Onur AKPINAR. Biyoloji Anabilim Dalı Bilim Dalı Kodu: Sunuş Tarihi: 04\08\2008. Tez Danışmanı: Prof. Dr. Füsun UÇAR.

EGE ÜNĐVERSĐTESĐ FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ (YÜKSEK LĐSANS TEZĐ) SÜT VE SÜT ÜRÜNLERĐNDEN YARROWĐA LĐPOLYTĐCA ĐZOLASYONU, ĐDENTĐFĐKASYONU VE ÜRETTĐKLERĐ ALKALĐN PROTEAZ VE RĐBONÜKLEAZ ENZĐMLERĐNĐN AKTĐVĐTELERĐNĐN ARAŞTIRILMASI Onur AKPINAR Biyoloji Anabilim Dalı Bilim Dalı Kodu: 401.01.04 Sunuş Tarihi: 04\08\2008 Tez Danışmanı: Prof. Dr. Füsun UÇAR Bornova-Đzmir

II

III Onur AKPINAR tarafından Yüksek Lisans Tezi olarak sunulan Süt ve Süt Ürünlerinden Yarrowia lipolytica Đzolasyonu, Đdentifikasyonu ve Ürettikleri Alkalin Proteaz Ve Ribonükleaz Enzimlerinin Aktivitelerinin Araştırılması başlıklı bu çalışma, E.Ü. Lisansüstü Eğitim ve Öğretim Yönetmeliği ile E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Eğitim ve Öğretim yönergesi nin ilgili hükümleri uyarınca tarafımızdan değerlendirilerek savunmaya değer bulunmuş ve 04/08/2008 tarihinde yapılan tez savunma sınavında aday oybirliği/oyçokluğu ile başarılı bulunmuştur. Jüri Üyeleri: Đmza Jüri Başkanı : Prof. Dr. Füsun B. UÇAR... Raportör Üye : Doç. Dr. Mustafa ATEŞ... Üye : Prof. Dr. Abdurrahman Ü. TAMER...

IV

V ÖZET SÜT VE SÜT ÜRÜNLERĐNDEN YARROWĐA LĐPOLYTĐCA ĐZOLASYONU, ĐDENTĐFĐKASYONU VE ÜRETTĐKLERĐ ALKALĐN PROTEAZ VE RĐBONÜKLEAZ ENZĐMLERĐNĐN AKTĐVĐTELERĐNĐN ARAŞTIRILMASI AKPINAR, Onur Yüksek Lisans Tezi, Biyoloji Bölümü Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Füsun UÇAR Ağustos 2008, 263 sayfa Farklı süt ve süt ürünlerinde bozulmaya neden olan 48 maya izole edilmiş ve bu izolatların tanılanmaları hem Barnett ve ark. (2000) tarafından önerilen fenotipik testler ile hem de 5,8S ITS PCR ile genotipik testlerle tanılanmıştırlar. Ayrıca, ITS PCR da elde edilen PCR fragmentlerinin sekans analizi yapılmıştır. Fenotipik testler sonucunda, 48 izolatın sadece 9 tanesi (5, 6, 9, 10, 17, 18, 19, 20 ve 21 numaralı strainler) Y. lipolytica straini olarak tanılanmış olmasına rağmen denemeye alınan 43 izolatın genotipik tanılamasında bu 9 Y. lipolytica straine ilave olarak 5 tane daha izolat (1, 3, 7, 8 ve 23 numaralı strainler) Y. lipolytica straini olarak tanılanmıştır. Ancak, sekans analizi sonuçlarında, 14 Y. lipolytica straininden bir tanesi (1 numaralı strain) Saccharomyces cerevisiae olarak tanılanmıştır. Yapılan sekans analizi sonucunda, ITS PCR a göre tanılanan 1, 8, 9 ve 10 numaralı Y. lipolytica strainleri haricinde 3, 5, 6, 7, 17, 18, 19, 20, 21 ve 23 numaralı Y. lipolytica strainleri sırasıyla %89, %99, %92, %93, %96, %93, %89,

VI %92, %92 ve %92 oranında Y. lipolytica strainleri ile benzerlik göstermiştir. Y. lipolytica tarafından üretilen alkalin proteaz ve ribonükleaz hücre dışına salgılanan ve endüstriyel önemi olan enzimlerdir. Araştırmamızda identifikasyonu yapılan 14 Y. lipolytica strainleri farklı karbon ve azot kaynakları kullanılarak alkalin ekstraselüler proteaz (AEP) ve ribonükleaz (RNaz) üretiminin regülasyonu yönünden çalışılmış ve farklı ph değerlerinindeki sıvı kültürler kullanılarak süpernant ortamın enzim aktivitesinin saptanması amaçlanmıştır. Bütün ortamlarda en fazla aktivite nötr ph da meydana gelmiştir. AEP i en fazla nötr ph da üreten strainin Yarrowia lipolytica CBS 6124 tip türünün olduğu ve 57 unit/ml aktiviteye sahip olduğu hesaplanmıştır. Bunu 5 numaralı Y. lipolytica straini 36,21 unit/ml ile takip etmiştir. Benzer şekilde, denemeler sonunda RNaz üretimi en fazla aktivite nötr ph da meydana gelmiştir. RNazı en fazla üreten strainin 21 numaralı Y. lipolytica straininin olduğu ve 3002,48 unit/ml aktiviteye sahip olduğu hesaplanmıştır. Anahtar Kelimeler: Y. lipolytica, identifikasyon, ITS-PCR, alkalin proteaz ve ribonükleaz enzimleri

VII ABSTRACT ISOLATION AND IDENTIFICATION OF YARROWIA LIPOLYTICA FROM MILK AND DAIRY PRODUCTS, STUDY OF ALKALINE PROTEASE AND RIBONUCLEASE ENZYMES ACTIVITIES OF THIS SPECIES AKPINAR, Onur MSc in Biology Department Supervisor: Prof. Dr. Füsun B. UÇAR August 2008, 263 pages 48 yeast strains causing spoilage on different dairy products were isolated and this isolates identified both suggested with phenotypic tests by Barnett et al. (2000) and genotypic tests with 5,8S ITS PCR. Also, PCR fragments obtained from ITS PCR were analyzed sequencing. Despite the results of phenotypic tests, 9 of the 48 isolates (5, 6, 9, 10, 17, 18, 19, 20 and 21 numbered strains) idetified as Y. lipolytica, after the study of 43 isolates which genotypically identified as Y. lipolytica than 5 strain (1, 3, 7, 8 ve 23 numbered strains) were added to these isolates phenotipically. However, after the results of sequencing, 1 of the 14 Y. lipolytica strains (numbered 1 strain) identified as Saccharomyces cerevisiae. After sequencing, except 1, 8, 9, 10 numbered Y. lipolytica strains which were identified according to ITS PCR, 3, 5, 6, 7, 17, 18, 19, 20, 21 and 23 numbered Y. lipolytica strains respectively show similarity 89%, 99%, 92%, 93%, 96%, 93%, 89%, 92%, 92% and 92%.

VIII Alkaline extracellular protease (AEP) and ribonuclease (RNase) produced by Y. lipolytica are secreted to extracellular environment and has an industrial occurance. In our research, identified 14 Yarrowia lipolytica strains, with the use of different carbon and nitrogen sources, regulation of AEP and RNase production studied. Morever, it is aimed to detect enzymes activities with the use liquid cultures which have different ph values. The most protease activity has a accoured in neutre ph. It is noted that in neutre ph Yarrowia lipolytica CBS 6124 type species has the AEP production the most and accounted 57 unit/ml activity. 5 numbered Y. lipolytica strain followed as 36,21 unit/ml. Similar to, after the RNase production assay, the most ribonuclease activity has a accoured in neutre ph. The most RNase producing strain is the 21 numbered Y. lipolytica strain and activity accounted as 3002,48 unit/ml. Key Words: Y. lipolytica, identification, ITS-PCR, alkaline protease and ribonuclease enzymes

IX TEŞEKKÜR Öncelikle, güncel nitelik taşıyan bu çalışma konusunu öneren ve çalışmam süresince değerli katkılarını esirgemeyen danışmanım, Sayın Prof. Dr. Füsun UÇAR a, tez çalışmam süresince yardımlarını esirgemeyen ve sürekli desteğini gördüğüm, Sayın Araş. Gör. Dr. H. Tansel ÖZTÜRK YALÇIN a ve hiçbir zaman yardımlarını esirgemeyen Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bölümü eğitim elemanlarına ve araştırma görevlilerine, çalışmalarım sırasında bana yardımcı olan tüm arkadaşlarıma en içten dileklerimle teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca, çalışmalarım sırasında değerli yardımlarını gördüğüm Sayın Doç. Dr. Ataç UZEL e şükranlarımı sunarım. Tez çalışmam süresince beni maddi-manevi destekleyen ve bulunduğum yere gelmemde büyük emekleri olan kıymetli aileme teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca, iki yıldır bana burs veren TÜBĐTAK a teşekkürü bir borç bilirim.

