T.C. Erzurum Teknik Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARI Yrd. Doç. Dr. Serkan ÖRTÜCÜ Arş. Gör. Ayşenur YAZICI Mikrobiyal Biyoteknoloji Anabilim Dalı 2017
Ad Soyad Numara : : : Dersler Konu Tarih Deney Kontrolü Deney 1 Deney 2 Deney 3 Deney 4 Bölüm 1: Mikrobiyoloji Laboratuvarında Uyulması Gereken Kurallar Bölüm 2: Mikrobiyoloji Çalışma Alanları, Sterilizasyon ve Dezenfeksiyon Bölüm 1: Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılan Malzemeler Bölüm 2: Mikroskop Çeşitleri Bölüm 3: Işık Mikroskobu ve Kullanımı Bölüm 1: Örnek Hazırlama ve Mikrobiyolojide Boyalar Bölüm 2: Basit Boyama Bölüm 1: Gram Boyama Deney 5 Deney 6 Deney 7 Deney 8 Bölüm 1: Endospor Boyama Bölüm 1: Mikrobiyolojide Besiyerleri Bölüm 2: Saf Kültür Teknikleri ve Yayma Ekim Yöntemi Bölüm 1: Funguslar Bölüm 2: Fungus Boyama Yöntemleri Bölüm 1: Kirby-Bauer Test Deney 9 Bölüm 1: Topraktan Bakteri ve Fungusların İzolasyonu Deney 10 Bölüm 1: Topraktan izole edilen mikroorganizmaların saflaştırılması Sunumlar Öğrenci Sunumları Gerçekleştirilecektir.
Deney 1 Bölüm 1: Mikrobiyoloji Laboratuvarında Uyulması Gereken Kurallar Mikrobiyoloji Laboratuvarında uyulması gereken kurallar aşağıda maddeler halinde verilmiştir. Bu kuralların tamamına uyulması sağlığınız açısından önemli ve zorunludur. 1. Laboratuvar dersinde mutlaka önlük giyilmeli ve bu önlük ders sonunda çıkarılarak yıkanmalıdır. Bu önlük ile laboratuvar dışında veya başka bir laboratuvar dersinde kullanılmamalıdır. 2. Laboratuvarda yemek yenmemeli, sakız çiğnenmemeli ve bir şey içilmemelidir. 3. Laboratuvar dersinden önce ve sonra eller bol su ile yıkanmalıdır. Temizlik kullarına uyulmalıdır. 4. Laboratuvara çamurlu, ıslak ve tozlu ayakkabılarla girilmemelidir. 5. Çalışırken eller kesinlikle ağıza götürülmemelidir. Aynı şekilde kullanılan tüm malzemeler (Kalem, kağıt vb.) kesinlikle ağıda ve göze değdirilmemelidir. 6. Çalışma masalarının üzeri deneye başlanmadan önce ve deney bittikten sonra dezenfektan maddeler ile temizlenmelidir. 7. Ekim yaparken veya çalışırken pencereler kapalı olmalı, konuşmamalı, lüzumsuz el-kol hareketleri yapmamalıdır. 8. Öze veya iğneleri kullanmadan önce iyice sterilize etmeli (yakmalı), soğuduktan sonra kullanmalı ve tekrar yaktıktan sonra yerine koymalıdır. 9. Sterilitesinden şüphe edilen bir malzeme veya etiketi çıkmış, ne olduğu bilinemeyen maddeler kesinlikle kullanılmamalıdır. 10. Çalışma masasının üzerinde deneyde kullanılacak malzemeler dışında hiçbir malzeme, çanta, mont, defter vb. bulunmamalıdır. 11. Mikroskop, ph metre, terazi, su banyosu, santrifüj vs. gibi lüzumlu ve her gün kullanılabilecek malzeme çok dikkatlice kullanılmalı, kullanılmadan önce ve sonra temizlenmelidir. 12. Laboratuvardan dışarı herhangi bir tehlikeli kültür, biyolojik örnek veya materyal çıkarılmamalıdır. 13. Çalışma yapılan ortamın canlı bakteri / spor taşıyan aerosoller ile kontamine olmasından kaçınılmalıdır. Aerosol; havada yayılmış çok küçük (invisable) katı veya sıvı partiküllerden oluşur. Aerosoller, kabarcıklar patladığında, bir sıvı diğerine eklendiğinde veya bir damla sıvı katı yüzeye düştüğünde oluşurlar (bu olaylar bakteriyolojik işlemlerde daima vardır). Birkaç mikrometreden de küçük olabilen bu partiküller havada süspanse olarak bir süre kalabilirler. Yani aerosoller potansiyel enfeksiyon kaynaklarıdır. 14. Çalışmalar her zaman alev altında yapılmalıdır. Bunzen beki veya alkol lambası bu amaçla kullanılır. Çalışmaların mikrobiyolojik steril kabinde yapılması ise en uygun olan yöntemdir. Bu şekilde mikroorganizmaların çevreye yayılması önlenir. Böylece hem çalışana hem de çalışma ortamına bulaşma önlenmiş olur. 15. Laboratuvarlarda sinek veya böcek bulunmamalı ve yok edilmelidir. Mikrop taşıyarak tehlikeli olabilirler. Laboratuvar havası temiz ve tozsuz olmalıdır. 16. Laboratuvarda aşırı hareketli davranılmamalıdır. Özellikle mikroorganizmaların havaya yayılabileceği göz önünde bulundurulmalıdır. 17. Mikroorganizma içeren tüp veya petri kutuları açık olarak masa üzerine bırakılmamalıdır.
