TRABZON YÖRESİ PROPOLİSİNİN YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ İLE FENOLİK BİLEŞİKLERİNİN BELİRLENMESİ VE ANTİOKSİDAN AKTİVİTELERİNİN TAYİNİ

TRABZON YÖRESİ PROPOLİSİNİN YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ İLE FENOLİK BİLEŞİKLERİNİN BELİRLENMESİ VE ANTİOKSİDAN AKTİVİTELERİNİN TAYİNİ Alper BEKAR YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ MART 2011 ANKARA

Alper BEKAR tarafından hazırlanan TRABZON YÖRESİ PROPOLİSİNİN YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ İLE FENOLİK BİLEŞİKLERİNİN BELİRLENMESİ VE ANTİOKSİDAN AKTİVİTELERİNİN TAYİNİ adlı bu tezin yüksek lisans tezi olarak uygun olduğunu onaylarım. Prof. Dr. Ahmet YAŞAR Tez Danışmanı, Kimya Anabilim Dalı. Bu çalışma, jürimiz tarafından oy birliği ile Kimya Anabilim Dalında Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir. Prof. Dr. Mustafa KAVUTCU Biyokimya Anabilim Dalı, G.Ü.. Prof. Dr. Ahmet YAŞAR Kimya Anabilim Dalı, G.Ü.. Doç. Dr. Elif LOĞOĞLU Kimya Anabilim Dalı, G.Ü.. Tarih: 21 / 03 / 2011 Bu tez ile G.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulu Yüksek Lisans derecesini onamıştır. Prof. Dr. Bilal TOKLU Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürü

TEZ BİLDİRİMİ Tez içindeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm. Alper BEKAR

iv TRABZON YÖRESİ PROPOLİSİNİN YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ İLE FENOLİK BİLEŞİKLERİNİN BELİRLENMESİ VE ANTİOKSİDAN AKTİVİTELERİNİN TAYİNİ (Yüksek Lisans Tezi) Alper BEKAR GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Ocak 2011 ÖZET Propolis, her türlü savunma anlamına gelen Latince bir terim olup, arıların bitkilerden topladığı reçinemsi doğal bir üründür. Arı kovanlarının korunmasında etkili olan bu doğal ürünün insan sağlığını korumada da etkili olabileceği düşünülmüştür. Bu düşünceden hareketle bilim adamları propolisin tıp ve eczacılıkta kullanılabilecek yüksek potansiyele sahip olduğunu keşfetti. Diğer arı ürünleri gibi propolisin bileşimi ve biyolojik etkinliği, arının gezindiği floraya, arının cinsine ve pek çok coğrafik özelliğe bağlı değişim göstermektedir. Çalışmamızın amacı Trabzon yöresine ait propolisin antioksidan kapasitesini belirlemek ve biyolojik aktiviteyi oluşturan fenolik bileşikleri tayin etmektir. Farklı ph özütlemelerinde 17 farklı fenolik standart madde kullanılarak yapılan ters faz yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) analizlerinde protokatekuik asit, p-oh benzoik asit, kafeik asit, p-kumarik asit, ferulik asit ve kuersetin tesbit edildi. Kafeik asit (2307,17 2662,21 µg/g) ana bileşen olarak tespit edildi. Ayrıca toplam polifenolik madde içeriği gallik asit olarak 253,40 mg GAE/g propolis olarak bulundu. FRAP yöntemi ile antioksidan aktivite tayinindeki FeSO 4 referanslığında 2162,39 µmolfeso 4 /g propolis bulundu. CUPRAC yöntemi ile antioksidan aktivite tayinindeki troloks standardına göre

v 3,92 mmol TEA/g propolis bulunurken DPPH radikalini % 50 temizleyen propolis miktarı ise DPPH radikal temizleme deneyi ile (IC 50 ) 0,025 mg/ml olarak bulundu. Analiz sonuçlarımızdan bal, polen gibi diğer arı ürünleri ve literatürde verilen diğer propolis türlerine göre oksidasyonu önleme kapasitesinin daha yüksek olduğu görüldü. Bilim Kodu : 201.1.200 Anahtar Kelimeler : Propolis, antioksidan, HPLC, fenolik bileşen. Sayfa Adedi : 37 Tez Yöneticisi : Prof. Dr. Ahmet YAŞAR

vi DETERMINATION OF PHENOLIC COMPOUNDS BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY AND ANTIOXIDANT ACTIVITYIN TRABZON REGION PROPOLIS (M.Sc. Thesis) Alper BEKAR GAZI UNIVERSITY INSTUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY Junuary 2011 ABSTRACT Propolis a Latin word meaning any kind of defence that is a natural resinous product collected by bees from the plants. This natural product is effective in prevention of bee hives also thought to be effective in protecting human health. With this idea, scientists discovered that propolis has high potential and can be used both in medicine and pharmacy. Like the other Bee products such as propolis navigates Flora composition and Biological activity, the bee varies are depending on the types of many geographic features. The purpose of this study is to determine antioxidant capacity in Trabzon Region propolis and biological activity of propolis is appointed by phenolic compounds. At different ph, phenolic compounds of 17 different substances using standard reverse phase high performance liquid chromatography (RP- HPLC) analysis protocathequic acid, p-oh benzoic acid, caffeic acid, p- coumaric acid, ferulic acid and quercetin were detected. Caffeic acid (2307.17 2662.21 µg/g) was detected as the main component. In addition, results of the total polyphenols, according to the gallic acid standard of 253.40 mggae/g of propolis, FRAP antioxidant activity determination by the method of reference, 2162.39 µmolfeso 4 /g of propolis, CUPRAC method for determination of antioxidant activity than trolox standard 3.92 mmol TEA/g of propolis. The

vii radical scavenging DPPH radical scavenging assay at 50% of the amount of cleaning propolis (IC 50 ) 0.025 mg/ml, respectively. Analysis findings of honey, pollen, propolis as well as other bee products and the other types of literature according to the oxidant of propolis of Trabzon region (antioxidant) were found to be higher than the capacity of prevention. Science Code : 201.1.20 Key Words : propolis, antioxidant, HPLC, phenolic compounds Page Number : 37 Adviser : Prof. Dr. Ahmet Yaşar

viii TEŞEKKÜR Tezimizde insan sağlığını korumak amacıyla doğal ürünlerin yerinin belirlenmesi, doğal ürünlerin kullanımının teşvik edilmesi, propolisin hem üreticiye hem tüketiciye ve bilim dünyasına önemli bir ürün olduğunu göstermemiz amaçlanmıştır. Türkiye propolis, bal ve polen üretimi bakımından dünyada ön sıralarda yer almaktadır. Türk araştırmacılar propolisin önemini kavrayıp, bu konuda çalışmalar da bulunmalı ve dünyaya da öncülük yapmalıdır. Çalışmada Trabzon yöresine ait propolis numunesinin biyolojik aktif bileşiklerinin ve de bu bileşiklerin antioksidan kapasitesinin araştırılması yapılmıştır. Sonuç olarak propolis maddesinin önemli bir antioksidan olduğu sağlık ve gıda sektöründe kullanılması gereken bir ürün olduğu ispat edilmiştir. Bilgi birikimini esirgemeyen Sayın Prof. Dr. Ahmet YAŞAR hocama, laboratuarını ve dökümanlarını kullanma imkânı tanıyan KTÜ Öğretim Üyesi Sayın Doç. Dr. Sevgi KOLAYLI hocama ve çalışmamda bana yardımcı olan KTÜ Öğretim Elemanı Sayın Arş. Gör. Hüseyin ŞAHİN e değerli katkılarından dolayı çok teşekkür ediyorum.

