, polimorfik marker sayısının ise 8.26 olduğu görülmüştür. Test edilen primer ile F. solani izolatlarından 4 ((AC) 8 YA) - 18 ((GA) 8 C) arasında değişen sayılarda band elde edilmiştir. Elde edilen bu amplifikasyon ürünlerinin moleküler ağırlıklarının ise 0.34 ((AG) 8 YC) - 4.6 ((AC) 8 YA) kb arasında değiştiği tespit edilmiştir. İzolatlar arasındaki Dice ın benzerlik katsayısı 0.31-0.98, kofenetik korelasyon katsayısı ise r=0.992 olarak bulunmuştur. (AG) 8 G, (GA) 8 C ve (AC) 8 YA primerleri F. solani izolatları arasındaki intraspesifik varyasyonun ortaya konulması için oldukça faydalı bilgiler sağlamışlardır (Şekil 4.10). F. solani izolatları arasındaki genetik farklılığın ISSR analizi ile test edilmesi sonucunda RAPD analizi ile elde edilen dağılıma benzer bir dağılım elde edilmiştir (Şekil 4.11). RAPD analizinde olduğu gibi F. solani izolatları iki farklı gruba ayrılmıştır. Ancak RAPD analizi ile kıyaslandığında bu gruplar içerisinde izolatların dağılımında ve benzerlik oranında (% 75) farklılıklar olduğu görülmüştür. Grup 1 RAPD analizindeki gibi yine aynı bölgelerden elde edilen 10 izolat ve 1 referans olmak üzere 11 izolattan oluşmuştur ve benzerlik oranı 0.69-0.98 dir. Bu grup içerisinde yer alan izolatlar arasında en fazla benzerlik oranı Ank-26 ve Ank-25 izolatları (0.983) arasında farklılık ise Uşk-8 ve Hay-6 izolatları arasında (0.741) görülmüştür. 59
Şekil 4.10 Fusarium solani izolatlarının a, (AG) 8 G b, (GA) 8 C ve c, (AC) 8 YA primerleri..ile amplifikasyonu sonucu elde edilen ISSR profilleri 60
Ref-1 dez-18 ka4 ant-1 usk-8 ank-26 ank-25 Grup 1 ka8 usk-7 hay6 dez-16 dez-19 usk-9 bur-8 bur-9 diyar-19 tok-5 km-21 kır-3 Grup 2 tok-4 km-23 km-25 diyar-20 diyar-21 ank-27 ank-28 0.38 0.53 0.68 0.83 0.98 Coefficient Şekil 4.11 Fusarium solani izolatlarından elde edilen ISSR verisinin UPGMA analizi ile oluşturulan dendogram 61
RAPD analizi ile kıyaslandığında bu grup içerisindeki dağılımda en fazla farklılığın Uşk-8 ve Dez 16 izolatları arasında olduğu görülmüştür. Bu grup için (AG) 8 G primeri 1200 bp, (AC) 8 YA primeri 1945 bp, (GA) 8 C primeri ise 1074 bp büyüklüğünde polimorfik markerlar sağlamıştır. Grup 2 içerisinde yer alan izolatlar arasındaki benzerlik katsayısının 0.75 (Dez-19 ile Ank-28) - 0.98 (Km-25 ve Diyar-20) arasında değiştiği tespit edilmiştir. Bu grup içerisindeki yerleşimde en fazla farklılığın ise Diyar-19, Tok-5 ve Km-21 izolatlarında olduğu görülmüştür. Genel olarak RAPD analizi ile kıyaslandığında ISSR analizinde gerek gruplar arasında gerekse gruplar içerisinde daha yüksek benzerlik olduğu ve izolatların bölgelere göre gruplanmalarının aynı olduğu tespit edilmiştir. RAPD analizinde olduğu gibi Güney Doğu Anadolu ve Karadeniz bölgelerinden elde edilen izolatlar sadece grup 2 içerisinde yer almıştır. (AG) 8 G primeri 1080 bp, (AC) 8 YA primeri 890 bp, (GA) 8 C primeri ise 1480 ve 1270 bp büyüklüğünde spesifik fragmentleri amplifiye ederek grup 2 nin diğer gruptan ayrılmasını sağlamışlardır. 4.2.3.3 F. solani izolatları arasındaki genetik farklılığın RAPD+ISSR ile analizi F. solani izolatları arasındaki genetik farklılığın ortaya konulmasında hangi marker sisteminin uygun olduğuna karar vermek için RAPD (248 amplifikasyon ürünü) ve ISSR (137 amplifikasyon ürünü) verisi birlikte değerlendirilerek bir dendogram oluşturulmuştur (Şekil 4.12). Oluşturulan bu dendogramın farklı marker sistemleri kullanılarak elde edilen bireysel dendogramlar ile karşılaştırıldığında gruplar içerisinde izolatların yerleşiminde görülen birkaç istisna ile F. solani izolatları arasında benzer bir gruplandırma sağladığı görülmüştür. Her primer başına düşen bant sayısı 12.8, polimorfik band sayısı ise 10.37 olarak bulunmuştur. İzolatlar arasındaki benzerlik katsayısının 0.26-0.97 arasında değiştiği, kofenetik korelasyon katsayısının ise 0.996 olduğu tespit edilmiştir. Her üç yöntemde de primer başına düşen polimorfik marker sayısı yüksek oranda benzerlik göstermektedir. 62
Ref-1 dez-16 dez-18 ka4 ant-1 usk-8 ank-26 Grup 1 ank-25 usk-7 ka8 hay6 dez-19 usk-9 bur-9 bur-8 kır-3 tok-4 km-23 km-21 Grup 2 tok-5 km-25 diyar-20 diyar-21 diyar-19 ank-27 ank-28 0.30 0.47 0.64 0.81 0.98 Coefficient Şekil 4.12 Fusarium solani izolatlarından elde edilen RAPD+ISSR verilerinin UPGMA analizi ile oluşturulan dendogram 63
4.2.3.4 RAPD ve ISSR yöntemleri ile elde edilen polimorfizim seviyelerinin..karşılaştırılması RAPD ve ISSR analizi ile elde edilen dendogramlar arasındaki farklılığı değerlendirmek için her bir dendograma ait kofenetik matriks değerleri Mantel testi kullanılarak karşılaştırılmıştır. Buna göre RAPD ve ISSR yöntemlerine ait kofenetik matriks değerleri arasındaki korelasyon r=0.992 olarak bulunmuştur. Mantel testleri sonucunda elde edilen bireysel korelasyon katsayılarıda (0.995, 0.992, 0.996) birbirlerine yüksek oranda benzerlik göstermektedir. Bu ise F. solani izolatları arasındaki genetik farklılığı değerlendirmek için her iki yönteminde oldukça etkili olduğunu ve kullanılabileceğini göstermektedir. 4.2.4 Moleküler yöntemlerle farklı kök patojenleri arasındaki genetik farklılığın tespit edilmesi 4.2.4.1 Nohut kök patojenleri arasındaki ilişkinin RAPD analizi ile incelenmesi Nohutlarda hastalığa sebep olan kök patojenleri arasındaki intra ve inter spesifik polimorfizimlerin tespit edilmesi amacıyla gerçekleştirilen bu çalışmada hastalıklı nohut bitkilerinden yapılan izolasyonlar sonucunda elde edilen 5 Fusarium türü, 2 farklı fungus türü ile farklı araştırıcılardan temin edilen 7 farklı fungus türüne ait toplam 95 izolat kullanılmıştır (Çizelge 3.1 ve 4.2). Nüklear DNA ın amplifikasyonu sonucunda test edilen tüm primerler kök patojenleri arasındaki genetik varyasyonu ortaya koyan polimorfik markerlar sağlamıştır. Bu farklı fungus türleri ile yapılan RAPD analizi sonucunda tüm fungus türleri kesin olarak birbirlerinden ayırt edilebilmiştir. Ayrıca morfolojik kriterler kullanılarak kesin teşhisi yapılamayan fungus izolatları RAPD analizi ile gruplandırılmıştır. Nohutlarda kök çürüklüğü ve solgunluğa sebep olan fungus izolatları arasındaki inter ve intra spesifik farklılıkların RAPD analizi ile değerlendirilmesinde toplam 402 fragment 64
değerlendirilmiş ve genelde aynı tür içerisinde yer alan izolatlar benzer amplifikasyon ürünleri göstermiştir. Test edilen primerler ile bu kök patojenlerinden 0.2 (OPA-4, OPK-7, OPA-9) 3.6 (OPA-9) kb arasında değişen büyüklüklerde 1-8 fragment amplifiye edilmiştir. Bu izolatların OPK-7, OPK-19 ve OPA-18 primerleri ile oluşturdukları amplifikasyon ürünleri Şekil 4.13 de verilmiştir. RAPD analizi ile elde edilen benzerlik indeksi ile cluster analizi arasındaki kofenetik korelasyon katsayısı ise r=0.981 olarak bulunmuştur Diğer çalışmalarda olduğu gibi bu çalışmada da RAPD analizi ile farklı fungus cins ve türleri arasında yüksek bir genetik varyasyon tespit edilmiştir. UPGMA cluster analizi ile elde edilen dendogramın ilk dalını oluşturan F. semitectum izolatları arasında ortalama 0.84 oranında bir benzerlik olduğu görülmüştür (Şekil 4.14). Bu izolatlar ile morfolojik özellikler bakımından poliblastik konidi verici hücrelerin bulunup bulunmamasıyla ayrılan F. equiseti izolatları arasındaki benzerlik oranı 0.233 olarak tespit edilmiştir. F. semitectum ile F. oxysporum izolatları arasındaki benzerlik oranın ise 0.247 olduğu görülmüştür. Denemede kullanılan F. oxysporum izolatları bireysel analizdeki gibi üç farklı gruba ayrılmıştır. Morfolojik olarak kesin teşhisi yapılamayan Kon-3 izolatının birinci grupta yer alan F. oxysporum izolatları ile birlikte dallanma gösterdiği belirlenmiştir. Cylindrocarpon olmasından şüphelenilen Ank-32 izolatının ise Grup 2 de yer alan F. oxysporum izolatları ile birlikte gruplandığı ve bu izolat ile C. tonkinense arasındaki benzerlik oranın 0.269 olduğu tespit edilmiştir. F. sambucinum olmasından şüphe edilen KA 2 izolatının ise referans olarak kullanılan F. sambucinum (Ref-6) izolatından (0.272 benzerlik oranı) farklı olarak F. oxysporum izolatları ile birlikte Grup 3 içerisinde yer aldığı, ayrıca teşhisi şüpheli olan Km-11 izolatının ortalama 0.724 benzerlik oranı ile bu grup içerisindeki izolatlar ile birlikte gruplandığı görülmüştür. Morfolojik kriterlere göre F. subglutinans olmasından şüphe edilen Tok-3 izolatının ise dendogramda F. oxysporum izolatları ile birlikte gruplandığı ve Ref-7 (F. subglutinans) izolatı ile arasındaki benzerlik oranının 0.184 olduğu yine bu çalışma ile tespit edilmiştir. 65