18. Çalışma bittikten sonra kontamine olmuş çöpler direkt olarak çöp kutusuna kesinlikle atılmamalı, otoklava konulmak üzere uygun şekilde toplama kaplarına konulmalıdır. 19. Kültür sıvıları kesinlikle lavabolara dökülmemeli, bu sıvılar mutlaka içinde dezenfektan bulunan kaplara dökülmelidir. 20. Laboratuvar çalışması süresince, laboratuvar görevlilerinin ikaz, uyarı ve isteklerine uymalıdırlar. 21. Ellerde kesik, yara ve benzeri durumlar varsa bunların üzeri su geçirmez bir bantla kapatıldıktan sonra ya da su geçirmez eldiven giyildikten sonra çalışmaya başlanmalıdır. Aksi takdirde çalışmamak en uygun davranış olur. 22. Laboratuvar çantanızı derse gelirken mutlaka yanınızda getiriniz. Tüm bu kurallara uyacağımı taahhüt ederim. Ad :. Soy ad :. İmza :.
Bölüm 2: Mikrobiyoloji Çalışma Alanları, Sterilizasyon ve Dezenfeksiyon Birçok mikrobiyolojik proseste, çalışma malzemelerinin, besiyerlerinin ve stok kültürlerin çevrede bulunan mikroorganizmaların oluşturacağı kontaminasyondan korunması gerekmektedir. Bu bakımdan aseptik teknikler, çalışmanın güvenilirliği ve doğruluğu açısından önem taşımaktadır. Çalışma Alanları Bakteri ve Fungus çalışma alanlarının temizliği için gerekli olan malzemeler aşağıda verilmiştir. 1. Dezenfektan solüsyonları olarak %70 lik Etil Alkol, %4 lük Çamaşır suyu kullanılır. 2. Bünzen beki ve UV strerilizatörleri çalışma ortamının havasını temizler. Bakteri ya da funguslar ile çalışmaya başlamadan önce mutlaka eller yıkanmalıdır. Ardından çalışma ortamı %70 lik EtOH ile temizlenmelidir. Kültürlerle çalışırken veya inkübatör dışında kültürler varken kesinlikle yeme ve içme yapılmamalıdır. Birçok mikroorganizma yüksek sıcaklığa, kurutmaya ve kaynatmaya dirençli sporları üretirler. Bu sporlar yüksek basınç ve sıcaklık koşullarında belirli bir süre tutularak ortamdan uzaklaştırılabilir. Bu işlemi düdüklü tencere mantığı ile çalışan otoklav adlı cihaz otomatik olarak yapmaktadır. Şekil 1: Mikrobiyoloji laboratuvarı Planı 1. Havalandırma 2. Biyolojik Güvenlik Kabini 3.Çalışma alanları 5. Lavabo.
Sterilizasyon ve Dezenfeksiyon Antiseptik veya dezenfektan maddeler mikroorganizmaları öldüren veya üremelerini engelleyen kimyasal maddelerdir. Ancak bu öldürme %100 gerçekleşmez. Sterilizasyon için kullanılan maddeler ise mikroorganizmaları %100 öldürür. Bu bakımdan bir malzeme ya sterildir, yada değildir. Hemen hemen steril diye bir kavram kullanılamaz. Dezenfeksiyon ise ortamda bulunan patojen özellikteki mikroorganizmaların öldürülmesi işlemidir. Prionlar Çok dirençli Sporlar Mikobakteriler Funguslar Zarflı Virüsler Vejetatif Bakteriler Az dirençli Şekil 2: Mikroorganizmaların kimyasallara karşı olan dirençliliğinin karşılaştırılması Sterilizasyon iki farklı şekilde yapılabilir. Bunlardan biri fiziksel sterilizasyondur. Fiziksel sterilizasyon ısı ve ışınlama ile yapılabilir. Diğer sterilizasyon yöntemi ise kimyasal sterilizasyondur. Kimyasal sterilizasyon ise alkilleyici ajanlar, ozon gazı, klorin dioksit gibi kimyasallar ile yapılan sterilizasyon işlemidir. a) Isı ile sterilizasyon: Cam, metal gibi yüksek ısıya dayanıklı malzemeler steril edilir. Burada yeterli derecede yeterli süre ısı vermek önemlidir. Şekil 3: Pastör Fırını
En hızlı ve güvenilir sterilizasyon yöntemi ise basınçlı buhar ile yapılan sterilizasyondur. Bu yöntemde otoklav adlı cihazlar kullanılır. Otoklav, basınçlı su buharı ile doymuş bir ortamda 121 C sıcaklıkta 15-20 dakikada sterilizasyon yapar. Bu yöntemde toksik olmayan buharın taşıdığı yüksek enerji kullanılır. Bu enerji sayesinde proteinlerin degredasyonu sağlanır. Ameliyat malzemelerinin sterilizasyonundan, mikrobiyoloji besiyerlerinin sterilizasyonuna kadar çok geniş kullanım alanına sahiptir. B A Şekil 4: A. İlkel Otoklav B. Modern Otoklav Otoklavın Çalışma Mantığı Otoklavlarda 100 C nin üzerindeki sıcaklıklarda, içindeki suyun yüzeyine yapılan buhar basıncının artırılması ve böylece suyun kaynama noktasının yükseltilmesiyle sağlanmaktadır. Otoklava verilen buharla, otoklav içindeki su önce ısınır ve daha sonra oluşan buhar içeride hapsedilerek, basınç yükselir. Otoklav basıncı ile (doymuş buhar basıncı) sıcaklık arasında belli bir ilişki vardır. Buna göre otoklav basıncının ölçülmesiyle otoklav sıcaklığı da saptanır. Tablo 1: Otoklavda Sterilizasyonun Kontrolü İndikatörler Değişim Sterilizasyon Yöntemi Browne Tüpleri Kırmızıdan yeşile döner Kuru hava ve basınçta kullanılır. Steam-Clox Kağıtları Mordan yeşile döner Basınç altında buharda kullanılır. Diack Tüpleri Eriyerek bej renk kırmızıya döner Basınç altında buharda kullanılır. Bowie-Dick Şeritleri Açık renkten koyu renge döner Basınç altında buharda kullanılır. Otoklav Şeridi Açık renkten koyu renge döner Basınç altında buharda kullanılır.