ix İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... iv ABSTRACT... v TEŞEKKÜR... vi İÇİNDEKİLER... vii ÇİZELGELERİN LİSTESİ... ix ŞEKİLLERİN LİSTESİ... x RESİMLERİN LİSTESİ... xii 1. GİRİŞ... 1 2. GENEL BİLGİLER... 2 2.1. Antioksidan... 2 2.2. Biyolojik Aktivite (Etkinlik)... 5 2.3. Doğal Ürünlerde Bulunan Biyolojik Aktif Maddeler... 6 2.4. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC)... 8 2.4.1. HPLC cihazı... 8 2.4.2. Hareketli faz... 9 2.4.3. Durgun faz... 10 2.5. Antioksidan Aktivite Tayin Yöntemleri... 10 2.5.1. Toplam fenolik madde tayini... 11 2.5.2. Demir indirgeme antioksidan gücü (FRAP) tayini... 11 2.5.3. CUPRAC Metodu ile antioksidan aktivite tayini... 12 2.5.4. DPPH Radikali temizleme aktivitesi tayini... 13

x Sayfa 3. DENEYSEL KISIM... 14 3.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler... 14 3.2. Kullanılan Alet ve Cihazlar... 15 3.3. Çalışmada Kullanılan Çözeltilerin Hazırlanması... 15 3.4. Propolis Numunesinin Alınması ve Saklanması... 17 3.5. Analizler İçin Numune Çözeltilerinin Hazırlanması... 17 3.6. RP-HPLC-UV Analizleri... 18 3.6.1. Standartlar ve kalibrasyon... 18 3.6.2. RP-HPLC-UV koşulları... 19 3.7. Toplam Fenolik Madde Tayini... 19 3.8. FRAP Metodu ile Antioksidan Aktivite Tayini... 20 3.9. CUPRAC Metodu ile Antioksidan Aktivite Tayini... 22 3.10. DPPH Radikal Temizleme Aktivitesi... 23 3.11. IC 50 Değerlerinin Bulunması... 23 4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA... 24 4.1. RP-HPLC-UV Analiz Sonuçları... 24 4.2. Toplam Fenolik, FRAP ve CUPRAC Sonuçları... 28 4.3. DPPH Radikali Temizleme Aktivitesi Sonuçları... 29 4.4. Sonuçlar... 30 KAYNAKLAR... 32 ÖZGEÇMİŞ... 36

xi ÇİZELGELER LİSTESİ Çizelge Sayfa Çizelge 2.1. En sık karşılaşılan serbest radikaller ve bazı özellikleri...2 Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan kimyasal maddeler ve satın alındıkları firmalar... 14 Çizelge 3.2. Çalışmada kullanılan alet ve cihazlar ve satın alındıkları firmalar... 15 Çizelge 3.3. Çalışmada Kullanılan Çözeltilerin Hazırlanışı... 16 Çizelge 3.4. Özütleme şartları ve uygulanan işlemler... 18 Çizelge 3.5. Toplam fenolik madde tayini için deney şartları... 20 Çizelge 3.6. FRAP yöntemi için deney şartları... 21 Çizelge 3.7. CUPRAC yöntemi için deney şartları... 22 Çizelge 3.8. DPPH yöntemi için deney şartları... 23 Çizelge 4.1. Üç farklı özütleme şartlarındaki RP-HPLC-UV analiz sonuçları... 24 Çizelge 4.2. Antioksidan aktivite analiz sonuçları... 29 Çizelge 4.3. Troloks Trabzon propolisinin IC 50 değerler... 30

xii ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil Sayfa Şekil 2.1. Solunum sisteminde oksijenin indirgenme mekanizmaları... 3 Şekil 2.2. Antioksidan türleri... 3 Şekil 2.3. Bazı önemli fenolik asit bileşikleri... 7 Şekil 2.4. Flavonollerin genel yapıları... 7 Şekil 2.5. HPLC cihazının bölümleri... 9 Şekil 2.6. Folin reaktifinin yapısı... 11 Şekil 2.7. Fe(III)-tripiridiltriazin kompleksinin yapısı... 12 Şekil 2.8. Bakır(II)-neokuproin kompleksinin yapısı... 12 Şekil 2.9. DPPH radikali... 13 Şekil 3.1. 280 ve 315 nm deki RP-HPLC-UV fenolik standart pikleri... 19 Şekil 3.2. Toplam polifenol tayini için kalibrasyon grafiği... 20 Şekil 3.3. FRAP tayini için kalibrasyon grafiği... 21 Şekil 4.1. RP-HPLC-UV analizleri sonucu değişik ph ortamlarında belirlenen ana bileşen. 3-(3,4-Dihidroksi- fenil)-akrilic asit (Kafeik asit)... 25 Şekil 4.2. Trabzon propolisinin nötral özütleme sonucu 280 nm deki ve 315 nm deki kromatogramları. (2) Protokatekuik asit, (3) p-oh benzoik asit, (7) Kafeik asit,(10) p-kumarik asit, (12) Ferrulik asit, (16) Kuersetin, (18) Propil paraben... 26 Şekil 4.3. Trabzon propolisinin ph 2 özütlemesi sonucu 280 nm deki ve 315 nm deki kromatogramları. (2) Protokatekuik asit, (7) Kafeik asit, (10) p-kumarik asit, (12) Ferrulik asit, (16) Kuersetin, (18) Propil paraben... 27 Şekil 4.4. Trabzon propolisinin asit hidrolizinin özütlemesi sonucu 280 nm deki ve 315 nm deki kromatogramları. (2) Protokatekuik asit, (3) p-oh benzoik asit, (7) Kafeik asit,(10) p-kumarik asit, (12) Ferrulik asit, (16) Kuersetin,(18) Propil paraben... 27

xiii Şekil Sayfa Şekil 4.5. IC 50 hesabı için Troloks standartının kalibrasyon grafiği.... 29 Şekil 4.6. IC 50 hesabı için Trabzon propolisinin kalibrasyon grafiği... 30

xiv RESİMLERİN LİSTESİ Resim Sayfa Resim 1.1. Arının arka bacağında topladığı ve kovanlardan kazınmış propolis örneği.....1

1 1. GİRİŞ Propolis, arıların bitkilerden topladığı reçinemsi madde olup kovanın savunmasında, dezenfeksiyonunda ve yalıtımında önemli rol üstlenmektedir. İçeriği toplandığı bölgenin coğrafik özelliklerine, bitki çeşitliliğine göre farklılık göstermekle birlikte genel olarak yaklaşık %50 reçine ve sebze plesenki, %30 balmumu, %10 elzem yağ asidi içeren yağlar, %5 polen ve %5 organik bileşiklerden oluşmaktadır[1,2]. Propolis üretimi için çam, kestane ve ökaliptus ağaçları önemli yer tutmaktadırlar. Kovanların bakteriyal, viral ve çeşitli etkilere karşı savunmasında rol alan propolisin pek çok biyolojik aktif özelliğe sahip olduğu bildirilmektedir. Antioksidan [3] antibakteriyal [4], antiviral ve antitümoral [5 8] gibi pek çok özelliğinden dolayı özellikle diş ve ağız sağlığı (diş macunlarında) başta olmak üzere, çeşitli enfeksiyöz hastalıklarda ve soğuk algınlıklarında (propolis pastilleri) kullanılmaktadır. Kovanlardan kazılarak elde edilen bu maddenin şimdilik fazla bir ekonomik değeri bulunmamakla birlikte değeri gün geçtikçe artmaktadır. Türkiye propolis, bal ve polen üretimi bakımından dünyada ön sıralarda yer almaktadır. Çalışmanın amacı; Trabzon yöresine ait propolis numunesinin biyolojik aktif bileşenlerinden bazı fenolik bileşiklerinin HPLC ile belirlenmesi ve antioksidan aktivitelerinin in vitro olarak tayin edilmesidir. Resim 1.1. Arının arka bacağında topladığı ve kovanlardan kazınmış propolis örneği

2 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Antioksidan Bir veya daha fazla ortaklanmamış elektron içeren atom veya moleküllere serbest radikaller denir. Günümüzde serbest radikallerin pek çok hücrede moleküler değişimlere, gen mutasyonlarına, yaşlanmaya, hücresel hasara ve dokuların yıkımına, ateroskleroz ve diyabete neden olduğu kabul edilmektedir. [9, 10] Serbest radikaller, diğer atom ya da moleküllerle kolayca reaksiyona girerler. Çünkü eşleşmemiş elektronların bir başka radikalin aynı durumdaki elektronu ile eşleşmek ya da bir elektron transferi reaksiyonuyla eşleşerek kararlı hale gelme eğilimleri vardır. Bu sebeple serbest radikaller, elektron alıcı (yükseltgen) ya da elektron verici (indirgen) özelliklere sahiptir. Çizelge 2.1. En sık karşılaşılan serbest radikaller ve bazı özellikleri Adı Simgesi Özelliği Hidrojen radikali H Bilinen en basit radikal Süperoksit radikali O 2 Oksijen metabolizmasının ilk ara ürünü Hidroksil radikali OH En toksik (reaktif) oksijen metaboliti radikali Hidrojen peroksit H 2 0 2 Reaktivitesi çok düşük, moleküler hasar yeteneği zayıf Singlet oksijen 1O 2 Yarılanma ömrü kısa, güçlü oksidatif form Perhidroksi radikali H0 2 Lipidlerde hızlı çözünerek lipit peroksidasyonunu artırmaktadır Peroksil radikali ROO Perhidroksile oranla daha zayıf etkili, lipitlere lokalize olma yeteneği Triklorometil CCI 3 CCI 4 metabolizması ürünü, karaciğerde üretilen bir radikal radikali Tiyol radikali RS Kükürtlü ve çiftlenmemiş elektron içeren türlerin genel adı Alkoksil radikali RO Organik peroksitlerin yıkımı ile üretilen oksijen metaboliti Azot monoksit NO L - argininden in vivo üretilir Azot dioksit N0 2 NO'in oksijen ile reaksiyonundan üretilir