Şekil 4.13 Farklı kök patojenlerinin a, OPK-7 b, OPK-19 ve c, OPA-18 primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen RAPD profilleri 1- Marker, 2-6 Fusarium semitectum, 7-13 F. equiseti, 14- Cylindrocarpon tonkinense, 15-16 F. acuminatum, 17-19 F. moniliforme, 20-21 F. solani, 22-29 F. oxysporum, 30- F. sambucinum, 31-F. subglutinans, 32-37 Macrophomina phaseolina, 38-39 Rhizoctonia solani, 40- negatif kontrol 66
F. oxysporum F. sambucinum F. subglutinans F. equiseti C. tonkinense F. solani F. moniliforme F. acuminatum R. solani F. semitectum M. phaseolina Bur-11 Ank-29 Bur-10 Dez-22 Dez-21 Kon-3 Dez-14 Gergen Bur-6 Uşk-3 Esk-2 Km-27 Uşk-6 Ova-1 Ank-13 Esk-4 Dez-8 Km-19 Ank-32 Km-9 Km-6 Diyar-16 Dez-5 Esk-8 Küt1 Esk-6 Tok-1 Kir-1 Dez-6 Ank-21 Ank-9 Kon-1 Diyar-13 Km-4 Esk-5 Km-2 Dez-11 Ank-3 Bur-5 Diyar-6 Ank-17 Km-7 Km-11 Ka2 Ank-4 Ank-12 Ank-11 Ank-10 Dez-12 Km-14 Km-13 Ank-5 Küt-2 Tok-3 Ref-6 Ref-7 Ank-30 Ank-35 Ref-5 Dez-20 Esk-12 Ank-31 Ref-4 Ank-39 Ref-1 Dez-16 Dez-18 Ka4 Ant-1 Usk-8 Ank-26 Ka8 Hay6 Dez-19 Km-25 Diyar-20 Km-21 Usk-9 Kır-3 Km-23 Ank-27 Ank-28 Ref-3 Ank-37 Ref-2 Ank-38 Usk-11 Diyar-22 Dez-24 Dez-23 Km-28 Ank-36 Kay-1 Ank-34 Ank-33 0.10 0.32 0.54 0.76 0.98 Coefficient Şekil 4.14 Onbir farklı fungus türüne ait RAPD verisinin UPGMA analizi ile oluşturulan dendogram 67
Referans olarak kullanılan F. subglutinans (Ref-7) ve F. sambucinum (Ref-6) izolatları aralarındaki 0.298 benzerlik oranı ile tek başlarına ayrı olarak dallanma göstermişlerdir. Test edilen F. equiseti izolatları arasında ise Ref-4 izolatı hariç 0.671 oranında bir benzerlik görülmüştür. Referans olarak kullanılan Ref-5 izolatı ile nohuttan elde edilen F. equiseti izolatları arasında 0.657 oranında benzerlik var iken bu oran Ref-4 izolatında 0.271 olarak tespit edilmiştir. Bu sebeple Ref-4 izolatı bu grup içerisinde ayrı bir alt grup olarak sınıflandırılmıştır. Ayrıca spor verici yapının tam olarak belirlenememesi sebebiyle F. semitectum olmasından şüphe edilen Ank-31 izolatının bu grup içerisindeki izolatlar ile dağılım gösterdiği tespit edilmiştir. Cylindrocarpon tonkinense (Ank-39) izolatı ise dendogramda (0.178) diğer nohut kök patojenlerinden ayrı bir grup içinde yer almıştır. F. solani izolatları da bireysel analizdeki gibi iki farklı gruba ayrılmıştır. Dendogramda diğer izolatlardan ayrı bir dağılma gösteren F. moniliforme izolatlarında, F. equiseti izolatlarındakine benzer bir durum ile karşılaşılmıştır. Bonn Üniversitesinden temin edilen Ref-2 izolatı bu grup içerisinde ayrı bir alt grubu oluşturmuştur. Ank-37 izolatı ile Ref-3 izolatı arasında 0.80 oranında bir benzerlik varken bu oran Ref-2 izolatında 0.288 olarak tespit edilmiştir. F. acuminatum ve R. solani izolatlarının genetik yapısının ise oldukça homojen olduğu görülmüştür. Uşk-11 ve Ank-38 (F. acuminatum) izolatları arasında 0.854 oranında benzerlik varken bu oran R. solani izolatlarında 0.791 olarak bulunmuştur. Kültürdeki gelişim renkleri ile birbirinden ayrılan F. acuminatum ve F. equiseti izolatları arasında ise 0.145 oranında benzerlik olduğu görülmüştür. Bu oran M. phaseolina izolatları arasında 0.757 olarak tespit edilmiştir. 4.2.4.2 Nohut kök patojenleri arasındaki ilişkinin ISSR analizi ile incelenmesi Nohut kök patojenlerinin ISSR yöntemiyle incelenmesinde RAPD analizindekine benzer sonuçlar elde edilmiştir. Primer-patojen kombinasyonuna bağlı olarak test edilen tüm primerler bireyler veya gruplar arasındaki polimorfizimi gösteren 383 fragmenti amplifiye etmiştir. Bu amplifikasyonlar sonucunda tüm izolatlardan 0.18 ((GA) 9 RY))-4.6 ((AC) 8 YA)) 68
kb arasında değişen büyüklüklerde 1-9 band elde edilmiştir. Bu izolatların (GA) 8 T, (AG) 8 G ve (AC) 8 T primerleri ile oluşturdukları amplifikasyon ürünleri Şekil 4.15 de verilmiştir. ISSR verisi ile yapılan cluster analizi sonucunda tüm patojenler birbirlerinden ayrı olarak gruplandırılmış, kofenetik korelasyon katsayısı ise r=0.985 olarak bulunmuştur Yine bu çalışmada da bazı fungus izolatları ile referans izolatlar arasındaki benzerlik oranının oldukça düşük olduğu bulunmuştur. Bununla birlikte F. semitectum, F. acuminatum ve R. solani izolatlarındaki genetik yapının oldukça konservatif olduğu görülmüştür. F. semitectum izolatları arasındaki genetik benzerlik 0.936 olarak tespit edilmiştir. F. semitectum ile morfolojik özellikler bakımından oldukça benzer olan F. equiseti izolatları arasındaki benzerlik oranı ise 0.244 dür (Şekil 4.16). Bireysel olarak yapılan analizlerdeki gibi F. oxysporum izolatları üç farklı grupta F. solani izolatları ise iki farklı grupta yer almışlardır. Ayrıca RAPD analizindeki gibi morfolojik olarak kesin teşhisi yapılamayan Kon-3, Ank-32, Km-11, Tok-3 izolatlarının ve F. sambucinum olarak teşhis edilen KA2 izolatının dendogramda F. oxysporum izolatları ile birlikte gruplandığı tespit edilmiştir. Cylindrocarpon tonkinense izolatı ise dendogramda diğer fungus izolatlarından ayrılmış ve F. oxysporum izolatları ile 0.282 oranında benzerlik göstermiştir. F. moniliforme nin Ank-37 ile Ref-3 izolatları arasındaki benzerlik oranı 0.698 olarak tespit edilirken diğer Ref-2 izolatı arasındaki benzerlik oranı 0.256 olarak bulunmuştur. F. moniliforme ve F. equiseti izolatları arasında ise 0.206 oranında benzerlik olduğu gözlenmiştir. F. subglutinans ve F. sambucinum referansları ortalama 0.192 benzerlik oranı ile dendogramda tek başlarına ayrı olarak dallanma göstermişlerdir. F. equiseti izolatları arasındaki benzerlik oranı ise 0.762 olarak bulunmuştur. Ref-4 izolatı bu grupta yer almakla beraber RAPD analizindeki gibi oldukça farklı olduğu görülmüştür (0.418). Ank-31 izolatı da yine bu grup içerisinde yer almıştır. Aralarında 0.913 oranında benzerlik olan F. acuminatum izolatları (Ank-38 ile Uşk-11) dendogramda ayrı bir grup oluşturmuşlardır. Dendogramın ayrı gruplarını oluşturan M. phaseolina izolatları arasındaki benzerlik oranı 0.764, R. solani izolatları arasında ise 0.891 olarak bulunmuştur. Bu çalışmada da izolatlar arasında görülen benzerlik oranının RAPD analizi ile kıyaslandığında daha yüksek olduğu gözlemlenmiştir. 69
Şekil 4.15 Farklı kök patojenlerinin a, (GA) 8 T b, (AG) 8 G ve c, (AC) 8 T primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen ISSR profilleri 1-Marker, 2-6 Fusarium semitectum, 7-13 F. equiseti, 14- Cylindrocarpon tonkinense, 15-16 F. acuminatum, 17-19 F. moniliforme, 20-21 F. solani, 22-29 F. oxysporum, 30- F. sambucinum, 31-F. subglutinans, 32-37 Macrophomina phaseolina, 38-39 Rhizoctonia solani, 40- negatif kontrol 70
F. oxysporum F. moniliforme F. subglutinans F. equiseti F. solani F. acuminatum M. phaseolina R. solani F. semitectum C. tonkinense F. sambucinum Bur-11 Ank-29 Bur-10 Dez-21 Dez-22 Kon-3 Dez-14 Km-27 Ova-1 Gergen Uşk-3 Esk-2 Bur-6 Dez-8 Km-19 Uşk-6 Esk-4 Ank-13 Ank-32 Km-9 Küt1 Tok-1 Km-6 Diyar-16 Dez-5 Kir-1 Ank-9 Esk-8 Ank-21 Kon-1 Diyar-13 Dez-6 Km-4 Esk-6 Km-2 Km-7 Esk-5 Ank-3 Dez-11 Ank-17 Bur-5 Diyar-6 Km-11 Ank-4 Ank-11 Ank-12 Km-13 Dez-12 Km-14 Ka2 Ank-10 Küt-2 Ank-5 Tok-3 Ank-39 Ref-3 Ank-37 Ref-2 Ref-7 Ref-6 Ank-30 Dez-20 Ank-31 Esk-12 Ank-35 Ref-5 Ref-4 Ref-1 Dez-16 Dez-18 Ka4 Usk-8 Ank-26 Ka8 Hay6 Ant-1 Dez-19 Usk-9 Km-21 Kır-3 Km-23 Km-25 Diyar-20 Ank-27 Ank-28 Ank-38 Usk-11 Diyar-22 Dez-24 Kay-1 Dez-23 Km-28 Ank-36 Ank-34 Ank-33 0.15 0.36 0.57 0.79 1.00 Coefficient Şekil 4.16 Onbir farklı fungus türüne ait ISSR verisinin UPGMA analizi ile oluşturulan dendogram 71
