35 Uludag Univ. J. Fac. Vet. Med. 34 (2015), 1,2: 35-40 Salmonella Türlerinin Klasik Virulans Faktörleri Zafer ATA 1 Ece ÇETİN 2 Geliş Tarihi: 17-02-2015 Kabul Tarihi: 30-04-2015 Özet: Gıda kaynaklı bakteriyel patojenler içerisinde yer alan Salmonella, kontamine gıdaların tüketilmesi sonucunda insanlarda gıda zehirlenmeleri ve ciddi barsak infeksiyonlarının gelişmesine yol açabilir. Bazı hastalar, barsak rahatsızlığını tedavisiz atlatabilir. Ancak, bazı hastalarda antibiyotik tedavisi gecikirse Salmonella enfeksiyonu sonucu ölüm gözlenmektedir. Gelişen Salmonella infeksiyonu bakterinin kendisi ve konakçının durumu tarafından belirlenir. Konakçının durumunu çevresel faktörler, genetik faktörler ve yaş belirler. Bakterilerin durumu virulans faktörleri tarafından belirlenir. Bu derlemede, günümüzdeki Salmonella spp. ler arasındaki sahip oldukları virulans faktörler (virulans karakterleri kodlayan genler) hakkında bilgiler sunulmaktadır. Bununla birlikte, genel olarak; Salmonella infeksiyonlarının patogenezinde rol oynayan çeşitli virulans faktörlerin katkısı kısaca ele alınmıştır. Anahtar Sözcükler: Salmonella, Virulans faktör, Patojenite adaları. The Distribution of Classical Virulence Factors Among Salmonella Species Abstract: Salmonella located within foodborne bacterial pathogens may cause food poisoning and serious intestinal infections as the result of contaminated foods in humans. Some patients may overcome this intestinal infection without antibiotic treatment. Neverthless, if treatment is delayed, mortality is observed in some patients as the result of the Salmonella infection. General progress of this infection influenced by several factors such as bacteria specifications and general conditions of the host. Conditions of the host are usually changes by as known enviromental factors, genetics and age of the host. The goal of this review is to inform about virulence factors (genes codes virulence specifications) of the present Salmonella spp. s. Additionaly, effects of virulence factors involved in salmonella infections has been studied shortly. Key Words: Salmonella, Virulence factor, Pathogenicity islands. 1 2 Dr., Askeri Veteriner Okulu ve Eğitim Merkezi Komutanlığı, Gemlik, Bursa, Türkiye, atazafervet@hotmail.com Araş.Gör., Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Besin Hijyeni ve Teknolojisi Anabilim Dalı, Görükle Kampusu, 16059, Bursa, Türkiye.
36 Giriş Bir Salmonella infeksiyonunun neticesini bakterinin kendisi ve konakçının durumu belirler. Konakçının durumunu çevresel faktörler, genetik faktörler ve yaş belirlerken, bakterilerin durumu virulans faktörleri tarafından belirlenir. Ancak, günümüzde hala virulans faktör veya virulans genlerinin sınırları tam anlamıyla tanımlanamamıştır 15. Örneğin virulans plazmidlerinin virulans faktör olup olmadığı hakkındaki tartışmalar hala sürmektedir. Bunun sebebi ise, virulans genlerin (virulans faktörler) sadece virulans proteinleri kodlamaktan sorumlu olmaları, bununla birlikte konakçı ve bakteri arasındaki etkileşime direkt olarak etkilerinin olmayışıdır 1. Salmonella cinsi bakterilerin virulans faktörlerinin tümü, muhtemelen patojenitelerinin peşinden moleküler anlamda mekanizmasındaki değişiklik ile hastalık