b) Işınlar ile Sterilizasyon Radyasyon ile yapılan sterilizasyon yüksek ısıya duyarlı olan malzemelerin sterilizasyonunda kullanılmaktadır. UV, Alfa ve Gamma ışınları kullanılarak yapılır. Bu ışınlar suyu hidroliz ederek oksijen radikalleri oluştururlar. Bu oksijen radikalleri ise nükleik asitleri parçalayarak ve pirimidin dimerleri oluşturarak mikroorganizmaların ölümüne yol açmaktadır. UV lambaları özellikle hastahanelerde ve laboratuvarlarda kullanılmaktadır. Fakat bu lambaların bir dezavantajı vardır. Cam, su ve flimlerin arkasına geçememektedir. Bu yüzden yüzey sterilizasyonunda kullanılır. Şekil 5: UV lambası c) Filitre ile sterilizasyon Mekanik olarak yapılan sterilizasyon yöntemidir. Sıvı ve gazların sterilizasyonunda kullanılır. Filitrelerde kullanılan porun büyüklüğüne göre sterilizasyonun derecesi belirlenir. Şekil 6: Şırınga filitresi d) Kimyasallar ile sterilizasyon Çok çeşitli kimyasallar sterilizasyon amaçlı olarak kullanılmaktadır. Mikroorganizmaların öldürülmesine veya inhibe edilmesinde kullanılan kimyasallar sıvı veya gaz formundadır. Sıvı kimyasallar daha çok yüzey sterilizasyonunda kullanılırken, gaz kimyasallar düşük sıcaklık fonksiyonları olan malzemelerin sterilizasyonunda kullanılır. Ethylene oxide, beta-propiolactone yada formaldehit gibi gazlar reaktif özellik gösterir. Alkilleyici özellikleri mikroorganizmaların öldürülmesinde kullanılmaktadır.
Laboratuvar Raporu 1 a. Aşağıdaki soruları cevaplandırınız. 1. Otoklavda kullanılan indikatörlerin isimlerini yazınız. 2. Filitre ile sterilizasyonda dikkat edilmesi gereken hususlar nelerdir?.. 3. Sterilizasyon, dezenfeksiyon ve antiseptik terimlerinin farklarını belirtiniz. 4. Mikroorganizma çalışma alanları hangi solüsyonlar ile temizlenmelidir? b. Aşağıdaki bilgileri doğru ve yanlış olarak değerlendiriniz.... 1. Ethylene oxide, beta-propiolactone ve formaldehit gazları reaktif özellik gösterir...................... 2. Sterilizasyon için kullanılan maddeler ise mikroorganizmaları %100 öldürmez. 3. Mikobakteriler zarflı virüslere göre daha direçlidirler. 4. Funguslar prionlara göre daha dirençlidirler. 5. Öldürülmesi en zor mikroorganizmalar sporlardır. 6. UV pirimidin dimerleri oluşturarak mikroorganizmaların ölümüne yol açmaktadır. 7. Mikroorganizma çalışma ortamları %100 lük EtOH ile temizlenmelidir. 8. Otoklav 121 C de kuru havada sterilizasyon yapmaktadır.
Deney 2 Bölüm 1: Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılan Malzemeler Aşağıdaki şekilde genel bir laboratuvarda bulunması gereken cam malzemeler verilmiştir. Bir mikrobiyoloji laboratuvarında mutlaka bulunması gereken cihazlar; mikroskop, etüv, biyolojik güvenlik kabini, inkübatörler, otoklav, santrifüj, vortex, tartı, saf su cihazıdır. Bölüm 2: Mikroskop Çeşitleri Çıplak gözle görülemeyecek kadar küçük mikroorganizmaların objektif ve okuler adı verilen mercekler sistemiyle büyültülerek detaylı görüntüsünün incelenmesini sağlayan alet mikroskop olarak adlandırılır. İlk mikroskop 1660 da Hollanda'lı Leuvenhoek tarafından yapılmıştır. Şekil 7: İlk Işık mikroskobu
Mikroskop çeşitleri olarak; 1. Faz-Kontrast Mikroskobu: Mikroorganizmayı öldürmeden ve boyama yapmadan incelemeyi sağlayan mikroskop türüdür. İlk olarak 1933 yılında Frederick Zernike tarafından geliştirilmiştir. Bu nedenle Zernike mikroskobu olarak da bilinmektedir. Canlı protozoanları ve transparan hücreleri incelemek için iyi bir araçtır. Ayrıca, hücre içi yapıların, flagella ve sil gibi organellerin incelenmesinde kullanılır. Şekil 8: Faz-Kontrast mikroskobunun çalışma prensibi Şekil 9: Faz-Kontrast mikrokobu ile çekilmiş hücre görüntüleri
2. Işık Mikroskobu: Aydınlatma kaynağı olarak görünür ışığın kullanıldığı (550 nm) mikroskop türüdür. Işık mikroskobunun tüm kısımları şekil 10 da gösterilmiştir. Işık mikroskon-bunun optik kısımlar oküler ve objektiflerdir. Oküler genellikle 10X büyütmeli olmaktadır. Objektifler ise 4X, 5X, 10X, 20X, 40X, 60X ve 100 X olabilmektedir. Laboratuvarımızda kullandığımız ışık mikroskoplarının oküleri 10X, objektifleri ise, 4X, 10X, 40X ve 100X tir. 100X objektifi immersiyon objektifi olarak adlandırılmaktadır. Şekil 10: Işık mikroskobunun bölümleri Işık Mikroskobunun büyütme gücü = Objektif Büyütmesi X Oküler Büyütmesi Objektif Büyütmesi= = Tüp uzunluğu / Objektifin fokal uzunluğu Işık kaynağı: Mikroskoplarda objeyi aydınlatmak için, genellikle elektrikle çalışan, mikroskobun dışında bulunan veya mikroskobun içine monte edilen ışık kaynakları kullanılmaktadır. Işık kaynağı aydınlatma için gerekli ışığı verir, ayrıca bazı modellerde ışığı ayarlamak için özel diyaframlar bulunur. Filtre: Kondansatörün altında bulunan özel ve halka şeklindeki yere ışık kaynağından gelen ışınları süzen mavi, yeşil veya mat filtreler konarak iyi görüntü sağlanmaya çalışılır. Diyafram: Lambadan gelen ışığın, gereğine göre az veya fazla oranda kondansatöre girmesini sağlamak için kondansatörün altında diyafram bulunur. İmmersiyonla çalışmalarda genellikle diyafram tam açılarak içeri fazla ışık girmesi ve objenin aydınlatılması sağlanır.