X

XI ĐÇĐNDEKĐLER Sayfa No ÖZET...V ABSTRACT...VIVII TEŞEKKÜR... IIX ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ...XV ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ... XXIIIIII 1. GĐRĐŞ... 1 2. LĐTERATÜR ÖZETĐ... 12 2.1. Maya Taksonomisi... 12 2.2. Mayaların Mikrobiyal Ekolojisi... 16 2.3. Tanılamada Kullanılan Yöntemler... 18 2.3.1. Konvansiyonel Yöntemlerle Mayaların Tanılanması... 19 2.3.2. Moleküler Biyolojik Teknikler ile Mayaların Tanılanması23 2.4. Süt Ürünleriyle Mayaların Đlişkisi... 45 2.4.1. Süt... 47 2.4.2. Fermente Süt Ürünleri... 48 2.4.3. Peynir... 50 2.4.4. Tereyağ ve Kaymak... 55 2.4.5. Diğer Süt Ürünleri... 55 2.5. Yarrawia lipolytica Mayasının Genel Özellikleri... 56 2.5.1. Doğal Habitatları ve Filogenetik Đlişkileri... 56 2.5.2. Dimorfizm... 58 2.5.3. Yarrowia lipolytica nın Ekstraselüler Proteinleri... 60

XII 2.6. Mayalarla Đlgili Türkiye de Yapılan Çalışmalar...73 3. MATERYAL VE METOTLAR...76 3.1. Materyal...76 3.1.1. Kullanılan Örnekler...76 3.1.2. Mayaların Đzolasyonu, Tanılanması ve Enzim Denemelerinde Kullanılan Besiyerleri...76 3.1.3. Çözelti, Tampon ve Boyalar...85 3.2. Metot...90 3.2.1. Mayaların Đzolasyonu...90 3.2.2. Đzolatların Tanılanmasında Kullanılan Fenotipik Testler...90 3.2.3. DNA Đzolasyonu...96 3.2.4. DNA ların Saflık Kontrolü...97 3.2.5. ITS PCR...97 3.2.6. ITS PCR Ürünlerinin Elektroforezi...99 3.2.7. PCR Fragmentlerinin Sekans Tayini...101 3.3. Enzim Denemeleri...101 3.3.1. Đzolatların Tribütirin Agarda Ekstrasellüler Lipaz Aktivitesinin Belirlenmesi...101 3.3.2. Alkalin Ekstraselüler Proteaz (AEP) Enzim Standardının Hazırlanması...102 3.3.3. Ribonükleaz (RNaz) Enzim Standardının Hazırlanması..102 3.3.4. AEP ve RNaz Aktivitelerinin Saptanması...103 4. BULGULAR...105 4.1. Đzolatların Elde Edilmesi...105 4.2. Đzolatların Fenotipik Tanılanması...108 4.3. Đzole Edilen Mayaların Sistematik Kategorileri...112

XIII 4.4. Fenotipik Olarak Tanılanan Đzolatların Dahil Olduğu Genusların Özellikleri... 113 4.4.1. Yarrowia Genusu... 113 4.5. Đzolatların Mikroskobik ve Makroskobik Fotoğrafları... 116 4.6. Đzolatların Genotipik Tanılanması... 126 4.6.1. DNA Đzolasyonu... 126 4.6.2. ITS PCR... 127 4.6.3. PCR Fragmentlerinin Sekans Tayininin Sonuçları... 130 4.7. Enzim Deneme Sonuçları... 142 4.7.1. Đzolatların Tribütirin Agarda Büyüme Boyunca Oluşan Ekstraselüler Lipaz Enzim Testi... 142 4.7.2. Alkalin Ekstraselüler Proteaz ve Ribonükleaz Üretimi... 145 4.7.3. Farklı Karbon, Azot Kaynakları ve Farklı ph larda Büyütülen Y. lipolytica Strainlerinin Alkalin Ekstraselüler Proteaz Enziminin Üretimi... 147 4.7.4. Alkalin Ekstraselüler Proteaz Enzimini Üreten Y. lipolytica Strainlerinin Enzim Aktivite Sonuçları... 166 4.7.5. Alkalin Ekstraselüler Proteaz Enzim Standardı... 174 4.7.6. Alkalin Ekstraselüler Proteaz Enzim Miktarının Hesaplanması... 174 4.7.7. Farklı Karbon, Azot Kaynakları ve Farklı ph larda Büyütülen Y. lipolytica Strainlerinin Ribonükleaz Enziminin Üretimi... 175 4.7.8. Ribonükleaz Enzimini Üreten Y. lipolytica Strainlerinin Enzim Aktivite Sonuçları... 192 4.7.9. Ribonükleaz Enzim Standardı... 200

XIV 4.7.10. Ribonükleaz Enziminin Miktarının Hesaplanması...201 5. TARTIŞMA...202 KAYNAKLAR DĐZĐNĐ...217 ÖZGEÇMĐŞ...2633

XV ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ Şekil Sayfa Şekil 2.1 Primer Hedef Bölgeleri Đçeren Fungal Ribozomal Genlerin Şematik Gösterimi... 37 Şekil 2.2 Proteazların Etki Şekilleri... 62 Şekil 2.3 Bovin Pankreatik Ribonükleaz Tarafından Katalizlenen Đki Etkin Reaksiyon Gösterilmiştir... 71 Şekil 4.1 Y. lipolytica nın MYGP Broth daki Vejetatif Hücrelerinin 27 C de 3 Günlük Görünümü (1000X)... 116 Şekil 4.2 Y. lipolytica nın YPD Agar daki Vejetatif Hücrelerinin 27 C de 2 Günlük Görünümü (1000X)... 117 Şekil 4.3 Y. lipolytica nın YPG Agar da 2 Günlük Genel Koloni Görünüşü... 117 Şekil 4.4 Y. lipolytica nın YLD Agar da 2 Günlük Genel Koloni Görünüşü... 118 Şekil 4.5 Y. lipolytica nın YLD Agar daki Görünüşü ve Ekim Yapılmadan Önce YLD Agar Besiyerinin Genel Görünüşü... 118 Şekil 4.6 D-Glukoz Đçeren Yeast Extract Broth da 27 C de 5 Günlük Fermentasyon Testi (Đşaretlenen izolatların hiç biri Y. lipolytica olarak tanılanmamıştır)... 119 Şekil 4.7 Üre Agar da 27 C de 2 Günlük Kolonilerin Üre Hidrolizi Testi (Đşaretlenen izolatların hiç biri Y. lipolytica olarak tanılanmamıştır)... 119 Şekil 4.8 Fenotipik Tanılama Testlerinde Đzolatların Ekilmesinde Đzlenilen Sıra; 1-48 Arası Đzolat Numaraları.... 120