4.2.4.3 RAPD ve ISSR yöntemleri ile elde edilen polimorfizim seviyelerinin..karşılaştırılması RAPD ve ISSR analizi ile elde edilen dendogramların kök patojenlerinin ayırımındaki etkinliklerini değerlendirmek için daha önce olduğu gibi dendogramdan hesaplanan kofenetik matriks değerleri MXCOMP algoritma programı kullanılarak Mantel testi ile karşılaştırılmıştır. Analiz sonucunda her iki yöntemin kofenetik matriks değerleri (0.985-0.981) arasındaki korelasyon katsayısı r=0.98 olarak bulunmuştur. Bu ise kök patojenlerinin ayırımında RAPD ve ISSR analizlerinden elde edilen dendogramlar arasında çok güçlü bir korelasyonun olduğunu göstermektedir (Şekil 4.17). Şekil 4.17 Onbir farklı fungus türünün RAPD ve ISSR analizlerine ait kofenetik matriks değerleri arasındaki korelasyon eğrisi (r=0.98) 72
5. TARTIŞMA ve SONUÇ Bitkilerde kök çürüklüğü ve solgunluk gibi belirtilere neden olan kök patojenlerinin epidemiyolojisi oldukça karmaşık olup inokulum yoğunluğu, patotip, bitki yaşı, konukçu dayanıklılığı ve genetik potansiyeli, sıcaklık, nem ve besin maddesi gibi çevre koşulları bu patojenlerin gelişimini etkileyebilmektedir (Haware et al. 1990). Özellikle Fusarium oxysporum f. sp. ciceris, F. solani f. sp. pisi, Pythium ultimum ve Thielaviopsis basicola nın neden olduğu hastalık şiddetinin toprak sıcaklığı ve inokulum yoğunluğu ile orantılı olarak değiştiği bilinmektedir (Bhatti and Kraft 1992). Ayrıca Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in sebep olduğu hastalık şiddetinin düşük toprak ph sında ve 25 C de arttığı tespit edilmiştir (Gupta et al. 1987). Survey çalışmaları sonucunda Fusarium oxysporum, F. solani, F. equiseti, F. acuminatum, F. semitectum, M. phaseolina ve R. solani nohutlarda hastalığa sebep olan etmenler olarak saptanmışlardır. Ülkemizde nohutlarda görülen en yaygın kök patojeninin ise Fusarium oxysporum olduğu ve bunu F. solani ve M. phaseolina nın takip ettiği yine bu çalışma ile tespit edilmiştir. Bu sonuç, Ankara bölgesinde nohutlarda görülen en yaygın solgunluk ve kök patojenlerinin sırasıyla Fusarium oxysporum f. sp. ciceris ve F. solani olduğunu bildiren Dolar (1996) sonuçlarıyla uyumludur. Ülkemizde 25 farklı ilden temin edilen 140 tohum örneğini inceleyen Maden (1987) nohut ekim alanlarının yaklaşık olarak % 50 sinin bu etmenle bulaşık olduğunu ve önemli ürün kayıplarına neden olduğunu bildirmiştir. Yapılan patojenisite testlerinde Fusarium oxysporum izolatlarının virulensliklerinin oldukça değişken olduğu bununla birlikte M. phaseolina ve R. solani izolatlarının virulensliklerinin nohut tarlalarında en fazla tespit edilen fungus türleri olan Fusarium oxysporum ve F. solani den daha yüksek olduğu görülmüştür. Demirci vd. (1999) tohum üretim tarlalarında solgunluk ve kök çürüklüğü simptomları gösteren 175 adet Aziziye-94 bitkisinden yapılan izolasyonlar sonucunda Fusarium solani f. sp. pisi (% 50.3), Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (% 38.3), Macrophomina phaseolina (% 5.7), Rhizoctonia solani (% 3.4), F. acuminatum, F. equiseti ve F. avenaceum izolatlarını elde etmişlerdir. Ayrıca bu nohut çeşidinde Fusarium solani f. sp. pisi ve Rhizoctonia solani nin diğer etmenlerden daha yüksek bir virulenslik potansiyeline sahip olduğunu bildirmişlerdir. Abou- Zeid and Hallila (2003) 73
Mısır ın farklı bölgelerindeki nohut ekim alanlarında F. solani nin sebep olduğu siyah kök çürüklüğünün Fusarium solgunluğuna göre daha yaygın ve ciddi olduğunu tespit etmişlerdir. Bununla birlikte nohutlarda kök çürüklüğü ve solgunluğa neden olan Pythium, Phytophthora spp., Verticillium sp. gibi kök patojenleri ülkemizde 2001-2002 yıllarında survey yapılan 15 ildeki nohut ekim alanlarında tespit edilememiştir. Bunun survey yapılan dönemdeki iklim koşullarının bu hastalıkların gelişimi için elverişli olmaması veya örnek alma döneminin uygun olmamasından dolayı kaynaklanmış olabileceği düşünülmüştür. Bitkilerde hastalığa sebep olan funguslar arasındaki genetik ilişkinin incelenmesi ve hastalıktan esas sorumlu olan fungus türlerinin yakın olarak ilişkili fungus türlerinden ve non patojenlerden ayrılmasını sağlayan genetik markerların belirlenmesinin hastalık etmenlerinin teşhisinde büyük öneme sahip olacağı bilinmektedir. Bu nedenle farklı organizmalardaki genetik farklılıkları ortaya koymak amacıyla birçok teknik geliştirilmiştir. Organizmaların genetik yapılarındaki farklılıkları ortaya koyan bu polimorfizimler ise organizmaların biyolojik aktiviteleri ve patojenisitelerindeki farklılıkları ortaya koyabilmektedir (Hernandez et al. 1999). Günümüzde genetik farklılıkların araştırılmasında ve genom araştırmalarında pek çok DNA markerı kullanılmaktadır. Bunlar içerisinde PCR a dayalı olan ve en yaygın olarak kullanılan marker sistemleri ise RAPD, AFLP, SSRs, Microsatellitlerdir. Ancak bu metotlardan bazılarının düşük polimorfizim vermesi, yüksek maliyeti, enzim kesimi ve ligasyon gibi zaman alıcı yöntemleri içermesi ve spesifik primer geliştirilmesinde sekans bilgisine ihtiyaç duyulması bu yöntemlerin kullanılabilirliğini sınırlandırmaktadır. Bununla birlikte RAPD gibi hızlı ve kolay olmasına rağmen tekrarlanabilirlik problemi olan yöntemlerde DNA ektraksiyonunun oldukça önemli olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada iki farklı DNA ekstraksiyon yöntemi kullanılmış ve RAPD analizlerinin tekrarlanabilirliği açısından kullanılan DNA ekstraksiyon yönteminin oldukça önemli olduğu görülmüştür. Özellikle Macrophomina ve Rhizoctonia gibi spor vermeyen, koyu renkli funguslardan DNA ekstraksiyonunda CTAB metodunun daha etkili olduğu tespit edilmiştir. ISSR 74
analizinde ise elde edilen polimorfizimlerin kalitesinin ve tekrarlanabilirliğinin primerlerin G+C içeriği, annealing sıcaklığı ve incelenen genomda bulunma sıklığı ile yakından ilişkili olduğu bilinmektedir (Kumar et al. 2001, Zhou et al. 2001). Bu çalışmada da temiz ve tekrarlanabilir bantlar elde etmek için kullanılan annealing sıcaklığının oldukça önemli olduğu ve her primer için ayrı ayrı belirlenmesinin gerektiği görülmüştür. Benzer şekilde Bornet and Branchard (2001), ISSR primerleri için annealing sıcaklılığının primere özgü olduğunu, Wallace formülü ile hesaplanan annealing sıcaklığından daha yüksek bir sıcaklığın kullanılması gerektiğini bildirmişlerdir. Bununla birlikte primerlerin G+C içeriğine bağlı olarak yüksek annealing sıcaklıklarının kullanılmasına imkan veren ISSR analizinde elde edilen bantların tekrarlanabilirliğinin RAPD analizindeki kadar önemli olmadığı görülmüştür. ISRR analizinde bazı primerler ((GC) 9 YR, (AT) 9 YR, (CT) 8 RG ve (CA) 8 RT)) ile herhangi bir amplifikasyon ürününün oluşmaması ise bu microsatellite primerlere komplementar bölgelerin fungus genomunda diğer eukaryot genomlarına göre daha az sıklıkta bulunmasından kaynaklandığı ileri sürülmektedir (Meyer et al. 1992, Longato and Bonfante 1997). Moleküler markerların patojen populasyonlarındaki genetik farklılığın araştırılmasında faydalı olduğu ve dayanıklı çeşitlerin geliştirilebilmesi için patojen varyasyonunun değerlendirilebilmesini sağladığı bilinmektedir. Bu amaçla gen ekspressiyonuna bağlı olmamalarından dolayı dejenere olmuş, spor vermeyen mutantların teşhisine olanak sağlayan ISSR ve RAPD tekniği, patojen populasyonlarındaki genetik polimorfizimi ortaya koymak, konukçu spesifitesi ve coğrafik dağılımı incelemek için değişik araştırıcılar tarafından farklı organizmalarda başarıyla uygulanmıştır (Fernandez et al. 1997, Migheli et al. 1998, Grunig et al. 2001, Jana et al. 2003, Mishra et al. 2004, Rodrigues et al. 2004). Bu çalışmada ülkemizdeki önemli nohut ekim alanlarında görülen kök patojenleri arasındaki genetik farklılığın değerlendirilmesi için bu iki farklı moleküler metot kullanılmıştır. Her iki metotta da izolatların grup içerisindeki yerleşimlerinde görülen farklılıklar ile beraber benzer bir gruplanmanın gerçekleştiği görülmüştür. 75