Kondansatör: Bir mikroskopta kondansatörün esas görevi ışığı obje üzerinde toplamak ve yeterince aydınlatmaktır. Genellikle iki mercekten oluşan kondansatörler, bir düğme ile aşağı yukarı iner çıkar ve ışığın iyi odaklanmasını sağlar. Işık mikroskobunun kullanımı, mikrobiyoloji laboratuvarı dersimizin temel öğrenme hedeflerinden birini oluşturmaktadır. Mikroskobun uzun ömürlü olması, bakımlarının ve kullanımının iyi olmasına bağlıdır. Bunun için mikroskop kullanımının öncesinde ve sonrasında mutlaka uymanız gereken kuralları vardır. Bu kurallar aşağıdaki tabloda gösterilmiştir. Işık Mikroskobu Kullanımı Tablo 1: Işık Mikroskobu Kullanımı ile ilgili Kurallar 1 Mikroskop ile incelemeye başlamadan önce parçalarının tam, sağlam, tozsuz ve lekesiz olmasına dikkat edilmelidir. Toz ve leke olması durumunda Ksilol ve etanolden oluşan özel temizleme solüsyonu ile silinmelidir. 2 Preparatın alt kısmı mikroskobun tablasına yerleştirilir ve kesinlikle objektiflere sürtülmemelidir. 3 Preparat tabla üzerindeki tutturucuya yerleştirildiğinden emin olunmalıdır. 4 Kondansatör yukarı doğru kaldırılır. Diyafram tam açılır. 5 Işığın açıldığından emin olunmalıdır. 6 Objektifler örneğin tam üzerine getirilir. 7 4X objektifi ile başlanılarak örnek görüntülenmeye başlar. 8 Örnek görüntülenmesi sırasında ışık ayarı, ve netlik yeniden gözden geçirilir. 9 İnceleme işlemi bittikten sonra, tabladan preparat çıkarılır. 10 Mikroskop temizlenir. Örtüsü örtülür. Ve uygun taşıma şekli ile kaldırılır. 3. Karanlık alan Mikroskobu: Faz-Kontrast mikroskobuna alternatif olarak, canlı mikroorganizmaları yüksek kontrast altında incelemeyi sağlayan mikroskop çeşididir. Hücre Boyamasına gerek kalmadan inceleme yapmaya yarar. Şekil 11: Karanlık Alan mikroskobu çalışma prensibi
Laboratuvar Raporu 2 a. Aşağıdaki soruları cevaplayınız. 1. Mikroskop lensleri temizlemek için kullanılan solüsyonları yazınız. 2. Genellikle kondansör hangi poziyonda tutulmalıdır? 3. İmmersiyon yağı hangi objektif ile kullanılır? 4. Canlı bakterinin hangi karakteristiği faz kontrast mikroskobunda görülür? 5. Işık mikroskobunun bölümlerini liste halinde yazınız.....
Deney 3 Bölüm 1: Örnek Hazırlama Işık mikroskobunda mikroorganizma incelemesi yapmak üzere mikrobiyolojik örneklerin slide üzerinde hazırlanması ve belirli işlemlerden geçmesi gerekmektedir. Bu bakımdan aşağıda şekilsel olarak çeşitli örnek hazırlama yöntemleri gösterilmiştir. a) Lam üzerine yayılan bakteri örneğinin hava ortamında kurutulması yöntemi. b) Hücreleri lam üzerine tek tek düşünen smear yayma yöntemi. c) Su üzerine mikroorganizma örneğinin yayılması ve lamelin üzerine kapatılması yöntemi.
