T.C. SAĞLIK BAKANLIĞI ŞİŞLİ ETFAL EĞİTİM VE ARAŞTIRMA HASTANESİ ( UZMANLIK TEZİ )

T.C. SAĞLIK BAKANLIĞI ŞİŞLİ ETFAL EĞİTİM VE ARAŞTIRMA HASTANESİ ( UZMANLIK TEZİ ) GENİŞLEMİŞ-SPEKTRUMLU BETA-LAKTAMAZ ÜRETEN GRAM NEGATİF BAKTERİLERDE blactx-m BETA-LAKTAMAZ GENLERİNİN ARAŞTIRILMASI BUKET TOKSOY DANIŞMAN UZM. DR. PhD. BANU BAYRAKTAR KLİNİK MİKROBİYOLOJİ İSTANBUL-29

ii BEYAN Bu tez çalışmasının kendi çalışmam olduğunu, tezin planlanmasından yazımına kadar bütün safhalarda etik dışı davranışımın olmadığını, bu tezdeki bütün bilgileri akademik ve etik kurallar içinde elde ettiğimi, bu tezde çalışmayla elde edilmeyen bütün bilgi ve yorumlara kaynak gösterdiğimi ve bu kaynakları da kaynaklar listesine aldığımı beyan ederim. Buket Toksoy

iii İTHAF En büyük tutkum Esmeralda ya ithaf ediyorum

iv TEŞEKKÜR Tezin, moleküler deneylerinde kullanılan laboratuar cihaz ve gereçlerinin temin edilmesine olanak sağlayan Sayın Doç. Dr. Ali İhsan Dokucu ya teşekkür ederim. Çalışma sürecimi programlayıp, takip eden ve her daim bilgi birikimiyle bana yol gösteren değerli Şefim ve Danışmanım Sayın Uzm. Dr. PhD. Banu Bayraktar a teşekkür ederim. Tezin her aşamasına fikirleri, bilgileri, eleştirileri ve desteği ile katılan Sayın Uzm. Dr. Emin Bulut a teşekkür ederim. Laboratuar çalışmalarım süresince motive edici destekleriyle manevi güç veren teknisyen ve personel, tüm arkadaşlarıma teşekkür ederim. Stresli günlerimde, beni dinginleştiren ve huzur veren aileme ve dostlarıma teşekkür ederim.

v İÇİNDEKİLER BEYAN... İİ İTHAF...İİİ TEŞEKKÜR...İV İÇİNDEKİLER...V TABLOLAR LİSTESİ...Vİ ŞEKİLLER LİSTESİ... Vİİ SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ...Vİİİ ÖZET...İX ABSTRACT...X. GİRİŞ VE AMAÇ... 2. GENEL BİLGİLER...3 2.. Gram Negatif Bakterilerde Antibiyotik Direnci...3 2.2. Direnç Mekanizmaları içinde Beta- laktamazlar...3 2.3. Genişlemiş-Spektrumlu Beta-Laktamazlar (GSBL)...5 2.3.. GSBL ların Karakterizasyonu...6 2.3.2. GSBL Saptama Metodları...6 2.4. CTX-M tipi GSBL lar ve epidemiyolojileri...8 3. GEREÇ VE YÖNTEM...2 3.. Bakteri kökenleri...2 3.2. Antimikrobik duyarlılık testi...2 3.3. GSBL tarama testi...3 3.4. Beta laktamaz gen identifikasyonu...4 3.5. Primerler...4 4. BULGULAR...6 5. TARTIŞMA...25 KAYNAKLAR...3 ÖZGEÇMİŞ...37

vi TABLOLAR LİSTESİ Tablo : Beta- laktamaz sınıflandırma şeması... 5 Tablo 2: GSBL ler için tarama ve doğrulama testleri... 7 Tablo 3: Beta-Laktamaz üreten kontrol kökenleri... 2 Tablo 4: blactx-m genlerinin amplifikasyonunda kullanılan primerlerin tanımladıkları enzim grupları... 5 Tablo 5: 2 Enterobacteriaceae kökeninin tür dağılımı... 6 Tablo 6: GSBL üreten 2 Enterobacteriaceae kökeninin izole edildiği klinik örnekler.. 7 Tablo 7: Klinik örneklerin toplandığı hastane birimleri... 8 Tablo 8: 2 Enterobacteriaceae kökeninin penisilin,. ve 2. kuşak sefalosporin grubu antibiyotik disk difüzyon duyarlılıkları... 9 Tablo 9: 2 Enterobacteriaceae kökeninin 3. ve 4. kuşak sefalosporin ve monobaktam grubu antibiyotik disk difüzyon duyarlılıkları... 2 Tablo : 2 Enterobacteriaceae kökeninin β-laktam/β- laktamaz inhibitör kombinasyon ve karbapenem grubu antibiyotik disk difüzyon duyarlılıkları... 2 Tablo : 2 Enterobacteriaceae kökeninin beta- laktam dışı antibiyotik disk difüzyon duyarlılıkları... 22 Tablo 2: CTX- M tipi beta laktamaz geni saptanan kökenlerin türlere ve ayaktan/yatan hastalara göre dağılımı... 23

vii ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil :EARSS ve ARMed sürveyansı iletişim ağına katılan laboratuarların raporladıkları 3. kuşak sefalosporin dirençli invaziv E. coli kökenlerinin % dağılımı (24)... Şekil 2: Amino asit sekans benzerliklerine göre CTX-M enzim gruplarının ağaç diyagramı... 9 Şekil 3: CTX-M tipi enzim ürettiği bildirilen Enterobacteriaceae kökenlerinin izole edildiği lokasyonların gösterildiği dünya haritası... Şekil 4: CTX-M-8 üreten C. amanolytica kontrol kökeninin çift disk sinerji testi MüllerHinton agar disk diffüzyon fotoğrafı... 3 Şekil 5: bla CTX-M saptanması amacıyla yapılan PZR deney sonucunun UV ışık altında agaroz jel fotoğrafı... 5 Şekil 6: bla CTX-M pozitif E. coli ve K. pneumoniae kökenlerinde GN, CİP ve SXT duyarlılık % oranları... 24

viii SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ K.pneumoniae: Klebsiella pneumoniae n: Köken sayısı E. coli: Escherichia coli MİK: Minimal İnhibitör Konsantrasyon C. amanolytica: Citrobacter amanolytica S: Duyarlı GSBL: Genişlemiş Spektrumlu Beta Laktamaz I: Orta düzey duyarlı PZR: Polimeraz zincir reaksiyonu R: Dirençli AMP: Ampisilin AMC: Amoksisilin/klavulanik asit PİP: Piperasilin TZP: Piperasilin/tazobaktam CF: Sefalotin SCF:.Sefaperazon/sulbaktam CXM: Sefuroksim ETP: Ertapenem FOX: Sefoksitin CFM: Sefiksim CRO: Seftriakson CTX: Sefotaksim CAZ: Seftazidim FEP: Sefepim ATM: Aztreonam CIP: Siprofloksasin NOR: Norfloksasin İMP: İmipenem MEM: Meropenem GN: Gentamisin AK: Amikasin NN: Tobramisin NET: Netilmisin C: Kloramfenikol SXT: Trimetoprim/sülfametoksazol F: Nitrofurantoin

ix ÖZET Toksoy, B. (29). Genişlemiş spektrumlu beta- laktamaz üreten gram negatif bakterilerde blactx-m beta-laktamaz genlerinin araştırılması. Sağlık Bakanlığı Şişli Etfal Eğitim ve Araştırma Hastanesi Klinik Mikrobiyoloji Laboratuarı. Tıpta Uzmanlık Tezi. İstanbul. Dünya genelinde Enterobacteriaceae kökenlerinde en sık karşılaşılan 3. kuşak sefalosporin d i r e n ç mekanizmasının CTX-M t i p i b e t a - laktamaz üretimi olduğu bilinmektedir. Plazmid kökenli blactx-m beta-laktamaz genlerini kazanan kökenler toplumda ve hastane ortamında çok hızlı yayılarak endemik hale gelebilmektedir. Bu nedenle, salgınları erken dönemde fark edebilmek ve organizmaların toplumda ve hastane ortamında yayılımını izleyebilmek için fenotipik testlerde muhtemel şüpheli saptanan mikroorganizmalardaki enzim üretimi genotipik testlerle doğrulanmalıdır. Bu çalışmaya, Şubat 29 ve Temmuz 29 tarihleri arasında Şişli Etfal Eğitim ve Araştırma Hastanesi Klinik Mikrobioloji Laboratuarında izole edilen GSBL üreten a r d ı ş ı k 2 Enterobacteriaceae kökeni dahil edilmiştir. Kökenlerde tüm blactx-m beta-laktamaz genleri; iki farklı primer seti içeren, multipleks PZR yöntemi ile araştırılmıştır. İncelenen 32 E.coli ve 35 Klebsiella spp. kökeninde (67/2: %83,5), CTX-M-, CTX-M-2 ve CTX-M-9 enzim gruplarını eksprese eden blactx-m beta-laktamaz genleri saptanmıştır. CTX-M-8 veya CTX-M-25 enzim gruplarını bulunduran kökene rastlanmamıştır. Kökenlerin %63.4 ü ayaktan hastalara ait örneklerden, %36.6 sı ise yatan hastalara ait örneklerden izole edilmiştir. Sonuç olarak, plazmid kökenli CTX-M tipi GSBL üreten patojenler artık hem toplumda hem de hastanede sıklıkla infeksiyon etkeni olarak karşımıza çıkmaktadır. Buna ek olarak, a ynı plazmid üzerinde taşınan diğer direnç genleri ise çoğul ilaç dirençli kökenlerin salgınlar yaparak hızlı bir şekilde endemik hale gelmesini kolaylaştırmaktadır. GSBL ve hatta CTX-M tipi GSBL üretiminin saptanması ve doğrulanması, antibiyotik direnci ile mücadele politikalarına faydalı katkı sağlayacaktır. Anahtar Kelimeler : Beta- laktamaz, CTX-M enzimleri, Enterobacteriaceae

