ADANA BİLİM ve TEKNOLOJİ ÜNİVERSİTESİ Gıdalarda Tağşişin Belirlenmesinde Kullanılan Moleküler Yöntemler Ar. Gör. Sevgin DIBLAN Yrd. Doç. Dr. Pınar KADİROĞLU 1
İçerik Tağşiş nedir ve etkileri Gıda tağşişinin belirlenmesinde kullanılan yöntemler Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Gerçek zamanlı PCR ve çeşitleri Gerçek zamanlı PCR ile ilgili çalışmalar Sonuçlar
Gıda Tağşişi Gıdalara özgü özellikleri belirleyici olan öğelerin tamamının veya bir kısmının veya miktarının değiştirilmesi ile izin verilen özelliklerine aykırı şekilde üretilmesi olarak tanımlanmaktadır. Gıda tağşişinin sonuçları: Sağlık açısından; gıda alerjisi olan bireyler Ekonomik açıdan; Tüketicinin kalitesiz ürün alması, Ülkenin ihracat itibarının zedelenmesi, rekabet gücünde azalma görülmesi, Firmaların marka değerlerinin zedelenmesi.
Gıda Tağşişi Gıda Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı verilerine göre 2012-2015 yılları arasında 418 firmanın 818 farklı ürünü teşhir edilmiştir. Sadece 2015 yılında 735 bin denetim yapılmıştır. Gıda Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı verilerine göre Verilen cezaların her biri ortalama 15 bin TL, Toplamda 58 milyon TL ceza verilmiştir.
Gıda Tağşişinin Belirlenmesinde Kullanılan Yöntemler Spektrofotometrik, elektroforetik, elektronik, immünolojik ve moleküler yöntemler gıdalarda tağşişin belirlenmesinde kullanılabilmektedir. Gıda tağşişinin belirlenmesinde kullanılan yöntemlerin seçiminde : Saptama limiti Örnek hazırlama kolaylığı Maliyet ve yüksek işlem hacmi
Üzüm pekmezine; kuru incir, kuru kayısı ektraktı, mısır şurubu, inulin ilavesi Isotope ratio mass spectroscopy ile C13 analizi Kırmızı et ürünlerinde, domuz, eşek, at ve kanatlı et ilavesi Polymerase chain reaction (PCR) metodu Sahte bal üretimi Isotope ratio mass spectroscopy ile C13 ve C4 analizi Süt ürünlerine, jelatin veya bitkisel yağ ilavesi, farklı tür süt ilavesi Gaz kromatagrafisi, PCR yöntemi Zeytinyağına, ikinci kalite zeytinyağı veya başka tohum yağları eklenmesi Gaz veya sıvı kromatografisi, spektrofotometrik yöntemler
Polimeraz Zincir Tepkimesi (PCR) Metodu ve Çeşitleri PCR tekniği 1985 yılında, ABD de, Henry A. Erlich, Kary Mullis ve Randall K. Saiki tarafından geliştirilmiştir ve nükleik asitin uygun bir ortamda çoğaltılmasına dayanmaktaydı.
PCR analizi, denatürasyon olarak adlandırılan DNA zincirlerinin yüksek sıcaklık uygulaması ile birbirlerinden ayrılması aşaması, sentetik oliganükleotidlerin hedef DNA ya bağlanması olarak bilinen hibridizasyon aşaması ve polimerizasyon olarak adlandırılan DNA zincirinin uzaması aşamalarından oluşmaktadır. 3 aşama için 30-40 döngü 1. aşama : Denaturasyon 2. aşama: Bağlanma fazı 3. aşama: Uzama fazı
Real-time PCR Aşamaların hepsi tek bir tüpte yapılır. DNA çoğalımı ile birlikte artan sinyal değerleri toplanır. PCR siklus sayısı 25-40 arasında olabilir. Bağlanma (72 C) Uzama (55 C) Denaturasyon (94 C)
Polimeraz Zincir Tepkimesi (PCR) Metodu ile Tağşiş Belirlenmesi Analiz metodu Kantitatif tayin Örnekleme ve DNA ekstraksiyonu P (Prepare) C (Cycle) R (Report) İstatistik analizler Referans gen seçimi ve validasyonu Raporlama
DNA Ekstraksiyonu Ekstraksiyon işlemi boyunca gıda örneğine fiziksel, kimyasal ve enzimatik olarak çeşitli uygulamalar yapılmaktadır. Seçilen metot sonucunda, DNA parçacığının miktarı veya uzunluğu azalabilmektedir Spektrofotometrik Fluorimetrik Kemilüminesans Uygun bir DNA ekstraksiyonu sonucunda Yüksek miktar Yüksek saflık
Primer Seçimi PCR analizinin hassasiyetinde primer seçimi de diğer önemli bir aşamadır. Primer ; Mitokondriyal veya çekirdek (nükleus) kaynaklı olabilir. Cytochrome B, D- loop, 12S rrna ve 16S rrna Mitokondrial DNA fazla miktarlarda bulunması en önemli avantajıdır. Ancak, mitokondri DNA larının çeşitliliği PCR analizinin hassasiyetini negatif yönde etkilemektedir. Bu nedenle çekirdek kaynaklı DNA hedef DNA olarak seçilebilir, bunlar çok az miktarda bulunsa da miktar tayini daha hassas şekilde sonlandırılmaktadır.