Bölüm 2: Mikrobiyolojide Boyalar Mikroorganizmaların boyanması morfoloji tayini ve gruplara ayrılmasında kullanılan en etkili yöntemdir. Mikrobiyolojide çok çeşitli boyalar mevcuttur. Mikrobiyolojik boyaların çoğunluğu organik bileşiklerdir. Bu boyalar benzen halkası ile birleşmiş kromofor ve okzokrom gruplarını içermektedir. Kromofor grubu taşıyan benzen halkasına kromogen halkası adı verilir. Kromogen grubu, birleşiğe boya özelliği verir. Ancak, böyle birleşik renkli olmasına karşın henüz boya karakterine değildir. Çünkü, bu boyanın doku veya lifle bağlanma yeteneği yoktur. Oluşan renk mekanik yoldan kolayca giderilebilir. Gerçek boya haline geçebilmesi için kromofor grubu yanı sıra, diğer grupları da (okzokrom) taşıması gerekmektedir. Okzokrom bileşiğe elektrolitik dissosiasyon özelliği kazandırarak, bileşikte tuz oluşumunu sağlar ve kromofor grubunun daha etkili olmasına yardım eder. Örneğin, nitro (NO 2) grubu kromofordur. Benzen halkasındaki 3 hidrojen atomu yerine NO 2 grubu girerse trinitro benzen oluşur. Sarı renkli bir kimyasal birleşik olan bu madde henüz boya değildir ve elektriksel olarak disosiye olmaz. Ancak, benzen halkasındaki diğer hidrojen atomu yerine bir okzokrom grubu (OH gibi) girerse birleşik boya haline dönüşür (pikrik asit) ve boyama kabiliyetini kazanır. Okzokrom grubu, aynı zamanda boyanın daha koyu boyanmasını sağladığı gibi boyanacak cisimle tuz oluşumuna sebep olur. Tablo 2: Kromofor ve Okzokrom grupları Kromofor grupları Azo Nitrozo Azoksi Thiocaronyl Nitro İmino Karbonil Ethenyl Okzokrom grupları - NR2 - NHR - NH2 - OH - OCH3 I Br Cl Bu boyaları yapılarına ve elektriksel yüklerine göre asidik, bazik ve nötral olmak üzere 3 ana gruba ayırabiliriz. a) Asidik Boyalar: Pozitif yüklü olan hücre ve bazı proteinlere bağlanma özelliği gösteren negatif yüke sahip boyalardır. Asidik boyalar genellikle zemin boyanmasında kullanılmaktadır. Örneğin Kapsül boyama yönteminde asidik boyalar kullanılır. Bu boyalara örnek olarak Nigrosin, Pikrik asit, Eosin, Asit fuschin, India ink verilebilir. b) Bazik Boyalar: Pozitif yüklü olan bu boyalar, negatif yüklü olan nükleik asit, -OH ve COOH gibi negatif grupları taşıyan moleküllere bağlanmaktadır. Bakterilerin hücre duvarları teikoik asit varlığından dolayı negatif yüklüdür. Bu bakımdan bakteri boyamalarında sıklıkla kullanılmaktadır. Bu boyalara örnek olarak, Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, bazik fuschin verilebilir.
c) Nötral Boyalar: Asit ve baz boyaların uygun oranda karışımlarından elde edilir. Bu boyalara örnek olarak Giemsa, Wright, Leishman verilebilir. Bölüm 3: Basit boyama Tek bir boya kullanılarak yapılan boyama yöntemine basit boyama denilir. Bu yöntemde en sık kullanılan boyalar metilen mavisi, kristal viole ve bazik funksin dir. Bu boyalar pozitif yüklüdür. Bu bakımdan bakteri görüntülemesinde kullanılırlar. Basit boyamada boyama süresi genellikle çok kısadır. (30 saniye ile 2 dakika arasında değişir.) Boyamanın ardından yıkama ve kurutma aşamaları yapılarak preparat hazırlanır. Materyaller Lam-Lamel Metilen Mavisi Laktofenol Mavisi dh 2O Kurutma kağıtları E. coli bakteri Kültürü Pennisilium türleri Uygulama 1.Basamak 2.Basamak Öncelikle bakteri örneği lama yayılır ve kurutma işlemi yapılır. Ardından 1 dakika metilen mavisi ile muamele edilir. Süre sonunda örnek yıkanır. Hava ortamında kurutularak inceleme yapılır.
Laboratuvar Raporu 3 Basit Boyama; Işık mikrokobu ile incelediğiniz E. coli ve Penicilium türlerinin görüntüsünü çiziniz. E. coli.. büyütme Penicillium.. büyütme 1. Hangi bazik boyalar asit boyalara göre bakteri görüntülemesinde daha başarılıdır? 2. Bakteri boyamada kullanılan 3 tane bazik boyayı yazınız. a).. b). c).. 3. Örnek hazırlamada niçin alevde fiksasyon yapılır? 4. Boyalardaki Kromofor ve Okzokrom gruplarının işlevlerini yazınız.
Deney 4 Bölüm 1: Gram Boyama 1884 yılında Christian Gram tarafından geliştirilmiş olan Gram boyama yöntemi bakterileri iki ana gruba ayıran ve mikrobiyolojinin günümüzde hala kullanılan en önemli boyama yöntemidir. Bu boyama yöntemi ile bakteriler Gram pozitif ve Gram negatif olarak iki gruba ayrılmaktadır. Şekil 12: Gram + ve Gram bakterilerin hücre duvarı yapılarındaki farklılıklar. Hücre duvarı farklılıkları sayesinde boyanmalarında farklılıklar oluşur. Materyaller Lam-lamel Kristal violet Safranin Gram s iodine Etil alkol Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Kurutma kağıtları Distile su Boyama paneli
Uygulama Şekilde gösterildiği gibi hücre fiksasyonunun ardından sıra ile boyama işlemleri yapılır. 1. Kristal viole boyası ile 20 saniye boyama yapılır. 2. Ardından su ile yıkanır. 3. Gram Iodin ile 1 dakika sabitleme yapılır. 4. Tüm gram Iodine %95 lik Etil Alkol ile yıkanır. Bu aşama kritik aşamadır. Yıkama slide renksiz olana kadar devam etmelidir. 5. Su ile 10-15 saniye yıkanır. 6. Safranin ile 20 saniye boyanır. 7. Su ile yıkanır. 8. Slide kurutulur. Işık mikroskobu ile inceleme yapılır.