x ABSTRACT Toksoy, B. (29). Detection of blactx-m beta-lactamase genes in extendedspectrum beta- lactamase producing gram negatif bacteria. Şişli Etfal Training and Research Hospital, Clinic Microbiology Laboratory. Tıpta Uzmanlık Tezi. İstanbul. It is known that CTX-M type beta- lactamase production is the most common resistance mechanism against third- generation cephalosporin in Enterobacteriaceae worldwide. The plasmid- mediated blactx-m b e t a - lactamase gene-acquired strain can quickly spread in the community or hospital settings and become endemic. Potential ESBL producer microorganisms detected by phenotypic test should be confirmed by genotypic confirmation assays for the early detection of CTX-M outbreaks and also tracking and monitoring the spread of organisms in the community and hospital settings. From February to July, 29, 2 consecutive ESBL-producing Enterobacteriaceae isolated in Şişli Etfal Training and Research Hospital Clinical Microbiology Laboratory were included in the study. All The blactx-m beta-lactamase genes were detected by the multiplex PCR assay using two different sets of primers. According to results, 32 E.coli and 35 Klebsiella spp. strains (67/2: 83,5%) were positive for blactx-m beta- lactamase genes belonging to CTX-M-, CTX-M-2 and CTX-M-9 groups. The CTX-M beta- lactamases from CTX-M-8 or CTX-M-25 groups were not found in any isolates. Sixty-four percent of the strains were isolated from outpatients and the rest of them (36%) were from inpatients. In conclusion, plasmid-mediated CTX-M type ESBL-producing strains have become a more frequent cause of infections, either in community or hospital settings. Moreover, transfer of other resistance genes which are placed on the same plasmids cause multi-drug resistant-strain outbreaks and facilitate rapid emergence of those strains as endemic pathogens. According to antibiotic policies about the prevention of resistance, the detection and confirmation of ESBL production, and CTX-M type ESBL production in particular, would be useful. Key Words: Beta- lactamase, CTX-M enzymes, Enterobacteriaceae

. GİRİŞ VE AMAÇ Bakterilerde gözlenen antibiyotik direnci, güçlü antibiyotik ilaçların kullanıldığı çevrede, yeni bir olgu ya da beklenmeyen bir durum olarak değerlendirilemez. Y a p ı l a n sürveyans çalışmaları, antibiyotik direncinin mikrobiyolojik değerlendirmesine olanak sağlamaktadır. Dolayısıyla, tanımlanmış direnç mekanizmalarının insidansının ve prevalansının detaylı takip edilmesi gerekmektedir. Şekil :EARSS ve ARMed sürveyansı iletişim ağına katılan laboratuarların raporladıkları 3. kuşak sefalosporin dirençli invaziv E. coli kökenlerinin % dağılımı (24) Yapılan epidemiyolojik çalışmalar, Akdeniz bölgesindeki ülkelerde izole edilen önemli patojenik bakterilerin yüksek düzey antibiyotik direnci bulundurduğunu göstermektedir. EARSS (European Antimicrobial Surveillance System) ve ARMed (Antibiotic Resistance in the Mediterranean region) sürveyans çalışmalarının sonuçlarına göre (24); ülkemizde izole edilen 3. kuşak sefalosporin

2 dirençli invaziv Escherichia coli ( E. coli) kökenlerine, % 25-5 oranları arasında rastlanmaktadır (Şekil ). Bakterilerin beta-laktamaz üretimi aracılığı ile beta- laktam antibiyotikleri enzimatik yıkımı tanımlanmış direnç meknizmalarındandır. Geniş spektrumlu sefalosporinlere dirençli Enterobacteriaceae kökenlerinde Geniş-Spektrumlu BetaLaktamaz (GSBL) üretimi Akdeniz bölgesinde yaygın direnç mekanizmalardandır. MYSTIC (Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection) sürveyans sonuçlarına göre, en sık GSBL bildirimi İtalya ve Türkiye den katılan merkezlerden olmuştur. Günümüzde, ilk tanımlanan GSBL tipi enzimler olan TEM- ve SHV- türevi enzimlerin sıklığı azalırken, CTX-M tipi enzimlerin sıklığı ve yayılımı hem Akdeniz bölgesindeki ülkelerde hem de tüm dünyada artış göstermiştir. Bu bağlamda, öncelikle laboraturımızda izole ettiğimiz GSBL üreten Enterobacteriaceae kökenlerinde CTX-M enzimlerinin sıklığının araştırılması amaçlanmıştır. Ayrıca, beta- laktamaz genlerini taşıyan plazmidlerle aktarılan diğer antibiyotik direnç genlerinin kazanımına bağlı değişen antibiyotik direnç oranlarının incelenmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla, ardışık tekrarlamayan GSBL üretimi fenotipik testle taranan 2 Enterobacteriaceae kökeninde CTX-M t i p i enzim kodlayan blactx-m genleri multipleks polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) yöntemi ile araştırılmıştır. Ayrıca, diğer antibiyotik duyarlılıkları disk difüzyon yöntemi ile belirlenmiştir.

3 2. GENEL BİLGİLER 2.. Gram Negatif Bakterilerde Antibiyotik Direnci 2. yüzyılın başında, tedavi için az sayıda antibiyotik seçeneği olan hayati tehdit oluşturan infeksiyonlarla yeniden karşı karşıya kalınmıştır. Bununla birlikte, bir önceki yüzyıldan farklı olarak, bu infeksiyonlara daha büyük sıklıkla gram negatif patojenler neden olmaktadır (Bradford ve Dean 28). 2. yüzyılda Enterobacteriaceae kaynaklı infeksiyonlarda, tedavi seçimi kolaydı. Tedavinin hedefe yönelik veya ampirik olmasından bağımsız olarak, sefalosporin ve fluorokinolon grubu antibiyotikler güvenilir ilaçlardı (Denton 27). Antibiyotik tüketiminin devam etmesiyle birlikte yeni dirençler ortaya çıkmaya başlamış ve direnç genlerinin epidemik tranferi sonucu dirençli kökenlerin hastalar arasında epidemik yayılımı meydana gelmiştir (Livermore 2). Son 7 yıl içinde, özellikle uzak doğuda, bilinen tüm antibiyotiklere dirençli gram negatif bakteriler içinde tipik olarak Pseudomonas v e Acinetobacter kökenleri görülmeye başlanmıştır. Bulundurdukları dirençle ilişkili moleküler mekanizmaların, Enterobacteriaceae kökenlerine aktarılabilir nitelikte olması dirençli Escherichia coli, Salmonella typhi, Shigella sonei, Klebsiella pneumoniae ve Enterobacter cloacae kökenlerinin ortaya çıkışı ile sonuçlanmıştır (Hawkey ve Munday 24). 2.2. Direnç Mekanizmaları içinde Beta-laktamazlar Yeni direnç; tür seleksiyonu, mutasyon veya DNA transferi yoluyla meydana gelmektedir. Her bir hasta yada hasta gruplarının tamamında, antibiyotiğin bir patojene karşı kazandığı başarı, daha direçli organizmaların seçilmesi için ekolojik alan yaratmaktadır. Daha öncesinde duyarlı olan kökenlerde ki direnç ise mutasyonlar aracılığı ile artabilmektedir. Ayrıca, duyarlı kökenler, direnç mekanizmalarını plazmidler (ayrı, kendi başına aktarılabilir DNA halkaları) veya kromozomal eklentiler (transpozonlar: bir genomdan diğerine atlayabilen yapışkan uçlu DNA parçaları ve bakteriofajlar) aracılığı ile kazanabilmektedir (Livermore 2). Gram negatif bakterilerde antibiyotik direnci, sıklıkla dış membran geçirgenliğinin azalması, antibiyotik effluksu ve diğer direnç mekanizmalarının eklenmesi sonucu ortaya çıkmaktadır (Franklin ve Snow 25, Hawkey ve Munday 24). Diğer direnç mekanizmaları arasında, enzimatik ilaç modifikasyonu gram