XVI Şekil 4.9 N- Base Agarda 27 C de Kolonilerin 2 Günlük Görünümü (Negatif Kontrol)...121 Şekil 4.10 Glukoz Đçeren N- Base Agarda Glukoz Asimilasyonunun 27 C de Kolonilerin 2 Günlük Görünümü (Pozitif Kontrol)...121 Şekil 4.11 Melibiyoz Đçeren N- Base Agarda 27 C de Kolonilerin 2 Günlük Görünümü...122 Şekil 4.12 Sellobiyoz Đçeren N- Base Agarda 27 C de Kolonilerin 2 Günlük Görünümü...122 Şekil 4.13 myo-đnositol Đçeren N- Base Agarda 27 C de Kolonilerin 2 Günlük Görünümü...123 Şekil 4.14 Trehaloz Đçeren N- Base Agarda 27 C de Kolonilerin 2 Günlük Görünümü...123 Şekil 4.15 Galaktoz Đçeren N- Base Agarda 27 C de Kolonilerin 2 Günlük Görünümü...124 Şekil 4.16 Eritritol Đçeren N- Base Agarda 27 C de Kolonilerin 2 Günlük Görünümü...124 Şekil 4.17 %0,01 Sikloheksimid Đçeren N- Base Agarda 27 C de Kolonilerin 2 Günlük Görünümü...125 Şekil 4.18 D-Riboz Đçeren N- Base Agarda 27 C de Kolonilerin 2 Günlük Görünümü...125 Şekil 4.19 Nitrat Đçeren C- Base Agarda 27 de Kolonilerin 2 Günlük Görünümü...126 Şekil 4.20 Tip tür Yarrowia lipolytica ve genotipik olarak Y. lipolytica olarak tanılanan izolatlar...128 Şekil 4.21 Tip tür Yarrowia lipolytica ve genotipik olarak Y. lipolytica olarak tanılanan ve tanılanamayan izolatların elektroforez

XVII sonuçları: M; Marker (O Gene Ruler 100bp DNA), K; Negatif Kontrol, T; Y. lipolytica CBS 6124, Y. lipolytica olarak tanılanan izolatlar; 21, 33, Y. lipolytica olarak tanılanamayan izolatlar 24, 26, 31, 26, 33, 2, 4, 11,12,27... 128 Şekil 4.22 Tip tür Yarrowia lipolytica ve genotipik olarak Y. lipolytica olarak tanılanamayan izolatların elektroforez sonuçları: M; Marker (O Gene Ruler 100bp DNA), K; Negatif Kontrol, T; Y. lipolytica CBS 6124, Y. lipolytica olarak tanılanamayan izolatlar 28, 29, 30, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40... 129 Şekil 4.23 Tip tür Yarrowia lipolytica ve genotipik olarak Y. lipolytica olarak tanılanamayan izolatların elektroforez sonuçları: M; Marker (O Gene Ruler 100bp DNA), K; Negatif Kontrol, T; Y. lipolytica CBS 6124, Y. lipolytica olarak tanılanamayan izolatlar 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48... 129 Şekil 4.24 1 Numaralı Đzolata Ait Filogenetik Ağaç... 131 Şekil 4.25 3 Numaralı Đzolata Ait Filogenetik Ağaç... 132 Şekil 4.26 5 Numaralı Đzolata Ait Filogenetik Ağaç... 133 Şekil 4.27 6 Numaralı Đzolata Ait Filogenetik Ağaç... 134 Şekil 4.28 7 Numaralı Đzolata Ait Filogenetik Ağaç... 135 Şekil 4.29 17 Numaralı Đzolata Ait Filogenetik Ağaç... 136 Şekil 4.30 18 Numaralı Đzolata Ait Filogenetik Ağaç... 137 Şekil 4.31 19 Numaralı Đzolata Ait Filogenetik Ağaç... 138 Şekil 4.32 20 Numaralı Đzolata Ait Filogenetik Ağaç... 139 Şekil 4.33 21 Numaralı Đzolata Ait Filogenetik Ağaç... 140 Şekil 4.34 23 Numaralı Đzolata Ait Filogenetik Ağaç... 141 Şekil 4.35 Tribütirin Agarda 27 C de Kolonilerin 7 Günlük Görünümü144

XVIII Şekil 4.36 Skim Milk Petrilerinde Nötr ph da 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...146 Şekil 4.37 Skim Milk Petrilerinde ph 5,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...153 Şekil 4.38 Skim Milk + Glukoz Petrilerinde ph 5,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...153 Şekil 4.39 Skim Milk + Glutamin Petrilerinde ph 5,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...154 Şekil 4.40 Skim Milk Petrilerinde ph 6,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...154 Şekil 4.41 Skim Milk + Glukoz Petrilerinde ph 6,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...155 Şekil 4.42 Skim Milk + Glutamin Petrilerinde ph 6,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...155 Şekil 4.43 Skim Milk Petrilerinde ph 7,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...156 Şekil 4.44 Skim Milk + Glutamin Petrilerinde ph 7,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...156 Şekil 4.45 Skim Milk Petrilerinde ph 8,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...157 Şekil 4.46 Skim Milk + Glukoz Petrilerinde ph 8,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...157 Şekil 4.47 Skim Milk + Glutamin Petrilerinde ph 8,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...158 Şekil 4.48 Skim Milk Petrilerinde ph 9,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...158

XIX Şekil 4.49 Skim Milk + Glukoz Petrilerinde ph 9,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 159 Şekil 4.50 Skim Milk + Glutamin Petrilerinde ph 9,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 159 Şekil 4.51 Skim Milk Petrilerinde ph 10,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 160 Şekil 4.52 Skim Milk + Glukoz Petrilerinde ph 10,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 160 Şekil 4.53 Skim Milk + Glutamin Petrilerinde ph 10,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 161 Şekil 4.54 Skim Milk Petrilerinde ph 11,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 161 Şekil 4.55 Skim Milk + Glukoz Petrilerinde ph 11,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 162 Şekil 4.56 Skim Milk + Glutamin Petrilerinde ph 11,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 162 Şekil 4.57 Skim Milk Petrilerinde ph 12,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 163 Şekil 4.58 Skim Milk + Glukoz Petrilerinde ph 12,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 163 Şekil 4.59 Skim Milk + Glutamin Petrilerinde ph 12,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 164 Şekil 4.60 Skim Milk + PMSF Petrilerinde ph 7,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 165 Şekil 4.61 Skim Milk + EDTA Petrilerinde ph 7,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 165

XX Şekil 4.62 Skim Milk + PMSF + EDTA Petrilerinde ph 7,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...166 Şekil 4.63 3 Numaralı Đzolatın ph 7 30 C de 24 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...171 Şekil 4.64 5 Numaralı Đzolatın ph 7 30 C de 24 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...171 Şekil 4.65 6 Numaralı Đzolatın ph 7 30 C de 24 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...172 Şekil 4.66 9 Numaralı Đzolatın ph 7 30 C de 24 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...172 Şekil 4.67 10 Numaralı Đzolatın ph 7 30 C de 24 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...173 Şekil 4.68 Y. lipolytica CBS 6124 tip türünün ph 7 30 C de 24 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...173 Şekil 4.69 Alkalin Ekstraselüler Proteaz Enziminin Standart Eğrisi...174 Şekil 4.70 Skim Milk Agarda ph 7 30 C de 24 Saat Sonundaki 5, 6 ve 49 Numaralı Đzolatların Süpernatantlarının Açılma Zonlarının Görünümü (49: Y. lipolytica CBS 6124 tip türü)...175 Şekil 4.71 RNA Petrilerinde ph 5,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...181 Şekil 4.72 RNA Petrilerinde ph 6,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...182 Şekil 4.73 RNA + Glutamin Petrilerinde ph 6,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...182 Şekil 4.74 RNA - Glukoz Petrilerinde ph 6,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...183

XXI Şekil 4.75 RNA Petrilerinde ph 7,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 183 Şekil 4.76 RNA - Glukoz Petrilerinde ph 7,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 184 Şekil 4.77 RNA + Glutamin Petrilerinde ph 7,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 184 Şekil 4.78 RNA Petrilerinde ph 8,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 185 Şekil 4.79 RNA - Glukoz Petrilerinde ph 8,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 185 Şekil 4.80 RNA + Glutamin Petrilerinde ph 8,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 186 Şekil 4.81 RNA Petrilerinde ph 9,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 186 Şekil 4.82 RNA Glukoz Petrilerinde ph 9,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 187 Şekil 4.83 RNA + Glutamin Petrilerinde ph 9,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 187 Şekil 4.84 RNA Petrilerinde ph 10,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 188 Şekil 4.85 RNA Glukoz Petrilerinde ph 10,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 188 Şekil 4.86 RNA + Glutamin Petrilerinde ph 10,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 189 Şekil 4.87 RNA Petrilerinde ph 11,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü... 189