Real-time PCR Belirleme Sistemleri Özgül olmayan Özgül SYBR Green I floresan boya kullanılır. TaqMan prob, Molecular beacon, Light-up prob, hibridizasyon prob SYBR yeşil boya DNA Denatürasyon Forward primer Taqman Probe 5 3 Bağlanmamış boya, ışıma yok Taq polimeraz Floresan işaret serbat kalır 5 3 Bağlanma ve ışıma
Real-time PCR Belirleme Sistemleri İki farklı prob FRET prob İki probun birbirine yaklaşması ile bir enerji yayılımı FRET (Fluoresance resoanace energy transfer) olarak bilinen bu enerji transferi sonucunda oluşan floresan miktarı PCR siklusu içinde oluşan amplikonların miktarına paralel olarak artış göstermektedir.
Kantitatif Değerlendirme Druml vd. 2015 Hedef veya tağşiş şüphesi bulunan genin çoğalma sayısı ölçülür ve bu değer bir pozitif standart ile karşılaştırılarak, oranlanır. Bu oran, karışım içinde bulunması gereken veya gerekmeyen bileşenlerin miktarı ile orantılıdır. Kantitatif belirleme için yaygın olarak kullanılan iki yöntem bulunmaktadır: 1. Floresan sinyalinin alındığı döngü sayısı olarak adlandırılan eşik çizgisine ulaşılan döngü sayısı karşılaştırması 2. Kalibrasyon kurvesi ile belirleme
Al-Kahtani et al. 2017 Sığır Deve Keçi Tavuk Tavşan Koyun En düşük belirleme limiti %1 Standart kurve ve Ct değeri ile hesaplama Araştırmada ayrıca 75 adet farklı markalarda ürünler analiz edilmiştir. RT-PCR, ticari PCR cihazının tespit edemediği 9 üründe domuz DNA sı tespit etmiştir (0.0001 ng/µl). Bu derece düşük bir oranın ise çapraz kontaminasyon ile oluşabileceği vurgulanmıştır.
Amaral et al. 2017 Sığır eti %10; %1; %0.1; %0.01; %0.001; %0.0005 ve %0.0001 domuz eti En düşük belirlenme limiti %0.0001 Araştırma piyasadaki helal gıdalarda domuz eti tespit etmiştir. Helal etiketi altında piyasaya sürülen ürünlerin kontrolünün ve bu konudaki araştırmaların artırılması gerektiği üzerinde durulmuştur.
Real-time PCR tekniği ile gıdalarda tağşişin belirlenmesi araştırmalarının çoğunluğu et ve süt ürünlerinde yapılmıştır. Et ürünlerinden özellikle salam, sosis veya hazır köfte olarak satılan gıdaların içine etiket bilgisinde belirtilmeyen farklı türlere ait et çeşitlerinin olması, tüketici güvenilirliği açısından en büyük sorunlardan birisidir. Yapılan araştırmalarda, araştırmacıların en çok üzerinde çalıştığı konu, tağşişin belirlenme limitidir. Örneğin, belirlenme limiti bazı araştırmalarda %0.5 gibi düşük değerlere kadar düşerken, bazı araştırmalar, en düşük belirlenme limiti %2 olarak belirlemişlerdir. Belirlenme limiti, metot optimizasyonu ile maksimum seviyeye çıkarılabilmektedir.
Gıdalarda PCR analizinin sırasında karşılaşılan diğer bir sorun ise gıdaların doğası gereği kompleks yapılar olmasıdır. Gıdaların içerdiği polisakkaritler, polifenoller, yağlar ve proteinler PCR siklusu boyunca inhibitör etkisi yapabilir hatta analizin sonlanmasına sebep olabilir. Primrose et al. (2011) yaptıkları araştırmada, PCR analizini etkileyen tüm faktörleri göz önünde bulundurarak metot geliştirmeye ve çözüm yöntemlerini ortaya koymaya çalışmışlardır. Araştırma sonunda, kompoze gıdalar için bunun mümkün olmadığını ancak tek bileşenli yani sosis, peynir değil de et, süt veya baklagiller gibi gıdalar için validasyon ile genel metotlar oluşturulabileceği aktarılmıştır.
Real time PCR Analizi Avantaj Dezavantaj 1. Küçük örnek miktarlarınd başarılı sonuçlar alınabilmekte, 2. Kantitatif tayin için, diğer PCR analizlerinde zorunlu olarak yapılması gereken elektroforez veya jel boyanması aşamalarının olmaması, analizin tek tüpten yapılması sonucunda, kontaminasyon riskinin düşük olması, 3. Isıl işlem görmüş ve DNA yapısı denatüre olmuş gıdalarda da uygulanabilmesi, 4. Hassasiyetinin ve tekrar edilebilirliğinin yüksek olması 1. Analizin gerekliliklerinin ve sarf malzemelerinin maliyetli olması, 2. Metot validasyonu için uzun zaman harcanması 3. Metot validasyonu için eğitimli ve nitelikli eleman ihtiyacı
SONUÇ Real-time PCR analizi et ürünlerinde farklı çeşit hayvan etlerinin ayrımı, makarnada durum veya ekmeklik buğday ayrımı, pirinç çeşitlerinin belirlenmesi ve farklı tür hayvan sütlerinin belirlenmesi gibi analizlerde hızlı ve güvenilir sonuçlar vermektedir. Bu nedenle, gıdalarda tağşişin belirlenmesinde kullanımının yaygınlaşma olasılığı yüksektir.
ADANA BİLİM ve TEKNOLOJİ ÜNİVERSİTESİ TEŞEKKÜR EDERİM 22