3 Canlılarda moleküler oksijenin kullanılması, eksik indirgenmesi sonucu serbest oksijen radikalleri oluşmaktadır. Son derecede reaktif olan serbest radikaller kısa ömürlü olup hücrelere ve canlılara zarar vermektedir. Şekil 2.1. Solunum sisteminde oksijenin indirgenme mekanizmaları Antioksidanlar çok düşük konsantrasyonlar da bile oksidasyonu yavaşlatan veya durduran bileşiklerdir. Son yıllarda besin kimyası ve koruyucu tıbbın bitkisel kaynaklı doğal antioksidanlara ilgisi artmıştır. Bunun sebebi sentetik antioksidanların kanserojenik olarak düşünülmesidir [11]. Antioksidanlar Doğal antioksidanlar Yapay antioksidanlar Enzimler Enzim olmayanlar SOD Katalaz Endojen Eksojen BHT, BHA, Troloks, SOD mimikleri ve çeşitli şelat oluşturucu maddeler Glutatyon peroksidaz Glutatyon E Vitamini Glutatiyon S transferaz Serüloplazmin β-karoten Sitokrom oksidaz Bilirubin Askorbik Asit Ferritin Laktoferin Flavonoidler Ürik asit Haptoglobinler Albumin Şekil 2.2. Antioksidan türleri

4 Doğal antioksidanlar insan organizması için genellikle zararsız olup yan etkileri bulunmamaktadır. Doğal antioksidanlar canlı organizmalardaki savunma sisteminde, gıda sanayiinde ise besinlerin bozulmasını önlemek, raf ömrünü uzatmak, lipitlerin ve vitaminlerin parçalanmasını engellemek ve besin rengini korumak için kullanılan önemli katkı maddeleridir [12] Doğal antioksidanların çoğu bitkisel kaynaklıdır. Bitkilerde vitaminler (A, C, E ), polifenoller veya flavonoidler halinde bulunurlar [13]. Antioksidanların kötü huylu kolesterol (LDL) un oksidasyonunu ve DNA daki tahribatı önlemede ayrıca apoptozisi indüklemede etkisi bulunmaktadır [14]. Oksidatif hasarı azaltıcı veya geçiktirici olarak bilinen antioksidanlar iki kısımda incelenmektedirler. Endojen ve eksojen antioksidanlar. Sentezlendiği organizmada etki gösteren antioksidanlara endojen antioksidanlar adı verilir ve bunlar enzimatik ve enzimatik olmayan antioksidanlar olarak iki kısımda incelenirler. Enzimatik antioksidanlar, hücrenin çeşitli organellerinde etki gösteren süperoksitdismutaz, katalaz, glutatyon peroksidaz, glutatyon redüktaz, glukoz 6 fosfat dehidrogenaz gibi enzimlerden oluşurlar. Çeşitli metal iyonlarını bağlama, serbest radikalleri yakalama, hapsetme ve süpürme gibi etkilere sahip glutatyon, bilirubin, ferritin, seruloplazmin, ürik asit gibi enzimatik olmayan antioksidanlar da mevcuttur. Eksojen antioksidan ise daha çok bitkiler tarafından sentezlenen çeşitli vitamin ve fenolik maddeler olup dışarıdan organizmaya alınıp etkinlik göstermektedirler [15]. Antioksidan savunma mekanizmaları oldukça çeşitli olup bunlardan bazılarını şöyle özetlemek mümkündür: 1. Radikal metabolit üretiminin önlenmesi, 2. Üretilmiş radikallerin temizlenmesi (detoksifikasyon) 3. Hücre deformasyonunun onarılması 4. Sekonder radikal üreten zincir reaksiyonlarının durdurulması 5. Endojen antioksidan kapasitesinin artırılması.

5 Vücuttaki fizyolojik aktivitenin doğal ürünü olan serbest radikalleri, organizma doğuştan kazandığı çok hassas bir donanımla oksidan-antioksidan denge olarak tanımlayabilecek bir çizgide tutmaya çalışır. Oksidanlar ve antioksidanlar arasındaki bu dengenin özellikle oksidanlar lehine bozulması membran lipitleri, proteinler ve DNA gibi hücrenin önemli yaşamsal yapılarında bütünlüğün bozulmasına ve canlıda patolojik olayların gelişmesine yol açar [16]. Son yıllarda oksidatif hasara karşı koruyucu rol oynadığından diyetle alınan antioksidanlara ve dolayısıyla doğal ürünlere karşı ilgi çok artmıştır. Bal ve propolis yapısında bulundurduğu çeşitli vitamin ve polifenollerden dolayı doğal antioksidan kaynağıdır.. Yapılan çalışmalarda bal ve propoliste bulunabilen biyoaktif bileşiklerin miktarı ve türü toplandığı bölgenin coğrafik özelliklerine ve bitki çeşitliliğine bağlı olarak değişim göstermektedir [9, 10, 13, 17]. Yapılan epidemiyolojik çalışmalar meyve sebze tüketimi ve doğal ürünlerle beslenmenin kanser oluşumunu ve oksidatif hasarı önlemede etkili olduğunu göstermiştir [18]. Doğal ürünlerde bulunan biyolojik aktif bileşiklerin kanser oluşumuna yol açan oksidasyonu engellediği, serbest radikal mekanizmalı reaksiyonları engellediği çeşitli çalışmalarla gösterilmiştir [11]. 2.2. Biyolojik Aktivite (Etkinlik) Kimyasal ve biyolojik açıdan herhangi bir zararlı reaksiyon üzerinde kontrol edici etki gösteren, onu zararsızlaştıran veya yok eden etkilerin hepsine biyolojik etkinlik adı verilir. Biyolojik etkinin deneyleri in vivo ya da in vitro olarak yapılır. Fakat in vivo çalışmalar oldukça sorumluluk ve etik kurul onayı gerektiren çalışmalar olduğundan çalışmalar önce in vitro olarak yürütülür. Daha sonra in vivo çalışmalara geçilir. Biyokimyasal araştırmalarda daha çok incelenen biyolojik etkinlik deneyleri; antioksidan aktivite, serbest radikal giderici aktivite, antitümoral, antikanserojen,

6 antifungal, antibakteriyal, antiviral, antiinflematuar, antiherbisit ve antiinsektisit etkiler gibidir [19]. 2.3. Doğal Ürünlerde Bulunan Biyolojik Aktif Maddeler Bitkiler fotosentez ve çeşitli metabolik yolları kullanarak karbohidrat, protein, lipidlerden başka ikincil metabolizma ürünleri olarak adlandırılan çeşitli organik bileşikleri de üretirler. Bu bileşiklerin sinyal iletimi yanında mikroorganizma, insektisit, herbisitlere ve serbest radikallere karşı koruyucu etkileri de vardır. Bu nedenle bunlar "ikincil bitki ürünleri" veya "fitokimyasallar" diye adlandırılırlar. Bitkiler sınırsız aromatik ve alifatik madde sentezleyebilme kabiliyetine sahip olup bunların çoğu fenolik bileşikler veya bunların oksijen ile substituye olmuş halleridir. Fenoller, oksijenli aromatik bileşiklerden olup, bir veya daha fazla hidroksil (-OH) grubu taşıyan en az bir aromatik halkaya sahip organik ve kristal yapıdaki maddelerdir. Suda orta derecede, hidrofilik organik çözücülerde (alkol, eter vb.) iyi çözünür. Polifenoller, flavonoidlerin çıkış maddesidir. Bitkilerde bulunan başlıca polifenolik bileşikler basit fenoller, flavonollerden türemiş olup benzokinonlar, fenolik asitler, asetofenonlar, fenilasetil asitler, hidrosinnamik asitler, fenilpropenler, kumarinler, naftakinonlar, kromoneneler, ksantonlar stilbenler, antrakionlar, flavonoidler ve ligninlerdir. Fenolik bileşikler veya polifenoller bitkilerde en fazla bulunan yapılardan biri olup bitki âleminde 5000'den fazla fenolik yapının bilindiği belirtilmektedir [20]. Fenolik bileşikler, bir grup bileşik sınıfı olup çeşitli meyveler, sebzeler, kuruyemişler, tohumlar, çiçekler, kök ve gövde de sentezlenebilen doğal maddelerdir [21]. Fenolik bileşikler basit fenolik asitlerden ve flavonollerden oluşmaktadır. Fenolik asitler başlıca iki fenolik bileşik olan benzoik asit (1) ve sinnamik asit(2) ten türeyen bileşikler olarak karşımıza çıkarlar. Bitkilerde organik asit esterleri veya