XXII Şekil 4.88 RNA - Glukoz Petrilerinde ph 11,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...190 Şekil 4.89 RNA + Glutamin Petrilerinde ph 11,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...190 Şekil 4.90 RNA Petrilerinde ph 12,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...191 Şekil 4.91 RNA Glukoz Petrilerinde ph 12,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...191 Şekil 4.92 RNA + Glutamin Petrilerinde ph 12,0 27 C de 48 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...192 Şekil 4.93 5 Numaralı Đzolatın ph 7 30 C de 24 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...197 Şekil 4.94 6 Numaralı Đzolatın ph 7 30 C de 24 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...198 Şekil 4.95 9 Numaralı Đzolatın ph 7 30 C de 24 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...198 Şekil 4.96 10 Numaralı Đzolatın ph 7 30 C de 24 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...199 Şekil 4.97 21 Numaralı Đzolatın ph 7 30 C de 24 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...199 Şekil 4.98 Y. lipolytica CBS 6124 tip türünün ph 7 30 C de 24 Saat Sonundaki Açılma Zonlarının Görünümü...200 Şekil 4.99 Ribonükleaz Enziminin Standart Eğrisi...200 Şekil 4.100 RNA Agarda ph 7 de 30 C de 24 Saat Sonundaki 5, 21 ve 49 Numaralı Đzolatların Süpernatantlarının Açılma Zonlarının Görünümü (49: Y. lipolytica CBS 6124 tip türü)...201

XXIII ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ Çizelge Sayfa Çizelge 2.1 Mayalar üzerinde taksonomik monografında tanımlanan türlerin ve genus sayıları... 16 Çizelge 2.2 Maya Karakterizasyonunda Kullanılan Geleneksel Kriterler (Deak ve Beuchat, 1996)... 20 Çizelge 2.3 Maya Đdentifikasyonu Đçin Asimilasyon ve Fermentasyon Testlerinde Kullanılan Bileşikler... 22 Çizelge 2.4. Önemli Bazı Mayaların ITS1 / 5,8S rdna / ITS2 Bölgesinin Boyutları... 37 Çizelge 4.1 Mayaların Đzole Edildiği Kaynaklar ve Đzolat Numaraları 105 Çizelge 4.2 Đzole edilen mayaların YLD besiyerinde pigment oluşturması... 107 Çizelge 4.3 Đzolatların Tanılanmasında Kullanılan Testler... 109 Çizelge 4.4 Glukozu Fermente Edemeyen Mayaların Tayin Anahtarı. 109 Çizelge 4.5 Mayaların Đzole Edildiği Kaynaklara Göre Genus ve Türlerin Dağılımı... 111 Çizelge 4.6 Đzole Edilen Mayaların Sistematik Kategorileri (Barnett et al., 2000)... 112 Çizelge 4.7 Đzole Edilen Mayaların Sistematik Kategorileri (Alexopoulos et al., 1996)... 113 Çizelge 4.8 Fenotipik Olarak Yarrowia lipolytica Tanılanan Đzolatlara Ait Literatürde Verilen Özellikler Đle Morfolojik ve Fizyolojik Test Sonuçlarının Karşılaştırılması... 115

XXIV Çizelge 4.9 ITS PCR Sonuçlarına Göre Y. lipolytica Olarak Tanılanan Đzolatlar...130 Çizelge 4.10 Đzolatların Tribütirin Agarda Büyüme Esnasında Oluşan Lipaz Aktivitesi (mm açık zon)...143 Çizelge 4.11 Yarrowia lipolytica Strainlerin Skim Milk ve RNA Agarda Nötr ph da Büyüme Esnasında Oluşan AEP ve RNaz Aktivitesi145 Çizelge 4.12 Tip Tür ve Yarrowia lipolytica Strainlerinin ph 5,0 de Skim Milk, Skim Milk + Glukoz ve Skim Milk + Glutamin Petrilerinde AEP Aktivitesi...147 Çizelge 4.13 Tip Tür ve Yarrowia lipolytica Strainlerinin ph 6,0 da Skim Milk, Skim Milk + Glukoz ve Skim Milk + Glutamin Petrilerinde AEP Aktivitesi...148 Çizelge 4.14 Tip Tür ve Yarrowia lipolytica Strainlerinin ph 7,0 de Skim Milk, Skim Milk + Glukoz ve Skim Milk + Glutamin Petrilerinde AEP Aktivitesi...148 Çizelge 4.15 Tip Tür ve Yarrowia lipolytica Strainlerinin ph 8,0 de Skim Milk, Skim Milk + Glukoz ve Skim Milk + Glutamin Petrilerinde AEP Aktivitesi...149 Çizelge 4.16 Tip Tür ve Yarrowia lipolytica Strainlerinin ph 9,0 da Skim Milk, Skim Milk + Glukoz ve Skim Milk + Glutamin Petrilerinde AEP Aktivitesi...150 Çizelge 4.17 Tip Tür ve Yarrowia lipolytica Strainlerinin ph 10,0 da Skim Milk, Skim Milk + Glukoz ve Skim Milk + Glutamin Petrilerinde AEP Aktivitesi...150

XXV Çizelge 4.18 Tip Tür ve Yarrowia lipolytica Strainlerinin ph 11,0 de Skim Milk, Skim Milk + Glukoz ve Skim Milk + Glutamin Petrilerinde AEP Aktivitesi... 151 Çizelge 4.19 Tip Tür ve Yarrowia lipolytica Strainlerinin ph 12,0 de Skim Milk, Skim Milk + Glukoz ve Skim Milk + Glutamin Petrilerinde AEP Aktivitesi... 152 Çizelge 4.20 3 Numaralı Y. lipolytica Strainin GPP ve GPP-Sitratta 1 gün büyütüldükten sonra farklı ph lardaki Skim Milk Agara Đnoküle edilerek Petrilerde Meydana Gelen AEP Aktivitesi (zon açıklığı mm cinsinden)... 166 Çizelge 4.21 5 Numaralı Y. lipolytica Strainin GPP ve GPP-Sitratta 1 gün büyütüldükten sonra farklı ph lardaki Skim Milk Agara Đnoküle edilerek Petrilerde Meydana Gelen AEP Aktivitesi (zon açıklığı mm cinsinden)... 167 Çizelge 4.22 6 Numaralı Y. lipolytica Strainin GPP ve GPP-Sitratta 1 gün büyütüldükten sonra farklı ph lardaki Skim Milk Agara Đnoküle edilerek Petrilerde Meydana Gelen AEP Aktivitesi (zon açıklığı mm cinsinden)... 168 Çizelge 4.23 9 Numaralı Y. lipolytica Strainin GPP ve GPP-Sitratta 1 gün büyütüldükten sonra farklı ph lardaki Skim Milk Agara Đnoküle edilerek Petrilerde Meydana Gelen AEP Aktivitesi (zon açıklığı mm cinsinden)... 168 Çizelge 4.24 10 Numaralı Y. lipolytica Strainin GPP ve GPP-Sitratta 1 gün büyütüldükten sonra farklı ph lardaki Skim Milk Agara Đnoküle edilerek Petrilerde Meydana Gelen AEP Aktivitesi (zon açıklığı mm cinsinden)... 169