Laboratuvar Raporu 4 Gram Boyama; S. aureus ve P. aeruginosa mikroorganizmalarının incelediğiniz görüntülerini çiziniz. S. aureus & P. aeruginosa Büyütme 1. Gram Boyamada S. aureus hangi renkte görülür? 2. Gram boyamada P. aeruginosa hangi renkte görülür? 3. Gram pozitif bakterilerde hangi hücre kompartmeni gram boyamada önemlidir? Niçin?.. 4. Gram boyamada son aşamada safranin boyası yerine Metilen mavisi kullanılabilir mi?
Deney 5 Bölüm 1: Endospor Boyama Basillus ve Clostridium gibi bazı bakteriler sıcaklığa dirençli yapılar üretirler. Bu yapılara endospor denir. Sıcaklık dışında çeşitli kimyasallara karşı da dirençlidirler. Endosporları incelemek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemler arasında, Schaeffer-Fulton ve Dorner metodları mikrobiyologlar tarafından en sık kullanılan metodlardır. Schaeffer-Fulton Metodu Bu metod da malaşit yeşili endosporu boyarken, safranin ise vejetatif hücreleri boyamaktadır. Endosporlar yeşil renkli olurken, vejetatif hücreler pembe renkli olarak görülmektedir. Aşağıdaki şekilde bu metodun aşamaları görülmektedir. Şekil 13: Schaeffer-Fulton Metodu Materyaller 24 saatlik nutrient agar Bacillus subtilis Hot plate Malaşit Yeşili Safranin Distile su Lam- Lamel Boyama Paneli
Uygulama 1. Bakteri örneği lamele yayılır. 2. Fiksasyonun ardından malaşit yeşili ile boyanır. 3. Hot plate ile lamele yüksek ısı verilir. 4. Örnek su ile yıkanır. 5. Ardından safranin ile boyanır. 6. Örnek yeniden su ile yıkanır. 7. Kurutularak ışık mikroskobunda inceleme yapılır.
Laboratuvar Raporu 5 Endospor boyama; ile incelediğiniz görüntüyü çiziniz. B. subtilis Büyütme 1. Endospor ve vejetatif hücreleri birbirinden nasıl ayırırsınız. 2. Endospor boyamada kullanılan diğer bir yöntem olan Dorner metodunu araştırarak yazınız...
Deney 6 Bölüm 1: Mikrobiyolojide Besiyerleri Laboratuvarda, mikroorganizmaların ihtiyaçlarına uygun içerikli besiyerleri hazırlanmalıdır. Mikrobiyolojik besiyeri (Medium /Media) bakterilerin yiyecekleridir. Besiyerleri 3 farklı tipte hazırlanabilir. a) Sıvı Besiyerleri: Nutrient broth, sitrat broth, glikoz broth, litmus milk gibi besiyerlerini kapsamaktadır. Bu sıvı besiyerleri genellikle mikroorganizmanın sayısını arttırma ve fermentasyon çalışmaları için tercih edilmektedir. b) Katı Besiyerleri: Sıvı besiyerlerine katılaştırıcı özellikteki agar, jelatin, silika jel gibi maddelerin eklenmesi ile elde edilmektedir. Katılaştırıcı ajanların mikroorganizmanı gelişmesini inhibe etmemesi önemli bir özelliktir. Ayrıca oda sıcaklığında da sıvılaşmaması gerekmektedir. Bu bakımdan katılaştırıcı olarak kullanılan agar ve silika jel oda sıcaklığında katı olmakta, jelatin ise sıvılaşabilmektedir. Jelatin ayrıca bazı mikroorganizmalar tarafından hidrolize edilebilmektedir. c) Yarı katı (Semisolid) besiyerleri: Sıvı ve katı arası özellikte olan besiyerleridir. Katılaştırıcı maddelerin miktarlarının az olması sebebiyle jel görünümünde olurlar. Genellikle bakteri hareketlerinin izlendiği çalışmalarda tercih edilmektedir. Mikrobiyolojik Besiyerlerinin İçeriği Beisyerlerinin içeriği araştırmacı tarafından, mikroorganizmanın ihtiyaçlarına uygun olarak belirlenmelidir. Besiyerlerinde 7 faktör oldukça önemlidir. Bunlar su, karbon, enerji, nitrojen, mineraller, büyüme faktörleri ve ph dır. 1. Su: Protoplazmanın %70-80 ini su oluşturmaktadır. Hücrelerin dış ortamla besin alış verişinde önemli bir rolü vardır. Enzimatik reaksiyonlar su ortamında gerçekleşmektedir. Bu bakımdan su bir besiyerinin ham maddesidir. Besiyerlerinde kullanılan suyun kalitesi çok önemlidir. Besiyeri hazırlarken çeşme suyu kullanılmamalıdır. Çünkü çeşme suyu yüksek kalsiyum ve magnezyum iyonları içermektedir. Bu iyonlar, peptonların ve beef ekstrak gibi diğer besiyeri içeriğinin çökelmesine yol açar. Bu nedenle besiyeri hazırlarken mutlaka distile su kullanılmalıdır. 2. Karbon: Organizmanın ototrof veya heterotrof olmasına göre farklı karbon ihtiyaçları vardır. Organizmalar asetik asit, glikoz gibi tek çeşit karbon kaynağı kullanabilecekleri gibi, farklı çeşitlerde de karbon kaynakları da kullanabilirler. 3. Enerji: Fotoototrofik mikroorganizmalar pigment içerdiğinden besiyerlerinde enerji sağlayan bileşiklere ihtiyaç duymazlar. Ancak, bazı organizmalar enerjilerini üretebilmek için ortamda nitrat, nitrit, sülfit gibi bileşiklere ihtiyaç duyarlar. Bu nedenle enerji üretebilmeleri için bu bileşiklerin besiyerine eklenmesi gerekmektedir. 4. Nitrojen: Organizmalar protein, peptid, pepton gibi bileşikleri besiyerinden alarak nitrojenleri oluşturabilirler. Heterotrofik mikroorganizmaların bu ihtiyaçları nutrient broth da bulunan beef ekstrak ve peptondan karşılanmaktadır. 5. Mineraller: Tüm mikroorganizmalar sodyum, potasyum, kalsiyum, magnezyum, manganez, demir, çinko, bakır, kobalt gibi metaik elementlere ihtiyaç duymaktadır. Bu elementlerin eser miktarları besiyerinde bulunmalıdır.