7 glukozitleri halinde bulunan başlıca fenolik asitler; gallik asit, p-hidroksisinnamik asit, trans-sinnamik asid 3,4-dehidroksibenzoik asit, vanillik asit, syringic acid, p- kumarik asit, o- kumarik asit, kafeik asit, ferulik asit, klorogenik asit, rosmarinik asit, absisik asit şeklindedir. COOH CH 2 -CH-COOH Benzoik asit (1 ) Sinnamik asit (2) Kafeik asit Ferulik asit Kumarik asit Şekil 2.3. Bazı önemli fenolik asit bileşikleri Adı R MM Rutin Glu-Rha 610 Hiperosit Gal 464 İsokuersitrin Glu 464 Kuersetin-3-o-pentosit Pentoz 434 Kuersitrin Rha 448 Kuersetin H 302 Şekil 2.4. Flavonollerin genel yapıları

8 İster fenolik asitlerde ve istersede flavonoller veya flavonoidlerde olsun substituentlerin pozisyon ve hidroksilasyon dereceleri antioksidatif aktiviteyi belirlemede oldukça önem taşımaktadırlar [22]. 2.4. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) Kromatografi biri sabit diğeri hareketli olmak üzere iki farklı faz arasında karışımdaki maddelerin fiziksel ve kimyasal özelliklerine bağlı olarak ayrılması tekniğidir. En basit kromatografi kağıt ve ince tabaka kromatografisidir. Günümüzde yüksek performanslı sıvı kromatografisi (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) sıvı fazda çözünebilen bir kimyasal maddenin kolay ve hızlı bir şekilde bileşenlerine ayrılabildiği oldukça duyarlı bir kromatografik yöntemdir. Uygun çözücü kullanılarak çözülen örnek karışımı (analitler), yüksek basınç altında kromatografik kolondan geçirilir ve burada bileşenlerine ayrılır. Bileşenlerin birbirinden ayrılması ve bunun derecesi (resolution parameter), analitler ile sabit faz arasındaki etkileşime bağlıdır ve önemlidir. Sabit faz, kolon içerisindeki hareketsiz dolgu materyali olarak tanımlanır. Analitler ile sabit ve hareketli fazlar arasında istenilen etkileşim hareketli faz olarak kullanılan çözücülerin ve sabit fazın değiştirilmesi ile elde edilebilir [16, 23] 2.4.1. HPLC cihazı HPLC cihazı Şekil 2.3 de de görüldüğü gibi pompa, enjektör, kolon, detektör ve bilgisayar birimlerinden oluşmaktadır. Kromatografik analiz süreci, çözücüde çözünmüş örneğin sisteme enjekte edilmesi ile baslar. Bu sistemin kalbi, ayırmanın gerçekleştiği kolondur. Hareketli faz ile birlikte kolona pompalanan örnek, kolon içinde bileşenlerine ayrılmaya başlar. Her bileşenin gönderdiği sinyaller detektör tarafından kaydedilir. Detektör tarafından kaydedilen ve bilgisayara aktarılan sinyallerin tamamı kromatogram olarak adlandırılır.

9 Şekil 2.5. HPLC cihazının bölümleri 2.4.2. Hareketli faz Çözünen olarak adlandırılan maddeleri kolonda sürekleyen çözücü veya çözücü sistemidir. HPLC uygulamalarında hareketli faz (eluent) türü ve bileşimi kromatografik performansı etkileyen faktörlerden biridir. HPLC sistemlerinde birçok hareketli faz kullanılmasına rağmen, bunların bazı ortak özellikleri şunlardır: Yüksek derecede saflık Kimyasal acıdan inert olması Uygun fiyat Örneği çözebilme Detektör ile uyumluluk Düşük viskozite

10 Her bir HPLC türünde kullanılan hareketli fazlar birbirinden farklıdır. Normal-faz sıvı kromatografisinde apolar, ters-faz sıvı kromatografisinde su ve asetonitril karışımı gibi polar çözücüler hareketli faz olarak kullanılır. Büyüklükçe ayırma kromatografisinde (Size-exclusion Chromatography, SEC) ise kullanılan çözücü polimer örneğini çözebilmeli, ama dolgu materyali ile kimyasal etkileşimeye girmemelidir. Doğru mol kütlesi tayininde bu durum çok önemlidir [16, 23]. 2.4.3. Durgun faz HPLC uygulamalarındaki ayırma, yüzey etkileşimlerinden yararlanılarak yapılır ve adsorban çeşidine ve özelliklerine bağlıdır. Modern HPLC adsorbentleri geniş yüzey alanına sahip, küçük, rijit yapıdaki partiküllerdir. Temel adsorban özellikleri şunlardır.. 3 10 µm tanecik boyutu, olabildiğince eş boyutlu, ortalamanın ± % 10 una denk gelecek tanecik boyutu dağılımı. 70 300 A o gözenek boyutu. 50 250 m²/g yüzey alanı Yüzeye tutturulan ligant türüne bağlı olarak, adsorban normal faz (-OH, -NH ) veya 2 ters faz (C8, C18, fenil) hatta anyon (-NH + ) ya da katyon 3 (-COO- ) değiştirici yapıda olabilir [20]. 2.5. Antioksidan Aktivite Tayin Yöntemleri Oksidasyonu yavaşlatan veya durduran her türlü bileşik antioksidan olarak adlandırılır. Biyolojik sıvıların ve çeşitli özütlerin toplam antioksidan kapasitesinin belirlenmesine yönelik son 15 yılda pek çok metot geliştirilmiştir.

11 Bu metodların dayandığı prensip genel olarak elektron ve hidrojen atom transferine dayanır. Bitkisel veya doğal özütlerin toplam antioksidan kapasitesinin belirlenmesinde ORAC, TEAC, β-karoten, DPPH, Folin metodu, NO radikali temizleme aktivite gibi yöntemler singlet oksijen transferine, FRAP, CUPRAC, LDL- oksidasyonunun inhibisyonunu, gibi yöntemler ise hidrojen atomu transferine dayanan metodlardır. Kullanılan metodlarda ise çeşitli radikal ve metal iyonları prooksidan olarak kullanılmaktadır [24]. Doğal özütlerin antioksidan kapasitelerinin belirlenmesinde en az üç farklı numune konsantrasyonunda çalışmalar yapılır ve bulunan sonuçlar standart bir antioksidan (Trolox, BHT, kateşin, gallik asit gibi) eşdeğeri cinsinden hesaplanır. 2.5.1. Toplam fenolik madde tayini Slinkard ve Singleton (1977) tarafından ileri sürülen metoda göre numunedeki toplam çözülebilir fenolik maddeler Folin-Ciocalteu reaktifi ile renkli bir kompleks oluşturur ve kompleks 760 nm de maksimum absorbans verir [25]. Gallik asit veya kateşin fenolik standardı kullanarak hazırlanan çalışma grafiğe göre tayin yapılır. Şekil 2.6. Folin reaktifinin yapısı 2.5.2. Demir indirgeme antioksidan gücü (FRAP) tayini Metot sulu çözeltide bulunan (Fe 3+ ) ün (Fe 2+ ) ye indirgenmesine dayanır. Çözeltiye antioksidan içeren bir örneğin eklenmesi sonucu, Fe 3+ -tripiridiltriazin kompleksinin

