Adenovirüs serotip 5 ve adenovirüs serotip 36 nın Colo-320 hücre hattında adipojenik etkilerinin gösterilmesi Tamer Şanlıdağ 1, Sinem Akçalı 1, Seda Vatansever 2, Candan Çiçek 3, Murat Sayan 4, Elçin Kal Çakmaklıoğulları 1, Pınar Taşkıran Şen 1 1. Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji AD, Manisa. 2. Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji-Embriyoloji AD, Manisa. 3. Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji AD, İzmir. 4. Kocaeli Üniversitesi Tıp FakültesiHastanesi Merkez Laboratuvarı PCR Ünitesi, Kocaeli.
Amaç Adenovirüs serotip 5 (Ad-5) ve serotip 36 nın (Ad-36) (ATCC VR-1610) adipojenik etkilerinin Colo-320 hücre hattında histokimyasal, immünohistokimyasal ve elektron mikroskobik yöntemlerle gösterilmesi
Gereç ve Yöntemler-1 Serotipler Adenovirüs serotip 5 (Ad-5) - Hayvan obezitesiyle ilişkili solunum yolu izolatı Adenovirüs serotip 36 (Ad-36) - İnsan obezitesiyle ilişkili Standart suş [ATCC VR-1610] Adenovirüs serotip 8 (Ad-8) - Kontrol suşu göz sürüntüsü izolatı
Gereç ve Yöntemler-2 Hücre hattı: Colo-320 Hızlı üreme özelliği Barsak epitel hücre kökenli Proliferasyonlarının dış etkenlerden etkilenmemesi
Gereç ve Yöntemler-3 Hücre kültürü COLO-320 Primer insan kolon karsinomu hücre hattı (HTL95027, Interlab Cell Line Collection, Genova, Italy) Medium: RPMI-1640 %10 FCS 2 mm L-glutamin %1 penisilin-streptomisin 10 gün (2 günde bir vasat değişimi) kültür Hücreler konfluent olduktan sonra 6 gözlü plaklara pasaj
Gereç ve Yöntemler-4 İnokülasyon COLO-320 Primer insan kolon karsinomu hücre hattı (HTL95027, Interlab Cell Line Collection, Genova, Italy) Ad-5, Ad-36 ve Ad-8 stok (10-4 dilüsyon) 200 er μl inokülasyon 37 0 C de %5 CO 2 li ortamda 1 saat inkübasyon
Gereç ve Yöntemler-5 İnokülasyon Süre sonunda hücreler; Medium: MEM %10 FCS 2 mm L-glutamin %1 penisilin-streptomisin %1 HEPES % 0.1 gentamisin % 0.4 Amfoterisin B İçeren vasata alındı Kültürün 1. ve 2. hf.larında histokimyasal, immünohistokimyasal ve elektron mikroskobik analiz için hücreler toplandı
Gereç ve Yöntemler-6 Histokimya-Oil Red boyama % 4 lük paraformaldehit 30 dk (fiksasyon) Agar (%2) Rutin parafin takip 5 µm lik kesitler Oil Red le boyama
Gereç ve Yöntemler-7 İmmünohistokimya-Leptin boyama % 4 lük paraformaldehit 30 dk (fiksasyon) % 3 lük hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) 5 dk Permeabilizasyon için % 0.1 lik Triton-X 100 ile 15 dk 1 saat bloking Anti-leptin (Invitrogen, USA) 1 gece inkübasyon İkincil antikorlar (85-9043, Histostain Kit, Zymed) Biotinlayted IgG (30 dk) Streptavidin (30 dk) Diaminobenzidine (DAB) 5 dk Olympus BX40 ile incelendi.
Gereç ve Yöntemler-8 Elektron mikroskopi % 2.5 gluteraldehit 4 saat (fiksasyon) % 1 osmik asit 1,5 saat (fiksasyon) Agar Epon 812 Yarı ince: Toluidin mavisi İnce: Uranil asetat-kurşun sitrat DEU Tıp Fakültesi Carl-Zeiss TEM-900 Elektron mikroskopta incelendi (Doç. Dr. Alper Bağrıyanık, Dr. Serap Cilaker Mıcılı )
Bulgular-1 Colo 320 sitopatik etki 1. hafta
Bulgular-2 Fotoğraf 1. Ad-36 ile infekte Colo-320 hücrelerinin Oil Red boyalı preperatları Oil Red Boyama Ad-36
Bulgular-3 Fotoğraf 2. Ad-5 ile infekte Colo-320 hücrelerinin Oil Red boyalı preperatları Oil Red Boyama Ad-5
Bulgular-4 Fotoğraf 3. Ad-8 ile infekte Colo-320 hücrelerinin Oil Red boyalı preperatları Oil Red Boyama Ad-8
Bulgular-5 Fotoğraf 4. Ad-36 ile infekte Colo-320 hücrelerinin immünohistokimyasal boyalı preperatları Ad-36 Ad-36 1. Hafta 2. Hafta Leptin
Bulgular-6 Fotoğraf 5. Ad-5 ile infekte Colo-320 hücrelerinin immünohistokimyasal boyalı preperatları Ad-5 Ad-5 1. Hafta 2. Hafta Leptin
Bulgular-7 Fotoğraf 6. Ad-8 ile infekte Colo-320 hücrelerinin immünohistokimyasal boyalı preperatları Ad-8 Ad-8 1. Hafta 2. Hafta Leptin
Bulgular-8 Fotoğraf 7. Ad-36 ile infekte Colo-320 hücrelerinde lipid vakuollerinin EM görüntüleri (1. hf) Elektron mikroskopi
Bulgular-9 Fotoğraf 8. Ad-36 ile infekte Colo-320 hücrelerinde lipid vakuollerinin EM görüntüleri (2. hf) Elektron mikroskopi
Bulgular-10 Fotoğraf 8. Ad-5 ile infekte Colo-320 hücrelerinde lipid vakuollerinin EM görüntüleri (1. hf) Elektron mikroskopi
Bulgular-11 Fotoğraf 9. Ad-5 ile infekte Colo-320 hücrelerinde lipid vakuollerinin EM görüntüleri (2. hf) Elektron mikroskopi
Bulgular-12 Fotoğraf 10. Ad-8 ile infekte Colo-320 hücrelerinde EM görüntüleri (1. hf) Elektron mikroskopi
Bulgular-13 Fotoğraf 11. Ad-8 ile infekte Colo-320 hücrelerinde EM görüntüleri (2. hf) Elektron mikroskopi
Bulgular-14 Fotoğraf 12. Ad-36, Ad-5 ve Ad-8 ile infekte Colo-320 hücrelerinde EM görüntüleri Ad-36 Ad-5 Elektron mikroskopi Ad-8 (K)
Sonuç Araştırmamız sonucunda Ad-5 ve Ad-36 serotiplerinin Colo-320 hücrelerinde lipid birikimine neden olarak adipojenik etki gösterdiği tespit edildi. Çalışmamız, ülkemizde bu alanda yapılmış ilk araştırma niteliğinde olup, sonuçlarımızın ülkemiz tıp literatürüne önemli katkılar sağlayacağını beklemekteyiz.