TAŞIYICI ENZİMLERDEKİ GENETİK POLİMORFİZMLERİN İLAÇ YANITINA ETKİLERİ

TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TAŞIYICI ENZİMLERDEKİ GENETİK POLİMORFİZMLERİN İLAÇ YANITINA ETKİLERİ FERDA BAŞAR FARMASÖTİK TOKSİKOLOJİ ANABİLİM DALI TEZSİZ YÜKSEK LİSANS DÖNEM PROJESİ DANIŞMAN: Doç. Dr. Sinan SÜZEN 2006-ANKARA

iii İÇİNDEKİLER KABUL VE ONAY II İÇİNDEKİLER III ÖNSÖZ V SİMGELER VE KISALTMALAR VI ŞEKİLLER VII TABLOLAR VIII 1.GİRİŞ VE AMAÇ 1 2.GENEL BİLGİLER 2 2.1.İlaç Yanıtını Etkileyen Faktörler 4 2.1.1. Vücut ağırlığı, dağılım hacmi 4 2.1.2. Yaş 4 2.1.3. Absorbsiyon 5 2.1.4. İlacın veriliş yolu 5 2.1.5. İlacın veriliş zamanı 5 2.1.6. Çevresel faktörler ve diyet 5 2.1.7. Önceden var olan hastalık hali ve özel durumlar 6 2.1.8. İlaç etkisini tamponlayan ikincil olaylar 6 2.1.9. Tolerans ve desensitizasyon 6 2.1.10. Genetik faktörler 7 2.2. Genetik farklılığa göre ilaçların metabolizma ve etkilerinin bireyler arasında değişmesi 7 2.2.1. Genetik mekanizma 8 2.2.2. Genetik polimorfizm 9 2.2.3. Genetik faktörlere bağlı etki değişikliğinin üç ana türü 9 2.3. İlaç taşıyıcı enzimler ve genler 11 2.3.1. MDR 1geni ve P-glikoprotein 12 2.3.2. Yapısı 13 2.3.3. Yeri ve görevi 14 2.3.4. Substratları 16

iv 2.3.5. MDR 1 polimorfizmleri 18 2.3.6. İnsan MDR 1 genindeki polimorfizmleri 25 3. GEREÇ VE YÖNTEMLER 27 4.BULGULAR 28 4.1. Çeşitli populasyonlarda MDR 1 polimorfizmleri 28 4.2. MDR 1 polimorfizmi ve hastalık ilişkisi 30 4.2.1. P-gp ve Ülserit Kolit 30 4.2.2. P-gp ve HIV enfeksiyonu 31 4.2.3. P-gp ve Renal Kanser 32 4.3. MDR 1 polimorfizmi ve teratojenite 32 4.4. MDR 1 polimorfizmi ve ilaç tedavileri 33 4.4.1. Kardiyak glikositler 33 4.4.2. İmmunosupresanlar 34 4.4.3. Trisiklik antidepresanlar 35 4.5. MDR 1 polimorfizmin Türk toplumundaki bulguları ve bunların akut lösemi hastalar üzerindeki etkileri. 36 4.6. Polimorfizmlerin tedavi üzerine etkileri 49 4.6.1. Farmakokinetik sonuçlar 49 4.6.2. Farmakodinamik sonuçlar 52 5. SONUÇ 56 ÖZET 57 SUMMARY 58 KAYNAKLAR 59 ÖZGEÇMİŞ 62

v ÖNSÖZ Dört yıl içerisinde aldığım Yüksek Lisans eğitimi sonunda yaptığım Taşıyıcı Enzimlerdeki Genetik Polimorfizmlerin İlaç Yanıtına Etkileri isimli dönem projemin etkili ve doğru ilaç kullanımına katkı sağlayacağı inancındayım. Bu proje benimde bu konuda daha ayrıntılı bilgi edinmemi sağlamıştır. Bundan dolayı; dönem projesi hazırlanırken çalışmalarımın her aşamasında beni yönlendiren ve desteğini esirgemeyen Sayın Doç. Dr. Sinan SÜZEN e teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca bu aşamaya gelinceye kadar bana emeği geçen tüm Farmasötik Toksikoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyelerine ve aileme teşekkür ederim.

vi SİMGELER VE KISALTMALAR MDR : Multiple Drug Resistance ( çoklu ilaç direnci ) P-gp : P-glikoprotein CsA : Siklosporin SNP : Single Nucleotide Polymorphisms (tek nüklotit polimorfizm) AML : Akut Myeloblastik Lösemi ALL : Akut Lenfoblastik Lösemi ATRA : All-Trans Retinoik Asit MMS : Merkezi Sinir Sistemi

vii ŞEKİLLER Şekil 1 : İlaçların emilim, dağılım, yıkılım ve atılımı 3 Şekil 2 : P-glikoprotein in görevi 15 Şekil 3 : İlaç yanıtında genetik polimorfizmin etkisi 18

viii TABLOLAR Tablo 1: İlacın dağılımı ve etkisi için önemli dokulardaki P-glikoprotein yeri 15 Tablo 2: P-glikoprotein in substratı olan ilaçlar 17 Tablo 3: Kafkaslarda genotip ve alel frekanslarını içeren polimorfizmlerinin özeti 20-21 Tablo 4: İlaç atılımında MDR 1 polimorfizminin etkisi 22-23 Tablo 5: Etnik populasyonlardaki ekson 26,21,ve 12 deki MDR 1 polimorfizmlerinin alel frekansları 29-30 Tablo 6: Akut lösemi hastalarının yaşları, bölgeleri, lösemi tipleri,verilen ilaçları ve fenotipleri 38-42 Tablo 7: Çeşitli alellerin MDR 1 polimorfizm bölgeleri, restriksiyon enzimleri ve parça uzunlukları 43 Tablo 8: Farklı populasyonlarda gözlenen G2677 T polimorfizmdeki alel ve genotip frekansı 44 Tablo 9: Farklı populasyonlarda gözlenen T- 129 C polimorfizmdeki alel ve genotip frekansı 44 Tablo10: Ekson 21 ve 26 polimorfik bölgelerdeki haplotipler ve ilaca dirençli, duyarlı fenotipler 45 Tablo11: C3435 T ve G2677 T polimorfizmleri sonucu oluşan haplotip sayıları 46

1 1.GİRİŞ VE AMAÇ Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) ilacı; fizyolojik sistemleri veya patolojik durumları insanın yararı için değiştirmek veya incelemek amacıyla kullanılan veya kullanılması öngörülen bir madde veya ürün olarak tanımlamaktadır. Günümüzde ilaç kullanımında karşılaşılan en önemli sorunlardan biri bireyler arasında ilaç yanıtındaki farklılıklardır. Bu farklılıklar klinikteki ilaç kullanımında ciddi sonuçlar doğurabilmektedir. İlaç yanıtına etki eden çeşitli faktörler arasında; vücut ağırlığı, dağılım hacmi, yaş, absorbsiyon, ilacın veriliş yolu, ilacın veriliş zamanı, çevresel faktörler ve diyet, tolerans ve desensitizasyon, genetik faktörler yer almaktadır. Son yıllarda İnsan Genom Projesi nin tamamlanmış olması ve genetik analizlerle ilgili yöntemlerin daha kolay hale gelmesi ile ilaç yanıtına etki eden unsurlardan genetik faktörler hakkında daha fazla ve güvenilir bilgiler elde edilmeye başlanmıştır. Bu iki alandaki gelişmeler ilaç yanıtındaki farklılığın genetik temeli konusunda bütün dünyada çalışmaların hızla artmasına neden olmuştur. Bu konuda çeşitli ilaç grupları ve bu ilaç gruplarının organizmadaki metabolizmaları, etki şekli ve mekanizmasında rol oynayan enzimleri kodlayan genler hakkında da bulgular çoğalmıştır. İnsan Genom Projesi ile ilaçla ilgili enzimleri kodlayan genlerin dizinimleri kolay bir şekilde elde edilmektedir. İlacın etki göstermesinde rol oynayan çeşitli genler arasında taşıyıcı enzimleri kodlayan genler hakkında da yeterli bilgiye erişilmiştir. Yapılan çalışmalarda bu taşıyıcı enzimlerde polimorfizmler olduğu ve bunların gerek ilaç etkisine gerekse de ilacın oluşturabileceği yan etkiler konusunda önemli potansiyele sahip olduğu anlaşılmıştır. Projenin amacı elimizde var olan bilgiler ışığında, ilaç yanıtına etki eden faktörlerden biri olan ilaç taşıyıcı enzimlerdeki genetik polimorfizmin araştırılması, bunun ilaç yanıtına etkisinin ve sonucunda bireyler arasında görülen farklılıkların incelenmesidir. Ayrıca bu proje ile elde edilen bilgilerle ilaç etkinliğini arttırmak, kişiye uygun ilaç dozunu ayarlamak, toksik etkileri en aza indirmek, yan etkileri azaltmak ve gereksiz ilaç kullanımını yok etmek hedeflenmektedir.