4 negatif bakterilerde daha yaygın olarak gözlenmektedir. Antimikrobiyal ilaçları modifiye eden enzimler, genel olarak iki sınıfa ayrılmaktadır. Bunlar; -kimyasal transformasyonlar yapabilen enzimler (makrolid ve aminoglikozid modifiye edici enzimler) ve -antibiyotik yıkımı yapan beta- laktamazlar şeklindedir (Alekshun ve Levy 27). Beta- laktamaz kodlayan genler (bla); bakteriyel kromozom, plazmid veya transpozonlar üzerinde bulunabilmektedir. Günümüzde, bla genleri, integronlar (5 konservatif integraz geni, diğer antibiyotik direnç genlerini bulunduran gen kasetleri ve gen kaseti atti için integrasyon kısmı içeren değişken uzunlukta genetik elemanlar) üzerinde artan sayıda tanımlanmaktadır. İntegronlar, hareketsiz olmakla birlikte hareketli genetik elemanlar (plazmidler ve transpozonlar) üzerinde bulunmaktadırlar. (Babic ve ark. 26). Bu genlerin ekspresyon ürünü olan plazmid kökenli ilk betalaktamaz; TEM-, 96 ların başında yunanlı bir hastadan izole edilen E. coli kökeninde tanımlanmıştır (Bradford ve Dean 28). Günümüzde, beta- laktamazların sayı ve çeşitliliği dikkat çekicidir ve en az 35 bakteriyel beta- laktamaz tanımlanmıştır. Bu enzim bolluğunun, sınıflandırılması major konulardandır ve iki güncel şema vardır. -Ambler sınıflandırma sistemi aminoasit sekanslarındaki benzerlikleri temel alırken, -Bush-Jacoby-Medeiros sınıflandırma sistemi substrat/inhibitör profilini temel almaktadır (Franklin ve Snow 25). Bu tanımlamalara göre yapılan sınıflandırma tablo de gösterilmektedir.

5 Tablo : Beta-laktamaz sınıflandırma şeması Ambler sistemi Sınıf A Penisilinaz TEM ler, SHV ler, PC, CTX-M ler, SME-, KPC- Sınıf B Metalo-beta-laktamaz IMP-, VIM-, CcrA Sınıf C Sefalosporinaz AmpC, CMY-2, ACT- Sınıf D Oksasilinaz OXA- Sefalosporinaz AmpC, CMY-2, ACT-, MIR- Bush-Jacoby-Medeiros sistemi Grup Geniş-spektrumlu sefalosporinleri parçalar; klavulanat dirençli Grup 2 Tümü kalvulanik asit duyarlı 2a Penisilinaz S. aureus dan PC 2b Geniş-spektrumlu penisilinaz TEM-, SHV-, TEM-2 GSBL SHV-2, TEM-, CTX-M ler, PER, VEB-, BES-, GES/IBC, TLA, SFO 2br İnhibitör dirençli TEM ler, IRT ler, TEM-3, TEM-3 2c Karbenesilin hidrolizi PSE- 2d Oksasilin hidrolizi OXA-, OXA- 2e Clavulanat ile inhibe olan sefalosporinaz FEC- 2f Karbapenemaz KPC-, SME- Metalo-beta-laktamaz IMP-, VIM-, Ccr A 2be Grup 3 İmipenem hidrolizi yapar, EDTA ile inhibe olur, klavulanat dirençli Grup 4 Sınıflandırılmamış 2.3. Genişlemiş-Spektrumlu Beta-Laktamazlar (GSBL) 98 lerin başında, genişlemiş-spektrumlu beta- laktamazlar görülmeye başlamıştır (Bradford ve Dean 28). İlk olarak 983 yılında, SHV- enzimini kodlayan genlerde tek mutasyonla oluşan, oksiimino-sefalosporinleri ve penisilinleri parçalayan yeni bir beta-laktamaz; SHV-2 Almanya da izole edilen Klebsiella ozaenae kökeninde tanımlanmıştır (Bradford 2, Esen 28). TEM-3, 987 yılında bildirilen GSBL fenotipi gösteren ilk TEM-türevi beta- laktamazdır (Bradford 2, Stürenburg ve Mack 23). Bundan sonra, geniş-spektrumlu TEM ve SHV enzim varyantlarının sayısı ve çeşitlerinde hızlı bir artış gözlenmiştir (Stürenburg ve Mack 23). Günümüzde, 5 farklı GSBL tanımlanmıştır. Bu enzimler, dünya genelinde

6 bir çok Enterobacteriaceae ve P. aeruginosa kökenlerinde bulunmaktadır (Bradford 2, Stürenburg ve Mack 23). 2.3.. GSBL ların Karakterizasyonu GSBL lar moleküler sınıf A ve fonksiyonel grup 2be içerisinde sınıflandırılmıştır (Falagas ve Karageorgopoulos, 29). GSBL ları kaynaklandıkları ata enzimlerden, y e r leri değişen ila 7 aminoasitin neden olduğu konfigürasyon değişimi ve aktif bölge özelikleri ayırmaktadır (Stürenburg ve Mack 23). GSBL fenotipinin ortaya çıkmasında etkili aminoasit pozisyon değişimleri başlıca; pozisyon 4 de glutamat yerine lizin, pozisyon 64 de arginin yerine serin veya histidin, pozisyon 238 de glisin yerine serin ve pozisyon 24 da glutamat yerine lizin gelmesi şeklindedir (Bradford 2). Böylece, oksiimino-zinciri içeren beta- laktamın enzimin aktif bölgesi ile birleşmesi için gerekli alan genişlemektedir v e meydana gelen nokta mutasyonları, enzimin klavulanatla inaktivasyonunu arttıran etki oluşturmaktadır (Stürenburg ve Mack 23). Buna göre, GSBL lar aktif bölgelerinde serin bulunduran, genişspektrumlu sefalosporinleri hidroliz eden ve klavulanik asit ile inhibe olan enzimler olarak tanımlanmıştır. Ayrıca GSBL lar sefamisinlere ve karbapenemlere karşı aktif değildir (Bradford 2). Enterobacteriaceae kökenlerinde, TEM ve SHV mutantlarından farklı, çeşitli tiplerde kazanılmış GSBL lar tanımlanmaktadır. Bunlar; CTX-M, VEB, GES/IBC, PER, TLA, BES ve SFO enzimleridir. Bu enzimler içinde yayılımı TEM ve SHV türevleri ile karşılaştırılabilir hatta onları da geçen CTX-M tipidir (Paterson ve Bonomo 25, Rossolini ve ark. 28). 2.3.2. GSBL Saptama Metodları GSBL ilk tanımlandığından bu yana, çeşitli sayıda farklı saptama metodları önerilmektedir (Stürenburg ve Mack 23). Enterobacteriaceae kökenlerinin etken olduğu infeksiyonların insidansı yüksek iken, bu infeksiyonlar da GSBL üreten organizmaların prevalansı göreceli olarak daha düşüktür (Katz ve ark. 24). Bu nedenle, testlerin kazanılmasında iki avantaj aşamalı uygulanmasının yaratacağı zamandan ve maliyetten düşünülmüştür (Schreckenberger 24). Günümüzde, Klinik Laboratuar Standartları Enstitüsü, GSBL saptama testleri için

7 uygulama standartlarını açıklamış ve devamlı güncellemektedir. Buna göre, MS8 baskısındaki öneriler tablo 2 de aktarılmıştır (CLSI 28). GSBL saptanmasına; sefpodoksim, sefotaksim, seftriakson, seftazidim veya aztreonam duyarlılığındaki azalmanın taranması ile başlanmaktadır (CLSI 28). GSBL enzimlerinde geniş spektrumlu sefalosporin hidroliz dereceleri birbirinden çok farklılıklar gösterebilmektedir (Stürenburg ve Mack 23, Katz ve ark. 24). Ayrıca, GSBL bulunduran kökenlerde minimal inhibitör konsantrasyon (MİK) değerleri duyarlı aralıkta kalabilmektedir (Schreckenberger 24). Dolayısıyla, birden fazla antibiyotiğin kullanılması, tarama testinin duyarlılığını arttıracaktır. Tarama testinde şüpheli çıkan kökenlerde, sefalosporin indikatör ile beta-laktamaz inhibitörü (sıklıkla klavulanik asit) arasındaki sinerjistik etkiyi gösteren fenotipik doğrulama testi GSBL saptanması amacıyla uygulanmalıdır (CLSI 28). Tablo 2: GSBL ler için tarama ve doğrulama testleri Test İlk tarama testi Fenotipik doğrulama testi Test yöntemi Disk difüzyon Sıvı mikrodilüsyon Disk difüzyon Sıvı mikrodilüsyon Sonuçlar K. pneumoniae, K. oxytoca ve E. coli için; Tarama konsantrasyonlarında ya da daha yüksek konsantrasyonlarda üreme GSBL üretimini gösterebilir. Test edilen antimikrobik ilaçlardan birinin (seftazidim veya sefotaksim) zon çapının klavulanik asit ile birlikte test edildiğinde tek başına test edilmesine göre =5mm artması= GSBL Test edilen antimikrobik ilaçlardan birinin klavulanik asitle birlikte test edildiğindeki MİK değerine göre =3 dilüsyon azalması=gsbl Sefpodoksim zonu = 7mm Seftazidim zonu = 22mm Aztreonam zonu = 27mm Sefotaksim zonu = 27mm Seftriakson zonu = 25mm P. mirabilis için; Sefpodoksim zonu = 22mm Seftazidim zonu = 22mm Sefotaksim zonu = 27mm Yukarıdaki zonlar GSBL üretimini gösterebilir. Bildirim GSBL ürettiği saptanan tüm kökenlerde, penisilinler, sefalosporinler ve aztreonam dirençli bildirilmelidir. GSBL üretiminin hem taranması hem de doğrulanması amacıyla rutin uygulanabilecek diğer güvenilir bir test ise çift disk sinerji testidir. Fakat, inokulum etkisi ve disklerin birbirinden çok uzak yerleştirilmesi durumlarında, GSBL üreten