yapıcı bilgisini kazanmaya devam ederek gelişmektedir. Örneğin; Salmonella vakuollerinden replikasyon ve canlılık proteinlerini içeren effektör proteinler günümüzde virulans fatörler olarak karakterize edilmektedir. Virulans plazmidleri, toksinler, fimbria ve flagella gibi diğer virulans faktörleri son yıllardaki çalışmalarda ortaya konulmuş ve bu nedenle de klasik virulans faktörler olarak açıklanmıştır 1. Bu derlemede, güncel Salmonella spp. lerin virulans faktörleri ve bu faktörlerden ortaya çıkan bilgiler moleküler düzeyde sunulmaktadır. Gerekli görülen yerlerde, virulans faktörlerin aynı grup üyeleri arasında etki şekli açısından ayırım yapılmasına çalışılmıştır. Ayrıca, genel olarak; Salmonella infeksiyonlarının patogenezinde rol oynayan çeşitli virulans faktörlerin katkısı kısaca ele alınmıştır. Patojenite Adaları Salmonella ların virulans genlerinin çoğunluğu Salmonella patojenite adaları (SPA) olarak adlandırılan kromozomun üzerindeki bölgelere dağılmış olarak bulunmaktadır (Şekil 1) 8,11. Bu gen topluluklarının horizantal gen transferi vasıtasıyla Salmonella cinsi olmayan diğer cinslerden edinilmiş olduğu düşünülmektedir. Bu hipotez sıklıkla patojenite adalarının uçlarındaki transpozon insersiyon sekansların veya bakteriyofaj kalıntıları gibi rezidüel genomların bu adalarda bulunan farklı GC içeriği ile karışması esasına dayanmaktadır 8. Şekil 1. nın virulans lokuslarının genetik haritası. Gen adalarının spesifik trna ları veya toparlayıcı genlerin pozisyonları kısmi olarak kromozomlar üzerinde tarif edilmiştir. Sadece enterik ateş ile ilgili Salmonella serovarlarında bulunan kesik çizgili oklar yoluyla haritaya yerleştirilen serovar Typhi gen adaları olan SPA6-10 da kapsayan tüm 10 salmonella patojenite adaları çemberde resimlenmiştir. Profaj genomları da haritada bulunmaktadır ve lolipop şeklinde gösterilmiştir. Adhezin/fimbrial operonlar kare olarak şematize edilmiştir 5. Transpozon insersiyon sekansların ve bakteriyofaj kalıntılarının spesifik bir fenotipik virulans özelliği için gerekli olan genlerle ilişkilendirilen bir çok fonksiyonu içermesi nedeniyle, Salmonella patojenite adalarının oluşması, söz konusu transfer esnasında Salmonella ların patojenitelerinde ani bir artışa yol açabilmektedir 8. Salmonella enterica da bulunan gen adalarının (patojenite adaları) çoğu patojenite için esansiyel olan önemli fonksiyonları kodlar ve bu lokuslar tür ve cinslerde tanımlanmıştır (Tablo 1) 5. Günümüze kadar Salmonella ların kromozomları üzerinde beş salmonella patojenite adası identifiye edilmiştir (Şekil 2). Bu patojenite adaları sırasıyla sentizom 63, 31, 82, 92 ve 25 de lokalize olmuşlardır 11. Salmonella patojenite adası 1 üzerinde tip III sekresyon sistemini
37 kodlayan DNA nın 40 kilobase (kb) lik bölgesi bulunmaktadır. Tip III bakteriyel transport sistemi; hücreler tarafından bakterilerin içeri alınmasına yol açan hedef hücre aktinine bağlanan SopE ve SptP bakteriyel proteinleri kodlamaktadır 9. Şekil 2. Virulans genlerin genetik organizasyonu SPA1-5 ve virulans plazmidi kapsar bir şekilde sunulmuştur. Operonlar içinde organizasyonları ve bu genlerin transkripsiyon yönleriyle operonlarını ayıran oklarla birlikte gösterilmiştir. Genlerin bilinen fonksiyonları