6. Büyüme faktörleri: Aminoasit ve vitaminleri içeren büyüme faktörleri, mikroorganizmaların karbon ve nitrojen kaynakları olarak sentez reaksiyonlarında önemli bileşiklerdir. Nutrient brothda bulunan beef extract büyüme faktörleri ile doyurulmuştur. Ayrıca patojen bakterilerin geliştirildiği kanlı agar da yine büyüme faktörleri içermektedir. 7. Hidrojen iyonu konsatrasyonu: Mikroorganizmaların büyümeleri besiyerinin ph derecesine bağlı olarak değişmektedir. Çünkü enzimlerin çalıştığı belirli bir ph derecesi vardır. Çoğu bakteri ph 7de iyi gelişme gösterirken, patojenler genellikle daha alkali ortamı tercih ederler. Örneğin trypticase soy broth bu patojenlerin gelişimi için uygun olan ph 7,3 olarak optimize edilmiştir. Besiyeri hazırlığı ile ilgili Ders Videosunu İzleyiniz https://www.youtube.com/watch?v=cneascr3oec Bölüm 2: Saf Kültür Teknikleri Toprak, su, besin, vücut gibi mikroorganizma popülasyonunun yoğun olduğu kaynaklarla çalışırken, saf kültürler elde etmek önemlidir. Mikroorganizmaları morfoloji ve fizyolojik karakterlerine göre ayırmak ilk olarak yapılacak saflaştırma basamağıdır. Birçok saf kültür elde etme metodu vardır. Bunlardan en sık kullanılan iki tanesi, streak plate (Yayma Plak) ve pour plate (Dökme Plak) yöntemleridir.
Şekil 14: Yayma ve Dökme plak Yöntemleri Materyaller Bunzen beki, Nurtient broth petri Karışık Kültür (Rhodotorula glutinis, E. coli, Serratia marcescens) Uygulama 1. Bencinizi uygun disinfektan maddelerle temizleyiniz. 2. Steril petrinize tarih, grup numarası ve kültür adını yazınız. 3. Kültür örneğinden 20 μl alarak petriye bırakınız. 4. Baget yardımıyla yayma ekim yapınız. 5. İnkübasyon süresi sonunda (1-2 gün) örneklerinizi inceleyiniz. Aşağıda uygulama basamakları görsel olarak verilmiştir. Yayma ekim yönteminde petri kutusunun içerisine 0,1-0,5 ml kültür pipetlenir. Arından Drigalski spatülü ile besiyeri üzerine yayılır. Spatül kullanılmadan önce ve sonra steril edilmelidir. Bu işlem alevden geçirme ile yapılabilir.
Laboratuvar Raporu 6 1. Besiyeri hazırlığında neden çeşme suyu tercih edilmez? 2. Yayma ve Dökme plak yöntemlerinden sizce hangisi ile daha çok tek koloni elde edilebilir? 3. Besiyerlerini kullanan ilk mikrobiyolog kimdir? Araştırınız. Kullandığı besiyerinin özelliklerini öğreniniz....
Deney 7 Bölüm 1: Funguslar Ökaryotik mikroorganizmaların önemli bir kısmı oluşturan funguslar heterotrof özelliktedir. Fungusların çoğu toprak ve suda saprofit olarak yaşarlar. Ekosistemde 100.000 in üzerinde fungus türü bulunmaktadır. Ekonomik olarak faydalı olan fungusların yanında insan ve bitki patojeni olarak yaşayan fungus türleri de mevcuttur. Fungusları inceleyen bilim dalına mikoloji adı verilir. Fungusları oluşturan alemin içerisinde tek hücreli mayalar ve çok hücreli küfler ve şapkalı mantarlar bulunmaktadır. Fungusların genel özelliklerini aşağıdaki şekilde özetleyebiliriz: 1. Bakterilerin aksine ökaryotik hücre yapısına sahiplerdir. 2. Fotosentez yapmazlar. 3. Doku farklılaşması geçirmezler. 4. Hücre duvarları kitin ve diğer polisakkaritlerden oluşmuştur. 5. Üreme yapıları olarak spor oluşturlar. Veya eşeysiz olarak üreyebilirler. Fungusların sınıflandırılmasında makroskobik ve mikroskobik morfolojileri, misel durumları, yaşam şekilleri, üremeleri gibi özelliklere bakılmaktadır. Şekil 15: Maya (Yeast), Filamentöz Fungus (Mold) ve bekterilerin yapısal olarak karşılaştırılması Materyaller 1 Saccharomyces cerevisiae sıvı kültürü, Lam-Lamel, Metilen mavisi, Işık Mikroskobu Uygulama 1 1. Kültürden alınan örnek ile preparat hazırlanır. 2. 40X de maya hücreleri görüntülenir.