12 (Şekil 2.4), renkli yapıdaki (Fe 2+ ) yapısına indirgenmesine dayanmaktadır. FRAP yöntemi nispeten basit bir yöntem olup, kolaylıkla standardize edilebilmektedir. FRAP yönteminin dezavantajı, özellikle bitkilerde bulunan ve önemli antioksidan aktivite gösteren glutatyonlar gibi bazı antioksidanlarla çok yavaş tepkimeye girmesidir. Ancak glutatyonlar, metot için uygun dalga boyu aralığında (593 nm) çok iyi absorbe edilemedikleri için bu dezavantaj ortadan kalkmakta ve meyve ve sebzelerde antioksidan aktivite tayininde FRAP metodu geçerli bir yöntem olarak kabul edilmektedir [26]. Şekil 2.7. Fe(III)-tripiridiltriazin kompleksinin yapısı 2.5.3. CUPRAC metodu ile antioksidan aktivite tayini Apak ve ark. (2004) tarafından geliştirilen metot bakır(ii)-neokuproin kromofor oksidan olarak kullanılır ve 450 nm de absorbans verir [27]. Kararlı bir reaktif olup ve hem hidrofilik hem de lipofilik antioksidanlara cevap verir. Şekil 2.8. Bakır(II)-neokuproin kompleksinin yapısı

13 2.5.4. DPPH radikali temizleme aktivitesi tayini DPPH (2,2- difenil-1-pikrilhidrazil) sentetik olarak üretilen bir radikal olup 517nm de maksimum absorbans oluşturur. Antioksidan madde veya maddelerle muamele edildiğinde DPPH tan kaynaklanan mor rengin şiddeti azalarak absorbansın düşüşüne sebep olmaktadır. Dolayısıyla DPPH derişimini yarıya düşüren numune içeriği µg/ml cinsinden IC 50 olarak tayin edilir. IC 50 değeri ne kadar düşükse antioksidan kapasite o kadar yüksektir. Şekil 2.9. DPPH radikali

14 3. DENEYSEL KISIM 3.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler Çalışmada kullanılan kimyasal maddeler ve satın alındıkları firma ve özellikleri Çizelge 3.1 de verilmektedir. Çalışmamda kullanılan tüm kimyasal maddeler analitik saflıkta olup değişik firmalardan temin edilmiştir. Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan kimyasal maddeler ve satın alındıkları firmalar Madde adı Satın alındığı firma Madde adı Satın alındığı firma Asetonitril Sigma Aldriich, Germany Benzoik asit Sigma Aldriich, Germany Metanol Sigma Aldriich, Germany o-kumarik asit Sigma Aldriich, Germany Etanol Sigma Aldriich, Germany cis,transabsisik Sigma Aldriich, Germany asit Asetik Asit Sigma Aldriich, Germany trans-sinnamic Sigma Aldriich, Germany asit NaOH Sigma Aldriich, Germany Rutin Sigma Aldriich, Germany HCl Sigma Aldriich, Germany Ferulik asit Sigma Aldriich, Germany Gallik asit Sigma Aldriich, Germany Kuersetin Sigma Aldriich, Germany Protokatekuik asit Sigma Aldriich, Germany Folin Reaktifi Sigma Aldriich, Germany Kateşin Sigma Aldriich, Germany Na 2 CO 3 Merck, Germany p-oh benzoik asit Sigma Aldriich, Germany TPTZ Merck, Germany Klorogenik asit Sigma Aldriich, Germany FeCl 3.6H 2 O Merck, Germany Vanilik asit Sigma Aldriich, Germany FeSO 4.7H 2 O Merck, Germany Kafeik asit Sigma Aldriich, Germany CuCl 2 Merck, Germany Siringik asit Sigma Aldriich, Germany Neocuproine Merck, Germany Epikateşin Sigma Aldriich, Germany CH 3 COONH 4 Merck, Germany p-kumarik asit Sigma Aldriich, Germany DPPH Merck, Germany

15 3.2. Kullanılan Alet ve Cihazlar Çalışmada kullanılan kimyasal aletler, cihazlar ve satın alındıkları firma ve özellikleri Çizelge 3.2 de verilmektedir. Çizelge 3.2. Çalışmada kullanılan alet ve cihazlar ve satın alındıkları firmalar Adı HPLC Spektrofotometre Ultrasonik banyo Döner buharlaştırıcı Su banyosu Rakamsal termometre Mikrofiltre (0,45µm) Etüv Manyetik karıştırıcı Yarı otomatik pipet Satın alındığı firma Shimadzu, Japan Shimadzu, Japan Elma, German IKA, China IKA, China Fluke Millex-HA Heraeus IKA, China Scorex 3.3. Çalışmada Kullanılan Çözeltilerin Hazırlanması Çalışmada kullanılan çözeltiler taze hazırlanmış olup pek çoğu buzdolabında +4 o C de muhafaza edilmiştir. Kullanılan çözeltilerin konsantrasyonları, hazırlanış şekilleri, ne amaçla kullanıldıkları Çizelge 3.3 de verilmektedir.

16 Çizelge 3.3. Çalışmada Kullanılan Çözeltilerin Hazırlanışı Çözelti adı Kullanım Amacı Hazırlanışı %80 lik Asetonitril HPLC % 2 lik Asetik Asit HPLC 0,5 N Folin Reaktifi Toplam Fenolik Madde Tayini %2 Na 2 CO 3 Toplam Fenolik Madde Tayini Gallik Asit Standartları 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 mg/ml 300 mm ph 3.6 asetat tamponu Toplam Fenolik Madde Tayini FRAP Deneyi 800 ml Asetonitril ölçülü balonda damıtık su ile 1000 ml ye tamamlandı. 20 ml Donar Asetik Asit ölçülü balonda damıtıksu ile 1000 ml ye tamamlandı. 2 N stok Folin reaktifi (4:1) saf suyla seyreltilir. 2 g Na 2 CO 3 100 ml saf suda çözülür. 3 mg gallik asit 3 ml metanolde çözülerek stok çözelti hazırlandı. Buradan metanolle gerekli seyreltmeler yapılarak 0,5 0,25 0,125 0,0625 mg/ml lik çözeltiler hazırlandı. 2,586 ml derişik (%99.5) asetik asit alınıp, hacim saf suyla 40,000 ml`ye tamamlanıp, 0.1 M NaOH (0,100 g/25 ml) ile ph=3,6`ya ayarlandı, hacim suyla 45 ml`ye tamamlanarak üzerine 105 ml etanol ilave edildi. 40 mm HCl FRAP Deneyi 82 µl der. (%37) HCl / 25 ml saf suda 10 mm TPTZ nin 40 mm HCl deki çözeltisi 20 mm FeCl 3.6H 2 O cözeltisi FRAP çalışma reaktifi FRAP Deneyi FRAP Deneyi FRAP Deneyi 1000 µm FeSO 4.7H 2 O FRAP Deneyi 0.0468 g TPTZ / 5.5 ml 40 mm HCl hazırlandı, sonra üzerine 10.5 ml etanol ilave edildi. 0.0811 g FeCl 3.6H 2 O / 5.5 ml saf suda çözülerek, üzerine 10.5 ml etanol ilave edildi. 300 mm ph 3,6 asetat tamponu: 10 mm TPTZ: 20 mm FeCl3 (10: 1: 1) karıştırıldı. 27,8 mg FeSO 4.7H 2 O damıtık suda çözülür ve 100 ml ye tamamlanır. 500, 250 ve 100 µm lık konsantrasyonlara damıtık su ile seyreltilerek kullanılır. 10 mm CuCl 2 CUPRAC Deneyi 336,25 mg CuCl 2 tartılır, 250 ml ye tamamlanır. 7,5 mm Neocuproine CUPRAC Deneyi 1 M ph 7.0 Amonyum asetat tamponu (CH 3 COONH 4 ) DPPH (2,2-difenil-1- pikrilhidrazil) Radikali CUPRAC Deneyi DPPH Deneyi 390,5 mg neokuproin etanolle 250 ml ye tamamlanır. 19,27 g amonyum asetat 150 ml kadar saf suda çözülür. ph sı asetik asit (bazikse) veya amonyak (asidikse) ile 7,0 a ayarlanır. 250 ml ye tamamlanır. 4 mg ticari DPPH 100 ml metanolde çözülür. 0,02 mg/ml Troloks DPPH Deneyi 0,1 mg Troloks 5 ml metanolde çözüldü.