şeklin altındaki anahtarda tarif edilmiş olan şablonlar ve gölgelendirmeler ile bu tabloda açıklanmıştır. Bu genlerin bilinmeyen fonksiyonları beyaz kutularda belirtilmiştir. Tip III effektörler tip III sekresyon sistemi yoluyla konak hücre sitoplazması içine giren bakteriyel proteinlerdir 5. Sop B invazyon proteinlerini gönderir. Bu proteinler sırasıyla istilacı patojenlerin etrafında microflamentlerin içinde konak hücre aktininin polimerizasyonuna sebep olurlar (Şekil 3) 5. Tablo 1. Salmonella gen adaları, profaj ve virulans plazmid 5 Lokus Regülasyon Fonksiyon(lar) Dağılım rfa/waa waah Distal uçta LPS sentezi; ; serumda canlı kalma S. bongori rfb/wba O-antijeni biyosentezi; a ; serumda canlı kalma S. bongori a SPA1 phop/q; Hücre invazyonu (enteritis) ; ompr/envz; sira S. bongori SPA2 phop/q; Makrofajlarda canlı kalma; ompr/envz; rpos hücre invazyonu SPA3 SPA4 SPA5 SPA6 SPA7 SPA8 SPA9 SPA10 SGA1 Virulans Plazmid waah?; sira sira rpos Makrofajlarda canlı kalma Makrofajlarda canlı kalma?; memelilerde kolonizasyon Akışkan sekresyon (enteritis) Fimbrial operonlar safa-d, tcsa-r Vi antijeni; Tip IV pili Bakteriosin immunite Tip I sekresyon; RTX homologu Fimbrial operon sefa-r DT104 MDR lokus Retiküloendoteliyal sistem içerisinde proliferasyon b ; S. bongori b ; S. bongori ateş serovars c ateş serovars d ateş serovars ateş serovars ateş serovars serovars c serovars e a Operonların genetik kompozisyonunda dağılımı b Salmonella serovarları arasındaki lokus içerisinde genetik çeşitlilik c serovar Choleraesuis de bulunma d serovar Typhi, Paratyphi ve Dublin de bulunma e Salmonella serovarları arasında değişken dağılım Salmonella spp. de invazyon lokusunun (inv) önemi, invazyon mekanizmasında özel bir role sahip olmasıdır. Çünkü, Ca +2 nın içeri alınması ile konak hücre sitoplazmalarında anatomik yapının yeniden yapılandırılması, M hücreleri ve enterositlerde iki önemli değişikliği tetiklemektedir. Adheze Salmonella lar aktin polimerizasyonunu etkileyen önemli bir sinyal ile memeli hücreleri içine luminal Ca +2 nın alınmasını gerçekleştirir. Salmonella lar ökaryotik hücrelere Sip A, Sip B, Sip C, Spt P, Sop E2 ve Şekil 3. Konak epitel hücrelerine Salmonella ların invazyon mekanizması 5. İkinci tip III sekresyon sistemini 40 kb lik salmonella patojenite adası 2 deki lokus kodlamakta ve hem epitelyum hücrelerinde hem
38 de makrofajların içinde bakterilerin canlı kalması için Salmonella lar bu sisteme gereksinim duymaktadır. 17 kb lik bölgede aralarında mgt C geninin ve on kadar okunan sekansın var olduğu salmonella patojenite adası 3 bulunmaktadır. Salmonella spp. lerde bu bölgede bulunan spesifik gen indirekt olarak fareler için virulentdir 1. Salmonella patojenite adası 4 makrofajlar içinde canlı kalmayı sağlar, 25 kb lik bölgede bulunur ve toksin sekresyonunu gerçekleştiren tip I sekresyon sistemini desteklediği varsayılmaktadır 16. 