2 2. GENEL BİLGİLER İlaçla tedavinin amacı çeşitli hastalıkları önlemek, hastalık etkilerini azaltmak veya kontrol altında tutmaktır. Bu amaca ulaşabilmek için toksik düzeylere çıkmayacak kadar yeterli ilaç dozlarını hedef dokulara ulaştırmak gereklidir. İlaçların etkisinin vücutta ortaya çıkış hızını, ilaç etkisinin şiddetini ve ilacın etki süresini kontrol eden dört temel mekanizma olduğu bilinmektedir (Şekil 1). Birincisi ilaç uygulanış bölgesinden emilip (doğrudan veya dolaylı olarak) plazmaya geçer(emilim). İkincisi ilaç kan dolaşımını geriye dönüşümlü olarak terk eder, hücreler arası ve hücre içi sıvıya dağılır (dağılım). Üçüncüsü ilaç karaciğer, böbrekler veya diğer dokular tarafından metabolize edilebilir. Son olarak ilaç ve metabolitler idrar, feçes veya safra yoluyla vücuttan atılır (atılım)(mycek ve ark.,2001)

3 ( Şekil 1 ) Uygulama Alanındaki İlaç Etkisi 1 Emilim Plazmadaki İlaç 2 Dağılım Dokulardaki İlaç 3 Metabolizma Dokulardaki İlaç Metabolitleri 4 Atılım İdrar, feçes ve safradaki İlaç ve / veya ilaç metabolitleri Şekil 1: İlaçların emilim, dağılım, yıkılım ve atılımı (Mycek ve ark., 2001 ).

4 2.1 İlaç Yanıtını Etkileyen Faktörler İlaçların vücuttaki etkisi çok çeşitli faktörler tarafından değiştirilebilir. Bu faktörlerden bazıları ilacın farmakokinetiğini farklılaştırmak suretiyle, onun etki yerindeki konsantrasyonunu değiştirirler ; etkideki değişme buna bağlıdır. Diğer bazı faktörler ise ilacın farmakokinetiği üzerinde bir değişme yapmaksızın hedef organ veya hücrelerin cevap verme yeteneğini değiştirmesidir. Radyoligand bağlama yöntemi ile reseptörlerin işaretlenmesi suretiyle, onların dokudaki sıklıklarını (dansitelerini ) ve afinitelerini ölçmek mümkün olduğundan, son zamanlarda etkiyi değiştiren bazı faktörlerin reseptörlerle ilgili bu parametreleri ( özellikle dokudaki reseptör sıklığını ) etkiledikleri anlaşılmıştır. Klinikte rasyonel ve yeterli bir tedavi yapmak için ilaç etkisini etkileyen faktörleri hatırda tutmak, bu faktörlerin hastada bulunup bulunmadığını araştırmak ve dozları hastanın durumuna göre ayarlamak gerekmektedir(kayaalp, 2000). İlaç etkisini değiştiren aşağıda yazılı ve önem dereceleri farklı faktörlere değinmeden önce bir noktanın uygulanması gerekir. Söz konusu faktörlerin bir bölümü, birbirinden bağımsız değildir, bir faktör, diğerlerinden birini veya birkaçını etkileyebilir(kayaalp, 2000). 2.1.1. Vücut ağırlığı, dağılım hacmi Vücut ağırlığı ( kişinin cüssesi ), ilacın dağıldığı sıvı kompartımanlarının ve dokuların hacmini yansıtır. Bu hacimlerin büyüklüğüne göre ilacın dağıldığı yerlerdeki, bu arada kandaki ve etki yerindeki, konsantrasyonu farklı olur. 2.1.2 Yaş Yaşın ilaç etkisini değiştirmesi esas itibariyle, yaşa göre vücut cüssesinin farklı olmasından ve kısmen de uç yaşlarda ( yeni doğan ve bebekler ile yaşlılarda) daha belirgin olmak üzere ilacın elimilasyon hızının yaşa göre değişkenlik göstermesinden ileri gelir.

5 2.1.3. Absorpsiyon azalması ve elimilasyon organlarının hastalıkları Şok ve konjestif kalp yetmezliği hallerinde ilaçların absorpsiyonu; dokulardan geçen kan akımı azaldığından ileri derecede azalır.böbrek hastalıkları, ilaçların renal itrah hızlarının azalması nedeniyle onların etkinliğinde artmaya yol açar. 2.1.4. Veriliş yolu İlaçların çeşitli, veriliş yerlerinden absorbsiyonlarının hız ve dereceleri yani biyoyararlanımları farklı olduğundan, dozun veriliş yoluna göre ayarlanması gerekir. 2.1.5. Veriliş zamanı İlaçların absorbsiyon, dağılım, metabolizma ve itrahını etkileyen çeşitli fizyolojik fonksiyonların gün içi ritim gösterdikleri bilinmektedir. 2.1.6. Çevresel faktörler ve diyet. Çevre kirlenmesine neden olan çeşitli maddelerin, biyotransformasyon yapan enzimleri etkileyerek ilaç etkisinde değişiklik yapması mümkündür. Bu maddelerden tarımsal savaşım aracı olarak kullanılan poliklorlu bifeniller DDT ve benzeri organik klorlu insektisitler ve kömür ile petrol ürünlerinin yanması sonucu havaya karışan benzopiren ve benzeri polisiklik aromatik hidrokarbonlar belirli mikrozomal enzimleri indüklerler. DDT ve lindon a maruz kalan fabrika işçilerinde antipirin metabolizmasının bunlara maruz kalmayan kişilerdekine göre iki kez daha hızlı olduğu saplanmıştır. Kişinin aldığı besinlerin içinde bulunan doğal maddelerin, katkı maddelerinin, beslenme yetersizliğinin, alkol ve kahve gibi içkilerin ilaca karşı kişinin reaksiyonunda değişiklik yapması mümkündür(kayaalp, 2000).

6 2.1.7. Önceden var olan hastalık hali ve özel durumlar Karaciğer ve böbrekler gibi eliminasyon organları dışında, diğer organları ilgilendiren hastalıklar da ilaçların etkinliğini değiştirebilirler. Bu nedenle bazı ilaçların etkileri normal kişilerde ve belirli bir hastalığı olanlarda nitelik ve / veya nicelik bakımından farklı olabilir. Mesela; trisiklik antidepresanlar normal kimselerde daima sedasyon yaptıkları halde endojen depresyonlu hastalarda uygulamaya başlandıktan birkaç hafta sonra psişik eksitasyon yaparlar(kayaalp, 2000). 2.1.8. İlaç etkisini tamponlayan ikincil olaylar İlacın vücutta belirli sistemlerde yaptığı değişime, bu sistemlerle ilgili nöral veya hormonal homeostoz mekanizmalarını aktive ederek etkiyi azaltmaya yönelik ayarlamalara neden olabilir. Örneğin antihipertansif ilaçların çoğu, kan basıncını düşürerek ve böbrek kan akımını azaltarak vücutta su ve tuz tutulmasına neden olurlar; bunun sonucu kan basını düşürücü etkilerinde azalma olur(kayaalp, 2000). 2.1.9. Tolerans ve desensitizasyon Bazı ilaçlar uzun süre devamlı kullanıldıkları zaman, başlangıçtaki dozun etki şiddetinin giderek azaldığı ve etki süresinin kısaldığı görülür. Aynı tesiri idame ettirmek için dozu gittikçe arttırmak gerekir. Bu duruma tolerans denir. Vücutta etkisine karşı tolerans oluşan ilaçların birçok örnekleri vardır. Bir örnek opioid analjeziklerdir, bu ilaçların kesintisiz bir şekilde yinelenerek verilmeleri halinde ağrı kesici etkiyi devam ettirebilmek için dozun giderek arttırılması gerekir. Desensitizasyon, genellikle in vitro (izole organlarda) agonist uygulanması sonucu bir saniyeden birkaç saate kadar değişen kısa bir süre içinde hedef hücrelerin cevap verirliliğinin azalmasını ifade eder(kayaalp, 2000).