17 3.4. Propolis Numunesinin Alınması ve Saklanması Çalışmada kullanılan propolis örneği Trabzon Arı Yetiştiriciler Birliği başkanlığından temin edildi. 3.5. Analizler İçin Numune Çözeltilerinin Hazırlanması Propolis numunesi yapısı itibarıyla organik polar çözücülerce kolaylıkla çözünür. Bu sebeple gerek antioksidan deneylerinde gerekse RP-HPLC-UV analizlerinde kullanılmak üzere stok metanollü hazırlandı. 5 g propolis numunesi 35 ml metanolle muamele edildi, 6 saat boyunca 60 o C de, sonikatörde, geri soğutucu altında, metanol ile ön özütlemesi yapıldı. Çözelti içerisinde var olan katı partiküller adi süzgeç kağıdıyla süzüldükten sonra eş hacimde olacak şekilde santrifüj tüplerine konuldu ve 4000 rpm de 5 dakika santrifüj edildi. Üst kısımdaki berrak çözelti tekrar adi bir süzgeç kâğıdıyla süzlülerek 50 ml lik bir balon jojeye aktarıldı ve son hacim metanolle 50 ml ye tamamlandı. İçeriğinden 5 ml alınarak antioksidan deneylerinde kullanılmak için ayrıldı. Geriye kalan 45 ml lik metanolik özütü üç eş kısma ayrıldı ve metanolleri 40 o C döner buharlaştırıcıda uçuruldu. Birinci kısımdan elde edilen kalıntı 10 ml damıtık suda çözüldü, dietileter ve etil asetat seçimli özütlemesi uygulandı. İkinci kısımdan elde edilen kalıntı bu kez 10 ml ph ı 2 ayarlı HCl çözeltisinde çözüldü ve yine dietileter ve etil asetat özütlemesi yapıldı. Her iki kısımdan elde edilen özütlerin organik fazları kendi içerisinde birleştirildi ve bu fazlar döner buharlaştırıcıda uçuruldu. Kalıntı uygun miktarda metanol ile çözülerek RP-HPLC-UV ile analiz edildi. Üçüncü kısımdan elde edilen ve 10 ml damıtık suyla çözünen kalıntıya 2 N olacak şekilde HCl ilave edildi ve iki saat boyunca 90 o C de bekletilerek asit hidrolizi yapıldı. Tekrar oda sıcaklığına getirilen çözeltiye dietileter ve etil asetat özütlemesi uygulandı ve özütler birleştirilerek çözücüleri uçuruldu. Kalıntı uygun miktarda metanol ile çözülerek RP-HPLC-UV ile analiz edildi.

18 Çizelge 3.4. Özütleme şartları ve uygulanan işlemler Özütleme Şartları Uygulanan İşlem Nötral ph Saf suda çözme ve seçimli özütleme ph 2 ph ı 2 ayarlı HCl nin sulu çözeltisinde çözme ve seçimli özütleme Asit Hidrolizi Çözeltinin son derişimi 2 N olacak şekildeki HCl çözeltisinde çözme ve seçimli özütleme 3.6. RP-HPLC-UV Analizleri 3.6.1. Standartlar ve kalibrasyon RP-HPLC-UV analizleri için analitik saflıkta 17 fenolik standart; gallik asit, protokatekuik asit (3,4-dihidroksi benzoik asit), kateşin, p-oh benzoik asit, klorogenik asit, vanilik asit, kafeik asit, siringik asit, epikateşin, p-kumarik asit, benzoik asit, o-kumarik asit, cis,trans-absisik asit, trans-sinnamic asit, rutin, ferulik asit, kuersetin ve iç standart olarak da propilparaben kullanıldı. Tüm stok çözeltiler %100 metanolde 1mg/mL derişimde hazırlandı. 17 standardın 2.5, 5, 10, 20, 25, 50 ve 100 mg/ml lik kalibrasyon örnekleri stok çözeltilerin% 30 luk metanolde seyreltilmesiyle hazırlandı. İç standart olan propil parabenin stok çözeltisinden her bir kalibrasyon çözeltisine son konsantrasyonu 10 ppm olacak şekilde eklendi. Her bir standardın konsantrasyonuna karşı, oluşan pik alanları iç standardın pik alınına bölünerek oluşan oran kullanılarak kalibrasyon eğrileri elde edildi.

19 Şekil 3.1. 280 ve 315 nm deki RP-HPLC-UV fenolik standart pikleri 3.6.2. RP-HPLC-UV koşulları RP-HPLC-UV analizleri iki dalga boyunda (280 ve 315 nm) aynı anda cevap alınabilen UV dedektör ile donanımlı Shimadzu LC-UV sisteminde yapıldı. Analizler Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 ters faz kolonu (150x4.6 mm, 5µ) kullanarak ve değişen polariteli program uygulanarak gerçekleştirildi [28]. Enjeksiyon hacmi 50 µl ye, akış hızı 1 ml.dk 1 ya ve kolon sıcaklığı 30 C ye ayarlandı. 3.7. Toplam Fenolik Madde Tayini Slinkard ve Singleton (1977) tarafından ileri sürülen metoda göre numunedeki toplam çözülebilir fenolik madde Folin-Ciocalteu reaktifi ile 760 nm de maksimum absorbans veren renkli bir kompleks oluşturur [25]. Gallik asit ile standart çalışma grafiği hazırlanarak tayin yapıldı.

20 Çizelge 3.5. Toplam fenolik madde tayini için deney şartları Tanık Deney Standart Deney Damıtık su 0,1 ml - - Standart(değişik konsantrasyonlarda) - 0,1 ml - Numune - - 0,1 ml Damıtık su 5 ml 5 ml 5 ml 0,2 N FolinReaktifi 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml Tüpler vorteks ile karıştırılır ve 3 dakika sonra %2 Na 2 CO 3 1.5 ml 1.5 ml 1.5 ml 760 nm'de tanık deneye karşı absorbans okunur Şekil 3.2. Toplam polifenol tayini için kalibrasyon grafiği Gallik Asit (mg/ml) 3.8. FRAP Metodu ile Antioksidan Aktivite Tayini FRAP metodu (Fe(III)-TPTZ-2,4,6-tris (2-pyridly)-S-triazin) kompleksinin antioksidanlar varlığında indirgenerek mavi renkli kompleks Fe(II)-TPTZ oluşması

21 ve bu kompleksin 593 nm de maksimum absorbans vermesi esasına dayanır [29]. Bu amaçla 3 ml FRAP reaktifi [300 mm ph 3,6 asetat tamponu: 10 mm TPTZ: 20 mm FeCl 3 (10: 1: 1 )] ile 100 µl numune karıştırıldı ve 4 dakika sonra 593 nm de absorbans okundu. Sonuçlar standart ile karşılaştırmalı olarak verildi. Çözücüden ve numuneden gelen renklilik absorbasını belirleme ve bunları numune absorbansından çıkarma amacıyla tanık deneyler yapıldı. Çizelge 3.6. FRAP yöntemi için deney şartları Reaktif Tanık Tüpü Numune Renk Tanık Tüpü (Metanol) Numune Renk Tanık Tüpü (su) Standart Numune FRAP Reaktifi 3 ml - - 3 ml 3 ml Numune - 100 µl 100 µl - 100 µl FeSO 4.7H 2 O (Değişen kons) - - - 100 µl - Damıtık Su - - 3 ml - - Metanol 100 µl 3 ml - - - Absorbans 0,7 0,6 y = 0,0006x - 0,0221 R 2 = 0,9994 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 200 400 600 800 1000 1200 FeSO 4.7H 2 O(mg/mL) Şekil 3.3. FRAP tayini için kalibrasyon grafiği