11 kb lik salmonella patojenite adası 5 in sekans analizi, bir effektör proteini kodlayan gen olan SopB genini de kapsadığı bilinen altı genin varlığını ortaya koymuştur 17. Salmonella patojenite adası 5 in diareye sebep olan patojenite yeteneğinden sorumlu olduğu ortaya konulmuştur. Bu lokus Salmonella lar arasında oldukça iyi muhafaza edilmiştir. Bakterinin sistemik infeksiyona sebep olması için gerekli olmayan ancak, inflamasyonel yanıta ve intestinal sekresyona neden olması için esansiyel olan pip A, -B, -C, -D ve sop B yi içeren birçok gen identifiye edilmiştir 5. Salmonella Typhi CT18 suşunun tüm genomik sekansları incelenmiş ve en az beş farklı bölgenin salmonella patojenite adası olarak adlandırıldığı bildirilmiştir 1. Salmonella patojenite adası 6 olarak adlandırılan bu bölgelerden biri tcf ve saf fimbria genlerini kodlar. Salmonella patojenite adası 7; Vi antijeninin biyosentetik genlerini ve tip IV fimbria genlerini kodlayan, değişken uzunluk ve mozaik yapıya sahip bir ada olarak tanımlanmıştır 1,12. 33 Salmonella suşu üzerine yapılan incelemede, sadece sınırlı sayıda serotipin S. Typhi CT18 suşunda bulunan salmonella patojenite adası 7 nin insersiyon bölgesini içerdiği ortaya konulmuştur 12. 6.8 kb uzunluğundaki salmonella patojenite adası 8 bakteriosin rezistans genini ekspre etmektedir. Salmonella patojenite adası 9 (16 kb) tip I sekresyon sistemini ve tek bir toksin benzeri bir proteini kodlamasına karşın, salmonella patojenite adası 10 (33 kb) ise sef fimbria genini kodlamaktadır 1. Bunlara ek olarak; farklı G+C içeriğine sahip çok sayıda daha küçük salmonella patojenite adaları Salmonella kromozomları içinde bulunmaktadır. Bu gen dizinlerinin bulunduğu bölge, makrofajlarda replikasyon ve canlılığı devam ettirme yeteneğinde olan Pag C ve msg A genlerinin bulunduğu bölgeye benzer ve sadece bir kaç virulans gen içerdiğinden dolayı küçük patojenite adası olarak adlandırılmaktadır 1. Virulans Faktörler Virulans Plazmidler Salmonella nın altı serotipinde (serotip Abortusovis, Choleraesuis, Dublin, Enteritidis, Gallinarum/Pullorum, Typhimurium) en az bir virulans plazmid bulunduğu bildirilmiştir. Buna ek olarak, bu serotiplerin tüm izolatları virulans plazmidleri taşımaktadır 2,13. Plazmidi bulunan Salmonella Enteritidis, plazmidi bulunmayan Salmonella Dublin suşlarında fareler için virulans özellik oluşturabilme yeteneğindedir. Benzer olarak Salmonella Gallinarum/Pullorum un virulans plazmidi Salmonella Typhimurium a fareler için virulans özelliğini yeniden kazandırabilmektedir. Salmonella Typhimurium un virulans plazmidi Salmonella Enteritidis e aktarılabilmektedir; ancak, Salmonella Typhimurium un virulans plazmidi Salmonella Dublin e aktarılsa bile virulans özellik kazandıramamaktadır 1. Salmonella nın bütün plazmidleri 7.8 kb spv lokusunda bulunmaktadır. Bu lokus da spv RABCD olarak adlandırılan beş gen bulunmaktadır. Spv genlerinin ekspresyonu intraselüler Salmonell spp. lerin artmasında önemli bir rol oynamaktadır 13. Toksinler Salmonella spp. ler hem endotoksin hem de ekzotoksin üretirler. Salmonella ların lipopolisakkarit (LPS) membranın dışında bulunan lipid tabakasındaki endotoksin hem in vivo hem de in vitro ortamlarda ortaya çıkmaktadır. Ekzotoksinler iki tip olarak alt gruba bölünebilirler: sitotoksin ve enterotoksin. Salmonella ekzotoksinleri hakkındaki bilgiler, özellikle, etki şekillerine ilişkin olarak oldukça sınırlıdır. Sitotoksinler (vero toksin) memeli hücrelerini öldürme yetenekleri ile tanınmaktadırlar 1. Salmonella patojenite adası 1 lokusu Salmonella nın enteropatojenitesinde, toksinlerinin ekspire edildiği bölge olması nedeniyle önemli bir faktör olarak ortaya çıkmaktadır 5. Fimbria Fimbria (pilus) 2-8 nm genişliğinde ve 0.5-10 µm uzunluğunda temel olarak fibrin olarak adlandırılan proteinlerin tekrarlayan helikal bir şekilde düzenlenmesiyle oluşan flamentöz yüzeysel yapılardır 4. Enterobacteriaceae ailesinde bulunan üyelerinde fimbria nın oluşturulması için; nükleus a bağlı yol, tip IV fimbria