8 kökenler atlanabilir (Stürenburg ve Mack 23, Schreckenberger 24). En az çift disk sinerji metodu kadar ve bazı çalışmaların sonuçlarına göre daha da fazla duyarlı doğrulama testi ise E-test ESBL (AB Biodisk, İsveç) dir. Maliyeti yüksek olduğu için karar verilmesinde güçlük yaşanan enzimlerin doğrulanmasında tercih edilebilir (Stürenburg ve Mack 23). Günümüzde; E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca ve P. mirabilis kökenleri için GSBL tarama ve doğrulama testlerinin standardizasyonları Klinik Laboratuar Standartları Enstitüsü rehberinde tanımlanmış durumdadır (CLSI 28). Bununla birlikte, kromozomal kökenli AmpC beta- laktamaz üretimi bilinen, Enterobacter spp, Serratia marcescens, Morgenella morgani, Providencia spp. v e Citrobacter spp. kökenlerinde de GSBL üretimi bildirilmekte ve yaygınlaşmaktadır (Stürenburg ve Mack 23, Choi ve ark. 27). Ayrıca plazmid kökenli AmpC kazanımı, E. coli ve Klebsiella spp. kökenlerinde artmaktadır (Black ve ark. 25, Schreckenberger 24). Dolayısıyla, bu kökenlerde CLSI nın önerdiği GSBL saptama testleri yalancı pozitiflikler verebilir. Ayrıca, yukarda aktarılan testler, sadece GSBL varlığı ya da yokluğuna karar verdiren testlerdir fakat b u özelliklerdeki kökenlerde k e s i n identifikasyon gerekmektedir ve bu sadece moleküler testler ile m ü m k ü n olabilmektedir (Stürenburg ve Mack 23). 2.4. CTX-M tipi GSBL lar ve epidemiyolojileri Günümüzde en detaylı takip edilen GSBL tipi, CTX-M enzimleridir. İlk CTXM beta- laktamaz, 98 li yıllarda Japonya, Avrupa ve Arjantin den bildirilmiştir (Denton 27, Rossolini ve ark. 28). CTX-M enzimleri yaygın olarak E. coli ve K. pneumoniae kökenlerinden bildirilirken, tifoidal ve nontifoidal Salmonella, Shigella spp., Citrobacter freundii, Enterobacter spp. ve Serratia marcescens kökenlerinde de bulunduğu bildirilmiştir (Babic 26). Kluyvera cryocrescens kökeninde bulunan KLUC- beta-laktamaz, CTX-M- grubu ile %77.4-99.7 oranında aminoasit homolojisi gösterdiği için CTX-M- grubu enzimlerin orijini olarak kabul edilirken; Kluyvera ascorbata kökenindeki kromozomal kökenli beta-laktamaz, CTX-M-2 grubu ile %95- homoloji göstermekte ve bu enzimlerin muhtemel progenitörü olarak kabul edilmektedir (Hawkey ve Munday 24). CTX-M-8 ve CTX-M-9 enzimlerini kodlayan genlerin

9 prekürsörleri ise Kluyvera georgiana kökenlerinde saptanmıştır (Rossolini ve ark. 28). Günümüzde, CTX-M tipi enzimlerin 6 den fazla allelik varyantı bilinmektedir. Bu enzimler, aminoasit sekans benzerlikleri esas alınarak 6 grup içinde incelenmektedir. Her grup, ilk tanımlanan grup üyesinin adını almaktadır. (i) CTXM- grubu; CTX-M-, CTX-M-3, CTX-M-, CTX-M-2, CTX-M-5, CTX-M-28, CTX-M-3 ve FEC- enzimlerini, (ii) CTX-M-2 grubu; CTX-M-2, CTX-M-4, CTXM-5, CTX-M-6, CTX-M-7, CTX-M-2 ve Toho- enzimlerini, (iii) CTX-M-8 grubu; sadece CTX-M-8 enzimini, (iv) CTX-M-9 grubu; CTX-M-9, CTX-M-3, CTX-M4, CTX-M-6, CTX-M-7, CTX-M-9, CTX-M-2, CTX-M-24, CTX-M-27 ve Toho-2 enzimlerini, (v) CTX-M-25 grubu; CTX-M-25, CTX-M-26 enzimlerini, (vi) CTX-M-45 grubu; sadece CTX-M-45 enzimini içermektedir (Şekil 2)(Bonnet 24, Rossolini ve ark.28, Galas ve ark. 28). Şekil 2: Amino asit sekans benzerliklerine göre CTX-M enzim gruplarının ağaç diyagramı Toho-, C T X -M -44; Toho-2, C T X -M -45; UOE-, C T X -M -5; U E O -2 ve Toho-3 C T X -M- 4 o larak gösterilmiştir. Konjugatif plazmid kökenli CTX-M tipi GSBL ların geniş spektrumlu sefalosporin hidroliz özellikleri, aminoasit değişiminden bağımsız olarak intrinsik niteliktedir (Stürenburg ve Mack 23). CTX-M üreten kökenlerde, sefotaksim MİK değeri dirençli aralıklarda (>64µg/ml), seftazidim MİK değeri sıklıkla duyarlı aralıklarda (2-8µg/ml) saptanırken, aztreonam MİK değeri ise değişkendir (Paterson

2). Ayrıca, diğer bir ayırıcı özellikleri ise tazobaktamın inhibitör etkisi, klavulanik asitten kat daha fazladır (Stürenburg ve Mack 23). Son 2 yıl içinde, CTX-M tipi enzimler hızlı ve global yayılım göstermişlerdir (Şekil 2). 99 ların ortasında Rusya, Letonya ve Belarus ülkelerinde CTX-M-4 ve CTX-M-5 enzimleri üreten Salmonella Typhimurium kökenlerinin neden olduğu büyük salgınlar deva m e d e r k e n, Avrupada CTX-M tipi GSBL lar nadiren gözlenmekteydi. Günümüzde ise, CTX-M enzimleri bir çok Avrupa ülkesinde yaygın hale gelmiştir ( L ivermore ve ark. 27). Galas ve ark. (28), Fransa da Enterobacteriaceae kökenlerinde yaygın olarak bulunan enzimin CTX-M-5 olduğunu bildirmişlerdir. Novais ve ark. (27), İspanya da epidemik kökenlerde başlıca CTX-M- grubu enzimlerin yaygın olduğunu ve bunların içinde CTX-M- enziminin en sık izole edildiğini bildirmişlerdir. Brigante ve ark. (25), İtalya da GSBL üreten E.coli kökenleri arasında en sık tipin CTX-M- grubu içinde CTX-M- enzimi olduğunu bildirmişlerdir. Baraniak ve ark. (22), Polonya da CTX-M-3 enziminin epidemiyolojik yayılım gösterdiğini bildirmişlerdir. Eisner ve ark. (26), Avusturya da izole edilen E. coli v e K. pneumoniae kökenlerinde CTX-M-5 üretiminin yaygın olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca izole edilen bir E. coli kökeni, Birleşik Krallık da epidemik CTX-M- 5 ü r e t e n E. coli k ö k eni ile benzerlik göstermesine rağmen iki bakteri arasında epidemiolojik bir bağlantı olmadığını bildirmişlerdir. Meglič ve ark. (29), Slovakya da izole edilen K. pneumoniae kökenlerinde %34 oranında CTX-M-5 enzimi bildirmişlerdir. Enzim ailesi, özellikle Uzak Doğu, Asya ve Afrika kıtalarında da hızlı yayılımına devam etmektedir. Moriguchi ve ark. (27), Japonya da sıklıkla CTX-M2, C T X -M-3, ve CTX-M-9 enzimleri üreten kökenlerin izole edildiğini bildirmişlerdir. Ayrıca, CTX-M-3 üreten fırsatçı pathojen Enterobacter cloacae kökenin etken olduğu salgını bildirmişlerdir. Cheng ve ark. (29), Çin de CTX-M-3 ve CTX-M-5 in en yaygın enzimler olduğunu, bunun yanısıra K. pneumoniae kökenlerinden izole edilen iki yeni enzim CTX-M-8 ve CTX-M-8 i bildirmişlerdir. Ho ve ark. (27), doğu Asya ve Hong Kong da en yaygın enzimin CTX-M-4 olduğunu bildirmişlerdir. Kim ve ark. (25) yaptıkları çalışmada, Kore de izole edilen Citrobacter freundii, E. coli, Enterobacter spp., K. pneumoniae v e S. marcescens k ö k e n l e r i n i n CTX-M-3, C T X -M- 5, C T X -M-9 ve CTX-M-4 bulundurduklarını bildirmişlerdir. Kiratisin ve ark. (28), yaptıkları çalışmada