7 2.1.10. Genetik faktörler Genetik faktörler ilaç metabolizmasını bireylerde ilaçların eliminasyon hızını, ilaç reseptörlerinin ve hedef hücrelerdeki diğer yapıların niteliğini ve niceliğini değiştirerek ilaç etkisini bireyler arasında, etnik gruplar ve ırklar arasında değişkenlik göstermesinde önemli rol oynarlar(kayaalp, 2000). 2.2. Genetik Farklılığa Göre İlaçların Metabolizma Ve Etkilerinin Bireyler Arasında Değişmesi Bazı kişilerde genetik yapıdaki değişikliğe bağlı olarak belirli protein tiplerinin, bu arada enzimlerin, yapısının bozulduğu yada eksik oldukları ve bunun sonucu bazı metabolizma hastalıklarının oluştuğu eskiden beri bilinmektedir. İlaçların eliminasyonu da büyük ölçüde enzimler aracılığı ile yapılan metabolik değişmelere bağlı olduğundan genetik yapıdaki değişiklikler, bazı kişilerde ilaçların farmakokinetiğinde anormal değişmelere neden olabilmektedir. Ayrıca hücrelerde ilaç etkisini başlatan reseptör proteini de genetik bozukluğa bağlı olarak kantitatif bakımdan farklı olabilir. Bu nedenle ilaca karşı, farklı cevap ilacın farmakokinetiğinde bir değişiklik olmaksızın reseptörlerin modifikasyonuna veya azalmasına da bağlı olabilir(kayaalp, 2000). Genotipik değişikliklere bağlı olarak bazı kişilerde ilaç metabolizmasının ve etkisinin kantitatif veya kalitatif bakımdan gösterdiği farklılık, kalıtsal olarak ana babadan dominant veya resesif bir karakter şeklinde sonraki kuşağa geçer. İdiyosenkrazi değimi yakın zamana kadar kimyasal maddelere karşı bireyin diğer bireylerden farklı cevap vermesi olarak tanımlanmakta idi. Son otuz beş yıldan beri, ilaç kinetiğini ve ilaçlara karşı kişinin verdiği cevabın genetik yapıya göre bireyler arasında değişmesi ile ve buna bağlı olarak ilaç etkiliğini interetnik (etnik gruplar arası) değişmesi ile uğraşan farmakogenetik adlı bir bilim dalı ortaya çıkmıştır(kayaalp, 2000). Biyotransformansyonda rol oynayan enzimlerin hücrelerde yapımının veya ilaçla ilgili diğer fonksiyonel önemli moleküllerin ve olayların genetik kontrolü manyetik veya polijenik şekilde yapılır. Monojenik kontrolde, bir kromozomda

8 belirli tek bir lokusta yerleşmiş alel genler tarafından kontrol söz konusudur. Bu durumda fenotipik karakterin kantitatif değerinin, populasyon içindeki bireylerde dağılımına ilişkin eğri daha doğrusu sıklık dağılım histogramı birden fazla donuk (mod) gösterir. Buna polimodal dağılımı denir. Polimodal dağılımın en basit şekli bimodal dağılımıdır; bimodal dağılım gösteren bir karakter tek bir lokustaki iki alel gen türü tarafından kontrol edilir ve sadece iki fenotip ile ifade edilir. Polijenik kontrolde ise olay, birden fazla lokustan yerleşmiş alelik genler tarafından kontrol edilir ve her bir lokustaki dominant gen fenotipik karakterin oluşmasına kuvantal katkıda bulunur, bu karakterin değeri kuvantumların toplamına bağlıdır. Söz konusu değerin bireyler arasında dağılımı kesintisizdir. Bu nedenle populasyon içinde böyle bir karakterin çeşitli derecelerinin dağılımı, tıpkı boy ve kan basıncı dağılım eğrisinde olduğu gibi ünimodal bir eğriye uyar(kayaalp, 2000). 2.2.1. Genetik Mekanizma Anne ve babadan çocuklara kalıtım sağlayan birimler yani gen ler kromozomlar, üzerinde yerleşmiş olup DNA moleküllerinin birer parçasıdırlar. Türlere göre genlerin sayısı farklıdır. Örneğin insanların 23 çift kromozomu olup, 22 çifti otozomal, bir çift cinsiyet kromozomudur. Kadınlarda cinsiyet kromozomları XX, erkeklerde XY dir. Böylece erkeklerdeki cinsiyet kromozomu çiftinin biri cinsiyeti tarif eden kromozom olup diğeri (Y) cinsiyet kromozomu değildir. Kromozomların aynı yerinde yerleşmiş gen çiftlerinin her biri aleldir. X kromozomu üzerinde yerleşmiş genle geçen kalıtım cinsiyete bağlı kalıtımdır. X- kromozomal karakterde erketen erkeğe kalıtım yoktur. Y- kromozomal karakterde ise ancak erkekten erkeğe geçer. Cinsiyet kromozomu dışındaki 22 çift alelle taşınan karakter otomozomal karakter olarak tanımlanır. Bu şekil kalıtım cinsiyete bağlı değildir. Her iki cinste de aynı oranda görülür. Canlının tanınabilen çeşitli karakterleri (boy,ağırlık,vs gibi) o organizmanın fenotiplerini oluşturur. Çocukların bu fenotipleri oluşturması için anne ve babadan aldıkları cevher genotip olarak adlandırılır(vural, 1996). Belirli bir lokusta bulunan ve belirli bir fenotipi kontrol eden genleri yani alelleri ikiden fazla tipi bulunabilir. (Örneğin plazma psödokolinesterazi fenotipini

9 en az dört alel türü kontrol eder) Belirli bir lokustaki gen çiftini oluşturan aleller birbirinin aynı ise, kişi bu gen (alel) ve onun temsil ettiği fenotip karakter bakımında homozigottur. Bir alelin temsil ettiği fenotipik karakter, homozigot bireyler yanında heterozigot olanlarda da ortaya çıkıyorsa dominant alelden söz edilir; bu durumda diğer alelin temsil ettiği fenotip, sadece resesif homozigot bireylerde ortaya çıkar. Bazen hem dominant ve hem de resesif alel fenotipe katkıda bulunur (ko-dominant kalıtım)(kayaalp, 2000). 2.2.2. Genetik Polimorfizm Genetik durumlar bazı ilaçların yukarıda değinildiği gibi farmakokinetiğini ve/ veya farmakodinamiğini etkiler ve monojenik geçiş gösterir. İlaç etkisi bireyler arasında değişiklik göstermesine yol açan bu durumların bir kısmı polimorfizmler, bir kısmı da nadir fenotipler şeklinde tanımlanır(kayaalp, 2000). Polimorfizm (poli+morfizmos kelimelerinden oluşmuştur) çok şekillilik anlamında bir sözcüktür. Organizmalarda birden fazla yapısal varyasyon (çeşitlilik) gösteren proteinlere polimorfik proteinler adı verilir(vural, 1996). Polimorfizm denildiğinde genellikle genetik polimorfizm anlaşılır. Genetik polimorfizm, aynı populasyonda, bir lokusta iki veya daha fazla alelin belli bir frekansta görülmesi şeklinde tanımlanabilir. Genetik polimorfizm, normal populasyonda en az iki fenotipin bulunduğu ve bu fenotiplerden birisinin frekansının % 1 den fazla olduğu monojenik bir özelliktir; bu genetik polimorfizm dar anlamda bir tanımıdır(vural, 1996). 2.2.3. Genetik faktörlere bağlı etki değişikliliğinin üç ana türü İlaç etkisinin genetik polimorfizme göre değişiklik göstermesi ile ilgili başlıca üç durum ayırt edilir. 1. İlaç farmakokinetiğinde, genetik faktörlere bağlı değişikler İlaçların farmakokinetiğinde genetik faktörlere bağlı olarak ortaya çıkan değişikliklere ait örnekler, özellikle ilaç metabolizması ile ilgilidir. İlaçların metabolizmasından sorumlu olan enzimlerin sentezinin veya yapısının bozulmuş