XXVI Çizelge 4.25 Y. lipolytica CBS 6124 Tip Türünün GPP ve GPP-Sitratta 1 gün büyütüldükten sonra farklı ph lardaki Skim Milk Agara Đnoküle edilerek Petrilerde Meydana Gelen AEP Aktivitesi (zon açıklığı mm cinsinden)...170 Çizelge 4.26 Tip Tür ve Y. lipolytica Strainlerinin ph 5,0 de RNA, RNA - Glukoz ve RNA + Glutamin Petrilerinde RNaz Aktivitesi...176 Çizelge 4.27 Tip Tür ve Y. lipolytica Strainlerinin ph 6,0 da RNA, RNA - Glukoz ve RNA + Glutamin Petrilerinde AEP Aktivitesi...176 Çizelge 4.28 Tip Tür ve Y. lipolytica Strainlerinin ph 7,0 de RNA, RNA - Glukoz ve RNA + Glutamin Petrilerinde RNaz Aktivitesi...177 Çizelge 4.29 Tip Tür ve Y. lipolytica Strainlerinin ph 8,0 de RNA, RNA - Glukoz ve RNA + Glutamin Petrilerinde RNaz Aktivitesi...178 Çizelge 4.30 Tip Tür ve Y. lipolytica Strainlerinin ph 9,0 da RNA, RNA - Glukoz ve RNA + Glutamin Petrilerinde RNaz Aktivitesi...178 Çizelge 4.31 Tip Tür ve Y. lipolytica Strainlerinin ph 10,0 da RNA, RNA - Glukoz ve RNA + Glutamin Petrilerinde RNaz Aktivitesi179 Çizelge 4.32 Tip Tür ve Y. lipolytica Strainlerinin ph 11,0 de RNA, RNA - Glukoz ve RNA + Glutamin Petrilerinde RNaz Aktivitesi180 Çizelge 4.33 Tip Tür ve Y. lipolytica Strainlerinin ph 12,0 de RNA, RNA - Glukoz ve RNA + Glutamin Petrilerinde RNaz Aktivitesi180 Çizelge 4.34 5 Numaralı Y. lipolytica Strainin GPP ve GPP-Sitratta 1 gün büyütüldükten sonra farklı ph lardaki RNA Agara Đnoküle edilerek Petrilerde Meydana Gelen RNaz Aktivitesi (zon açıklığı mm cinsinden)...193 Çizelge 4.35 6 Numaralı Y. lipolytica Strainin GPP ve GPP-Sitratta 1 gün büyütüldükten sonra farklı ph lardaki RNA Agara Đnoküle edilerek

XXVII Petrilerde Meydana Gelen RNaz Aktivitesi (zon açıklığı mm cinsinden)... 193 Çizelge 4.36 9 Numaralı Y. lipolytica Strainin GPP ve GPP-Sitratta 1 gün büyütüldükten sonra farklı ph lardaki RNA Agara Đnoküle edilerek Petrilerde Meydana Gelen RNaz Aktivitesi (zon açıklığı mm cinsinden)... 194 Çizelge 4.37 10 Numaralı Y. lipolytica Strainin GPP ve GPP-Sitratta 1 gün büyütüldükten sonra farklı ph lardaki RNA Agara Đnoküle edilerek Petrilerde Meydana Gelen RNaz Aktivitesi (zon açıklığı mm cinsinden)... 195 Çizelge 4.38 21 Numaralı Y. lipolytica Strainin GPP ve GPP-Sitratta 1 gün büyütüldükten sonra farklı ph lardaki RNA Agara Đnoküle edilerek Petrilerde Meydana Gelen RNaz Aktivitesi (zon açıklığı mm cinsinden)... 195 Çizelge 4.39 Y. lipolytica CBS 6124 Tip Türünün GPP ve GPP-Sitratta 1 gün büyütüldükten sonra farklı ph lardaki RNA Agara Đnoküle edilerek Petrilerde Meydana Gelen RNaz Aktivitesi (zon açıklığı mm cinsinden)... 196

XXVIII

1 1. GĐRĐŞ Maya ve maya benzeri organizmalar funguslar içerisinde homojen ve çok büyük grup oluşturmaktadır. Bugüne kadar tanımlanmış yaklaşık 1500 tür bulunmaktadır (Verachtert and De Mot,1990; Barnett et al., 2000; Boekhout et al., 2003; Öztürk, 2007). Mayaların taksonomisi moleküler biyolojik yöntemlerin gelişmesine bağlı olarak sürekli değişmektedir. Maya taksonomisindeki değişimin en büyük nedeni kromozom analizleri ve moleküler biyolojik yöntemlerin uygulanmasıdır. Ayrıca maya ve maya taksonomisine ilginin artması da tür sayısının yükselmesine neden olmuştur (Lieckfeldt et al., 1993; Jakobsen and Norvhus, 1996; Öztürk, 2007). Mayalar ticari amaçlar için kullanılan mikroorganizmaların en önemli grubudur. Bilindiği gibi en iyi fermantatif organizmalar olarak mayaların en yüksek aktiviteleri alkol üretimi olup; alkollü içeceklerin üretiminde ticari olarak kullanılmaktadır. Ayrıca mayalar ekmek yapımı, oriantal besinlerin ve turşuların üretiminde, B12, β-karoten gibi vitaminlerin üretiminde, besinlerin tekstürünün ve içeriğinin düzenlenmesini sağlayan fosfomannan gibi endüstriyel polisakkaritlerin üretiminde, gliserol ve polihidroksi alkollerin üretilmesinde, protein açığının kapanması için tek hücre proteini olarak üretimde, lipidlerin üretiminde kullanılmaktadır (Phaff et al.,1966 ; Deak,1995 ; Jakobsen and Norvhus,1996; Hierro et al.,2004; Öztürk, 2007). Mayalar günümüzde en kıymetli endüstriyel mikroorganizmalar olarak kabul edilmektedir. Kullanım alanları arasında gıda, kimya, ilaç ve

2 zirai alanlar bulunmaktadır. Günümüzde moleküler biyoloji teknikleri ve maya hücreleri kullanılarak elde edilen ticari ürünler arasında endüstriyel enzimleri, interferonları ve çeşitli tıbbi ilaçların hammaddelerini saymak mümkündür. Bunlara ilave olarak potansiyel uygulama alanları da düşünülecek olursa yakın bir gelecekde kullanımının daha da artacağını tahmin etmek zor olmayacaktır (Jakobsen and Norvhus,1996; Öztürk, 2007). Bunların yanı sıra, ökaryotik hücreler içinde en iyi tanınan ve laboratuar ortamında manipulasyonu en kolay olan organizmalar olmaları sebebi ile en ideal konakçı olma özelliği göstermektedirler. Ticari açıdan bakıldığında benzer şekilde maya hücreleri bakterilere nazaran daha avantajlı görünmektedir. Maya hücrelerinin ürettikleri proteinleri bulundukları ortama salgılama yeteneklerinin de yüksek olması, ticari açıdan önemli bir avantajdır (Hierro et al., 2004; Öztürk, 2007). Fermentasyon, besinlerin güvenli ve kalitesinin korunmasında birkaç yüzyıldır kullanılan oldukça etkili ve düşük maliyetli bir yöntemdir. Bu rolünün dışında, fermentasyon, besinsel kalitenin gelişmesinde, aroma ve tat üretiminin zenginleştirilmesinde ve besin substratlarının tekstürünün modifiye edilmesinde oldukça önem arz etmektedir. Bütün bu durumlar mikroorganizmalar tarafından yönetilmektedir. Fermentasyon mikroorganizmaları arasından mayalar, şüphesiz önemli mikroorganizma grubudur. Besinlerin fermentasyon proseslerinde kullanılan mayalar, orijinal materyalleri organoleptik, fiziksel ve besinsel olarak modifiye etmektedir ve bu yüzden yüzyıllardır ekmek yapımında ve alkollü meşrubatların üretiminde kullanılmaktadır (Romano et al., 2006). Maya endüstrisi en büyük fermentasyon endüstrilerinden biridir. Bugünkü bilgilerimize göre dünyada yılda

3 ortalama 2 milyon ton ekmek mayası üretilmekte ve yaklaşık 2 milyar dolarlık bir ekonomik değer oluşturmaktadır. Oluşturulan bu ekonomik değerin yaklaşık %15-20 gibi oldukça önemli sayılabilecek bir miktarı ülkemizde gerçekleştirilmektedir (Hierro et al., 2004; Öztürk, 2007). Mayalar mükemmel bir protein kaynağıdır ve kalite olarak soya proteinine eşdeğerdir. Zengin lizin içeriğinden dolayı lizin içeriği fakir tahılları destekleyici rolü vardır. Mayalar hayvan yemlerinde de kullanılmaktadır. Özellikle ABD de bu amaçla çalışan fermentasyon tesisleri bulunmaktadır. Bu tesislerde üretilen çeşitli maya türleri (Torula gibi), üretildikleri ortamlarla beraber ya da ayrı olarak kurutulmakta ve hayvan yemi olarak satılmaktadır (Hierro et al., 2004; Öztürk, 2007). Mayalar çok eski zamanlardan beri iyi bir B vitamini kaynağı olarak tanınmaktadır. B vitaminleri maya sayesinde keşfedilmiş ve biotin, niasin, pantotenik asit ve timin gibi birçok B vitamini ilk olarak mayadan elde edilmiş ve tanınmıştır. Bu nedenle mayalar B vitamini eksiklikleri ve buna bağlı bozuklukların giderilmesine de yardımcı olmaktadır. Mayalardan elde edilen diğer önemli bir endüstriyel ürün ise yeast extract olarak da bilinen maya özütüdür. Dünya çapında yılda yaklaşık 40.000 ton üretilmektedir. Maya özütü ağırlıklı olarak Mono Sodyum Glutamat (MSG) alternatifi olarak gıdalarda doğal lezzet verici madde olarak kullanılmaktadır. Özellikle son yıllarda MSG a getirilen yasal sınırlamalardan ve tüketici tarafından tercih edilememesi eğiliminden dolayı yeast extract a olan talep süratle artmıştır. Bugün hazır çorbadan çikolataya, dondurma yapımına kadar çeşitli gıda maddelerinde maya özütü değişik oranlarda kullanılmaktadır.