Materyaller 2 Çeşitli filamentöz fungusların katı kültürleri, Lam-Lamel, Laktofenol mavisi, Işık Mikroskobu, şeffaf renkli bant. Uygulama 2 1. Petrideki katı kültüre hafifçe bant dokundurulur. 2. Bant lam üzerine koyulur ve üzerine bir damla laktofenol mavisi damlatılır. 3. Bant lam üzerine yapıştırılır. 4. 40X de görüntüleme yapılır.
Laboratuvar Raporu 7 Mikroskopta incelediğiniz görüntüleri çiziniz.
Deney 8 Bölüm 1: Kirby-Bauer Test Bir molekülünün veya kimyasalın antimikrobiyal etkisinin incelenmesi için geliştirilmiş olan bir testtir. U.S. FDA tarafından onaylanmış olan standart bir method olan bu testte ph ı 7,2 ve 7,4 olan Mueller Hiltone II agar kullanılmaktadır. Yöntemde S. aureus, P. aeruginosa, E. coli ve P. vulgaris mikroorganizmaları patojenik özelliklerinden dolayı tercih edilmektedir. Bu laboratuvar dersimizde çeşitli antiseptik özellikteki kimyasalların antimikrobiyal etkileri değerlendirilecektir. Agar Disk Difüzyon Deneyi: Bu yöntemde, Araştırılacak olan kimyasallar bir filitre kağıdına emdirilir. Ardınan bakterilerin yayıldığı petriye belirli aralıklarla yerleştirilir. İnkübasyon süresi sonunda ( genellikle 30 derece, 24 saat) bakterilerin gelişmediği bölgeleri oluşturan zonların çapları cetvel yardımıyla ölçülerek incelenen kimyasalın etkinlik derecesi belirlenir. Deneysel Aşamalar:
Materyal Muller Hiltone agar plate S. aureus, P. aeruginosa, E. coli sıvı kültürleri Bunzen beki Steril pamuklu yayma çubuğu Filter disk Cetvel Uygulama 1. Muller Hiltone agar petri üzerine sıvı kültürler pamuklu çubuk yardımıyla yayılır. 2. Petri 15 dk. oda sıcaklığında inkübe edilir. 3. Steril filitre disklerine kloroform, fenol, formaldehit, amfisilin emdirilir. 4. Petri üzerine önceden işaretlenmiş olan bölgelere bırakılır. 5. 30 C de 24 saat inkübasyona bırakılır. 6. İnkübasyon sonunda oluşan zonların cetvel yardımıyla çapları ölçülerek, maddelerin antimikrobiyal etkileri karşılaştırılır.
Laboratuvar Raporu 8 1. Antimikrobiyal etki araştırmalarında Kirby-Bauer Testi dışında kullanılan diğer testleri araştırınız. Mantıksal olarak farklarını ve benzerliklerini değerlendiriniz. 2. Kloroform, fenol, formaldehit ve amfisilinin oluşturduğu zonların çaplarını yazınız. 3. Kloroform, fenol, formaldehit, amfisilinin antimikrobiyal etkilerini karşılaştırınız. 4. Gözlediğiniz petri görüntüsünü çiziniz.
Deney 9 Bölüm 1: Topraktan Bakteri ve Fungusların İzolasyonu Toprak ve su mikroorganizmaların başlıca yaşama alanlarıdır. 1 gram toprak örneğinde milyonlarca bakteri ve fungus bulunmaktadır. Yerel örneklerin izolasyonu için ideal bir kaynak olarak laboratuvar dersimizde topraktan bakteri ve fungus izolasyonu gerçekleştirilecektir. Materyaller Toprak, Distile su, Deney tüpleri, Vortex, Nutrient agar plate, Potato dextrose agar plate, Baget, İnkübatör, mikropipet. Uygulama 1. 1 gram toprak örneği 10 ml distile suya alınır. 2. İyice vorteks ile homojen hale getirilir. 3. Seri dilüsyon düzeneği hazırlanır. 4. 10-4 dilüsyon yapılan deney tüpünden bakteri izolasyonu için Nutrient agar plate e fungus izolasyonu için Potato dextrose agar plate üzerine 100 μl örnek eklenir ve yayma ekimi yapılır. 5. Örnekler 25 C de 1 hafta inkübe edilir. 6. Koloni sayımı yapılır ve seçilen örnekler saflaştırılır.
Laboratuvar Raporu 9 1. Petrilerde elde ettiğiniz kolonileri sayınız. Mikroorganizma Koloni sayısı Bakteri Maya Fungus 2. Aşağıdaki şekilde gösterilen çizgi ekim yöntemini inceleyiniz. Yukarıdaki şekilde öze kullanılarak yapılan çizgi ekimi gösterilmektedir. Çizgi ekimi ile yayma ekimini araştırınız. Çizgi ekiminin avantajlarını ve dezavantajlarını değerlendiriniz.
Deney 10 ve Laboratuvar Raporu 10 Bölüm 1: Topraktan İzole edilen Bakteri ve Fungusların Saflaştırılması Bir önceki laboratuvarda elde ettiğiniz karışık örnek içeren petrilerdeki örnekleri saflaştırma işlemini gerçekleştireceğiz. Bu amaçla, karışık örneklerde bulunan tek kolonileri seçerek yeni besiyerlerine çizgi ekimi yöntemi ile ekiniz. Aşağıdaki soruları cevaplayınız. 1. Kaç farklı örnek seçtiniz? Tercih sebebinizi belirtiniz. 2. Saflaştırma işlemi sırasında niçin yayma ekim yöntemini kullanmadık? 3. Mikrobiyoloji laboratuvarı dersinden çıkarımlarınız nelerdir? Çevredeki mikrobiyal çeşitlilik hakkında oluşan fikirlerinizi belirtiniz.
Science knows no country, because knowledge belongs to humanity, and is the torch which illuminates the world. Louis Pasterur