Tayland da izole edilen E.coli kökenlerinde en yaygın enzimlerin CTX-M-4 ve CTX-M-5 olduğunu bildirmişlerdir. Shahid ve ark. (29), Hindisan da izole ettikleri E. coli ve K. pneumoniae kökenlerinin CTX-M-5 enzimi bulundurduklarını bildirmişlerdir. Mamlouk ve ark. (26), yaptıkları çalışmada E. coli v e K. pneumoniae kökenlerinde CTX-M-5 enzimini ve Afrika kıtasındaki ilk CTX-M-6 enzimini izole ettiklerini bildirmişlerdir. Şekil 3: CTX-M tipi enzim ürettiği bildirilen Enterobacteriaceae kökenlerinin izole edildiği lokasyonların gösterildiği dünya haritası Dünya geneline baktığımızda ise, Kuzey Amerika kıtasında yapılan araştımalarda daha yaygın bildirilen enzim grupları CTX-M-, CTX-M-25, CTX-M9, CTX-M-2 iken Güney Amerika da; CTX-M-, CTX-M-2, CTX-M-8 ve CTX-M9 dur. Avrupa da CTX-M-, CTX-M-2, CTX-M-9 ve CTX-M-25 gruplarından; Afrika kıtasın da ise CTX-M-, CTX-M-2 ve CTX-M-25 gruplarından enzimler bildirilmektedir. Kuzey Asya dan CTX-M- ve CTX-M-2 gruplarından enzimler, Güney Asya dan ise CTX-M-, CTX-M-2 ve CTX-M-9 grubundan enzimler bildirilmektedir. Uzak doğuda ise yaygın enzim grupları, CTX-M-, CTX-M-2, CTXM-8, CTX-M-9 ve CTX-M-45 dir (Şekil 3) (Rossolini ve ark.28).

2 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.. Bakteri kökenleri Şubat 29 Temmuz 29 tarihleri arasında Şişli Etfal Eğitim ve Araştırma Hastanesi Klinik Mikrobiyoloji Laboratuarında toplanan ardışık, tekrarlamayan (her hastadan tek köken, n=2) Enterobacteriaceae kökenleri çalışmaya dahil edilmiştir. Bu kökenlerde, GSBL üretimi taranmış ve ardından blactx-m genleri araştırılmıştır. Kökenlerin tür düzeyinde identifikasyonları, konvansiyonel yöntemler ve BBL CRYSTALTM Enteric/Nonfermenter I D s is t e m i ( Becton Dickinson, A B D ) kullanılarak yapılmıştır. Çalışmada kontrol amacıyla kullanılan bakteriler, İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Klinik Mikrobiyoloji Laboratuarından temin edilen, Aktaş ve ark. (25) nın çalışmalarında kontrol kökeni olarak kullandıkları TEM- üreten E.coli ve SHV- üreten K. pneumoniae negatif kontrol kökenleri, aynı kaynaktan temin edilen CTX-M-5 üreten E.coli ve Universte D auvergne Faculté de Médecine Service de Bactériologie laboratuarından temin edilen CTX-M-8 üreten Citrobacter amanolytica pozitif kontrol kökenleridir (Tablo 3). Tablo 3: Beta-Laktamaz üreten kontrol kökenleri Kökenler Sınıf β-laktamaz Grup Laboratuar Escherichia coli 2b (A) TEM- - İ.Ü. İstanbul Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Laboratuarı Klebsiella pneumoniae 2b (A) SHV- - İ.Ü. İstanbul Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Laboratuarı Escherichia coli 2be(A) CTX-M -5 İ.Ü. İstanbul Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Laboratuarı Citrobacter amonolytica 2be(A) CTX-M -8 8 Universte D auvergne Faculté de Médecine Service de Bactériologie 3.2. Antimikrobik duyarlılık testi Ampisilin (µg), piperasilin (µg), sefalotin (3µg), sefuroksim (3µg), sefoksitin (3µg), sefiksim (5µg), seftriakson (3µg), sefotaksim (3µg), seftazidim (3µg), sefepim (3µg), aztreonam (3µg), amoksisilin/klavulanik asit (3µg), piperasilin/tazobaktam (/µg), sefaperazon/sulbaktam (3/75µg), e rtapenem (µg), imipenem (µg), meropenem (µg) gentamisin (µg), amikasin (3 µg), tobramisin ( µg), netilmisin (3 µg), siprofloksasin (5µg), norfloksasin ( µg), trimetoprim/sulfametoksazol (25µg), kloramfenikol, nitrofurantoin (3 µg) disk

3 difüzyon duyarlılıkları Klinik Laboratuar Standartları Enstitüsü standartları uygulanmış ve sonuçlar bu standartlara göre değerlendirilmiştir (CLSI 2 8 ). Antibiyogramın kalite kontrol değerlendirmesinde, E. coli ATCC 25922 standart kökeni kullanılmıştır. 3.3. GSBL tarama testi Çalışmaya dahil edilen kökenlerde, GSBL üretiminin fenotipik taranmasında çift disk sinerji testi kullanılmıştır. Bulanıklığı.5 MacFarland olarak ayarlanmış bakteri inokulumu Müller-Hinton agar besiyerine ekilmiştir. Petrinin merkezine amoksisilin/klavulanik asit diski ve bu diskin 2-25mm uzağına sefoksitin, sefotaksim, sefdazidim, seftriakson, sefiksim, sefepim ve aztreonam diskleri yerleştirilmiştir. 6-8 saatlik inkübasyondan sonra, ü ç üncü kuşak sefalosporin, sefepim ve aztreonam disklerinin inhibisyon zonundaki genişleme ve üreme olan bölümlerde alansal inhibisyonların görülmesi GSBL üretimi olarak kabul edilmiştir (Bradford 2, Stürenburg ve Mack 23). Testin kalite kontrol değerlendirmesinde, E coli ATCC 25922 negatif kontrol ve C. amanolytica (Universte D auvergne Faculté de Médecine Service de Bactériologie, Fransa) pozitif kontrol kökenleri kullanılmıştır (Şekil 4). Duyarlılık ve GSBL tarama testlerinde kullanılan antimikrobik diskler Becton Dickinson (ABD) Firması ndan temin edilmiştir. Şekil 4: CTX-M-8 üreten C. amanolytica kontrol kökeninin çift disk sinerji testi MüllerHinton agar disk diffüzyon fotoğrafı FEP CRO CFM ATM AMC CTX FOX CAZ CF AMC: Amoksisilin/klavulanik asit, CFM: Sefiksim,, FEP: Sefepim CRO: Seftriakson, ATM: Aztreonam, FOX: Sefoksitin, CF: Sefalotin, CAZ: Seftazidim, CTX: Sefotaksim,