10 olduğu fenotipe yavaş metabolizör, normal olduğu fenotipe ise hızlı metabolizör adı verilir. Yavaş metabolizörlerde ilaç eliminasyon hızı azalır, genellikle ilacın etkisi şiddetlenir ve toksik belirtiler ortaya çıkabilir. İlaçların böbreklerden itrahı genetik polimorfizm göstermez. Herhangi bir ilacın renal klerensi yaş ve ağırlık bakımından eşlenmiş sağlıklı bireylerde fazla farklı değildir. Benzer şekilde ilaçların karaciğerden safraya değişmeden itrah edilmesi olayı da bireyler arasında pek değişkenlik göstermez. İlaç absorpsiyonunda ve dağılımında genetik faktörlerin katkısı konusunda yeterli bilgi mevcut değildir(kayaalp, 2000). İlacın eliminasyon hızının genetik yapıya göre değişmesinin ana nedeni, ilaç metabolizmasında rol alan enzimlerin sentez hızının veya niteliğinin genetik polimorfizm göstermesidir. Enzim polimorfizmin, o enzimin sentez ettiren genin noksan veya inaktif olması şeklindeyse bu enzim üzerinden olan ilaç metabolizması meydana gelmez. Eğer enzim azalmış olarak kısmen sentez ediliyorsa metabolizma hızı azalmıştır. Diğer bir durum genetik polimorfizmin sentez edilen enzimde fonksiyonel bozukluğa yol açmasıdır; bu durumda ilacın substrata özgüllüğü değişir. İlacın polimorf enzim varyantı ile metabolizma hızının azalması genellikle etkinin şiddetlenmesi ve toksik belirtilerin ortaya çıkması ile sonuçlanır. Bunun bir örneği uzun süren süksinilkolin apnesi dir(kayaalp, 2000). Süksinilkolin plazmadaki psödokolinesteraz tarafından süksinilmonokoline hidroliz edilmek suretiyle inaktive edilen çizgili kas felç edici bir ilaçtır. Yıkımı çabuk olduğundan mutad İ.V. dozunun yaptığı kas felci ve buna bağlı apne 2-10 dakika kadar sürer. Bazı kişilerde plazmadaki psödokolinesteraz atipik şekildedir ve sülsinilkolin in etki süresi uzamıştır. Bu gen, dünyada oldukça yaygın olup bir çok toplumlarda % 2 sıklıkta rastlanmaktadır. Bu enzimi taşıyan, otozomal resesif karakter gösterir, her iki cinste de görülür(kayaalp, 2000). 2. İlaç farmakodinamiğinde genetik faktörlere bağlı değişiklikler Alyuvarlarda glikoz 6-fosfat dehidrojenaz eksikliği olan kimselerde bazı ilaçların yaptığı hemolitik anemiler: Alyuvarlarında adı geçen enzimin eksik bulunduğu kişilerde, başta anilin, nitrobenzen ve hidrozin türevi ilaçlar olmak üzere, kendisi veya vücutta oluşan

11 metaboliti oksidan özellik gösteren birçok ilaç akut hemolize neden olur. İlacın alınmasına devam edildiğinde hemoliz devam etmez; çünkü sadece yaşlı eritrositler hemolize uğrarlar(kayaalp, 2000). 3. Enzimlerin indüklenme veya inhibisyon eğilimlerinin genetik farklılığa bağlı durumları: Karaciğerde mikrozomal enzimleri yaygın bir şekilde indükleyen fenobarbital ile 14 gün kadar tedavi edilen insanlarda mikrozomal enzimlerin indüklenme derecesinin ve buna bağlı olarak antipirin gibi test ilaçlarının eliminasyon yarılanma ömürlerindeki kısalmanın kişiler arasında fazla fark gösterdiği saplanmıştır. İkizlerde yapılan çalışmalarda bu durumun genetik faktörlerden ileri geldiği anlaşılmıştır. İndükleyici ilaçtan önce antipirin yarılanma ömrünün yüksekliği ile indüksiyondan sonraki azalmanın derecesinin doğru orantılı olduğu görülmüştür. Söz konusu durum, enzim indüksiyonuna bağlı etkileşmelere, bazı kişilerin diğerlerinden daha yatkın olduklarını ortaya koyar. Belirli bir enzim sentezine indüklenebilirliğinin genetik polimorfizmin o enzimi sentez ettiren geni kodlama yapmayan regülatör bölgesindeki mutasyonlarla ilişkili olduğu sanılmaktadır(kayaalp, 2000). 2.3 İlaç Taşıyıcı Enzimler ve Genler Son yıllarda ilaçların alımı ve dağılımı süreçlerine bakışımızda önemli değişiklikler olmuştur. Yakın zamana kadar gastrointestinol bölgeden vücuda alınma ilacın kristal boyutuna, çözünürlüğüne, ilacın pk sına ve barsak sıvısının ph sına bağlı pasif bir süreç olarak görülüyordu. Bir ilaç emildikten sonra, kandan dokulara transferin ; ilacın fizikokimyasal özellikleri ve protein bağlarıyla ilgili olduğu düşünülüyordu(eichelbaum ve ark., 2004). Günümüzde değişik dokuların plazma zarında yer alan taşıyıcı proteinlerin, ilaçların farmakokinetiğinde ana belirleyici olduğu açık bir hale gelmiştir. Barsaklarda, hepatik ve böbrek epitel hücrelerindeki yerleşiminden dolayı, bu taşıyıcı proteinler ilaçların emilmesi, biyouygunluk ve eliminasyonu açısından önemlidir. Bunların dışında kan-beyin ve kan-plasenta sınırları gibi kan-organ sınırlarında yer almalarından dolayı ilaçların organlara transferinde önemli rol

12 oynarlar. Sadece endojen bileşenlerin değil ilaçları da içeren ekzojen substratları da taşıyan MDR,MRP, OATP, OCT, OAT ve nükleosit taşıyıcı proteinleri arasında MDR 1 geninin P-glikoproteini en çok dikkati çekendir.bunun nedeni pek çok tedavi ilaçlarının P-glikoprotein substratlarının olması ve bazı hücrelerde P-glikoprotein ifadesini etkileyen mutasyonların görünmesidir(eichelbaum ve ark., 2004). 2.3.1 MDR 1 ( çoklu ilaç direnci, multiple drug resistance ) geni ve ürünü P- glikoprotein MDR 1 geni ürünü olan P-glikoprotein, görevi hücrelerden ksenobiyotiklerin ( organizmanın doğal bileşenlerinden olmayan maddelerin ) ATP ye bağımlı dışarı atılması olan bir zar proteinidir. Tümör hücrelerin çeşitli kanser karşıtı elementlere karşı MDR ( çoklu ilaç dayanımı Multidrug resistance ) gelişimindeki rolü nedeniyle önemi anlaşılmıştır.buna rağmen, bu geçirgenin sadece tümör hücrelerinde değil, aynı zamanda normal dokularda da ( barsak,karaciğer,böbrek ) ortaya çıktığı görülmüştür. P-glikoproteini çok geniş bir substrat özgüllüğüne sahip olduğu için, çok çeşitli ilaçların atılmasında görev yapmaktadır(fromm, 2002). Üstelik bu efluks taşıyıcının ekspresyonu, gastrointestinal bölgeler ve beyin kılcal damar endotel hücreler gibi bazı doku bölümlerinde oral absorbsiyon yoluyla da merkezi sinir sistemine birçok ilaçların girişini sınırlar(marzolini ve ark., 2004). 2000 de Hoffmeyer MDR 1 polimorfizmleri ile ilgili sistemik bir gözlem yapmış ve 12 tek nükleotit polimorfizm tespit etmiştir (SNP,Single Nucleotide Polymorphisms)(Sakaeda ve ark., 2002). Çok sayıda çalışma MDR 1 genindeki SNP lerin bulunması ve bunların ciddi ilaç seviyelerde değişmelere neden olduğu ve ilaca hassasiyetin ortaya çıkardığı; Parkinson Hastalığı, ateşli barsak hastalığı, inatçı nöbetler ve insanlardaki direnci sağlayan virüs tedavisinde CD 4 hücresinin bulunması gibi birçok probleme neden olabileceklerini ortaya koymuştur. Yine de, bu gibi bir çok sahada, MDR 1 genindeki SNP lerin etkilerinin değişken ve bazı durumlarda ise çelişkili olduğu belirtilmiştir(marzolini ve ark., 2004). MDR ilaç etkisini sağlayan hücredeki ilaç birikimini engeller. P-glikoprotein, çoklu ilaç direnci ile birleşen akciğer dirençli protein ve göğüs kanserine dirençli protein en önemli proteinlerdir. Bu proteinler çeşitli çoklu ilaç direncinde önemli rol