39 yolu olarak adlandırılan yol ve proteinlerin bağlanmasını kolaylaştıran yol olmak üzere üç yol tanımlanmıştır 7. Salmonellae nın fimbriaları hedef hücrelerinde kolonizasyona neden olduğu gösterilmiş olmasına rağmen 4, Salmonella patogenezinde fimbria nın rolü henüz tam olarak anlaşılamamıştır 14. Flagella Flagella, birçok Salmonella da bulunan ve motilite özelliğini kazandıran bir organeldir. Günümüzde, Salmonella nın flagellar gen sistemi tam anlamıyla anlaşılamamıştır. Ancak flagellasız serotiplerin flagellasının ve hareketinin bulunmayışı sınırlı moleküler bilgiyle açıklanabilmektedir. Flagellaya sahip olan Salmonella ların çoğunun faydalandığı flagellin varyasyonu, konakçı savunma sisteminden kaçmayla ilgidir 1. Salmonella spp. den kaynaklanan infeksiyonlarda, flagellanın rotasyon yönüyle ve flagella vasıtasıyla sağlanan hareketteki flagellanın rolü, Salmonella spp. lerin patogenezinde, ökaryot hücrelere invazyonda ve onların adhezyonunda varsayılan rolleri hakkında, farklı sonuçlara yol açtığını ileri süren birçok çalışma bulunmaktadır 6,10. Sonuç Virulans plazmidlerin, toksinlerin ve fimbriaların dağılımı ve varlığı üzerine yapılmış olan çalışmaların birçoğu; hibridizasyon denemelerine dayanmaktadır. Ancak bu denemelere dayalı belirli virulans faktörlerin varlığını göstermek birbiri ile çelişen sonuçların çıkmasına yol açabilmektedir. Ortaya çıkan bu sonuçlar, genler tarafından kodlanan virulans faktörlerin ekspresyonunun hangi faktörlere bağlı olduğu hakkında yeterli bilgi verememektedir 1. Üstünde durulması gereken diğer bir faktör de belirli virulans özelliklerden sorumlu olan serotipler arasındaki virulans faktörlerin identifikasyonunda karşılaşılan zorlukların gözlenmesidir. Örnek olarak, Salmonella Pullorum / Gallinarum un ve Salmonella Abortusovis in konakçı adaptasyonunun, virulans plazmidleri vasıtasıyla meydana geldiğinin düşünülmesidir 3,13. Ancak, Salmonella Typhi için genetik degradasyonun insanlara tam anlamıyla adaptasyondan sonra virulans özellik kazandığı kabul edilmiştir 1. Belirli bir virulans faktörün etki şeklinin değerlendirilmesinde, Salmonella nın aynı suşu kullanıldığı zaman bile, farklı araştırmacılar tarafından gerçekleştirilmiş araştırmalar arasında deneysel düzenlerdeki değişiklikler nedeniyle de farklı sonuçlarla karşılaşılmaktadır. Örneğin, kullanılan ökaryotik hücrelerin veya bakterilerin üreme koşullarındaki farklılıklar çelişkili sonuçların çıkmasına yol açabilmektedir 1,13. Diğer taraftan, bu farklı deneysel koşullar nedeniyle ortaya çıkan çelişkili sonuçların yol açtığı bulgular, saptanan bir infeksiyonda Salmonella spp. lerin esnekliğini de göstermektedir 1. Kaynaklar 1. Alphons, J.A.M., JAAP, E., 2005. Distribution of classic virulence factors among Salmonella spp. FEMS Microbiol and Med. Immunol., 44: 251-259. 