Fusarium oxysporum f. sp. ciceris ülkemizde ve dünyadaki nohut ekim alanlarında görülen önemli bir hastalıktır. Nohutun en önemli kök patojeni olarak kabul edilen F. oxysporum izolatları bu çalışma ile üç farklı gruba ayrılmış ve incelenen primerlerden bazılarının bu izolat populasyonlarındaki genetik varyasyonun ortaya konulması için oldukça faydalı bilgiler sağladığı görülmüştür. RAPD analizi ile gerek gruplar arasında gerekse gruplar içerisinde yüksek bir polimorfizim olduğu tespit edilmiş ve ISSR analizindeki gibi F. oxysporum izolatları arasında benzer bir dağılım görülmüştür. Bu yöntemler ile elde edilen dendogramların benzerlikleri ve her iki yöntemin ayırım güçleri MXCOPH programı kullanılarak Mantel testi ile ortaya konulmuştur. Her iki yöntemin birlikte kombine edilmesiyle oluşturulan dendogramında bu fungus populasyonundaki genetik polimorfizimin incelenmesi için oldukça faydalı olduğu görülmüştür. Ayrıca Fusarium oxysporum izolatları her iki marker sistemiyle kesin olarak diğer nohut kök patojenlerinden ayrılabilmiştir. Tek bir vejetatif uyum grup içerisinde yüksek bir genetik benzerlik paylaşmalarına rağmen Fusarium oxysporum f. sp. ciceris içerisinde farklı ırkların bulunması bu izolatların birbirinin klonu olabileceğini veya ortak bir soydan gelmiş olabileceklerini göstermektedir (Leslie 1993, Jimenez-Gasco et al. 2001). Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in ırklarının serolojik ve elektroforetik değişkenliğini inceleyen Desai et al. (1992) bu ırkların yakın bir antijenik ilişki gösterdiğini ve ortak bir isoenzim içeriğini paylaştıklarını, Perez-Artes et al. (1995) ise mitokondrial DNA in RFLP analizinde aynı restriksiyon profilini gösterdiklerini ifade etmişlerdir. Jimenez-Gasco et al. (2002) Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in EF1α (Elongation factor), β-tubulin, histone 3, actin ve calmodulin gen sekanslarının aynı olmasından dolayı bu patojenin monofiletik orjinli olduğunu belirtmişlerdir. Zamani et al. (2004) nohutta vasküler solgunluğa sebep olan F. oxysporum un 15 izolatını vejetatif uyum, patojenisite ve RAPD analizi bakımından karşılaştırdıkları çalışmalarında patojenisite ve vejetatif uyum testi ile bu izolatları üç farklı gruba ayırmışlardır. Oniki primer kullanarak yaptıkları RAPD analizinde ise Fusarium oxysporum izolatları arasında yüksek bir genetik varyasyonun olduğunu tespit etmişlerdir. Ancak RAPD analizi ile elde edilen dağılım ve diğer iki analiz arasında herhangi bir ilişki bulamamışlardır. Fusarium oxysporum izolatlarını koloni büyüklüğü, enzim aktivitesi ve RAPD analizi ile karşılaştıran Motallebi et al. (2002) 76
yüksek virulensliğe sahip izolatların aynı enzim aktivitesine ve daha büyük kolonilere sahip olduğunu bildirmişlerdir. RAPD analizi ile de yüksek virulensliğe sahip izolatlar düşük virulenslikteki izolatlardan ayrı olarak gruplandırılmıştır. Meksika nın farklı bölgelerinden elde edilen 41 Fusarium oxysporum f. sp. ciceris izolatını RAPD analizi ile inceleyen Luna-Paez et al. (2003) Dice ın benzerlik katsayısını kullanarak yaptıkları UPGMA analizi ile bu 41 izolatı 7 farklı gruba ayırmışlardır. Kelly et al. (1994) büyüklükleri 17-20 bp arasında değişen üç primer ile gerçekleştirdiği RAPD analizi ile 63 Fusarium oxysporum f. sp. ciceris ve 11 farklı fungus izolatını birbirinden ayırmışlardır. Elde edilen RAPD verisi ile yapılan UPGMA analizi ile Fusarium oxysporum f. sp. ciceris izolatlarını sararma ve solgunluk belirtisine sebep olmalarına göre iki farklı gruba ayırmışlardır. Bunun yanı sıra F. oxysporum ve F. solani izolatları arasındaki benzerlik oranının % 11-18 arasında değiştiğini tespit etmişlerdir. Fusarium solani nohutta kök çürüklüğü ve solgunluğa sebep olan Fusarium kompleksi içerisinde Fusarium oxysporum f. sp. ciceris den sonra ikinci sırada yer almasına rağmen bu fungusun izolatları arasındaki genetik ilişki ile ilgili herhangi bir bilgi mevcut değildir. Bununla birlikte klasik yöntemlerle yapılan teşhislerde çok yaygın olmamakla beraber araştırıcılara göre farklı formae speciales ayırımları görülmektedir. Ancak farklı konukçu dizisindeki hastalık reaksiyonlarına göre bir ayırım yapılamamıştır. Bu sebeple F solani izolatları arasındaki genetik varyasyonun ortaya konulması yapılacak dayanıklılık ıslahı çalışmaları açısından önem taşıyacaktır. F. solani izolatlarının hem ISSR hemde RAPD yöntemi ile iki farklı gruba ayrıldığı görülmüş ve her iki yöntem arasında yüksek bir korelasyon tespit edilmiştir. Ayrıca kısmen de olsa izolatların coğrafik orjini ve dendogramdaki dağılımı arasında bir ilişki olduğu bulunmuştur. Soya fasulyesinde hastalığa sebep olan F. solani f. sp. phaseoli izolatları arasındaki genetik farklılığı ortaya koymak için yapılan RAPD ve sekans analizleri sonucunda rdna nın D2 ve ITS bölgelerinin sekans analizlerinin bu varyasyonu ortaya koymak için yeterli olmadığı görülmüştür (Achenbach et al. 1997). Bununla beraber RAPD analizi ile ani ölüm sendromuna sebep olan F. solani f. sp. phaseoli izolatları iki farklı gruba ayrılabilmiştir. RAPD ile iki gruba ayrılmalarına rağmen bu ayırım patojenisite testleriyle 77
sağlanamamıştır. Ayrıca elde edilen dendogramlar ile izolatların coğrafik dağılımları arasında kısmen de olsa bir ilişki olduğu tespit edilmiştir (Achenbach et al. 1997). Fusarium cinsi kültür koşullarına bağlı olarak yüksek derece değişken olan ve morfolojik kriterlere dayanılarak bir araya getirilen mitosporik bir fungus topluluğudur (Yoder and Christianson 1998). Bu sebeple morfolojik ve kültürel özelliklere dayanılarak yapılan Fusarium türlerinin teşhisi uzman taksonomistlerce yapılsa bile her zaman güvenilir sonuçlar vermemekte ve genetik olarak farklı olan türler aynı tür olarak sınıflandırılabilmektedir. Bu çalışmada da morfolojik kriterlere dayanılarak bazı fungus izolatlarının teşhisleri mutasyonlar, kültür aktarmaları, ortam koşulları gibi farklı sebeplerden dolayı yapılamamıştır. Ancak morfolojik özelliklere dayanılarak kesin teşhisleri yapılamayan izolatların moleküler yöntemlerle kesin olarak türleri belirlenebilmiş ve bu izolatların RAPD ve ISSR yöntemiyle oluşturulan dendogramlarda ufak farklılıklarla beraber benzer dağılım gösterdikleri tespit edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan her iki analiz yöntemiyle daha önce F. semitectum olmasından şüphelenilen Kon-3 izolatının Fusarium oxysporum olduğu tespit edilmiştir. Yine teşhisleri tam olarak yapılamayan Km-11 ve Tok-3 izolatları dendogramda F. oxysporum izolatları ile birlikte dağılım göstermişlerdir. Ayrıca F. sambucinum olarak teşhis edilen KA2 izolatının ve Cylindrocarpon tonkinense olmasından şüphelenilen Ank-32 izolatının F. oxysporum izolatları ile birlikte gruplandığı görülmüştür. Yine poliblastik spor verici yapıların tespit edilememesi nedeniyle F. semitectum olmasından şüphelenilen Ank-31 izolatının F. equiseti izolatları ile birlikte dağılım gösterdiği yapılan bu çalışma ile saptanmıştır. Analizler sırasında nohuttan elde edilen bazı kök patojenlerinin referans olarak kullanılan izolatlar ile oldukça farklı olduğu görülmüştür. Diğer izolatlar ile referans izolatlar arasında görülen bu farklılık muhtemelen referans izolatların sınıflandırılmasında kullanılan teşhis anahtarlarından veya farklı konukçulardan elde edilmelerinden kaynaklanmaktadır. Kını et al. (2002), RAPD analizi ile farklı konukçulardan elde edilen F. moniliforme izolatları arasında 5 farklı grubun olduğunu bildirmiştir. Bu çalışmada Ref-2 izolatı ile diğer F. moniliforme izolatları arasında tespit edilen farklılığın nedeni konukçu farklılığı veya nohuttaki F. moniliforme nin yeni sınıflandırmaya göre F. verticilloides olarak tanımlanması olabilir. Jana et al. 78