4 Mayalardan elde edilen ve ticari değere sahip diğer bir ürün ise invertaz enzimidir. Đnvertaz enzimi gıda sanayinde özellikle de şekerleme endüstrisinde ortası yumuşak şeker ve çikolataların yapımında kullanılmaktadır (Verachtert and De Mot, 1990; Öztürk, 2007). Mayalar, mandıra ürünlerinden peynir üretiminde ve ayrıca kefir gibi fermente sütlerin üretiminde de gerekli mikroorganizmalardır. Mayalar, öncelikle ürünlerde tek starter kültür olarak kullanılmaktadır ama bir çok ürünün üretimi hala spontan fermentasyon ile gerçekleşmektedir. Mayalar birçok durumda ikincil starter kültürdür ve aroma üretiminin zenginleştirilmesi veya diğer mikroorganizmaların büyümesini kolaylaştırmak için kullanılmaktadır (Romano et al., 2006). Mandıra ürünlerinin mikrobiyolojisi genellikle laktik asit bakterileri tarafından domine edilmiş olsa da, bazı önemli literatürler, peynir, kefir ve kımız gibi fermente sütlerin üretiminin olgunlaşma safhası sırasında tat ve doku gelişiminde mayaların önemli role sahip olduklarından bahsetmektedirler (Fleet, 1990; Deak 2007). Mandıra ürünlerinin üretiminde dominant olan önemli türler; Debaryomyces hansenii, Yarrowia lipoliytica, Kluyveromyces marxianus ve Saccharomyces cerevisiae dır ama Galactomyces geotrichum, Candida zeylanoides ve çeşitli Pichia türleri de ayrıca önemli mikroorganizmalardır (Deak, 2007). Mayaların diğer önemli bir özelliği de probiyotik uygulamalarının olmasıdır. Günümüzde, probiyotik organizmalar olarak S. cerevisiae türleri dışında ki maya türlerini de kullanmada önemli bir artış

5 yaşanmaktadır. D. hansenii, K. marxianus, Y. lipolytica ve Issatchenkia oritentalis gibi bazı maya türleri yoğurt ve peynirler ile sıklıkla ilişki içerisindedirler (Psomas et al., 2001; Lourens-Hattingh and Viljoen, 2001; Fleet and Balia, 2006). Ayrıca, yüzey özellikleri ve poliamin üretimi uygun olan balık su kültürlerinde D. hansenii potansiyel probiyotik olarak çalışılmaktadır (Tovar et al., 2002; Fleet and Balia, 2006). Mayalar bu kadar yararlı faaliyetlerinin dışında gıdalarda ve içeceklerde bozulmaya neden olmaktadırlar. Bundan 30-40 yıl öncesine kadar maya konusundaki yayınlarda, gıda kaynaklı mayaların halk sağlığı için önemli olmadığı, tüketici için tehlikesinin bulunmadığı, hatta fermente gıdalarda (kefir, kımız ve bira gibi) yüksek miktarlarda bulunmasının gerektiği bildirilmekteydi (Betts et al., 1999; Loureiro and Querol 1999; Hierro et al., 2004). Fakat 1980 den sonra yapılan araştırmalarda ilk defa olarak, gıda kaynaklı mayaların halk sağlığı ve güvenliği üzerinde durulmaya başlandı. Daha sonra bu konu çeşitli literatürlerde desteklenerek mayaların alerjik etkisinin bulunduğu hatta S. cerevisiae nin barsak iltihabına sebep olduğu belirlenmiştir. (Fleet,1990; Jakobsen and Narvhus, 1996; Öztürk, 2007). Son yıllarda gıdalarda bozulmaya sebep olan mayaların gıda teknolojisindeki önemi artmış ve önemli ekonomik kayıplardan sorumlu tutulmuşlardır. Gıdalarda bulunan mayaların gıdalarda bozulmaya sebep olduğundan 20. yüzyılın ilk yarısında sıklıkla bahsedilmeye başlandı. Barnett ve arkadaşları (1983) gıdalarda 30 cinse ait 120 ye yakın maya türünün bulunabildiğini belirtmiştir. Pitt ve Hocking (1985), gıdalarda

6 bozulmaya sebep olan mayalardan önemlilerini; Dekkera bruxellensis, Issatchenkia orientalis, Debaryomyces hansenii, Yarrowia lipolytica, Kloeckera apiculata, Pichia membranafaciens, Zygosaccharomyces bailii, Zygosaccharomyces bisporus, Zygosaccharomyces rouxii, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis, Candida tropicalis, Candida zeylanoides ve Candida holmii şeklinde bildirmişlerdir. Mayaları yakın zamana kadar insan sağlığı için önemli olmadığı kanısı mayalar üzerinde durulmasını engellemiş ve bu sebeple meydana gelen ürün kayıplarından bahsedilmemiştir. Mayaların neden olduğu ekonomik kayıplar çok olmasına rağmen, ticari gizlilikden dolayı maya bozulmalarındaki endüstriyel patlamaların ekonomisi ve sonuçları rapor edilmemiştir. Ancak son yıllarda yapılan çalışmalarda ve bildirilen raporlarda mayaların gıdalarda önemli bir bozulma etkeni olduğu belirtilmektedir (Fleet, 1990 ; Jakobsen and Narvhus, 1996; Tempel and Jakobsen, 1998; Betts et al.,1999; Perez et al., 2001; Deak, 2006; Öztürk, 2007). Endüstride mayaların neden olduğu bozulmaların ana kaynağı koruyucu içeren gıdalar, zeytin, peynir, mayonez, süt gibi yağ oranı yüksek gıdalar ile sirke, şarap, bira, ekmek gibi fermente gıdalardır. Oldukça fazla sayıda maya türünün fermentasyon ve gıda sanayiinde istenmeyen kontaminantlar olduğu bilinmektedir. Bu tür mayalar saprofit özellikte olup gıdaların bozulmasına, üretimin istenmeyen şekilde sonuçlanmasına yol açmaktadır. Mayalar oldukça geniş ph aralığında (ph 2-9), düşük su aktivitesinde, düşük sıcaklıklarda, yüksek tuz ve yüksek şeker oranlarında çok rahatlıkla gelişebilmektedirler (Pitt and Hocking, 1985, Betts et al.,1999). Aynı zamanda pektin ve diğer

7 kompleks karbonhidratları, organik asitleri, proteinleri ve lipitleri de kullanabilmektedirler. Fermente ve düşük ph lı süt ürünlerinde depolama stabilitesini azaltan ve bozulma etmeni dominant mikroorganizmaların Debaryomyces hansenii, Pichia membranifaciens ve Candida holmii den oluşan mayalar olduğu saptanmıştır (Fleet,1990; Westall and Filtenborg, 1998a; Prillinger et al.,1999; Welthogen and Viljaen 1999), Chedar peynirinden Debaryomyces hansenii, Cryptococcus albidus, Yarrowia lipolytica, Rhodotorula minuta, Rhodotorula glutinis, Torulaspora delbrüeckii ve Kluyveromyces marxianus gibi mayaları izole etmişlerdir. Önceleri peynirlerde mayaların bulunuşunun önemsiz olduğu düşünülse de son yıllarda mayaların peynirlerde bozulmaya sebep olduğu belirlenmiştir (Fleet, 1990; Prillinger et al.,1999). Gıda endüstrisinde en tehlikeli olan mayalar da asit koruyuculara ve osmatik strese dayanıklı olanlardır. Mayalar ya fermentasyon şartlarının kötü olması ya da üretim sonrası kontaminasyondan dolayı gıdaların bozulmasına yol açarlar. Bu bozulmalar gıdalarda acı tat ve kötü koku oluşumu, bulanıklık, sediment veya pellet oluşumu, gaz oluşturma özellikleri sayesinde bazı gıdalarda istenmeyen gözenekli yapı oluşumu gibi bir takım değişikliklerdir (Fleet, 1990; Westall and Filtenborg, 1998; Tempel and Jakobsen, 1998; Loureiro and Querol,1999; Öztürk, 2007). Süt ürünlerinde mayaların bulunuşu önemlidir. Mayalar bozulmaya, gıda zehirlenmesine, alerjik reaksiyonlara ve sağlık için önemli bir çok olumsuz etkiye sebep olmaktadır Bakteriyal kültürlerle üretilen süt ürünlerinde mayaların bulunuşu, bozulmanın büyük bir kaynağıdır (Fleet, 1990; Jakobsen and Narvhus, 1996).