4 3.4. Beta laktamaz gen identifikasyonu Kalıp DNA, kökenlerin bir gecelik (8-24 saat) Müller-Hinton agar kültüründen hazırlanmıştır. Seçilen iki koloni µl distile su ile karıştırılmıştır ve hücreler 95 C de dakika bekletilerek parçalanmıştır. 5.g de 2 dakika santrifüj yapılarak hücresel debris uzaklaştırılmıştır. Süpernatant, amplifikasyon için kalıp DNA kaynağı olarak kullanılmıştır (Pitout 27). blactx-m beta-laktamaz genlerinin eşzamanlı saptanması amacıyla, MyCyclarTM termal cyclerda (Bio-Rad, ABD) Fermentas Taq polimeraz kiti ve 2mM dntp (Fermentas, Glen Burnie, Maryland, ABD) karışımı kullanılarak multipleks PZR uygulanmıştır. Toplam hacmi 22µl olan ve mm Tris-HCl (ph: 8.8), 5mM, KCl,.5mM MgCl2, mm datp, dgtp, dctp, dttp (Fermentas),.µM CTXMA, CTX-MA2, CTX825-F, CTX825-R primerleri,,25µm rrs- ve rrs-2 primerleri, 2,5U Fermentas Taq içeren reaksiyon karışımı hazırlanmıştır (Pitout 27). Reaksiyon karışımına 3µl süpernatant eklendikten sonra, dakika 37 C, 6 dakika 94 C yi takiben 3 siklus; dakika 92 C, dakika 55 C, dakika 72 C; ve 7 dakika 72 C ile sonlandırılan PZR programı uygulanmıştır. PZR ürünleri,.5xtbe buffer (x TBE; 89mM Tris, 89mM boric asit, 2mM EDTA içermektedir) içinde %,5 luk agaroz jellerde elektroforez yapılıncaya kadar 4 C de saklanmıştır (Pitout 27). Etidyum bromid ile hazırlanan jeller elektroforez sonrasında UV ışıkta incelenmiştir. 3.5. Primerler CTX-M-, C T X -M-2, C T X -M-9 gruplarından CTX-M tiplerinin PZR amplifikasyonu için kullanılan primerler; CTX-MA (5 -SCSATGTGCAGYACCAGTAA) ve CTX-MA2 (5 -CCGCRATATGRTTGGTGG-TG) dir ve 55bp amplikon üretmektedirler (S= G veya C; Y= C veya T; R= A veya G). Bunlar, optimal bağlanma kapasitesini sağlamak amacıyla eşit miktarlarda farklı primerlerin karıştırılması ile elde edilen dejenere primerlerdir. CTX-M-8, C T X -M-25 gruplarından CTX-M tiplerinin PZR amplifikasyonu için kullanılan primerler; CTX825-F ( 5 -CGCTTTGCCATGTGCAGCACC) ve CTX825-R ( 5 -GCTCA GTACGATCGAGCC) dir ve 37bp amplikon üretmektedir. Primerlerin tanıdığı enzim grupları tablo 4 de gösterilmiştir. İnternal kontrol olarak 6S rrna gen

5 bölgesinin PZR amplifikasyonu amacıyla rrs- ( 5 -GGATTAGATACC CTGGTAGTCC) ve r r s-2 ( 5 - TCGTTGCGGGACTTAACCCCAC) primerleri kullanılmıştır. Bu primerler, 32bp amplikon üretmektedirler (Pitout 27). Ayrıca, blactx-m genlerinin saptanması için yapılan PZR deney sonuçları şekil 5 de gösterilmiştir. Tablo 4: blactx-m genlerinin amplifikasyonunda kullanılan primerlerin tanımladıkları enzim grupları Primerler CTX-MA ve CTX-MA2 CTX825F ve CTX825R Gruplar CTX-M- CTX-M-2 CTX-M-9 CTX-M-8 CTX-M-25 Enzimler CTX-M- CTX-M-2 CTX-M-9 CTX-M-8 CTX-M-25 CTX-M-3 CTX-M-4 CTX-M-3 CTX-M- CTX-M-5 CTX-M-4 CTX-M-2 CTX-M-6 CTX-M-6 CTX-M-5 CTX-M-7 CTX-M-7 CTX-M-28 CTX-M-2 CTX-M-9 CTX-M-3 Toho- CTX-M-2 FEC- CTX-M-26 CTX-M-24 CTX-M-27 Toho-2 Şekil 5: bla CTX-M saptanması amacıyla yapılan PZR deney sonucunun UV ışık altında agaroz jel fotoğrafı L H N P P2 N2 P3 L 5 bp 3 bp rrs L: bp ladder, H: distile su, N: TEM- üreten E. coli negatif kontrol kökeni, P: CTX-M- /2/9 grubu enzim üreten E.coli pozitif kontrol kökeni, P2: CTX-M -8 üreten C.amanolytica pozitif kontrol kökeni, N2: Çalışmada izole edilen negatif E. coli kökeni, P3: Çalışmada, izole edilen pozitif K. pneumoniae kökeni, rrs: 6S rrna internal kontrol

6 4. BULGULAR Araştırma kapsamında, GSBL üretimi fenotipik olarak gözlenen 2 Enterobacteriaceae kökenine ait bulgular incelenmiştir. Kökenlerin % 7.5 inin E.coli, % 26 sının Klebsiella spp. türlerinden olduğu saptanmıştır. Sayısal üstünlüğü oluşturan bu iki türe ilave olarak saptanan diğer türlere ait bilgiler tablo 5 de özetlenmiştir. Tablo 5: 2 Enterobacteriaceae kökeninin tür dağılımı Kökenler Ayaktan hasta Yatan hasta Toplam n (%) n (%) n (%) 94 (76,4) 47 (6) 4 (7.5) 27 (22) 24 (3) 5 (25.5) Klebsiella oxytoca Enterobacter aerogenes 2 () Enterobacter cloacae 3 3 (.5) Citrobacter freundii Proteus mirabilis 23 (6.5) 77 (38.5) 2 Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Toplam n: köken sayısı E.coli, hem ayaktan (94/23; %76.4) hem de yatan (47/77; % 6) hastalara ait örneklerden izole edilen kökenlerde baskın tür olarak saptanmıştır. Ayrıca, E. coli nin ayaktan hastalara ait örneklerden (94/4; %66.6) izolasyonu yatan hastalardan (47/4; %33.3) izolasyonundan daha yüksek oranda saptanırken, K. pneumoniae izolasyon oranları iki grupta da (27/5; %53, 24/5; %47) birbirine yakın oranlarda gözlenmiştir. İncelenen diğer türlerin ise daha yüksek oranda yatan hastalara ait örneklerden (6/8; % 75) izole edildikleri saptanmıştır (Tablo 5).

7 Kökenlerin % 83.5 i idrar örneklerinden izole edilmiştir. Diğer klinik örneklerin çeşitleri ve sayıları tablo 6 de aktarılmıştır. Tablo 6: GSBL üreten 2 Enterobacteriaceae kökeninin izole edildiği klinik örnekler Klinik örnek çeşitleri Ayaktan hasta Yatan hasta Toplam n (%) n (%) n (%) İdrar 2 (98.3) 46 (59.7) 67 (83.5) Yara (2.8) (5.5) Bronkoalveolar lavaj 7 (9) 7 (3.5) Periton sıvısı 3 3 (.5) BOS 2 2 () Biopsi 2 2 () Trakeal aspirat 2 2 () Konjonktiva 2 2 () Apse Kateter Servikal sürüntü Vajinal sürüntü 23 (6.5) 77 (38.5) 2 Toplam n: köken sayısı GSBL: Genişlemiş Spektrumlu Beta Laktamaz Ayaktan hastalara ait örnek çeşitleri içinde de idrar örneği (% 98.3) baskın oranda saptanırken yatan hastalara ait örneklerde idrara (% 59.7) ilave olarak invaziv örneklerden de (% 4.3) izolasyon gözlenmiştir. İdrar dışındaki klinik örnekler, vücudun flora bulunan bölgeleri dahil steril bölgelerinden toplanan örneklere kadar çeşitlilik göstermiştir (Tablo 6).

8 Kökenlerin izole edildiği örneklerin %35 inin pediatri klinik v e polikliniklerinden gönderildiği saptanmıştır. Klinik örneklerin gönderildiği diğer hastane birimleri ve gönderilen örnek sayıları tablo 7 de aktarılmıştır. Tablo 7: Klinik örneklerin toplandığı hastane birimleri Hastane Birimleri Poliklinik Klinik Toplam n (%) n (%) n (%) Pediatri 5 (4.6) 2 (26) 7 (35) Üroloji 24 (9.5) 8 (.3) 32 (6) Nefroloji 9 (5.4) 3 22 () 25 (32.4) 25 (2.5) Dahiliye 9 (7.3) 5 (6.5) 4 (7) Fizik Tedavi Rehabilitasyon 9 (7.3) 9 (4.5) Büyük Enfeksiyon 8 (6.5) 8 (4) Nöroloji 5 (6.5) 5 (2.5) Endokrinoloji 2 3 (.5) Genel Cerrahi 3 3 (.5) Ortopedi 3 3 (.5) Radyasyon Onkolojisi 2 () Beyin Cerrahi 2 2 () Kadın Doğum Nükleer Tıp 23 (6.5) 77 (38.5) 2 Yoğun Bakım Üniteleri Toplam n: köken sayısı Klinikler arasında en yüksek oranda örnek gönderilen birim, yoğun bakım üniteleri (%32.4) olmuştur. Ayrıca baskın örnek türünün idrar olması ile paralellik, göstererek. Üroloji (%9.5) ve nefroloji (%5.4) polikliniklerinden gönderilen örnek sayıları yüksek saptanmıştır (Tablo 7).