(2005) nohuttan elde edilen M. phaseolina izolatları arasında yüksek bir genetik farklılığın olduğunu, bu izolatların soya fasulyesi ve pamuktan izole edilen izolatlardan oldukça farklı olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca farklı araştırıcılar tarafından morfolojik olarak yanlış sınıflandırılan değişik Fusarium türlerine ait izolatların kesin tanısı, moleküler yöntemler kullanılarak tespit edilmiştir (Altomare et al. 1997, Yoder and Christianson 1998, Vakalounakis and Fragkiadakis 1999). F. semitectum, F. acuminatum ve R. solani izolatlarının genetik yapısının oldukça konservatif olduğu yine yapılan bu çalışma ile tespit edilmiştir. Bununla birlikte test edilen bazı fungus izolatlarının az olması sebebiyle bu funguslardaki genetik farklılığın ortaya konması için daha fazla izolatın kullanılmasının faydalı olacağı düşünülmüştür. Bitkilerin patojen mikroorganizmalarla sürekli olarak interaksiyon halinde olması sebebiyle zaman içerisinde patojenlere karşı dayanıklılık mekanizmalarında kırılmalar olmaktadır. Bu sebeple dayanıklı çeşitlerin geliştirilmesi ve etkili hastalık kontrol sistemlerinin oluşturulabilmesi için patojen populasyonlarında var olan genetik farklılığın ortaya konması gerekmektedir. Yapılan bu çalışma ile elde edilen RAPD ve ISSR profilleri kök patojenlerinin birbirinden ayrılmasını sağlamakla beraber aynı tür içindeki izolatlar arasındaki intraspesifik farklılığın ortaya konulmasında oldukça faydalı olmuştur. Özellikle mutasyon sebebiyle klasik olarak teşhisi mümkün olmayan veya teşhisi şüpheli olan fungus izolatları elde edilen dendogramlardaki grublanmaları ile birbirlerinden ayırt edilebilmişlerdir. Ayrıca her iki yöntem ile elde edilen gruplanmanın benzer olduğu ve bu sebeple her iki yönteminde kök patojenleri arasındaki genetik farklılığı incelemek için oldukça uygun olduğu tespit edilmiştir. Her iki yöntemin kombine edilmesiyle oluşturulan dendogramların ise RAPD analizine kıyasla ISSR analizi ile edilen dendograma daha fazla benzediği tespit edilmiştir. Bunun yanısıra ISSR analizi ile elde edilen benzerlik oranının RAPD analizine göre daha yüksek olduğu görülmüştür. Colletotrichum izolatlarının konukçu spesifitesi ve genetik farklılığını araştıran Lu et al. (2004) ISSR ve RAPD analizi ile izolatların dağılımında küçük farklılıklar olmakla beraber elde edilen dendogramların büyük ölçüde benzer olduğunu bildirmişlerdir. Aynı araştırıcılar RAPD analizi ile Colletotrichum izolatlarında tesbit edilen benzerlik oranının % 18-85 arasında değişir iken 79
ISSR analizinde bu oranın % 44-90 arasında değiştiğini ve her iki yönteminde morfolojik olarak teşhis edilemeyen izolatların ayrılmasında ve Colletotrichum türlerinin populasyon analizi için uygun olduğunu belirtmişlerdir. Ayrıca ISSR ve RAPD verisinin birlikte değerlendirilmesi ile elde edilen dendogramın büyük ölçüde ISSR dendogramına benzediği yine bu araştırıcılar tarafından ifade edilmiştir. Benzer şekilde ISSR analizinin funguslardaki populasyon yapısının incelenmesi için oldukça faydalı olacağı değişik araştırıcılar tarafından bildirilmiştir (Grunig et al. 2001, Rodrigues et al. 2004, Jana et al. 2005). Tüm dünyada nohutlarda hastalığa sebep olan bu patojenlerle mücadele yöntemi olarak dayanıklı nohut çeşitlerinin geliştirilmesi önerilmektedir. Ancak patojenlerin genetik yapısında görülen mutasyon ve rekombinasyonlar dayanıklılıkta kırılmalara sebep olmaktadır. Ayrıca dayanıklılığın bölgesel olarak değişkenlik göstermesi nedeniyle ıslah materyallerinin farklı üretim bölgelerinde test edilmesi gerekmektedir. Bu moleküler tekniklerle patojenlerdeki populasyon genetiğinin incelenerek bölgelere göre intra ve interspesifik varyasyonun tespit edilmesi; farklı genetik yapıya sahip patojenlerin farklı üretim bölgelerine girmesinin engellenmesi ve hassas çeşitlerin ekilerek belirli bir alanda inokulum birikmesinin önüne geçilmesine olanak sağlayacaktır. Yapılan bu çalışma ile elde edilen sonuçların klasik yöntemlerde karşılaşılan problemleri elemine ederek patojenlerin daha hızlı ve doğru bir şekilde tespitini sağlayan metotların geliştirilmesinde, populasyon yapısındaki değişikliklerin incelenerek bölgelere göre dayanıklı çeşitlerin belirlenmesinde ve böylelikle hastalıklara karşı entegre mücadele yöntemlerinin daha etkili olarak uygulanmasında araştırmacılara faydalı olacağı düşünülmektedir. 80
KAYNAKLAR Abou-Zeid, N.M. and Hallila, H. 2003. Current status of chickpea diseases in Egypt. In: International Chickpea Conference, Chickpea Research for Millennium Raipur, Chhattisgarh, January, pp. 156-166, India. Achenbach, L.A., Patrick, J.A. and Gray, L.E. 1997. Genetic homogeneity among isolates of Fusarium solani that cause soybean sudden death syndrome. Theor. Appl. Genet., 95, 474-478. Akem, C. 1999. Ascochyta blight of chickpea: present status and future priorities. International Journal of Pest Management, 45, 131-137. Almeida, A.M.R., Abdelnoor, R.V., Arias, C.A.A., Carvalho, V.P., Jacoud Filho, D.S., Marin, S.R.R., Benato, L.C., Pinto, M.C. and Carvalho, C.G.P. 2003. Genotypic diversity among Brazilian isolates of Macrophomina phaseolina revealed by RAPD. Fitopatologia Brasileira, 28, 279-285. Altomare, C., Petrini, O., Logrieco, A. and Bottalico, A. 1997. Taxonomic relationships among the toxigenic species Fusarium acuminatum, Fusarium sporotrichioides and Fusarium tricinctum by isozyme analysis and RAPD assay. Can. J. Bot., 75, 1674-1684. Alves-Santos, F.M., Ramos, B., Garcia-Sanchez, M.A., Eslava, A.P. and Diaz-Minquez, J.M. 2002. A DNA-based procedure for in plant detection of Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli. Phytopathology, 92, 237-244. Anonymous. 1996. International code on the identification of fungi of agricultural and environmental significance. IMI, Egham, UK. Anonymous. 2003. Web sitesi. DNA minipreps fungi. http://www.dumru.mc.duke.edu. Erişim Tarihi: 10.05.2003. Anonymous. 2005. Web sitesi. F.A.O. http://www.fao.org.erişim Tarihi: 07.03.2006. Armstrong, G.M. and Armstrong, J.K. 1981. Formae speciales and races of Fusarium oxysporum causing wilt disease. In: P.E. Nelson, T.A. Toussoun, & R.J. Cook [eds.] Fusarium: Disease, Biology, and Taxonomy. Pennsylvania State University Press, University Park, pp. 391-399. Assigbetse, K.B., Fernandez, D., Dubois, M.P. and Geiger, J.P. 1994. Differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum races on cotton by Random Amplified Polymorfic DNA (RAPD) analysis. Phytopathology, 84, 622-626. Balmas, V., Scherm, B., Primo, P.D., Rau, D., Marcello, A. and Migheli, Q. 2005a. Molecular characterisation of vegetative compatibility groups in Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici and f. sp. lycopersici by random amplification of polymorphic DNA and microsatellite-primed PCR. Eur. J. Plant Pathol., 111, 1-8. Balmas, V., Scherm, B., Ghignone, S., Mohamed-Salem, A.O., Cacciola, S.O. and Migheli, Q. 2005b. Characterisation of Phoma tracheiphila by RAPD-PCR, microsatellite-primed PCR and ITS rdna sequencing and development of specific primers for in planta PCR detection. Eur. J. Plant Pathol., 111, 235-247. 81
