ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Meltem BERBER KABUKSUZ ÇEKİRDEK KABAKLARINDA (Cucurbita pepo L. var. styriaca) IŞINLANMIŞ POLENLE TOZLAMA YÖNTEMİYLE HAPLOİD ÜRETİMİ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2009

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KABUKSUZ ÇEKİRDEK KABAKLARINDA (Cucurbita pepo L. var. styriaca) IŞINLANMIŞ POLEN İLE TOZLAMA YÖNTEMİYLE HAPLOİD ÜRETİMİ Meltem BERBER YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez.../.../2009 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza... İmza... İmza... Prof. Dr. Kazım ABAK Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Prof. Dr. Şebnem ELLİALTIOĞLU DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Biyoteknoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu çalışma Ç.Ü. Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: ZF2008YL50 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ KABUKSUZ ÇEKİRDEK KABAKLARINDA (Cucurbita pepo L. var. styriaca) IŞINLANMIŞ POLENLE TOZLAMA YÖNTEMİ KULLANILARAK HAPLOİD ÜRETİMİ Meltem BERBER ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof.Dr. Kazım ABAK Yıl : 2009, Sayfa: 62 Jüri : Prof.Dr. Kazım ABAK Prof.Dr. Saadet BÜYÜKALACA Prof.Dr. Şebnem ELLİALTIOĞLU Bu çalışma esas olarak iki amaca yönelik yapılmıştır. Birincisi kabuksuz çekirdek kabaklarında (Cucurbita pepo var. styriaca) ışınlanmış polen uyartımıyla haploid bitki elde edilmesi; diğeri de bu amaca yönelik olarak en uygun ışın dozunun araştırılmasıdır. Araştırmada tanık olarak kabuklu tohumlu kabak genotipleri de kullanılmıştır. Toplam on beş genotipin kullanıldığı araştırmada 50, 100 ve 150 Gray ışın dozları denenmiştir. Çalışmada tüm genotiplerde toplam 2073 embriyo elde edilmiştir ve bu embriyoların 979 adedi bitkiye dönüşmüştür. Araştırmada kullanılan tüm genotiplerde haploid embriyo elde edilebilmiş, genotipler arasında önemli fark çıkmamıştır. Denemede test edilen her üç ışın dozu da iyi sonuç vermiştir. Ancak 150 Gray ışın dozundan daha çok haploid bitki elde edilmiştir. Dış koşullara alıştırılan 75 bitkide indirekt yöntemlerle (çiçek tozu varlığı, yaprak ve çiçek özellikleri, stoma yoğunluğu, stomaların bekçi hücrelerinde bulunan kloroplastların sayımı) yapılan gözlemler sonucunda bu bitkilerin %42.6 sının haploid, %57.3 ünün ise diploid olduğu belirlenmiştir. Anahtar Kelimler: Kabak, Cucurbita pepo L., ışınlanmış polen, haploid. I

ABSTRACT MSc THESIS PRODUCTION OF HAPLOIDS IN NAKED SEED PUMKINS (Cucurbita pepo L. var. styriaca) BY POLLINATION WITH IRRADIATED POLLEN Meltem BERBER DEPARMENT OF BIOTECHNOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIEDSCIENCES UNIVERSITY OF CUKUROVA Supervisor : Prof.Dr. Kazım ABAK Year : 2009, Pages: 62 Jury : Prof.Dr. Kazım ABAK Prof.Dr. Saadet BUYUKALACA Prof.Dr. Sebnem ELLIALTIOGLU This study is realiesed for two basic purposes. First one is to produce haploid plants from naked seed pumpkins (Cucurbita pepo var. styriaca) with irradiated pollination technique and the second one is to research the most suitable doses of irradiation for this aim. In the research the shelled seed pumpkin genotypes are also used as control and a total of fifteen genotypes were used as plant matarial. Three irradition dosses of gamma rays (50, 100 and 150 Gray) were tested. During the study, a total of 2073 embryos are resqued from different genotypes and 979 of these embryos transformed into plants. Haploid embryos are obtained in all of the used material and any important difference has not been observed between genotypes. All three dosses of irradiation gave good results in the study. However; more haploid plants are acquired from the 150 Gray. 75 of plants were acclimatized and cultiveted in a plantichimes and ploidy levels of there plants were determined using indirect methods (existence of pollens, leaf and flower features, stoma density and chloroplast number in gard cells of stoma). 42.6% of these plants seen to be haploid and 57.3% of them diploid. Key Words: Pumpkin, Cucurbita pepo L., irradiated pollen, haploid. II