13 alan proteinlerdir. Bu proteinler arasında P-glikoprotein MDR de önemli olarak açıklanan ilk proteindir. Bu hücre zarına yerleşik, enerji bağımlı glikoproteindir. ATP ye bağlanabilen kaset ailesinin bir üyesidir. P-glikoprotein ilaçları değişmez bir forma dönüştürür. İlacın hücre içi konsantrasyonunu etkisiz dozlara indirir ve böylece hidrofobik anti-kanser ilaçlarına ve aynı zamanda birçok hidrofobik ajanlara direnç sağlar(kaya ve ark., 2005). 2.3.2 Yapısı 1976 da glikosilleştirilmiş membran proteini, kolkişine dirençli Çin hamsterinin yumurta hücrelerinden izole edilmiştir. Bu glikoprotein değiştirilmiş ilaç alışkanlığını gösteren süblimler için eşsiz göründüğünden, ona P-glikoproteini ismi verilmiştir. Lösemi dirençli fare P338 in süblinlerinde, önemli ölçüde düşürülmüş danarubisin ve adrimisin alımı ve saklanması görülmüştür. Yaklaşık 10 yıl sonra insan MDR 1 geninin, çoklu ilaç direncine sahip karsinoma hücrelerinden izole edilmiş ve insan P-glikoproteinini kodlamak için gösterilmiştir. Bu güne kadar insanlardan, farelerden hamsterlardan ve sıçanlardan çeşitli P-glikoprotein izoformları aydınlatılmış ve bunları yakın ilişkili genler ailesi tarafından sınıflanmıştır. 3 çevrilmemiş bölgeye dayanarak, 3 alt sınıfta incelenir; sınıf 1: insan mdr 1 i fare mdr 1a sı (veya mdr 3), hamster P-glikoprotein 1 ı ve sıçan P- glikoprotein 1 si, sınıf 2 : fare mdr 1b den, hamster ve sıçan P-glikoprotein2 (veya mdr 1b) den oluşan ve sınıf 3: insan MDR 3 ü (veya MDR 2), fare mdr 2 si, hamster ve sıçan P-glikoprotein3(Sakaeda ve ark., 2002). P-glikoprotein 7. kromozomda bulunur ve 29 ekson dan oluşur. 1280 aminoasitli, fosforilleştirilmiş ve glikosilleştirilmiş bir proteindir ve 6 hidrofobik transmembran segmenti ve bir intraselüler ATP bağlanma alanı içeren iki homolog yarıdan oluşur.yarılar esnek bağlayıcı bir polipeptit tarafından ayrılır(kaya ve ark., 2005). Çin hamsteri yumurtalık hücrelerine yapılan görüntü analizi ve elektron mikroskobisiyle yapılan yapı analizi ortaya koymuştur ki, insan P-glikoproteini yaklaşık olarak çapı 10 nm ve maksimum 8 nm olan bir silindirdir, dolayısıyla molekülün yarısı membranın içindedir. Geniş evrimsel analiz ortaya koymuştur ki insan P-glikoproteini tek bir taşıyıcı oluşturmak için etkileşime girer ve majör ilaç

14 bağlama alanları, transmembran alanları 5,6,11 ve 12 içinde ya da yanında yer alır. P-glikoproteini anlaşıldığı üzere hücre içindeki substratlarını saptayan ve hücre dışına atan bir pompa gibi işlem görür. Substratlarını temizleyen hidrofobik (su geçirmeyen) bir elektrikli süpürge olarak görev yaptığı öne sürülmüştür(sakaeda ve ark., 2002). Bir başka modelde şöyle önerilmiştir: P-glikoproteini, substratlarını lipid katmanın iç yapraksı yüzeyinden dış yapraksı yüzeyine taşıyan bir flipas olarak görev görür. P-glikoproteini ortak yapısal ve işlevsel özellikleri taşıyan, geniş bir işlevsel protein ailesine aittir Bu üst aileye ATP bağlama zinciri üst ailesi adı verilir(sakaeda ve ark., 2002). Günümüze kadar, 40 dan fazla ABC taşıyıcı geni kimliklendirilmiş ve sınıflandırılmıştır. Genelde tüm ABC tarayıcıları iki transmembran alandan (TMDs) oluşmaktadır. Her TMD altı zarlı helis kemer içerir. Hitherto raporunda belirtmiştir ki, ABC tarayıcıları 7 alt ailede sınıflandırılmıştır; ABCA dan ABCG ye kadar. Bu yeni nomenklatür sisteminde, P-glikoproteini ABCB1 olarak tanımlanır. Son zamanlarda MDR 1 terimi, P-glikoproteini yerine kullanılmaya başlanmıştır. (Sakaeda ve ark., 2002) 2.3.3 Yeri ve görevi P-glikoprotein sadece tümör hücrelerinde değil aynı zamanda normal dokularda da bulunur. Normal dokularda hücreleri zehirli maddelerden korur. İnsanlarda P-glikoprotein, yüksek seviyede böbrek üstü bezlerinde, orta seviyede göğüste, akciğerlerde (solunum epiteli), mide, kalın barsak, ince barsak, rektum, karaciğer, pankreas, böbrek, prostat, idrar kesesi ve plasentada, düşük seviyede ise beyinde, özafagus, yumurtalık, testis, dalak, timus, ilik, kalp, yumuşak kaslar ve deride bulunur. Beyinde, testislerde ve plasentada bulunan kılcal endotelial hücrelerin varlığı beyinden ve fetustan zehirli maddelerin alınmasını engelleyen bir bariyer olarak düşünülür. P-glikoprotein in bu geniş doku dağılımı normal hücreli metabolizmada temel rol oynar(kaya ve ark., 2005). P-glikoprotein hemotopoetik kök hücrelerde, periferik kan hücrelerinde antijen üreten hücrelerde, T ve B lenfositlerde bulunmuştur. P-glikoprotein dokusu dağılımı Tablo 1 de özetlenmiştir(fromm, 2002).

15 Doku Yer Görev İnce barsak Epitel hücreleri Barsak kanalına luminal zarı ilaçların salınımı Karaciğer Hepatoksiklerin safraya kanal içi zarı ilaçların salınımı Böbrek Proksimal tüplerin tüplere Epitelyum hücrelerinin ilaçların salınımı luminal zarı Merkezi Sinir Kan-beyin bariyerini MSS nin ksenobiyotik- Sistemi (MSS) oluştural endotel hücrelerin lerden korunması luminal zarı Testis Kan duvarlarının kapille- Kan-testis bariyeri rindeki endotel hücreler Plasenta Tropoblast Fetusun ksenobiyotiklerden korunması Tablo 1: İlacın dağılımı ve etkisi için önemli dokulardaki P-glikoprotein yeri; (Fromm, 2002). P-glikoprotein hücre içi ve hücre dışı bölgelerden ilaçları atabilen etkili bir pompa görevi görmektedir. Aynı zamanda hücre zarında sıkışan ilaç moleküllerini de etkileyebilir. ATP hidrolizi ile aşırı konsantrasyon değişimlerine karşı transportörün fonksiyonunu sağlayarak aktif ilaç transportu için enerji sağlar.(şekil 2)(Marzolini ve ark., 2004). Ekstrasellüler ksenobiyotik Plazma memranı Şekil 2 : P-glikoprotein in görevi(marzolini ve ark., 2004).

16 Kobaylarda yapılan deneylerde düzenleme, absorbsiyon, eliminasyonda P- glikoprotein in doğrudan fonksiyonu gösterilmiştir. Kobaylar iki MDR 1 genini korumakta ve deneysel olarak bu genlerden teki veya her ikisi baskılanmaktadır. Bu kobaylarda uygulanabilir olsa da hayvanlar ksenobiyotıklere karşı aşırı hassas olmuş ve beyinde birikim ve belirgin bir şekilde birçok ilaca karşı farmokinetiği değişmiştir. Arttırılmış biyouygunluk ve damardan uygulamalar sonrasında; digoksin, taksol, tri-n- butilmetilamonyum gibi ilaçlar için elenen kobaylarda indirgenmiş fetal ve üriner geçişler gözlemlenmiştir.p-glikoprotein substratı olan ilaçlarda birikim karaciğerlerde, beyinde, dalakta da artmıştır. Loperamid, Vinblastin, İvermektin, Siklosparin gibi tıbbi müdahalelerin uygulanabilirliğindeki artış sonradan ortaya çıkan kobayların MDR 1 gen fonksiyonlarındaki zafiyet beyin, karaciğer ve barsakta birikimin artmasının yanı sıra, gelişmiş bir terapatik etkiyle birlikte aynı zamanda yan etkilere karşı hassasiyette de artışa sebep olmaktadır(brinkmann ve ark., 2001). 2.3.4 Substratları P-glikoprotein in çok geniş substrat özgüllüğü vardır ve yapısal olarak çok farklı bileşenleri taşır. Bu maddeler genelde hidrofobik ve amfipatikdir. Tablo-2 P- glikoprotein nin substratlarının geniş bir listesini içermektedir. P-glikoprotein tarafından taşınan substratların sayısı geniştir ve kanser kemotrapisi, hipertansiyon, alerjide, enfeksiyonda, bağışıklık sisteminin bastırılması, nöroloji ve iltihaplanma için kullanılan çeşitli farmakolojik ajanları içerir. Antikanser ajanlara ek olarak bu taşıyıcı kalp ilaçlarının HIV proteaz engelleyicilerinin (vücudun bağışıklık sistemini yavaşlatan) immunosuppresanların, antibiyotiklerin ve antihistaminiklerin nakledilmesini sağlar(fromm, 2002). Aynı zamanda P-glikoprotein in birçok ilaç substratı özellikle sitokrom P450 3A4 gibi ilaç metabolizma enzimlerinin de substratıdır. CYP3A4 ile P-glikoprotein substratları arasındaki çakışma karaciğer ve barsak gibi organlardaki CYP3A4 ve MDR 1 genlerinin doku ekspresyonu ve bağlı regülasyonunun dışında oluşur. İlginç bir şekilde iki gende birbirine çok yakın olan 7q22.1 ve 7q21.1 kromozomunda yer alır. Hem P-glikoprotein hem de CYP3A4 ile etkileşimde bulunan büyük ilaç döngüsü, insanlardaki P-glikoprotein işlevlerinin kesinleştirilmesi için probe ilaçların bulunmasını güçleştirmektedir. P-glikoprotein