Barnes, I., Gaur, A., Burgess, T., Roux, J., Wingfield, B.D. and Wingfield, M.J. 2001. Microsatellite markers reflect intra-specific relationships between isolates of the vascular wilt pathogen Ceratocystis fimbriata. Mol. Plant Pathol., 2(6), 319 325. Barve, M.P., Haware, M.P., Sainani, M.N., Ranjekar, P.K. and Gupta, V.S. 2001. Potential of microsatellites to distinguish four races of Fusarium oxysporum f. sp. ciceri prevalent in India. Theor. Appl. Genet., 102, 138-147. Beniwal, S.P.S., Ahmed, S. and Gorfu, D. 1992. Wilt/root rot diseases of chickpea in Ethiopia. Tropical Pest Management 38 (1), 48-51. Bhaduoria, P., Chaturvedi, S.K., Gurha, S.N. and Awasthi, N.N.C. 2003. Inheritance of resistance to wilt (Fusarium oxysporum f. sp. ciceri) in chickpea (Cicer arietinum L.). In International Chickpea Conference, Chickpea Research for Millennium Raipur, Chhattisgarh, January, pp. 208-209, India. Bhattti, M.A. and Kraft, J.M. 1992. Effects of inoculum density and temperature on root rot and wilt of chickpea. Plant Dis., 76, 50-54. Booth, C.1971. Fusarium a laboratory guide to the identification of the major species. C.M.I. Kew surrey, pp.58. England. Bornet, B. and Branchard, M. 2001. Nonanchored inter simple sequence repeat (ISSR) markers: reproducible and specific tools for genome fingerprinting. Plant Molecular Biology Reporter, 19, 209-215. Cabrera de la Colina, J., Trapero-Casas, A. and Jimenez-Diaz, R.M. 1985. Races of Fusarium oxysporum f. sp. ciceri in Andalucia, Southern Spain. International Chickpea Newsletter, 13, 24-26. Chakrabarti, A., Mukherjee, P.K., Sherkhane, P.D., Bhagwat, A.S. and Murthy, N.B.K. 2001. A simple and rapid molecular method for distinguishing between races of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris from India. Current Science, 80 (4), 571-575. Chiocchetti, A., Ghignone, S., Minuto, A., Gullino, M.L., Garibaldi, A. and Migheli, Q. 1999. Identification of Fusarium oxysporum f. sp. basilici isolated from soil, basil seed, and plants by RAPD analysis. Plant Dis., 83(6), 576-581. Cramer, R.A., Byrne, P.F., Brick, M.A., Panella, L., Wickliffe, E. and Schwartz, H.F. 2003. Characterization of Fusarium oxysporum isolates from common bean and sugar beet using pathogenicity assays and random-amplified polymorphic DNA markers. J. Phytopathol., 151, 352 360. Crowhurst, R.N., Hawthrorne, B.T., Rikkerink, E.H.A. and Templeton, M.D. 1991. Differentiation of Fusarium solani f. sp. cucurbitae races 1 and 2 by random amplification of polymorphic DNA. Curr. Genet., 20, 391-396. De Haan, L.A.M., Numansen, A., Roebroeck, E.J.A. and Van Doorn, J. 2000. PCR detection of Fusarium oxysporum f. sp. gladioli race 1, causal agent of Gladiolus yellows disease, from infected corms. Plant Pathol., 49, 89-100. Demirci, E., Eken, C. and Kantar, F. 1999. Pathogenicity of wilt and root rot pathogens of chickpea cv. Aziziye-94. J. Turk. Phytopath., 28, 25-32. Desai, S., Nene, Y.L., Jambunathan, R. and Reddy, R.A.G. 1992. Races of Fusarium oxysporum causing wilt in chickpea: biochemical variability. Indian Phytopathology, 45 (1), 62-65. Dice, L.R. 1945. Measures of the amount of ecologic association between species. Ecology 26, 297-302. 82
Dolar, F.S. 1996. Determination of chickpea diseases in Ankara, Turkey. International Chickpea and Pigeonpea Newsletter No:3, 33-34. Dolar, F.S. 1997. Determination of the races of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in Ankara province, Turkey. J. Turk. Phytopath., 26(1), 11-15. Dolar, F.S. and Nirenberg, H.I. 1998. Cylindrocarpon tonkinense Bugn.- A new Pathogen of chickpea. J. Phytopathol., 146(10), 521-523. Duncan, S., Barton, J.E. and O Brien, P.A. 1993. Analysis of variation in isolates of Rhizoctonia solani by random amplified polymorphic DNA assay. Mycol. Res., 97(9), 1075-1082. Edel, V., Steinberg, C., Avelange, I., Laguerre, G. and Alabouvette, C. 1995. Comparison of three molecular methods for the characterization of Fusarium oxysporum strains. Phytopathology, 85, 579-585. Eser, D. ve Soran, H. 1978. Yerli ve Yabancı Kökenli Nohut Çeşitlerinin Orta Anadolu Koşullarında Erkencilik, Verimlilik ve Hastalılara Dayanıklılık Yönünden Mukayeseli İncelenmesi. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yayın No. 684, Ankara. Fenille, R.C., Souza, N.L. and Kuramae E.E. 2002. Characterization of Rhizoctonia solani associated with soybean in Brazil. Eur. J. Plant Pathol., 108, 783-792. Fenille, R.C., Ciampi, M.B., Kuramae, E.E. and Souza, N.L. 2003. Identification of Rhizoctonia solani associated with soybean in Brazil by rdna-its sequences. Fitopatologia Brasileira 28:413-419. Fernandez, D., Quinten, M., Tantaoui, A. and Geiger, J.P. 1997. Molecular records of micro- evolution within the Algerian population of Fusarium oxysporum f. sp. albedinis during its spread to new oases. Eur. J. Plant Pathol., 103, 485-490. Freeman, S. and Maymon, M. 2000. Reliable detection of the fungal Fusarium oxysporum f. sp. albedinis, causal agent of bayoud disease of date palm, using molecular techniques. Phytoparasitica, 28(4), 341-348. Garcia-Pedrajas, M.D., Bainbridge, B.W., Heale, J.B., Artes, E.P. and Diaz, J. 1999. A simple PCR based method for the detection of chickpea wilt pathogen Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in artificial and natural soils. Eur. J. Plant Pathol., 105, 251-259. Gente, S., Desmasures, N., Panoff, J.M. and Gueguen, M. 2002. Genetic diversity among Geotrichum candidum strains from various substrates studied using RAM and RAPD-PCR. Journal of Applied Microbiology, 92, 491-501. Gerlach, W. and Nirenberg, H. 1982. The Genus Fusarium: a Pictorial Atlas. Mitteilungen Biologie Bundesanst Land Forstwirtschaft Berlin Dahlem 209, 1-406. Grajal-Martin, M.J., Simon, C.J. and Muehlbauer, F.J. 1993. Use of Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) to Characterize Race 2 of Fusarium oxysporum f. sp. pisi. Phytopathology, 83, 612-614. Grunig, C.R., Sieber, T.N. and Holdenrieder, O. 2001. Characterisation of dark septate endophytic fungi (DSE) using inter-simple-sequence-repeat-anchored polymerase chain reaction (ISSR-PCR) amplification. Mycol. Res., 105(1), 24-32. Gupta, O.M., Kotasthane, S.R. and Khare, M.N. 1987. Factors influencing epidemiology of vascular wilt of chickpea. Proceedings of Indian Academy of Sciences, 57, 86-91. 83
Gupta, O. and Babbar, A. 2003. Occurrence of sources of resistance in desi and kabuli chickpea genotypes against collar rot and yield contributing characters. In International Chickpea Conference, Chickpea Research for Millennium Raipur, Chhattisgarh, January, pp 64. India. Han, Q., Inglis, G.D. and Hausner, G. 2002. Phylogenetic relationships among strains of the entomopathogenic fungus, Nomuraea rileyi, as revealed by partial b-tubulin sequences and inter-simple sequence repeat (ISSR) analysis. Letters in Applied Microbiology, 34, 376 383. Hantula, J., Dusabenyagasani, M. and Hamelin, R.C. 1996. Random amplified microsatellites (RAMS) a novel method for characterizing genetic variation within fungi. Eur. J. for Path., 26, 159 166. Hantula, J. and Muller, M.M. 1997. Variation within Gremmeniella abietina in Finland and other countries as determined by random amplified microsatellites (RAMS). Mycol. Res., 101(2), 169-175. Hantula, J., Lilja, A., Nuorteva, H., Parikka, P. and Werres, S. 2000. Pathogenicity, morphology and genetic variation of Phytophthora cactorum from strawberry, apple, rhododendron and silver birch. Mycol. Res., 104(9), 1062-1068. Haware, M.P. and Nene, Y.L. 1982. Races of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris. Plant Dis., 66, 809-810. Haware, M.P., Nene, Y.L. and Mathur, S.B. 1986. Ascochyta blight. Seed Borne Diseases of Chickpea Technical Bulletin from the Danish Government Institute of Seed Pathology for Developing Countries, No:1, pp. 9-15. Copenhagen, Denmark. Haware, M.P., Jimenez-Diaz, R.M., Amin, K.S. and Halila, H. 1990. Integrated management of wilt and root-rots of chickpea. pp.129-137. In: H.A. van Rheenen and M.C. Saxena (eds.), chickpea in the Nineties: Proceedings of the Second International Workshop on Chickpea Improvement. Dec 1989, ICRISAT Center, Patancheru, India. Hernandez, J.F., Posada, M.A. and Arbelaez, G. 1999. Identification of molecular markers of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi by RAPD. Proc. of the Int. Symp. on cut flowers in the Tropics, 123-131. Huang, R., Galperin, M., Levy, Y. and Perl-Treves, R. 1997. Genetic diversity of Fusarium moniliforme detected by vegetative compatibility groups and random amplified polymorphic DNA markers. Plant Pathol., 46, 871-881. Huhtala, S.P., Hyvönen, J., Bulat, S.A. and Ylı-Mattila, T. 1999. RAPD-PCR, isozyme, rdna RFLP and rdna sequence analyses in identification of Finnish Fusarium oxysporum isolates. Mycol. Res., 103(5), 625-634. Innis, M.A. and Gelfand, D.H. 1990. Optimisation of PCRs. In PCR Protocols: A guide to methods and applications (M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky& T.J. White eds.): 3-11. Academic Press, San Diago. Jana, T., Sharma, T.R., Prasad, R.D. and Arora, D.K. 2003. Molecular characterization of Macrophomina phaseolina and Fusarium species by a single primer RAPD technique. Microbiol. Res., 158, 249-257. Jana, T., Sharma, T.R. and Singh, N.K. 2005. SSR-based detection of genetic variability in the charcoal root rot pathogen Macrophomina phaseolina. Mycol. Res., 109(1), 81-86. 84