9 Çalışmaya dâhil edilen 2 kökenin antimikrobik disk difüzyon duyarlılık sonuçları tablo 8, tablo 9, tablo ve tablo de gösterilmiştir. Denenen penisilin türevlerine ve. kuşak sefalosporine duyarlı köken saptanmamıştır (Tablo 8). Tablo 8: 2 Enterobacteriaceae kökeninin penisilin,. ve 2. kuşak sefalosporin grubu antibiyotik disk difüzyon duyarlılıkları Antibiyotikler Ayaktan hasta Yatan hasta Toplam S I R S I R S I R AMP 23 77 2 PİP 23 77 2 CF 23 77 2 CXM 23 77 2 FOX (8.3) 3 (.5) (8.2) 6 (79.2) 3 (3.9) 3 (6.9) 6 (8.5) 6 (8) 23 (.5) Toplam 23 77 2 S: duyarlı, I: orta düzey duyarlı, R: dirençli n: köken sayısı AMP: Ampisilin, PİP: Piperasilin, CF: Sefalotin, CXM: Sefuroksim, FOX: Sefoksitin Sefoksitin dirençli kökenler %.5 oranında gözlenmiştir. Bu 23 kökenin, i E. coli, 6 sı K. pneumoniae olarak saptanmıştır. Ayaktan hastalara ait örneklerden izole edilen orta düzey sefoksitin duyarlı (%.5) kökenlerin oranı, yatan hastalardan (%3.9) daha yüksek oranda gözlenmiştir. Ayrıca yatan hastalara ait örneklerden izole edilen sefoksitin dirençli kökenlerin oranı (% 6.9), ayaktan hastalardan (% 8.) iki kat daha yüksek saptanmıştır (Tablo 8).

2 Üçüncü kuşak sefalosporin direncli kökenler sefiksim, seftriakson ve sefotaksim antibiyotiklerinde % 94 ile % 97 oranlarında gözlenirken, seftazidim de % 4 oranında saptanmıştır. Benzer şekilde ayaktan v e yatan hastalara ait örneklerden izole edilen kökenlerde sefiksim, seftriakson ve sefotaksim direnç oranları setazidimden daha yüksek gözlenmiştir (Tablo 9). Tablo 9: 2 Enterobacteriaceae kökeninin 3. ve 4. kuşak sefalosporin ve monobaktam grubu antibiyotik disk difüzyon duyarlılıkları Antibiyotikler Ayaktan hasta Yatan hasta Toplam S I R S I R S I R CFM 3 (2.5) 2 (97.5) 3 (4) 74 (96) 6 (3) 94 (97) CRO 3 (2.5) 9 (96.7) 2 (2.6) 5 (6.4) 7 (9) 3 (.5) 8 (4) 89 (94.5) CTX 5(4) 8 (96) 4 (5.2) 73 (94.8) 9 (4.5) 9 (95.5) CAZ 39 (3.7) 37 (3) 47 (38.3) 23 (3) 2 (27.2) 33 (42.8) 62 (3) 58 (26) 8 (4) FEP 29 (23.6) 2 (6.4) 74 (6) 2 (27.3) 8 (.4) 48 (62,3) 5 (25) 28 (4) 22 (6) ATM 9 (7.3) 24 (9.5) 9 (73.2) 6 (2.7) 6 (78) (5) 4 (2) 5 (75) Toplam 23 77 2 S: duyarlı, I: orta düzey duyarlı, R: dirençli n: köken sayısı CFM: Sefiksim, CRO: Seftriakson, CTX: Sefotaksim, CAZ: Seftazidim, FEP: Sefepim, ATM: Aztreonam Dördüncü kuşak sefalosporin ve aztreonam direncli kökenler ise sırasıyla %6 ve %75 oranlarında gözlenmiştir. Bu antibiyotiklere dirençli kökenlerin oranları da seftazidim dirençli (% 4) kökenlerden yüksek saptanmıştır (Tablo 9).

2 Beta laktam/ beta laktamaz inhibitörü kombinasyonları içinde kökenlerin en yüksek sefaperazon/sulbaktam (% 55) kombinasyonuna duyarlı olduğu saptanmıştır. Hem piperasilin/tazobaktam hem de sefaperazon/sulbaktam kombinasyonlarına orta düzey duyarlı (sırasıyla; % 47.5, % 35.5) kökenlerin oranı, direnç (sırasıyla; % 25.5, % 9.5) oranlarından daha yüksek saptanmıştır (Tablo ). Tablo : 2 Enterobacteriaceae k ö k e n inin β-laktam/β-laktamaz inhibitör kombinasyon ve karbapenem grubu antibiyotik disk difüzyon duyarlılıkları Antibiyotikler Ayaktan hasta Yatan hasta Toplam S I R S I R S I R AMC (9) 2 (6.3) 92 (74.7) (3) 9 (.6) 58 (75.4) 2 (.5) 29 (4.5) 5 (75) TZP 47 (38.2) 6 (48.8) 6 (3) 27 (35) 35 (45.5) 5 (9.5) 74 (37) 95 (47.5) 3 (5.5) SCF 63 (5.2) 5 (4.6) (8.2) 47 (6) 2 (27.3) 9 (.7) (55) 7 (35.5) 9 (9.5) ETP 23 77 2 İMP 23 77 2 MEM 23 77 2 Toplam 23 77 2 S: duyarlı, I: orta düzey duyarlı, R: dirençli n: köken sayısı AMC: Amoksisilin/klavulanik asit, TZP: Piperasilin/tazobaktam, SCF:.Sefaperazon/sulbaktam, ETP: Ertapenem, İMP: İmipenem, MEM: Meropenem Kökenlerin ayaktan ya da yatan hastalara ait örneklerden izole edilmelerinin, saptanan duyarlılık oranlarında belirgin farklar oluşturmadığı gözlense de orta düzey sefaperazon/sulbaktam duyarlı köken oranları ayaktan hastalarda ( % 4.6) yatan hastalardan (%27) daha yüksek saptanmıştır. Amoksisilin/klavulanik asit (%75) direnci gözlenen kökenlerin oranı ise diğer kombinasyonlardan çok daha yüksek saptanmıştır. Karbapenem direnci gözlenmemiştir (Tablo ).

22 Aminoglikozid seçenekleri arasında, kökenlerin en yüksek oranda dirençli oldukları antibiyotik tobramisin (%66.5) olarak gözlenirken, amikasin (% 85.5) duyarlılığı en yüksek oranda saptanmıştır. Hem ayaktan hem de yatan hasta gruplarından izole edilen kökenlerde aminoglikozid grubuna ait duyarlılık oranları birbirine yakın değerlerde gözlenmiştir (Tablo ). Tablo : 2 Enterobacteriaceae kökeninin beta-laktam dışı antibiyotik disk difüzyon duyarlılıkları Antibiyotikler Ayaktan hasta Toplam Yatan hasta S I R S I R S I R AK 6 (86) 9(7.4) 8(6.6) 65 (84.5) 4 (5.2) 8(.3) 7 (85.5) 3 (6.5) 6 (8) NET 975(77.3) 7(5.7) 2 (7) 58 (75.3) 4 (5.2) 5 (9.5) 53 (76.5) (5.5) 36 (8) GN 6 (48.8) 63 (5.2) 36 (46.7) 3 (4) 38 (49.3) 96 (48) 3 (.5) (5.5) NN 4 (32.5) 82 (66.6) 25 (32.4) 5 (66.2) 65 (32.5) 2 () 33 (66.5) CIP 44 (35.8) 79 (64.2) 27 (35) 5 (65) 7 (35.5) 29 (64.5) NOR 45 (36.6) 78 (63.4) 3 (39) 47 (6) 75 (37.5) 25 (62.5) SXT 33 (26.8) 89 (72.3) 6 (2.8) 6 (79.3) 49 (24.5) 5 (75) C 9 (74) 32 (26) 6 (79.2) 6 (2.8) 52 (76) 48 (24) F 93 (75.6) 5(4) 25 (2.3) 64 (83) 3 (7) 57 (78.5) 5 (2.5) 38 (9) Toplam 23 77 2 S: duyarlı, I: orta düzey duyarlı, R: dirençli n: köken sayısı GN:Gentamisin, AK:Amikasin, NN:Tobramisin, NET:Netilmisin, CIP:Siprofloksasin, NOR:Norfloksasin, SXT:Trimetoprim/sulfametoksazol, C:Kloramfenikol, F:Nitrofurantoin Fluorokinolon grubu antibiyotiklere dirençli kökenlerin oranları sırasıyla siprofloksasin için % 64.5, norfloksasin için % 62.5 olarak saptanmıştır. Aminoglikozid grubu duyarlılık oranlarıyla benzer şekilde ayaktan ve yatan hasta gruplarından izole edilen kökenlerde duyarlılık oranları birbirine yakın değerlerde gözlenmiştir (Tablo ). Beta laktam ve beta laktamaz inhibitörleri haricindeki antibiyotikler içinde, kökenlerde trimetoprim/sulfametoksazol gözlenmiştir (Tablo ). (%75) direnci en yüksek oranda