8 Yarrowia lipolytica mayası dimorfik, heterotallik, askomisetik bir tür olup yağ asitleri ve alkanların içerildiği alifatik karbon kaynaklarını tek olarak kullanabilen bir obligat aerobtur. Bu durum oksijen varlığında bile respirasyondan çok etanolik fermantasyonu tercih eden Saccharomyces cerevisiae a zıt bir durumdur (Kerscher et al., 2002). Enzimler, biyokimyasal reaksiyonları katalize eden protein yapısında moleküllerdir ve çeşitli amaçlarla kullanılmak üzere gündelik ve ekonomik hayata girmiştir. Alkalin ekstraselüler proteazlar deterjan, dericilik, gümüşün geri kazanımı, medikal uygulamalarda terapötik ajan olarak, gıda prosesi ve atık uygulamaları gibi kimyasal proseslerde endüstriyel potansiyeli olduğu düşünülen güçlü enzimlerdir. Ribonükleazlar ise birçok medikal uygulamada ve genetik araştırmalarda kullanım alanı yaygın enzimlerdir (Kumar and Takagi, 1999). Saprofitik hayat biçiminde korunduğunda Y. lipolytica ekstrasellüler lipazları (Pignede et al., 2000), organik asitleri (McEwen et al., 1998), alkalin proteaz (Ogrydziak, 1993) ve RNaz ları salgılamada beceriklidir (Cheng and Ogrydziak, 1986). Son yıllarda bu enzimler ticari önemi artmış olup birçok alanda kullanılmaktadır (Kumar and Takagi, 1999). Yarrowia lipolytica proteolitik ve lipolitik aktivitelerinden dolayı süt ve süt ürünlerinin bozunmasında gösterilen en önemli maya türlerinden biridir. Peynir ve diğer süt ürünlerinin işlenmesi gibi geleneksel gıda teknolojisinde belli rolünden ayrı olarak bu maya, hayvan besinleri için tek-hücre protein üretimini, sitrik asit ve α-ketoglutarik asit benzeri organik bileşiklerinin üretimini ve ricinoleik asitin beta-oksidasyonundan oluşan bir portakal aroma bileşeğini, g-dekalaktonun üretimi gibi alifatik bileşiklerin biyodönüşümünü başarmaktadır. Ayrıca, rekombinant

9 proteinlerin salgılanmasında konukçu organizma olarak da kullanılmaktadır. Vektörler heterolog proteine ekstrasellüler alkalin proteaz salgılama sinyalinin (XPR2) N-terminal füsyonuna izin verecek şekilde inşa edilmiştir. Y. lipolytica sürekli olarak birçok heterolog proteinleri çok iyi salgılandığından dolayı diğer maya türleri ile rekabet edecek durumdadır (Ogrydziak, 1993). Mayaların sebep olduğu gıda bozulmalarının kontrolü için gıdalardaki toplam canlı maya populasyonunun sayımı ve aranmasında etkili tekniklerin kullanılması gereklidir. Farklı tipteki gıdalarda muhtemelen predominant olan türlerin tanılanması zorunludur. Konvansiyonel yöntemlerle mayaların tanılanması için 60 ila 100 morfolojik ve fizyolojik testin yapılması ve bu testlerin uzman kişiler tarafından değerlendirilmesi gerekmektedir. Ayrıca bu testler oldukça kompleks, zahmetli ve zaman alıcıdır. Gıda mikolojisinde genel uygulamalar konvansiyonel testlere dayalıdır. Mayaların sayımı ve rutin aranması canlı sayımının saptanması şeklindedir. Koloni sayım teknikleri basit, kullanışlı, kabul edilebilir olmasına karşın birçok dezavantajı da vardır. O nedenle gıda mikolojisinde en önemli ihtiyaç hızlı, duyarlı, doğru ve otomatize olabilen prosedürlerle direkt veye indirekt bir şekilde canlı hücrelerin saptanabilmesidir (Török and King, 1991; Lopez et al., 2001; Arias et al., 2002; Öztürk, 2007). Gıda üretim zincirindeki ve gıda fermantasyon prosesindeki kontaminasyonun kaynağı ve rotasının araştırılmasına olanak sağlayan basit ve hızlı teknikler ile gıdanın mikrobiyolojik kalitesi geliştirilmektedir. Özellikle son on yılda moleküler biyolojinin hızlı

10 gelişmesiyle mikroorganizmaların identifikasyonu için yeni teknikler ortaya çıkmıştır. Bu teknikler gıda endüstrisinde kontaminasyonun kaynağı ve rotasını çizmesi açısından oldukça kullanışlı ve strain seviyesinde farklılıkları ortaya koyan tekniklerdir. Bu teknikler elektroforetik karyotiplendirme, mitokondrial DNA restriksiyon analizi, ribozomal DNA restriksiyon analizleri, DNA fingerprint, RAPD analizleri ve 5,8S rrna genlerini (rdna) ifade eden ITS dizilerinin restriksiyon analizleridir (Rohm and Lechner, 1990; Van der Vassen et al.,1996 ; Couto et al.,1996; Deak et al., 2000 ; Perez et al., 2001; Öztürk, 2007). Son yıllarda genetik tiplendirmede kullanılan yöntemlerin çok hızlı bir şekilde geliştiğine tanık olduk. Đyi bir genotip tiplendirme metodu çoklu analize ve yüksek teknolojiye uygulanabilirliğinin yanısıra güçlü, hassas ve özgün, hızlı, kolay idare edilebilen ve de en önemlisi ortalama bir fiyata sahip olmalıdır. Gıda endüstrisinde bozulma problemlerinde en önemli nokta ise erken safhada spesifik bozunmanın hızlı bir şekilde araştırılmasıdır. Bu da ancak PCR a dayalı tekniklerin kullanılmasıyla gerçekleştirilecektir. Mikroorganizmaların identifikasyonunda kullanılan moleküler teknikler morfolojik ve fizyolojik karakteristiklere dayanan konvansiyonel tekniklere göre daha duyarlı ve spesifik olduğundan gıda endüstrisinde istenmeyen kontaminasyonların kaynağı doğru olarak saptanabilecek ve bozulmaya neden olan mayaların tanısı kısa sürede güvenilir bir şekilde gerçekleştirilecektir. Böylece elde edilen kesin sonuçlarla daha iyi, etkili ve ucuz bir kalite kontrolü uygulanabilecektir. Gelişen teknolojiye bağlı olarak endüstriyel öneme sahip olduğu bilinen proteolitik ve ribonükleolitik mikroorganizmalara ilave olarak potansiyel

11 alkalin proteaz ve ribonükleaz üreticisi yeni mikrobiyal kaynaklara ihtiyaç giderek artmakadır. Belirtilen nedenlerle bu kaynakların taranması da oldukça önem kazanmıştır (Kumar and Takagi, 1999). Yukarıda bahsedilen önemlerinden dolayı, bu araştırmada süt ve süt ürünlerinde bozunmaya neden olan Y. lipolytica strainlerinin izolasyonu, fenotipik ve moleküler biyolojik yöntemlerle tanılanması ile potansiyel proteaz ve ribonükleaz üreten Y. lipolytica strainlerinin saptanması amaçlanmıştır.