Jimenez-Diaz, R.M., Trapero-Casas, A. and Cabrera de la Colina, J. 1989. Races of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris infecting chickpeas in Southern Spain. In: Tjamos, E.C. and Beckman, C. (eds.) Vascular wilt diseases of plants, NATO ASI Series, Springer-Verlag, Vol. H28, pp. 515-520, Berlin Jimenez-Diaz, R.M., Singh, K.B., Trapero-Casas, A. and Trapero-Casas, J.L. 1991. Resistance in kabuli chickpeas to Fusarium wilt. Plant Dis., 75, 914-918. Jimenez-Gasco, M., Perez-Artes, E. and Jimenez-Diaz, R.M. 2001. Identification of pathogenic races 0, 1 B/C, 5, and 6 of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris with random amplified polymorphic DNA (RAPD). Eur. J. Plant Pathol., 107, 237-248. Jimenez-Gasco, M., Milgroom, M.G. and Jimenez-Diaz, R.M. 2002. Gene genealogies support Fusarium oxysporum f. sp. ciceris as a monophyletic group. Plant Pathol., 51, 72-77. Jimenez-Gasco, M. and Jimenez-Diaz, R.M. 2003. Development of a specific polymerase chain reaction-based assay for the identification of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris and its pathogenic races 0, 1A, 5, and 6. Phytopathology, 93, 200-209. Justesen, A.F., Yohalem, D., Bay, A. and Nicolaisen, M. 2003. Genetic diversity in potato field populations of Thanatephorus cucumeris AG-3, revealed by ITS polymorphism and RAPD markers. Mycol. Res., 107(11), 1323-1331. Kaiser, W.J., Alcala-Jimenez, A.R., Hervas-Vargas, A., Trapero-Casas, J.L. and Jimenez- Diaz, R.M. 1994. Screening of wild Cicer species for resistance to race 0 and 5 of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris. Plant Dis., 78, 962-967. Kelly, A., Alcala-Jimenez, A.R., Bainbridge, B.W., Heale, J.B., Perez-Artes, E. and Jimenez-Diaz, R.M. 1994. Use of Genetic Fingerprinting and Random Amplified Polymorphic DNA to Characterize Pathotypes of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris Infecting Chickpea. Phytopathology, 84, 1293-1298. Kelly, A., Bainbridge, B.W., Heale J.B., Perez-Artes, E. and Jimenez-Diaz, R.M. 1998. In planta-polymerase chain reaction detection of the wilt inducing pathotype of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris in chickpea (Cicer arietinum L.). Physiol. Mol. Plant Pathol., 52, 397-409. Kını, K.R., Leth, V. and Mathur, S.B. 2002. Genetic variation in Fusarium moniliforme isolated from seeds of different host species from burkina faso based on random amplified polymorphic DNA analysis. J. Phytopathol., 150, 209 212. Kumar, L.S., Sawant, A.S., Gupta, V.S. and Ranjekar, P.K. 2001. Comparative analysis of genetic diversity among Indian populations of Scirpophaga incertulas by ISSR- PCR and RAPD-PCR. Biochemical Genetics, 39, 297-309. Leslie, J.F. 1993. Fungal vegetative compatibility. Annual Review of Phytopathology, 31, 127-151. Lilja, A., Hietala, A.M. and Karjalainen, R. 1996. Identification of a uninucleate Rhizoctonia sp. by pathogenicity, hyphal anastomosis and RAPD analysis. Plant Pathol., 45, 997-1006. Longato, S. and Bonfante, P. 1997. Molecular identification of mycorrhizal fungi by direct amplification of microsatellite regions. Mycol. Res., 101 (4), 425-432. Lu, G., Cannon, P.F., Reid, A. and Simmons, C.M. 2004. Diversity and molecular relationships of endophytic Colletotrichum isolates from the Iwokrama Forest Reserve, Guyana. Mycol. Res., 108(1), 53-63. 85
Luna-Paez, A., Valadez-Moctezuma, E., Silva-Rojas, H.V. and Marban-Mendoza, N. 2003. Genetic variability of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris strains in Mexica using PCR-RAPD. Latin American Association of Plant Pathology, and Mexican Society for Plant Pathology April 6-11, meeting abstracts South Padre Island, Texas. Maden, S. 1987. Seed-borne Fungal Diseases of Chickpea in Turkey. J. Turk. Phytopath., 16(1), 1-8. Manulis, S., Kogan, N., Reuven, M. and Ben-Yephet, Y. 1994. Use of the RAPD Technique for Identification of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi from Carnation. Phytopathology, 84, 98-101. Meng, X. and Chen, W. 2001. Applications of AFLP and ISSR techniques in detecting genetic diversity in the soybean brown set rot pathogen Phialophora gregata. Mycol. Res., 105(8), 936-940. Menzies, J.G., Bakkeren, G., Matheson, F., Procunier, J.D. and Woods, S. 2003. Use of inter-simple sequence repeats and amplified fragment length polymorphisms to analyze genetic relationships among small grain-infecting species of Ustilago. Phytopathology, 93, 167-175. Meyer, W., Lieckfeldt, E., Wöstemeyer, J. and Börner, T.H. 1992. DNA fingerprinting for differentiating aggressivity groups of the rapeseed pathogen Leptosphaeria maculans. Mycol. Res., 96(8), 651-657. Meyer, W., Mitchell, T.G., Freedman, E.Z. and Vilgays, R. 1993. Hybridization probes for conventional DNA fingerprinting used as single primers in the polymerase chain reaction to distinguish strains of Cryptococcus neoformans. J. Clin. Microbiol., 31, 2274 2280. Migheli, Q., Briatore, E. and Garibaldi, A. 1998. Use of random amplified polymorphic DNA (RAPD) to identify races 1, 2, 4 and 8 of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi in Italy. Eur. J. Plant Pathol., 104, 49-57. Mishra, K.P., Fox, R.T.V. and Culham, A. 2003. Inter-simple sequence repeat and aggressiveness analyses revealed high genetic diversity, recombination and longrange dispersal in Fusarium culmorum. Ann. Appl. Biol., 143, 291-301. Mishra, P.K., Tewari, J.P., Clear, R.M. and Turkington, K.T. 2004. Molecular genetic variation and geographical structuring in Fusarium graminearum. Ann. Appl. Biol., 145, 299-307. Moricca, S., Ragazzi, A., Kasuga, T. and Mitchelson, K.R. 1998. Detection of Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum in cotton tissue by polymerase chain reaction. Plant Pathol., 47, 486-494. Motallebi, M., Zamani, M.R., Jazayeri, O. and Harighi, M.J. 2002. Use of RAPD, enzyme activity staining, and colony size to differentiate phytopathogenic Fusarium oxysporum isolates from Iran. Brezilian Journal of Microbiology, 33, 299-303. Muehlbauer, F.J. and Singh, K.B. 1987. Genetics of chickpea. In: M.C. Saxena and K.B. Singh (eds.), The Chickpea. CAB. International, Wallingford, Oxon, OX10 8DE, pp. 99-125, UK. Muehlbauer, F.J. 1993. Food and grain legumes. In: J. Janick and J.E. Simon (eds.), New crops., pp. 256-265., Wiley, New York. Nelson, P.E., Toussoun, T.A. and Marasas, W.F.O. 1983. Fusarium Species: an Illustrated Manual for Identification. Pennsylvania State University Press, University Park. 86