22 3.9. CUPRAC Metodu ile Antioksidan Aktivite Tayini Bu metotta bakır(ii)-neokuprain kromofor oksidan olarak kullanılır ve 450 nm de absorbans verir. Kararlı bir reaktif olup ve hem hidrofilik hem de lipofilik antioksidanlara cevap verir. Çizelgede verilen pipetlemeler yapıldıktan sonra deney tüpleri vorteks karıştırıcısında karıştırılır ve 60 dakika sonra tanığa karşı 450 nm de absorbanslar okundu. CUPRAC metodunda Troloks un molar absorblama katsayısı ε=1.67x10-4 L/mol.cm olduğundan Troloks için kalibrasyon eğrisi orjinden geçer. Reaksiyon karışımındaki Troloks a eşdeğer numune konsantrasyonu hesaplandı. Çözücüden ve numuneden gelen renklilik absorbasını belirleme ve bunları numune absorbansından çıkarma adına tanık (deney) denemeler yapıldı. Çizelge 3.7. CUPRAC yöntemi için deney şartları Numune Renk Tanığı Tanık met 10 mm CuCl 2 1 ml 1 ml 7,5 mm Neocuproine (alkolik) 1 ml 1 ml NH 4 Ac tamponu (1 M, ph 7.0) 1 ml 1 ml Numune x ml x ml Damıtık su (1,1-x) ml (1,1-x) ml Metanol x ml Damıtık su (4,1-x) ml Eğer bir özüt (başlangıç hacmi=v cup ) m gram materyalden hazırlanmış, analiz öncesi r kat seyreltilmiş, seyreltilmiş özütten analiz için V s hacminde alınmış ve deney sonunda renk oluşumu için V f son hacmine tamamlandıktan sonra A f değerinde absorbans gözlendiyse numunenin Troloks eşdeğeri antioksidan kapasitesi (mmol TR/g madde) aşağıdaki formül kullanılarak bulunabilir. Kapasite (mmol TR/g)= (A f / ε TR )(V f /V s )r(v cup /m)

23 3.10. DPPH Radikal Temizleme Aktivitesi DPPH radikali (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) ticari olarak satın alınabilen bir radikal olup denemelerimizde satın alınan bu radikalin 100 µm lık metanolik çözeltisi kullanıldı. Denemelerde Cuendet vd. (1997) metodu kullanıldı [30]. Elde edilen özütler değişik konsantrasyonlarda hazırlandı. Eşit hacimde (750 µl) DPPH çözeltisi ve numune çözeltileri karıştırılıp oda sıcaklığında 50 dakika bekletilir. Süre sonunda DPPH ın maksimum absorbans verdiği 517 nm de absorbanslar okundu. Tanık olarak DPPH çözeltisi ve numunenin çözüldüğü çözücü kullanıldı. Bulunan absorbanslara karşılık gelen konsantrasyonlar grafiğe geçirilerek IC 50 değerleri mg/ml cinsinden hesaplandı. Çizelge 3.8. DPPH yöntemi için deney şartları Numune Tanık Tüpü Reaktif Tanık Tüpü Numune Tüpü Propolis (Değişik konsantrasyon) 750 µl - 750 µl Metanol 750 µl - - DPPH (150 µm) - 750 µl 750 µl Çözücü - 750 µl - 50 dk. sonra 517 nm de absorbans okunur. 3.11. IC 50 Değerlerinin Bulunması IC 50 radikal miktarını yarıya indiren numune konsantrasyonudur. IC 50 değerinin bulunması için farklı konsantrasyonlarda çalışmak gerekir. Bu nedenle çalışmalarda 6 farklı konsantrasyonda ölçüm yapıldı. Numunelerin yeterli miktarda farklı konsantrasyonu hazırlanıp absorbans ölçümleri yapıldı ve absorbanslar konsantrasyona karşı grafiğe geçirildi. Maksimum absorbansın yarısına karşılık gelen

24 konsantrasyon miktarı IC 50 değerini vermektedir. IC 50 değeri mg/ml veya mm gibi birimlerle ifade edilmektedir.

25 4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA 4.1. RP-HPLC-UV Analiz Sonuçları Propolisin numunesi, yapılan analiz sonuçları nispetinde farklı yönleriyle incelendi. RP-HPLC-UV analizleri öncesinde ortam ph ını değiştirerek farklı özütleme şartları denendi. Bu sayede cihaza yüklenen standartlar nispetinde hangi bileşenin hangi ortama daha elverişli olup olmadığının analiz edilebilme durumları irdelendi. Özütleme şartları ph öncülüğünde farklılaştırıldı (Çizelge 3.4.). 17 standart öncülüğünde yapılan RP-HPLC-UV analizlerinde 6 standardın varlığı pik yorumlamalarıyla tespit edildi ve Çizelge 4.1. de analiz sonuçlarına yer verildi. Çizelge 4.1. Üç farklı özütleme şartlarındaki RP-HPLC-UV analiz sonuçları. Standartlar (µg/g numune) Nötral ph2 Asidik Kafeik Asit 2307,17 2663,35 2662,21 Ferulik Asit 710,29 786,29 1209,35 p-kumarik 863,22 991,82 1057,41 p-oh Benzoik Asit 68,64 g* 568,29 Protokatekuik Asit 17,58 21,99 166,28 Kuersetin 10,48 12,28 16,7 Gallik Asit g* g* g* Kateşin g* g* g* Klorojenik Asit g* g* g* Vanilik Asit g* g* g* Şiringik Asit g* g* g* Epikateşin g* g* g* Rutin g* g* g*

26 Çizelge 4.1.( Devam) Üç farklı özütleme şartlarındaki RP-HPLC-UV analiz sonuçları. Standartlar (µg/g numune) Nötral ph2 Asidik Benzoik Asit g* g* g* o-kumarik Asit g* g* g* Absisik Asit g* g* g* t-sinnamik Asit g* g* g* g* = Gözlenemedi. µg/g cinsinden edinilen sonuçlarda asidik hidroliz ile elde edilen özütleme ortamının diğer iki özütleme şartlarına göre daha elverişli olduğu tespit edildi. Bileşenlerin miktarının ve türlerinin ortam şartlarına göre farklı olmasının en önemli nedeni polifenollerin (fenolik bileşikler) mevcut yapısından ileri gelmektedir. Polifenoller her molekülde birden fazla fenol grubunun (karbolik asit) bulunduğu organik maddelerdir. ph etkisi gibi etkilerle bu organik bileşiklerin fonksiyonel gruplarının yer değiştirmesiyle mevcut yapısı değişebilir ve farklı bir fenolik bileşene dönüşebilir. Bu durumun ortaya koyduğu önemli avantajlar mevcuttur. Bu avantajın en baskını analiz öncesinde, Propolis içerisinde hangi bileşen, hangi ortamda maksimum oranda varlığını sürdürür? sorusuna açık bir yol gösterici niteliğindedir. Şekil 4.1. 3-(3,4-Dihidroksi- fenil)-akrilik asit (Kafeik asit). RP-HPLC-UV analizleri sonucu değişik ph ortamlarında belirlenen ana bileşen. RP-HPLC-UV ile fenolik bileşen analizinde kullanılan standartlar nispetinde çalışılan propolis numunesinin ana bileşeni olarak, kafeik asit bulunmuştur. Ana

27 bileşen olarak bulunan kafeik asidin literatüre kazandırılan diğer propolis çalışmalarıyla karşılaştırıldığında desteklendiği görülmektedir [5,31 36]. Şekil 4.2. Trabzon propolisinin nötral özütleme sonucu 280 nm deki ve 315 nm deki kromatogramları. (2) Protokatekuik asit, (3) p-oh benzoik asit, (7) Kafeik asit,(10) p-kumarik asit, (12) Ferrulik asit, (16) Kuersetin,(18) Propil paraben Şekil 4.3. Trabzon propolisinin ph 2 özütlemesi sonucu 280 nm deki ve 315 nm deki kromatogramları. (2) Protokatekuik asit, (7) Kafeik asit,(10) p-kumarik asit, (12) Ferrulik asit, (16) Kuersetin, (18) Propil paraben

28 Şekil 4.4. Trabzon propolisinin asit hidrolizinin özütlemesi sonucu 280 nm deki ve 315 nm deki kromatogramları. (2) Protokatekuik asit, (3) p-oh benzoik asit, (7) Kafeik asit,(10) p-kumarik asit, (12) Ferrulik asit, (16) Kuersetin,(18) Propil paraben 4.2. Toplam Fenolik Bileşenlerin, FRAP ve CUPRAC Sonuçları Trabzon propolisinin antioksidan analiz sonuçlarına bakıldığında ve literatürle karşılaştırıldığında yüksek oranda antioksidan özelliğe sahip olduğu tespit edildi. Bu yaklaşım nazarıyla toplam polifenol içeriği gallik asit eşdeğeri öncülüğünde 253,40 mg/g propolis bulundu. Bu sonucun Şahin ve ark. nın (2010) yürüttüğü ve 267,69 mg/g propolis olarak bulduğu çalışmayla desteklenmiştir [37]. Diğer antioksidan deneylerle de FRAP (Fe 3+ indirgeme antioksidan kapasite) metodu ile antioksidan aktivite tayinindeki FeSO 4 referanslığında 2162,39 µmolfeso 4 / g propolis, CUPRAC metodu ile antioksidan aktivite tayinindeki troloks referanslığındaki 3,92 mmol Troloks Eşdeğeri/g propolis sonucuna erişildi. DPPH radikali temizleme antioksidan deneyiyle de yapılan analizler pekiştirildi. Aktivite ölçümünde referans madde olarak troloks kullanıldı.