17 ile taşınmayan CYP3A4 substratları (nifedipin) vardır. Diğer taraftan; digoksin, feksofenadin ve talinolol CYP enzimleriyle belirli bir alanda birbirlerinin etkisi altında kalmazlar(marzolini ve ark., 2004). İlaçlar Antikanser Ajanlar Antiaritmikler İmmunosupresanlar Aktinomisin D Amiodaran Siklosporin Danarubisin Digoksin Sirolimus Doksorubisin Propofenon Takrolimus Etoposit Quinidin Valsdopar İmatinib Verapamil Antidepresanlar İrinotesan Glukokortikoidler Amitriptilin Mitomisin C Aldosteron Fluoksetin Mitoksantron Kortizol Paroksetin Paklitaksel Deksametazon Sertralin Teniposit Metilprednisolan Nöroleptikler Topotekan Antiviral Ajanlar Kloropramazin Vinblastin Amprenavir Flupentiksel Vinkristin İndinavir Phenotiazin Antihipertansif Ajanlar Nelfinavir Antiepileptikler Carvedilol Ritonavir Fenobarbital Celiprolol Saquinavir Fenotoin Diltiazem Antibiyotikler Antiasitler Losartan Kloritromisin Simetidin Nikardipin Eritromisin Ranitidin Reserpin Levofloksasin Opoitler Talinolol Rifampin Metadon Antimikotikler Sparfloksasin Morfin İtrakonazol Tetrasiklin Pentazosin Ketokonazol Antiemetikler Diğerleri Domperidon Atorvastatin Mefloquin Ondonsetran Bromokriptin Progesteron Kolşisin Retinoik asit Dipridamol Radomin 123 Emetin Spironolakton Feksofenadin Terfenadin İvermektin Vecuranium Loperamit Tablo 2: P-glikoprotein in substratı olan ilaçlar(marzolini ve ark., 2004).

18 2.3.5 MDR 1 Polimorfizmleri İlaç taşıyıcıları genetik polimorfizmlerini açıklayan çalışmaların sayısı gün geçtikçe artmaktadır. Günümüzde genetik polimorfizmin farmokokinetik üzerine etkisini en iyi karakterize eden taşıyıcı MDR 1 dir. MDR 1 in fonksiyonu; emilme boyutunu, doku yayılımını ve substratların boşaltımını değiştirecektir. MDR 1 deki polimorfizmler ilaç yanıtını büyük ölçüde etkiler. Ayrıca ilaç metabolize eden enzimlerdeki ve hedef moleküllerdeki farklılıklarda ilaç yanıtını etkiler. Genetik Polimorfizm İlacın hedef molekülleri (reseptörler) İlacı metabolize eden enzimler İlaç taşıyıcılar Farmakokinetik Farmakolojik Etki, Yan Etki İlaç Yanıtındaki Bireysel Farklılıklar Şekil 3: İlaç yanıtında genetik polimorfizmin etkisi(ishikawa ve ark., 2004). P-glikoprotein in ilaç kullanımındaki önemi barsak ve karaciğerdeki CYP3A4 ilaç enzimleriyle P-glikoprotein in kolokalizasyonu bu transportörün ilaçların oral yolla alınmasında, yayılmasında ve dışarı atılmasında önemli bir rolü olduğunu gösterir. Önemli bir belirti olan bu rol hayvan modellerinde ortaya çıkarılmıştır. Fare ırkındaki eksik MDR 1a, P-glikoprotein in ivermektin ve antiparazit subsutratlarının nörotoksik etkilere hassasiyetini belirlemiştir. Farelerde, kan-beyin sınırında P- glikoprotein in eksik olması nörotoksisiteye neden olan beyindeki ivermektin toplanmasını 80 kat daha fazla olmasına sebep olur. CF-1 fareleri, ölü doğumlara sebep olan L- 652280 substratına daha meyillidir. MDR 1a eksikliğini moleküler temeli daha ileri çalışmalarda incelenmiş ve CF-1 farelerinde P-glikoprotein eksikliğinin anormal ribonükleik asit habercisinin (mrna) iç içe geçmesine ekson 23 ün kaybolmasına sebep intron-ekstran kesişimdeki eksan 23 deki deoksiribonükleik asitten 8,35 kb lik ilave yapılarak ortaya çıkarılır ayrıca mdr

19 1a/1b nin bozulduğu fare jenerasyonu, bize P-glikoprotein in ilaç tedavisindeki hayati bağlantısını anlamamızda yardımcı olmuştur. İlginç olan, mdr 1a /1b nin fareler üzerinde yapılan karşılaştırmalı çalışmalar göstermiştir ki, mdr 1a en önemli P-glikoprotein ilaç transportörüdür ve mdr 1b sade karaciğer ve böbreklerde çıkarken, beyin kapillerinde barsak yüzeyinde ve plasentada ortaya çıkar. Böylece farelerdeki 2 P-glikoprotein izoformları insanda MDR 1 geninin kodladığı P- glikoprotein ile aynı fonksiyonu yaptığını göstermektedir. İnsanlarda, barsak P-glikoproteini, ilaç emilmesindeki rolü inhibisyon çalışmalarından dolaylı olarak türetilmiştir. Çünkü P-glikoprotein in ilaç emilmesine yol açtığını direkt olarak ispatlamak güçtür(marzolini ve ark., 2004). P-glikoprotein in aynı zamanda denek farelerdeki mdr 1a çalışmalarda ortaya çıkarılmış boşaltım sürecini de içermektedir. Dolaylı ve direk barsakta digoksin salgılamasıyla belirli bir metabolizmaya maruz kalmayan ilaç, fare mdr 1a sı ile yabani tip hayvanlar karşılaştırıldığında azalır. P-glikoprotein in inhibisyon ve indüksiyonu, CYP enzimlerinden daha az araştırılmış olsa da, tedavi etkisi ve toksisite bakımından önemli bir klinik içeriği vardır. P-glikoprotein inhibisyonu ile bağlantılı birçok ilaç etkileşimleri bildirilmiştir. Verapamil, guinidin ve amiadaron gibi diğer kardiyo ilaçlar ve digoksin arasında önemli bir klinik bağlantı vardır.örneğin verapamil ile digoksinin birlikte uygulanması barsak, karaciğer ve böbrekteki P-glikoprotein in olağan inhibüsyonu sonucu % 40 oranında digoksin plazma konsantrasyonunun arttığı görülmektedir. Son yıllarda MDR 1 geninde 20 den fazla tek nükleotid polimorfizmler tanımlanmıştır. Genotip ve alel frekanslarını içeren bu polimorfizmlerin özeti tablo 3 te yer almaktadır. Normal hücrelerde ilk mutasyonlar Mickley tarafından tanımlanmıştır(fromm, 2002). MDR 1 geninin ilk sistematik analizi ; sağlıklı Kafkas bireyleri ile yapılan araştırmada gerçekleştirilmiştir(fromm, 2002). MDR 1 geninin intronekson sınırlarındakiler dahil 29 eksonunu inceleyen ve kodlama bölümünde 21 SNP Hoffmeyer tarafından ortaya çıkarılmıştır. Daha sonra yapılan çalışmada Cascorbi 461 gönüllüyü daha önce açıklanan mutasyonların frekansları ve ek mutasyonların varlığı açısından tanımlamıştır. Bu mutasyonların dokuzu P- glikoproteinin aminoasit dizilimini değiştirmektedir. P-glikoproteinin amin bağlı kısmına yakın olanı AGIG SNP,Asn den Asp ye aminoasit değişimine yol