2. Chiu, C.H., Ou, J.T., 1996. Rapid identification of Salmonella serovars in feces by specific detection of virulence genes, inva and spv C, by an enrichment broth culture multiplex PCR combination assay. J. Clin. Microbiol., 34: 2619 2622. 3. Chu, C., Hong, S.F., Tsai, C., Lın, W.S., Lıu, T.P., Ou, J.T., 1999. Comparative physical and genetic maps of the virulence plasmids of Salmonella enterica serovars Typhimurium, Enteritidis, Choleraesuis, and Dublin. Infect. Immun., 67: 2611 2614. 4. Collinson, S.K., Lıu, S.L., Clouthıer, S.C., Banser, P.A., Doran, J.L., Sanderson, K.E., Kay, W.W., 1996. The location of four fimbrinencoding genes, agfa, fima, sefa and sefd, on the Salmonella enteritidis and/or S.typhimurium XbaI BlnI genomic restriction maps. Gene, 169: 75 80. 5. D aoust, J-Y., Maurer, J.J., 2007. Salmonella species. In: Food Microbiology:Fundamentals and Frontiers, Ed: Doyle, M.P., Beuchat, L.R. Asm press, p: 187-236. 6. Dıbb-Fuller, M.P., Allen-Vercoe, E., Thorns, C.J., Woodward, M.J., 1999. Fimbriae and flagella-mediated association with and invasion of cultured epithelial cells by Salmonella enteritidis. Microbiology, 145: 1023 1031. 7. Fernandez, L.A., Berenuer, J., 2000. Secretion and assembly of regular surface structures in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiol. Rev., 24: 21 44. 8. Groısman, E.A., Ochman, H., 1996. Pathogenicity islands: bacterial evolution in quantum leaps. Cell., 87: 791 794. 9. Hayward, R.D., Koronakıs, V., 2002. Direct modulation of the host cell cytoskeleton by Salmonella actin-binding proteins. Trends Cell Biol., 12: 15 20. 10. Lockman, H.A., Curtıss III, R., 1992. Virulence of non-type 1-fimbriated and nonfimbriated and
40 nonflagellated Salmonella typhimurium in murine typhoid fever. Infect. Immun. 60: 491 496. 11. Marcus, S.L., Brumell, J.H., Pfeıfer, C.G., Fınlay, B.B., 2000. Salmonella pathogenicity islands: big virulence in small packages. Microbes Infect., 2: 145 156. 12. Pıckard, D., Waın, J., Baker, S., Lıne, A., Chohan, S., Fookes, M., Barron, A., Gaora, P.O., Chabalgoıty, J.A., Thanky, N., Scholes, C., Thomson, N., Quaıl, M., Parkhıll, J. ve Dougan, G., 2003. Composition, acquisition, and distribution of the Vi exopolysaccharide-encoding Salmonella enterica Pathogenicity Island SPI-7. J. Bacteriol., 185: 5055 5065. 13. Rotger, R., Casadesus, J., 1999. The virulence plasmid of Salmonella. Int. Microbiol., 2: 177 184. 14. Van der velden, A.W.M., BäumleR, A.J., Tsolıs, R.M., Heffron, F., 1998. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infect. Immun., 66: 2803 2808. 15. Wassenaar, T.M., Gaastra, W., 2001. Bacterial virulence: can we draw the line?. Fems Microbiol. Lett., 201: 1 7. 16. Wong, K.K., Mcclelland, M., Stıllwell, L.C., Sısk, E.C., Thurston, S.J., SAFFER, J.D. 1998. Identification and sequence analysis of a 27- kilobase chromosomal fragment containing a Salmonella pathogenicity island located at 92 minutes on the chromosome map of Salmonella enterica serovar typhimurium. Infect. Immun., 66: 3365 3371. 17. Wood, M.W., Jones, M.A., Watson, P.R., Hedges, S., Wallıs, T.S., Galyov, E.E., 1998. Identification of a pathogenicity island required for Salmonella enteropathogtenicity. Mol. Microbiol., 29: 883 891.