29 Diğer antioksidan deneylerin değerlendirilmesinden farklı olan bu yöntemde IC 50 verileri kullanıldı. IC 50 değeri ortamdaki radikalik etkiyi yarıya indirgeyen numune derişimidir. Bu derişim değeri ne denli düşük ise etki o denli kuvvetlidir. Bu yaklaşım öncülüğünde troloksun 0,00447 mg/ml IC 50 değerine karşın Trabzon propolisinin 0,025 mg/ml IC 50 değeri bulundu. Özellikle bulunan IC 50 değeri üzerinden bal ürünü baz alınarak literatürle karşılaştırıldığında, propolisin biyoaktivitedeki etkinliğinin derecesi ön plana çıkmaktadır. Ulusoy ve ark. (2010) çalıştığı 9 adet kestane balı örneklemlerinde 0,08 0,3 mg/ml IC 50, Sangsrichan, S. ve Wanson W. (2008) incelediği 10 adet farklı bal örneklerinde de 60 110 mg/ml IC 50 değeri bulunmuştur [38-39]. Bu sonuçlar ile Trabzon propolisinin IC 50 değeri karşılaştırıldığında, propolisin bala göre daha biyoaktif olduğu yorumu yapılabilmektedir. Ayrıca propolisin kendisi arasında karşılaştırılması yapılırsa Li-Chang L. ve ark. (2003) tarafından Tayvan nın farklı bölgelerinde, Çin ve Brazilyadan edinilen propolislerde 0,02 0,1 mg/ml IC 50 değerleri bulunmuştur [40]. Varolan bu değerlerin Trabzon propolisindeki IC 50 değerini desteklemekte olduğu görülmektedir. Çizelge 4.2. Antioksidan aktivite analiz sonuçları CUPRAC Toplam Fenolik Bileşen FRAP Tayinler (mmol Troloks (mg GallikAsit/g propolis ) (µmolfeso 4 / g propolis) Eşdeğeri/g propolis ) Sonuç 253,40 2162,39 3,92

30 4.3. DPPH Radikali Temizleme Aktivitesi Sonuçları Absorbans 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,004 0,008 0,012 0,016 0,02 Derişim (mg/ml) Şekil 4.5. IC 50 hesabı için Troloks standardının kalibrasyon grafiği. Absorbans 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 Derişim (mg/ml) Şekil 4.6. IC 50 hesabı için Trabzon propolisinin kalibrasyon grafiği. Çizelge 4.3. Troloks Trabzon propolisinin IC 50 değerleri Numuneler IC 50 (mg/ml) Trolox (Standart) 0,00447 Trabzon propolis 0,025

31 4.4. Sonuçlar 1. Trabzon propolisinin RP-HPLC-UV ile fenolik bileşen analizinde 17 fenolik standart analiz edilmiş ve 6 standardın varlığı tespit edilmiştir. Bu standartlar sırasıyla protokatekuik asit, p-oh benzoik asit, kafeik asit, p-kumarik asit, ferulik asit ve kuersetindir. 2. RP-HPLC-UV ile tespit edilemeyen fenolik bileşenler ise; gallik asit, kateşin, klorojenik asit, vanilik asit, şiringik asit, epikateşin, rutin, benzoik asit, o-kumarik asit, absisik asit ve t-sinnamik asittir. 3. Belirlenen 6 standarttan p-oh benzoik asit haricindeki diğer 5 standart nötral, ph 2 ve asidik ortam diye isimlendirilen özütleme ortamında gözlenlenirken, p-oh benzoik asit nötral özütleme ortamında gözlemlenemedi. 4. Asidik hidrolizin diğer iki özütleme şartlarına göre daha elverişli olduğu tespit edildi. 5. Asidik hidrolizli özütleme ortamında protokatekuik asit 166,28 µg/g, p-oh benzoik asit 568,29 µg/g, p-kumarik asit 1057,41 µg/g, ferulik asit 1209,35 µg/g ve kuersetin 16,7 µg/g sonuçlarıyla maksimum oranlara ulaştı. 6. Toplam bazda incelendiğinde ortaya çıkan derişim hesaplarına göre ana bileşenin kafeik asit (2307,17 2662,21 µg/g) olduğu belirlendi. 7. p-kumarik asit 863,22 1057,41 µg/g ve ferulik asit 710,29 1209,35 µg/g olarak bulunurken diğerlerine nispeten daha az oranda olan kuersetinin de 10,48 16,7 µg/g olarak varlığı tespit edildi. 8. Toplam polifenol içeriği gallik asit eşdeğeri öncülüğünde 253,40 mg/g propolis olarak bulundu. 9. FRAP (Fe 3+ indirgeme antioksidan kapasite) metodu ile antioksidan aktivite tayinindeki FeSO 4 referanslığında 2162,39 µmolfeso 4 / g propolis olarak bulundu. 10. CUPRAC metodu ile antioksidan aktivite tayinindeki troloks referanslığındaki 3,92 mmol Troloks Eşdeğeri/g propolis sonucuna erişildi. 11. DPPH radikal temizleme aktivitesi deneyinde troloks standardıyla propolis esktraksiyon numunesinin IC 50 değerleri karşılaştırıldı. Troloksun 0,00447 mg/ml IC 50 değerine karşın Trabzon propolisinin 0,025 mg/ml IC 50 değeri bulundu.

32 12. Sonuç olarak Trabzon yöresine ait propolisin fenolik maddelerce zengin ve yüksek antioksidan kapasiteye sahip olduğu belirlendi.

33 KAYNAKLAR 1. Cisarino, L., Pisati, A. ve Fasani, F. Contact dermatitis from propolis. Contact Dermatitis, 16:110 111(1987). 2. Chemid. A chemical database sponsored by the National Library Of Medicine. Bethesda, ND. (1996). 3. Pietta, P.G., Gardana, C., Pietta, A. M. Analytical methods for quality control pf propolis. Fitoterapia, 73 (1): 7 20 (2002). 4. Caravaca, G. A. M., Romero, G. M., Román, A. D., Carretero, S. A., Gutiérrez, F. A. Advances in the analysis of phenolic compounds in products derived from bees. J Pharmaceut. Biomed., 41 (4): 1220-1234 (2006). 5. Ahn, R., Kumazawa, S., Usui, Y., Nakamura, J., Matsuka, M, Zhu, F., Nakayama, T. Antioxidant activity and constituents of propolis collected in various areas of China. Food Chemistry, 101:1383 1392 (2007). 6. Marquele, F.D., Oliveira, A.R.M., Bonato, P.S., Lara, M., Fonseca, M.J.V. Propolis extracts release evaluation from topical formulation by chemiluminescence and HPLC. J. Pharmaceut. Biomed., 41: 461-458 (2006). 7. Alıyazıcıoglu, Y., Deger, O., Oval, E., Barlak, Y., Hosver, I., Tekelıoglu, Y. Effect of Turkish pollen and propolis extracts on respiratory burst for K-562 cell lines. Int. Immunopharm., 5:1652-1657 (2005). 8. Sarmento Silva, T.M., Amorim Camara, C., da Silva Lins, A.C., Barbosa-Filho, J.M., da Silva, E.M.S., Magalha es Freitas, B., de Assis Ribeiro dos Santos, F. Chemical composition and free radical scavenging activity of polen loads from stingless bee Melipona subnitida Ducke. Journal of Food Composition and Analysis, 19: 507 511 (2006). 9. Storz, G., Imlay, J. A. Oxidative stress. Current Opinion in Microbiology, 2: 188-194 (1999). 10. Halliwell, B., Gutteridge J.M., Cross, E.C. Free radical, antioxidants, and human disease: Where are we now? Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 119 (6): 598 620 (1992). 11. Ito, N., Hirosa, M., Fukushima, H., Isuda, T., Shirai, T., & Tatematsu, M. Studies on antioxidants and their carcinogenic and modifiying effects on chemical carcinogens. Food and ChemicalToxicology, 24: 1071 1082 (1986).