20 açmaktadır.g1199a mutasyonu ATP bağlanma alanına yakın sitoplazmik ilmekte bulunur.ala dan Ser aminoasit değişimine sebep olan ve sık rastlanan SNP (G2677T/A ) yada Thr ikinci geçirgen zar alanında bulunur. G2995A mutasyonu da aynı zamanda ikinci geçirgen zar alanında bulunmaktadır, fakat ikinci ATP bağlama alanına daha yakındır.sonraki polimorfizm ise buna rağmen, son iki araştırmada bulunamamıştır.son olarak ekson 7 ( A5486),13(C1474T ) ve 26 da ( A3320C ve T3421A ) bulunan nadir SNP lerinde aminoasit değişimine neden oldukları bildirilmiştir.hoffmeyer in ilk çalışmasında tanımladığı T307C ( Phe-Leu ) değişkeni Cascorbi nin incelediği daha geniş kitlede bulunamamıştır.sessiz mutasyon C3435T nin G2677T polimorfizmi ( Ala893Ser ) ve diğer bir sessiz polimorfizme ( C1236T ) bağlı olduğu bulunmuştur(fromm, 2002). YER POZİSYON ALEL ETKİ ALEL FREKANSI (%) GENOTİP GENOTİP FREKANSI (%) 1 Ekson 1/B Ekson 1b/12 T C 94.1 5.9 T/T T/C C/C 88,2 11,8 0.0 2 İntron 1 Ekson 2-1 G A 91.0 9.0 G/G G/A A/A 82.0 18.0 0.0 3 Ekson 2 cdna 61 A G 21 Asn 21 Asp 88.8 11.2 A/A A/G G/G 78.5 20.6 0.9 4 İntron 4 Ekson 5 35 G C 99.4 0.6 G/G G/C C/C 98.8 1.2 0.0 5 İntron 4 Ekson 5 25 G T 83.5 16.5 G/G G/T T/T 70.5 26.0 3.5 6 İntron 6 Ekson 6 + C 62.8 C/C 39.0 139 T 37.2 C/T T/T 47.5 13.4

21 7 İntron 6 Ekson 6 + C 98.8 C/C 97.6 145 T 1.2 C/T 2.4 T/T 0.0 8 Ekson 7 cdna 548 A 183 Asn 98.6 A/A n.a. G 183 Ser 1.4 A/G n.a. G/G n.a. 9 Ekson 11 cdna 1199 G 400 Ser 94.5 G/G 88.9 A 400 Asn 5.5 G/A 11.1 A/A 0.0 10 İntron 12 Ekson 12 + C 95.1 C/C 90.2 44 T 4.9 C/T 9.8 T/T 0.0 11 Ekson 13 cdna 1474 C 492 Arg 98.6 C/C n.a T 492 Cys 1.4 C/T n.a T/T n.a 12 İntron 16 Ekson 17 T 53.8 T/T 28.4 76 A 46.2 T/A 50.8 A/A 20.8 13 İntron 17 Ekson17+137 A 99.4 A/A 98.8 G 0.6 A/G 1.2 G/G 0.0 T/T n.a 14 Ekson 21 cdna 2677 G 893 Ala 56.5 G/G 30.9 T 893 Ser 41.6 G/T 49.2 A 893 Thr 1.9 T/T 16.1 G/A 2.0 T/A 1.8 A/A 0.0 Tablo 3: Kafkaslar da genotip ve alel frekanslarını içeren polimorfizmlerin özeti (Fromm, 2002). Hoffmeyer, insan P-glikoprotein ekspresyonu ile bir MDR 1 polimorfizminin bağlantısını bulan ilk kişidir.(fromm, 2002 ) Sessiz C3435T polimorfizmi, beyaz

22 ırkta barsak P-glikoprotein seviyeleri ile bağlantılı olarak bulunmuştur. CC genotipine sahip bireyle, TT genotipine (P=0.056) sahip olanların ince barsaklarında olandan yaklaşık olarak iki kat P-glikoprotein ekspresyonuna sahiplerdir. Heterozigot denekler orta seviye bir P-glikoprotein ekspresyonuna sahiplerdir. Benzer fakat önemsiz, 3435 pozisyonundaki genotipe ilişkin bir P-glikoprotein açılımı eğilimi, aynı zamanda 100 insan plasentasında gözlemlenmiştir (CC>CT>TT). Bu araştırma ayrıca 2677 pozisyonundaki polimorfizmine ilişkin plasentada P-glikoprotein açılımı için önemsiz bir eğilimide ortaya çıkarmıştır. Son olarak, Tanabe, CT getotipine sahip gruba göre; ekson 1b de TT genotipine sahip hastalardan alınan insan plasentalarında önemli derecede yüksek P-glikoprotein seviyeleri keşfetmiştir. Hoffmeyer e zıt olarak, Nakamura, 3435TT ye sahip Japon bireylerde, CT ve CC gruplarına göre daha fazla MDR 1 mrna seviyeleri rapor etmiştir. MDR 1 allelik değişkenler için bir terminoloji Kim tarafından yakın zamanda ileri sürülmüştür(fromm, 2002). MDR 1 Polimorfizmleri ve İlaç Atımı İlaç atımında MDR 1 polimorfizmlerinin etkisi hakkındaki şu an var olan bilgiler 4. tabloda özetlenmiştir. Hoffmeyer 3435TT grubundaki rapor edilmiş olan alt barsak P-glikoprotein açılımlarına uygun olarak, CC genotipine sahip deneklerin tersine, TT grubunda istikrarlı digoksin plazma konsantrasyonlarının varlığını bildirmiştir(fromm, 2002) İlaç SNP Sonuç Yorum Digoksin C3435T CC<CT<TT CC>CT>TT Kafkaslarda digoksin oral dozda Japonlarda digoksin tek oral dozda alınımı Fenitoin C3435T CC<CT<TT Tek oral dozda alınımı

23 Feksofenadin C3435T CC TT G2677T GG>TT Nelfinavir C3435T CC>CT>TT Tek oral dozda alınımı Siklosporin C3435T CC CT TT Talinolol C3435T CC CT TT Loperamit C3435T CC TT Tek oral dozda alınımı Tablo4 : İlaç atılımında MDR 1 polimorfizminin etkisi(fromm, 2002). Fellay tarafından yakın zamanda yapılan bir araştırmada HIV-1 bulaşmış insanlar üzerinde antiretrovial tedaviye cevabın 3435 pozisyonundaki MDR 1 polimorfizmine ve diğer ilaç taşıyıcılarının alellik değişikliklerine ve ilaç metabolize enzimlerine bağlı olarak incelenmiştir. P-glikoprotein ekspresyonunun hastalık riski ve tedavi adına potansiyel bir rolünden şüphelenilmiştir. Çünkü HIV proteaz inhibitörleri P-glikoprotein fonksiyonları ile bağdaştırılmıştır, ve HIV üretimi, P- glikoproteinin aşırı derecede açılımı gerçekleşirse büyük ölçüde azalmıştır. Aslında, Fellay sağlıklı gönüllülerdeki önceki bulgularla tutarlı olarak, CT ve CC gruplarına göre, 3435 pozisyonundaki TT genotipine sahip HIV hastalarının mononükleer çevresel kan hücrelerinde P-glikoprotein ve azalmış MDR 1, mrna seviyelerini tespit etmiştir. Dahası, 3435 konumundaki TT genotipine uygun hastaların, antiretroviral tedaviden sonraki 6 ay içerisinde CD4 hücrelerinin sayısında ve CT ve CC genotip gruplarına göre yeni CD4 hücrelerinin en yüksek iyileşmesinde büyük ölçüde yükseliş göstermiştir. MDR 1 3435TT genotipine sahip hastalar için bu avantaj, HIV enfeksiyonuna duyarlı hücre grupları ve muhtemelen HIV virüsü için farmakolojik barınaklar içerisine geliştirilmiş bir HIV proteaz inhibitörü atımı üzerine potansiyel etkisinin verilerini ilk ortaya koyan kişidir. Nelfinavir plazma konsantrasyonları 3435CC genotipine sahip hastalarda en yüksek seviyededir, bunu ufak bir farkla CT ve TT genotipine sahip hastalar takip eder. Bu sonuç P- glikoprotein açılımı verilerinin bazı yayımlanmış kısımlarına ters düşer ve MDR 1-893 Ser değişkeni ile düzenli olarak transefect edilen hücrelerdeki artan P- glikoprotein aktivitesini bulan Kim in bulgularına uyar daha çok. Buna rağmen, P-