Nene, Y.L. and Haware, M.P. 1980. Screening chickpea for resistance to wilt. Plant Dis., 66, 379-380. Nene, Y.L., Sheila, V.K. and Sharma, S.B. 1984. A world list of chickpea (Cicer arietinum L.) and pigeonpea (Cajanus cajan (L.) Millsp.) pathogens. ICRISAT Pulse Pathology Progress Report 32. pp.19. Nene, Y.L. and Reddy, M.V. 1987. Chickpea diseases and their control. In: Saxena, M.C. and Singh K.B. (eds.), The Chickpea, pp. 233-270. C.A.B. Wallingford, Oxon, UK. Nene, Y.L., Sheila, V.K. and Sharma, S.B. 1996. A world list of chickpea and pigeonpea pathogens. 5 th edn. Patoncheru 502 324 Andhra Pradesh, India: International Crops Research Institute for the Semi Arid Tropics. 27p. Niessen, M.L. and Vogel, R.F. 1997. Specific Identification of Fusarium graminearum by PCR with gaoa Targeted Primers. System. Appl. Microbiol., 20,111-113. Perez-Artes, E., Roncero, M.I.G. and Diaz, R.M.J. 1995. Restriction fragment length polymorphism analysis of the mitochondrial DNA of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris. J. Phytopathol., 143, 105-109. Phillips, J.C. 1988. A distinct race of chickpea wilt in California. International Chickpea Newsletter, 18, 19-21. Rathaparkhe, M.B., Tekeoğlu, M. and Muehlbauer, F.J. 1998. Inter-simple sequence-repeat (ISSR) polymorphism are useful for finding markers associated with disease resistance gene clusters. Theor. Appl. Genet., 97, 515-519. Reader, U. and Broda, P. 1985. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letters in Applied Microbiology, 1, 17-20. Rodrigues, K.F., Sieber, T.N., Grunig, C.R. and Holdenrieder, O. 2004. Characterization of Guignardia mangiferae isolated from tropical plants based on morphology, ISSR- PCR amplifications and ITS1-5.8S-ITS2 sequences. Mycol. Res., 108(1), 45-52. Rohlf, F.I. 1998. NTSYS-pc. Numerical taxonomy and multivariate analysis system, Version 2.0. Applied Biostatistics, New York, USA. Rutherford, M.A., Bridge, P.D., Paterson, R.R.M., Brayrford, D. and Thomas, V. 1995. Development of in vitro identification techniques for special pathogenic forms of Fusarium oxysporum. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 25, 137-142. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 1989. Molecular cloning: A Laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Schilling, A.G., Möller, E.M. and Geiger, H.H. 1996. Polymerase Chain Reaction-Based Assays for Species-Specific Detection of Fusarium culmorum, F. graminearum, and F. avenaceum. Phytopathology, 86, 515-522. Sharma, K.D., Chen, W. and Muehlbauer, F.J. 2004. A consensus set of differential lines for identifying races of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris. International chickpea newsletter, 11, 34-36. Shrivastava, A. and Agrawal, S.C. 2003. Studies on pathotypes of Fusarium oxysporum f. sp. ciceri in Vindhyan plateau zone of Madhya Pradesh. In International Chickpea Conference, Chickpea Research for Millennium Raipur, Chhattisgarh, January, pp 201-203, India. Shukla, J., Tuteja, U., Ratnaparkhe, M.B. and Batra, H.V. 2001. Inter-simple-sequencerepeat (ISSR)-PCR for the identification of saprophytic strains of Leptospira. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 17, 529-533. 87
Singh, K., Singh, D., Singh, S. and Gupta, S.K. 2003. Sources of resistance in chickpea entries against wilt/root rot complex. In International Chickpea Conference, Chickpea Research for Millennium Raipur, Chhattisgarh, January, pp. 196-200, India. Singleton, L.L., Mihail J.D. and Rush, C.M. 1992. Methods for Research on Soilborne Phytopathogenic Fungi. APS press, pp.266. St. Paul, Minnesota.U.S.A Sivaramakrishnan, S., Kannan, S. and Singh, S.D. 2002. Genetic variability of Fusarium wilt pathogen isolates of chickpea (Cicer arietinum L.) assessed by molecular markers. Mycopathologia, 155, 171-178. Smith, D.R., Bronson, J.J. and Stanosz, G.R. 2003. Host-related variation among isolates of the Sirococcus shoot blight pathogen from conifers. For. Path. 33, 141 156. Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R. 1973. Numerical Taxonomy. Freeman. San Francisco. pp. 573 Sneh, B., Burpee, L. and Ogoshi, A. 1991. Identification of Rhizoctonia species. APS press St. Paul, M.N., U.S. Soran, H. 1977. The fungus disease situation of edible legumes in Turkey. J. Turk. Phytopath., 6(1), 1-7. Sreekar, Y.R., Thakur, M.P., Pandey, R.L., Shrivastava, G.K., Gupta, S.B. and Khare, N. 2003. Detection of soil borne pathogens associated with chickpea wilt complex under varying agronomical practices. In International Chickpea Conference, Chickpea Research for Millennium Raipur, Chhattisgarh, January, pp. 43, India. Toda, T., Hyakumachi, M. and Arora, D.K. 1999. Genetic relatedness among and within different Rhizoctonia solani anastomosis groups as assessed by RAPD, ERIC and REP-PCR. Microbiol. Res., 154, 247-258. Trapero-Casas, A. and Jimenez-Diaz, R.M. 1985. Fungal wilt and root rot diseases of chickpea in Southern Spain. Phytopathology, 75, 1146-1151. Turner, A.S., Lees, A.K., Rezanoor, H.N. and Nicholson, P. 1998. Refinement of PCRdetection of Fusarium avenaceum and evidence from DNA marker studies for phenetic relatedness to Fusarium tricinctum. Plant Pathology, 47, 278-288. Vakalounakis, D.J. and Fragkiadakis, G.A. 1999. Genetic Diversity of Fusarium oxysporum Isolates from Cucumber: Differentiation by Pathogenicity, Vegetative Compatibility, and RAPD Fingerprinting. Phytopathology, 89, 161-168. Voight, K., Schleier, S. and Bruckner, B. 1995. Genetic variability in Gibberella fujikuroi and some related species of the genus Fusarium based on random amplification of polymorphic DNA (RAPD). Curr. Genet., 27, 528-535. Welsh, J. and McClelland, M. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acid Res., 18, 7213-7218. Westerlund, F.V., Campbell, R.N. and Kimble, K.A. 1974. Fungal root rots and wilt of chickpea in California. Phytopathology, 64, 432-436. Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A. and Tingey, S.V. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acid Res., 18, 6531-6535. Yang, H.A., Sivasithamparam, K., Barton, J.E. and O Brien, P.A. 1995. Characterization of cereal bare patch isolates of Rhizoctonia solani by random amplified polymorphic DNA analysis. Plant Pathol., 44, 811-818. 88
Yoder, W.T. and Christianson, L.M. 1998. Species-specific primers resolve members of Fusarium section Fusarium. Fungal Genetics and Biology, 23, 68-80. Zamani, M.R., Motallebi, M. and Rostamian, A. 2004. Characterization of Iranian isolates of Fusarium oxysporum on the basis of RAPD analysis, virulence and vegetative compatibility. J. Phytopathol., 152, 449 453. Zhou, S., Smith, D.R. and Stanosz, G.R. 2001. Differentiation of Botryosphaeria species and related anamorphic fungi using Inter Simple or Short Sequence Repeat (ISSR) fingerprinting. Mycol. Res., 105(8), 919-926. Zietkiewicz, E., Rafalski, A. and Labuda, D. 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genome, 20, 176-183. 89
ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı: Harun BAYRAKTAR Doğum Yeri: Ankara/Beypazarı Doğum Tarihi: 25.12.1976 Medeni Hali: Bekar Yabancı Dili: İngilizce Eğitim Durumu Lise: Yenimahalle Endüstri Meslek Lisesi (1993) Lisans: Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü (1994-1998) Yüksek Lisans: Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma.Anabilim.Dalı (1998-2001) Çalıştığı Kurum/Kurumlar ve Yıl Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü, Araştırma Görevlisi (1999-2006) Yayınları Bayraktar, H. ve Dolar, F.S. 2001. In vitro koşullarda salisilik asit ve asetilsalisilik asit in nohut kök patojenlerine etkilerinin saptanması. Türkiye IX. Fitopatoloji Kongresi Bildirileri, 3-8 Eylül, Tekirdağ. Bayraktar, H. ve Dolar, F.S. 2002. Induction of resistance in chickpea to Ascochyta blight [Ascochyta rabiei (pass.) Labr.] by salicylic acid. J.Turk. Phytopath., 31(1):49-61. Bayraktar, H., Babalıoğullu, I., Demirci, F., Dolar F.S. and Maden, S., 2002. Distribution of ascochyta blight in some of the important chickpea grown provinces of Turkey. J.Turk. Phytopath., 31 (2):105-110. Demirci, F. Bayraktar, H., Babalıoğullu, I., Dolar, F.S. and Maden, S. 2003. In vitro and in vivo effects of some fungicides against chickpea blight pathogen, Ascochyta rabiei. J. Phytopathol., 151, 519-524. Maden, S., Dolar, F.S., Babalıoğullu, I., Bayraktar, H. and Demirci, F. 2004.Determination of pathogenic variability of Ascochyta rabiei and reactions of chickpea cultivars against the pathotypes in Turkey. 5th European Conference on Grain Legumes Handbook, 307. 7-11 June, Dijon, France. 90