23 Klinik örneklerden izole edilen GSBL üreten 2 Enterobacteriaceae kökeni, blactx-m genlerini bulundurması açısından PZR yöntemi kullanılarak incelenmiştir. 67 kökenin (%83.5) blactx-m genlerini bulundurduğu saptanmıştır. Bu kökenlerde gözlenen gen gruplarına, tür çeşitlerine ve hasta kaynaklarına ait bulgular tablo 2 de gösterilmiştir. Tablo 2: CTX- M tipi beta laktamaz geni saptanan kökenlerin türlere ve ayaktan/yatan hastalara göre dağılımı CTX-M Grupları CTX-M- veya CTX-M-2 veya CTX-M-9 CTX-M-8 veya CTX-M-25 Toplam Ayaktan hasta Yatan hasta Ayaktan hasta Yatan hasta n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) Escherichia coli 87 (82) 45(73) 32 (79) Klebsiella pneumoniae 8 (7) 6 (26) 34 (2.3) Klebsiella oxytoca Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Proteus mirabilis 6(63.4) 6(36.6) 67 Kökenler Toplam n: köken sayısı CTX-M-8 v e y a C T X -M-25 enzim gruplarını bulunduran kökene rastlanmamıştır. 32 kökenin (%79) E. coli, 34 kökenin (%2) K.pneumoniae ve kökenin K. oxytoca türleri olduğu saptanmıştır. Kökenlerin %63.4 ünün ayaktan hastalara ait örneklerden, %36.6 sının ise yatan hastalara ait örneklerden izole edildiği saptanmıştır (Tablo 2).

24 Çalışmamızda disk difüzyon yöntemi ile 9 kökende orta düzey sefotaksim duyarlılığı gözlenmiştir. Bu kökenlerde blactx-m genleri saptanmamıştır. Bununla birlikte, seftazidim direnci gözlenen 8 kökenin 57 sinde blactx-m genleri bulunduğu saptanmıştır. Sefoksitin direnci gözlenen 7 kökenin ise 4 ünde blactx-m genleri saptanmıştır. CTX-M enzim grupları saptanan kökenlerde gentamisin, siprofloksasin ve trimetoprim/sulfametoksazol direnç oranları şekil 6 da gösterilmiştir. Şekil 6: bla CTX-M pozitif E. coli ve K. pneumoniae kökenlerinde GN, CİP ve SXT duyarlılık % oranları 9 79 8 69 7 6 5 88 72 5 5 E. coli K. pneumoniae 4 3 2 GN CİP SXT GN: Gentamisin, CİP: Siprofloksasin, SXT: Trimetoprim/sulfametoksazol

25 5. TARTIŞMA Geniş spektrumlu s e f a l o s p o r in grubu antibiyotiklere dirençli Enterobacteriaceae kökenlerind e C T X -M tipi GSBL üretimi, son 2 yılda tanımlanmış, hızlı yayılım gösteren direnç mekanizmalardandır. CTX-M pandemisi olarak adlandırılan, dünya genelindeki CTX-M yayılımı; bakteriyel patojenler arasında plazmidle taşınan direnç elemanlarının hızlı ve global yayılımına en dikkat çekici örnektir. Enzimin dramatik yayılımının sebepleri henüz tam olarak anlaşılamamıştır (Rossolini ve ark. 28). Enzim üretimine en sık Klebsiella spp ve E. c o l i t ü rlerinde rastlanmaktadır ( C a n t ón ve Coque 26, Falagas ve Karageorgopoulos, 29). Araştırmamıza ait veriler de benzer bulgular göstermiştir. İlk başlarda, GSBL nin major kaynağı haline gelen E. coli kökenleriyle enzim yayılımı daha yüksek oranda toplumdan bildirilmiştir. Bu nedenle, hastane ortamına CTX-M girişinin, hastanenin yarattığı selektif ortamdan ziyade toplum merkezli olabileceğinden şüphelenilmektedir (Cantón ve Coque 26). Çalışmamıza dahil edilen kökenlerin, % 7.5 i E. coli dir ve toplamda kökenlerin % 6.5 i ayaktan hastalardan izole edilmiştir. Aynı zamanda, yaygın antibiyotik kullanımı nedeniyle hastane ortamının, diğer bir major kaynak olan K pneumoniae türlerinin E. coli ve diğer türlere gen transf e r e d e n CTX-M ü r e t e n vektörler haline gelmesine ortam yaratabileceği düşünülmektedir (Meglič ve ark. 29). Hastane ortamında dirençli bakterilerin başlıca kolonize oldukları ve salgın yapabildikleri hasta grubunu yoğun bakım uygulanan hastalar oluşturmaktadır (Denton 27). Ç a l ışmamıza dahil edilen kökenlerin yatan hastalar içinde yoğun bakım hastalarından izolasyon oranı (%32.4) ilk sırada gelmektedir. İnfeksiyon kontrolü amacıyla yapılan sürveyans çalışmalarından edinilen bilgilerde, GSBL saptanan yatan hastalarda; idrar yolu infeksiyonu spesifik risk faktörleri arasında bildirilmektedir (Colodner ve ark. 24). Çalışmamıza dahil edilen kökenlerin çoğunluğu hem yatan (%59.7) hem de ayaktan (%98.3) hastalarda idrar yolu infeksiyon etkenleridirler. Colodner ve ark. (24) GSBL üreten bakterilerin neden olduğu toplum kökenli idrar yolu infeksiyonu gelişiminde hasta yaşını bağımsız risk faktörleri arasında bildirmişlerdir. Buna göre, özelikle yetişkin hastalar

26 risk grubundadır. Çalışmamızda d a ayaktan ve yatan yetişkin hastaların oranı (%59.4, %74 ) çocuk hastalardan (%4.6, %26) yüksek saptanmıştır. 99 lı yıllarda, özellikle nozokomiyal salgınlarla ilişkili olmak üzere artan sayıda TEM- ve SHV- türevi GSBL lar dünyanın çeşitli ülkelerinden bildirilmiştir. Günümüzde, CTX-M ailesi çoğunlukla toplum olmak üzere hastne ortamında da en sık karşılaşılan GSBL tipidir (Cantón ve Coque 26, Denton 27). Nitekim çalışmamızda, blactx-m geni araştırılan 2 kökenin 67 sinde CTX-M tipi GSBL üretimi genotipik olarak doğrulanmıştır. Denton (27) yaptığı araştırmada, sefalosporin dirençli E. coli kökenlerinin %5, Klebsiellae spp. kökenlerinin ise %8 oranlarında CTX-M tipi GSBL üretiklerini bildirmiştir. Rossolini ve ark. (28) yaptığı araştırmada, CTX-M üretme oranlarını E.coli kökenlerinde %89, K. pneumoniae kökenlerinde %58 olarak bildirmiştir. Çalışmamızda ise, CTX-M üreten 67 kökenin içinde E. coli (%79), Klebsiellae spp.(%2) kökenlerinden daha yüksek oranda saptanmıştır. Yakın geçmişte, Japonya dan Toho-2; Çin den CTX-M-3, CTX-M-9, CTXM-3, CTX-M-4; Vietnam dan CTX-M-4, CTX-M-7; Taivan dan CTX-M-3, CTX-M-4; Kore den CTX-M-4; Hindistan dan CTX-M-5; Kenya dan CTX-M2; Rusya, Macaristan, Letonya dan CTX-M-5; Polonya dan CTX-M-3, CTX-M-5; Yunanistan dan CTX-M-3; İspanya dan CTX-M-9, C T X -M-, C T X -M-4; Fransa dan CTX-M-, CTX-M-2, CTX-M-3, CTX-M-9, CTX-M-4, CTX-M-2, CTX-M-2 enzimlerinin neden olduğu salgınlar bildirilmiştir (Stürenburg ve Mack 23). Günümüzde, çoğu Avrupa ülkesinde, Asya da ve Güney Amerika da CTX-M tipi GSBL lar e ndemik olarak bulunurken, Kuzey Amerika da ise Kanada haricinde Amerika Birleşik Devletleri nden sporadik vakalar bildirilmektedir. C T X -M tipi enzimler, birbirinden uzak bölgelerde gözlense ve hatta farklı ülkelerde benzer enzimler tanımlansa dahi her bölgeye ait baskın enzimler bulunmaktadır (Navarro ve M i r ó 2 2 ). Belirili ülkelerden yaygın olarak bildirilen CTX-M enzimleri, İspanya dan CTX-M-9 ve CTX-M-4, İtalya dan CTX-M-, Güney Amerika ülkeleri, Japonya ve İsrail den CTX-M-2 şeklindedir. Ayrıca CTX-M-5 ise t ü m dünya genelinden bildirilmektedir (Cantón ve Coque 26, Meglič ve ark. 29). Ülkemizde CTX-M tipi enzimlerin prevalansı ve dağılımı ile igili veriler sınırlı sayıdadır. Bununla birlikte, Paterson ve ark. (23), inceledikleri 9 K.