24 glikoprotein substratı olmayan non-nükleosit ters-transkriptase inhibitörü bir MDR 1 3435- bağımlı plazma konsantrasyonu örneği bulmuştur. (CC>CT>TT). Bu gözlemin altında yatan mekanizma şu anda pek açık değildir. Nelfinavir plazma konsantrasyonlarının genotipe bağlı farklarına göre, bunun CYP3A4 ve P- glikoprotein düzenleme aktivitesinin dolaylı bir sonucu olduğu ileri sürülmüştür. Çünkü Nelfinavir aynı zamanda CYP3A4 ün bir substratıdır, ve P-glikoprotein ve CYP3A4 ince barsak ve karaciğerde birlikte açığa çıktığından, enterosit lerda yüksek bir nelfinavir birikiminin düşük barsak P-glikoprotein içeriğine sahip olan insanlarda ortaya çıktığı iddia edilebilir. Hayvanlar üzerinden elde edilen veriler nelfinavir in kendi metabolizmasını uyarabildiğini gösterdiğinden, enterosit lerdeki yüksek bir nelfinavir birikimi, barsak CYP3A4 indüksiyonu ve mantığa aykırı bir şekilde MDR 1 TT genotipine bağlı insanlarda azalmış nelfinavir plazma konsantrasyonlarına sebep olabilir. Buna uygun olarak, invitro deneyleri ve MDR 1a/1b fare örnekleri açıkça gösteriyor ki P-glikoprotein yokluğu CYP3A4 uyarıcılarına tepkiyi arttırıyor. Açıkça, tedaviye tepki veren bir MDR 1 polimorfizminin bağlantıları üzerine bu bulgular şu anda tam olarak açıklanamamış olup, bu alandaki çalışmaları teşvik edecek ve daha etkili antiretroviral tedaviler için fayda sağlayacaktır(fromm, 2002). Nelfinavir e benzer şekilde, immunosuppressan (bağışıklık sistemini zayıflatan) siklosporine hem CYP3A4 hem de P-glikoprotein substratıdır. Lown, siklosporine oral tasfiyesindeki değişkenliğin % 56 ve % 17 sinin hepatik CYP3A4 aktivitesi ve barsak P-glikoprotein içeriğine bağlı olduğunu kararlaştırmıştır(fromm, 2002). Dahası, karaciğer siklosporin zirve plazma konsantrasyonu için karaciğer CYP3A4 aktivitesi % 32 lik oran gösterirken, intestinal P-glikoproteini de % 33 lük bir oran vermektedir. Bu bulgulardan dolayı Von Ahsen MDR 1 C3435T polimorfizmin siklosporin üzerine etkisini 124 böbrek nakli alıcısının konsantrasyonları vasıtasıyla araştırmıştır(fromm, 2002). MDR 1 geninin 3435 pozisyonunda CC, CT ve TT genotiplerinde hiç bir siklosporin farkı bulunamamıştır. Dahası bu grupta böbrek nakli alıcısının 3435 pozisyonundaki MDR 1 geni ile böbreksel işleve veya akut reddedim olayı arasında

25 bir bağlantılık gözlemlenmiştir. Bu gözlemler şu takip eden nedenlerden kaynaklanıyor olabilir(fromm, 2002). İlk olarak Von Ahsen konsantrasyonlar aracılığıyla siklosporin üzerindeki MDR 1 polimorfizmin etkisini incelemiş, buna rağmen Lown, konsantrasyonlar aracılığı ile siklosporinin intestinal P-glikoprotein ile değil hepatik CYP3A4 tarafından belirlendiğini göstermiştir(fromm, 2002). İkincisi, Lown ın verileri siklosporinin sandimmune formülasyonu ile elde edilmiştir ki Von Ahsen in çalışmalarındaki hastaları, P-glikoprotein inhibitörleri içerdiği bilinen neoral formülasyon almışlardır. Son olarak, siklosporin nefrotoksisite (böbreklere hasar verici) donörün renal (böbrekle ilgili) P-glikoprotein açılımı ve muhtemelen MDR 1 genotipiyle nakil alıcısının MDR 1 genotipi üzerinden daha bağımlı olabileceği bilinmektedir(fromm, 2002). 2.3.6 İnsan MDR 1 genindeki polimorfizmler MDR 1 genindeki genetik değişkenliğin ilaç kullanımını aynı zamanda etkili tedaviyi de etkileyebileceğinden bahsetmiştik. Ayrıca CF1 fareleri ve bazı koli cinsi köpekler gibi diğer hayvan türlerinde doğal yolla ortaya çıkan polimorfizmler vardır, bu taşıyıcı fonksiyonunu tamamen ortadan kaldırır. Bu güne kadar P-glikoprotein işleyişinin tamamen olmadığı bir durum olmasa da insanlardaki benzer genetik etkilerin varlığı kabul edilmektedir. Sonuçta P-glikoprotein fonksiyonunun olmayışıyla birlikte ilave fenotipler ortaya çıkarılmıştır. Örneğin MDR 1a deney fareleri arasında insanlarda görülen iltihaplı barsak hastalıklarına benzer bir yaş bağlantılı fenotip olan Collitis ortaya çıkmıştır. İltihabın normalde barsak duvarında bulunan MDR 1a P-glikoprotein işlevi olan barsak bakterisinden gelen toksinlerden meydana geldiği düşünülmüştür. Bununla beraber, MDR 1 polimorfizminin ve bunun ilaç alımında ya da ortaya çıkan hastalıklar üzerindeki etkilerini inceleyen bir çok çalışma yürütmektedir(marzolini ve ark., 2004). SNP ler bireyler arasındaki nükleotid farklılıklarını belirler ve insan genomundaki en çok bilinen bir grup dizin (sıra) değişimlerini temsil eder.genomlardaki yerlerinin temelinde kodlu yada kodsuz SNP ler tesadüfi olarak sınıflandırılabilir. İnsandaki MDR 1 geni 29 eksondan meydana gelmektedir. Genetik

26 polimorfizm ilk olarak Kioka nın kanserli hücrelerde yaptığı çalışmalarla belirlenmiştir(morzalini ve ark., 2004). Daha sonradan, Hoffmeyer in de içinde bulunduğu bazı gruplar tüm MDR 1 kodlama bölgesini açığa çıkarmışlardır. Günümüzde 29 SNP nin MDR 1 geninde bulunduğu bildirilmiştir. 19 SNP eksonik bölgelerde11 SNP birbirinden farklı yerlerde bulunmaktadır. İlginç bir şekilde, ekson 21 deki 2677 pozisyonundaki SNP lerin 2 farklı aminoasit değişimine sebep olabildiği, isimlerinin Ala893Ser ve Ala893Thr olduğu belirtilmiştir. Ancak, ekson 26 daki SNP, kodlanmış aminoasiti değiştirmemesine rağmen değişken protein ekspresyonu ile ilişkili ilk varyanttır(marzolini ve ark., 2004). Aynı çalışmada, homozigot T alelinin bulunduğu bireylerdeki duodenumdaki P-glikoprotein in C alelinin bulunduğu bireylerle karşılaştırıldığında ekspresyonunun azaldığı gözlemlenmiştir. Diğer çalışmalar, ekson 21 ile ekson 1b de bulunan SNP lerin belki de değişik transpotör ve ekspresyonlarla birleştirilmiş olabileceğini göstermektedir. Yapılan çalışmalar, ekson 26 ve ekson 21 deki SNP ler arasında bağlı bir dengesizliğin varolduğunu göstermektedir. P-glikoprotein deki fonksiyonel farklılıkları bularak ilk olarak ekson 26 daki benzer SNP leri bağlamış ve belki de ekson 21 deki farklı polimorfizminlerin birleşmesine neden olmuştur. Bu tip farklılık haplotiplerin varlığı daha sonradan bazı gruplarca onaylanmıştır. Tüm etnik gruplarda 3 ortak haplotip ortaya çıkmaktadır. Ekson 26 ve ekson 21 deki SNP ler arasındaki güçlü bir bağlı dengesizlik olduğu kabul edilerek, haplotip kombinasyonları çoğu çalışmada kişilerin % 70 inden fazlasında bulunmuştur. Son günlerde ekson 12 deki benzer SNP lerin ekson 26 ve 21 deki SNP lerle bağlı olduğu görülmüştür. Benzer olarak, ekson 26,21 ve 12 deki MDR 1 polimorfizimlerinin olağan genotipik kombinasyonları incelendiğinde % 50 den fazla çalışma, bireylerdeki 3 yerde güçlü bir bağlı dengesizlik ortaya çıkarmıştır(marzolini ve ark., 2004).