12 2. LĐTERATÜR ÖZETĐ 2.1. Maya Taksonomisi Fermentasyondan sorumlu olan bu organizmalar, 19. yüzyılın başına kadar yaşayan canlılar olarak fark edilememiştir (Acheampong, 2000; Öztürk, 2007). Saccharomyces cerevisia nın ilk bilimsel tanılanmasından beri, maya taksonomisindeki gelişmeler, isimlendirmede tartışmalara neden olmuş ve sürekli değişmiştir (Barnett, 2004). 1836 ve 1838 yılları arasında, Charles Cagniard-Latour, Friedrich Kützing ve Theodor Schwann mayaların yaşayan organizma gruplarından bir tanesi olduğunu göstermişler ve Schwann bu grup organizmaların funguslar içerinde yer aldığını belirtmiştir. 1838 de Julius Meyen, S. cerevisiae, S. pomorum ve S. vini yi içeren Saccharomyces genusunu bulmuştur (Barnett, 2004; Çorbacı, 2008). Emil Christian Hansen 1880 li yılların başında saf maya kültürlerinin elde edilmesini sağlayan teknikler geliştirmiş ve bu sayede maya taksonomisinde pratiklik artmıştır. Aynı araştırıcı 19. yüzyılın sonlarına doğru 200 tür hakkında yayın yapmış ve tanılamasını yaptığı 90 tür halen günümüzde bilinmektedir. 1893 ve 1911 yılları arasında askospor oluşturan birçok yeni maya genusu tanılanmıştır. 1893 de Paul Lindner, tomurcuklanma ile değilde fizyon ile çoğalan Schizosaccharomyces pombe yi tanıladığını rapor etmiştir (Barnett, 2004; Çorbacı, 2008).

13 1904 de Hansen, Saccharomycetes lerin sistematiği ile ilgili bir yayın yapmış ve bu yayın mayaların sınıflandırılmasında önemli bir basamak oluşturmuştur (Barnett, 2004; Çorbacı, 2008). 1928 de Guilliermond, 22 genusu kapsayan ve mayaların identifikasyonu için ayırıcı bir anahtar oluşturmuştur. Araştırıcı identifikasyon için, vejetatif hücrelerin görünümü, askosporların varlığı veya yokluğu, eğer varsa sayısı ve şekli ve ayrıca mayaların bazı şekerleri fermente etme kapasitelerini dikkate almıştır (Barnett, 2004). 1931 de, Stelling-Dekker tarafından ilk sınıflandırma çalışması yapılmış ve yayınlanmıştır (Barnett, 2004; Çorbacı, 2008). 1942 de, Diddens in yardımı ile Lodder doktora tezinde bazı anaskosporogenik mayaların sistematiği üzerine çalışmalar yapmış ve çalışmasında kullandığı mayaların çoğunun şekerleri fermente edememesinden dolayı okzonografik metodu kullanarak mayaların karbon kaynaklarını aerobik olarak asimile etme kapasitelerini de test etmiştir (Barnett, 2004; Çorbacı, 2008). 1951 de Lynferd Wickerham, mayaların ekoloji ve taksonomisini yetersiz bularak bu kategorilerle ilgili çalışmalar yapmış ve asimilasyon ve/veya fermentasyon için test edilen karbon kaynaklarının sayısını 30 a çıkarmıştır (Barnett, 2004; Çorbacı, 2008). 1952 de, Lodder ve Kreger-van Rij en gelişmiş maya sınıflandırmasını bir kitap altında toplamışlardır (The Yeasts: Taxonomic Study). Bu sınıflandırmayı yaparken de önceki çalışmalarda kullanılan

14 benzer teknikleri kullanmışlardır ve 180 türü 3 familya altında toplamışlardır; askosporogenik olan Endomycetaceae, asporogenik (fungi imperfecti) olan Cryptococcaceae ve basidiomisetik yada fungi imperfecti olan Sporobolomycetaceae (Barnett, 2003; Çorbacı, 2008). 1970 de Lodder, The Yeasts: a Taxonomic Study nin ikinci baskısını yayınlamıştır. Bu baskı için 4300 strain çalışılmış ve bu strainler 39 genus ve 349 tür altında sınıflandırılmıştır. Lodder, Wickerham ve belki birkaç araştırıcıdan daha etkilenerek karbon kaynaklarının asimilasyon testlerini 30 ila 40 şekere çıkarmış ve 5 ila 13 arasında da şeker fermentasyonu testi kullanmıştır. Bu kitapta toplanan genuslar, Ascomycetes, Ustilaginales, Sporobolomycetaceae ve diğer anaskosporogenik mayalar şeklinde 4 grup altında sınıflandırılmıştır (Barnett, 2004; Çorbacı, 2008). 1979 yılında Alexopoulos ve Mims, mayaları askomisetik, basidiomisetik ve deuteromisetik mayalar adı altında üç grupta incelemişlerdir. Askomisetik mayaları, Ascomycetes sınıfı, Hemiascomycetidae alt sınıfı, Endomycetales ordosu ve Saccharomycetaceae familyası altında, basidiomisetik mayaları ise Ustilaginales ordosu ve Ustilaginaceae familyası altında incelemişlerdir (Alexopoulos et al., 1996; Çorbacı, 2008). 1984 yılında Kreger-van Rij, 1998 yılında Kurtzman, Fell ve diğer 36 araştırmacı tarafından The Yeasts: Taxonomic Study kitabının üçüncü ve dördüncü baskısı yapılmış ama birkaç küçük ayrıntı dışında ilk iki baskı temel alınmıştır (Barnett, 2004).

15 Alexopoulos et al. (1996), moleküler biyolojik yöntemlerin gelişmesine bağlı olarak yaptıkları sistemaktikte bazı değişiklikler yapmışlardır. Askomisetik mayalar tekrar Saccharomycetales ordosu ve Saccharomycetaceae familyası altında incelenmekle beraber, bazı genuslar aynı ordo altında farklı familyalara sokulmuştur. Daha önce yapılan sistematikte Saccharomycetales ordosunda yer almayan bazı mayalar bu ordo içerisine alınmıştır. Barnett et al. (2000), Askomisetik mayaları, Archiascomycetes, Saccharomycetes ve Hemiascomycetes sınıfları altında toplarken Basidiomisetik mayaları Hymenomycetes, Urediniomycetes ve Ustilaginomycetes sınıfları altında toplamıştır. Tez kapsamındaki izole edilen türlerin sistematiği de hem Alexopoulos et al. (1996) hem de Barnett et al. (2003) göre yapılmıştır. Çizelge 2.1 de geçen yıllar içersinde maya türleri ve genuslarındaki artan sayılar özetlenmiştir (Deak, 2007).

16 Çizelge 2.1 Mayalar üzerinde taksonomik monografında tanımlanan türlerin ve genus sayıları (Deak, 2007) Referans Takson Türler Genus Lodder ve Kreger-van Rij (1952) Lodder (1970) Barnett ve ark., (1983) Kreger-van Rij (1984) Barnett ve ark., (1990) Kurtzman ve Fell (1998) Barnett ve ark., (2000) Kurtzman ve ark.,(2007) 164 349 469 500 597 692 678 ~1500 26 39 63 60 83 96 93 ~141 2.2. Mayaların Mikrobiyal Ekolojisi Sıcaklık, su aktivitesi, ph, mevcut O 2, besin maddelerinin bulunması, inhibitörlerin varlığı gibi birçok çevresel faktör mayaların büyümesini etkilemektedir. Mayaların optimum büyüme sıcaklığı 24-48 0 C arasında olduğundan dolayı büyük çoğunluğu (%98) mezofil olarak dikkate alınmaktadır. Çevresel faktörler mayaların büyüme sıcaklığını etkilemektedir. Solute konsantrasyonda bir artış veya su aktivitesinde bir düşüş organizmanın optimum büyüme sıcaklığında 2-6 0 C kadar artışa neden olmaktadır (Deak, 2006; Öztürk, 2007). Mikroorganizmanın metabolik aktivitesi için suyun bulunması (A w ) gıdalardaki mikroorganizmaların büyümesini etkileyen en önemli faktörlerden biridir. Su aktivitesi çözelti konsantrasyonuna göre