TEŞEKKÜR Bu elinizde tutmakta olduğunuz tezin yazımı aşamasında en çok zorlandığım, bir türlü hislerimi anlatabilecek kelimeleri bulamadığım ve ne yazarsam yazayım içimdekileri yansıtamayacağım bölümü bu bölümüdür. İlk gördüğüm andan itibaren çok sevdiğim, kendisinden öğrendiğim her kelimede, sorduğum her soruya aldığım yanıtta hayran kaldığım, parmağımı kaldıracak halim yok artık dediğim anlarda söylediği bir kelimeyle insana her şeyi yapabileceğini hissettiren, tanıdığım için onur duyduğum ve beni seçtiği için minnettar olduğum danışman hocam Prof. Dr. Kazım ABAK a; hayata bakış açımı değiştiren, hep annem gibi gördüğüm, her açıdan örnek aldığım, tarifi olmayan bir sevgi, bağlılık ve güven duyduğum, çalışmayı her zaman en keyifli hale getiren ve her konuda desteğini hiçbir zaman esirgemeyen saygıdeğer hocam Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA ya teşekkürlerimi sunarım. Kafamdaki döllenme biyolojisi karmaşasını çözen, tezime çok büyük katkıları olan, her karşılaştığımızda kendisinden bir şeyler öğrendiğim hocam Prof. Dr. Sinan Eti ye; güler yüzüyle, eleştirileriyle her konuda cesaret veren, bakış açısına hayran kaldığım ve fikirlerine çok önem verdiğim değerli hocam Prof. Dr. Sevgi Paydaş a teşekkür ederim. Tezimin her aşamasında çok büyük emeği olan, çalışma disiplininden, ne zaman ne yapmam gerektiğine kadar her konuda bana yardımcı olan, daha ben ne olacak diye düşünürken dile getirmeme fırsat bile kalmadan her sorunu çözebilen, elinden her iş gelen, kendisine magic finger demenin yerinde olacağı, gideceğini bilmenin hüznüyle içimi sıkan biricik ablam ve hocam Dr. Mehtap YILDIZ a, bana evini, gönlünü açan, embriyo kurtarma ekibinde kabaklarımla boğuşan, içinden git başımdan artık demek istediği anlarda bile bana katlanan ablam Ar.Gör.Songül ÇÖMLEKÇİOĞLU na, doku kültürünün erbabı, hiç bir soruyu yanıtsız bırakmayan, her fırsatta yardımlarını esirgemeyen ablam Ar.Gör.Hatıra TAŞKIN a teşekkürlerimi bir borç bilirim. Çalışmamın istatistik analiz kısmına yardımcı olan Yüksek Mühendis Bekir Bülent Arpacı ya, tezimin yapım aşamasında her zaman yardımcı olan yüksek lisans öğrencisi, arkadaşım Remziye EBRİŞİM e, her şeyi beraber öğrendiğimiz, birçok III

konuda bana yardımcı olan Yüksek Mühendis Gökhan BAKTEMUR a, sebzelerin dilinden anlayan, ustaların ustası Şükrü TÜRKMEN e, Çukurova Üniversite si Tıp Fakültesi Radyasyon Onkolojisi Anabilim dalı öğretim öğesi Prof. Dr. Candaş TUNALI ya teşekkür ederim. Beni benden çok düşünen babam Mehmet BERBER e, hayatını benim eğitimime adayan annem Nede BERBER e, tezimle yatıp kalkan kız kardeşim Nihal BERBER e, beni düşünen, destekleyen, stresli olduğum her anıma katlanan, tezimin İngilizce yazışmalarını yapan ve katkıları olan dostlarım Figen GÖKÇE, Dilan ÇELİK, Emrah ÇANKAYA ve Özge CUMAOĞULLARI na çok teşekkür ederim. Ve adını yazamadığım, tezimde emeği olan herkese, kendimi buraya ait hissettiren Bahçe Bitkileri Bölümü ne teşekkürler. IV

İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ I ABSTRACT. II TEŞEKKÜR..... III İÇİNDEKİLER... V SİMGELER VE KISALTMALAR. VII ÇİZELGELER DİZİNİ IX ŞEKİLLER DİZİNİ. X 1.GİRİŞ... 1 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR. 6 3. MATERYAL ve YÖNTEM. 15 3.1. Materyal...... 15 3.2. Yöntem... 16 3.2.1. Bitkilerin Yetiştirilmesi.. 16 3.2.2. Çiçeklerin İzolasyonu... 16 3.2.3. Polenlerin Işınlanması 17 3.2.4. Tozlama. 17 3.2.5. Embriyoların Çıkartılması ve Kültürü... 18 3.2.5.1. Dezenfeksiyon. 18 3.2.5.2. Embriyoların Çıkarılması 19 3.2.5.3. Besin Ortamları ve Kültür Koşulları 20 3.2.6. İn Vitro Bitki Gelişmeleri ve Dış Koşullara Alıştırma.. 22 3.2.7 Ploidi Seviyesinin Belirlenmesi ve Morfolojik Gözlemler. 24 3.2.7.1 Birim Alandaki Stoma Sayısı (adet). 25 3.2.7.2 Kloroplast Sayıları (adet).. 25 3.2.7.3 Morfolojik Gözlemler... 25 3.2.9 Yapılan Sayım, Ölçüm ve Gözlemler. 26 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA.. 28 4.1. Araştırma Bulguları 28 4.1.1.Meyve Tutma Oranları 28 V

4.1.2. Meyve Başına Düşen Ortalama Tohum Sayıları 4.1.3. Meyve Başına Kurtarılan Ortalama Embriyo Sayıları 4.1.4. Elde Edilen Embriyoların Gelişme Safhaları.. 4.1.5. Embriyoların Bitkiye Dönüşüm Oranları... 4.1.6. Dış Ortama Alıştırma ve Bitkiye Dönüşüm. 4.1.7.Seçilen Bitkilerde Morfolojik gözlemler ve Ploidi Seviyesinin Belirlenmesi.. 4.2. Tartışma 5. SONUÇ ve ÖNERİLER KAYNAKLAR... ÖZGEÇMİŞ... 32 35 39 42 45 47 51 55 56 61 VI

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ AFLP : Amplified Fragment Lenght Polymorphism BAP : Benzil Amino Pürin KN : Kinetin IBA : Indol Bütürik Asit IAA : Indol Asetik Asit NAA : Naftalin Asetik Asit 2,4-D : 2,4 dikloro fenoksi asetik asit Co 60 : Kobalt 60 Gy : Gray ÇÜZF : Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi G.Ölkürbis : Gloidosfer Ölkürbis GÖ : Gloidosfer Ölkürbis Y.Yeşil : Yabancı yeşil YY : Yabancı yeşil İsk 1 : İskenderun 1 İsk 2 : İskenderun 2 SK : Sakız Nev : Nevşehir Ed : Edirne No : Numara BDO : Bitkiye dönüşüm oranı OES : Ortalama embriyo sayısı OTS : Ortalama tohum sayısı MBDOES : Meyve başına düşen ortalama embriyo sayısı TTS : Toplam tohum sayısı TMS : Toplam meyve sayısı TS : Tohum sayısı TTMS : Toplam tutan meyve sayısı VII

TTÇS : Toplam tozlanan çiçek sayısı MTO : Meyve tutma oranı g : Gram mg : Miligram Kg : Kilogram ml : mililitre l : Litre mm : Milimetre cm : Santimetre µm : mikromolar V : Hacim TDZ : Thidiazuron WMV : Watermelon mosaic virus ZYMV : Zucchini yellow mosaic virus UV : Ultra viyole % : Yüzde B5 : Gamborg et all. VIII

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. Tezde kullanılan bitkisel materyal ve özellikleri... Çizelge 3.2. E20A Besin Ortamının Bileşimi Çizelge 3.3. MS Besin Ortamının Bileşimi... Çizelge 4.1. Meyve tutma oranı. Çizelge 4.2. Meyve başına düşen ortalama tohum sayıları Çizelge 4.3. Meyve başına kurtarılan ortalama embriyo sayıları.. Çizelge 4.4. Embriyo aşamaları... Çizelge 4.5. Bitkiye dönüşüm oranları... Çizelge 4.6.Embriyoların bitkiye dönüşümleri sürecinde gelişmeyen, enfekte olan ve vitrifiye olan bitki sayıları ve kalan bitkilerin saksıya aktarılma oranları.. Çizelge 4.7. Seraya şaşırtılan bitkilerden diploid oldukları düşünülenlerde yaprak ve çiçek özellikleri. Çizelge 4.8. Seraya şaşırtılan bitkilerden haploid oldukları düşünülenlerde yaprak ve çiçek özellikleri. Çizelge 4.9. Diploid (solda) ve haploid (sağda) bitkilerin stoma ve kloroplast sayıları.. 15 21 22 29 34 37 40 43 46 48 49 50 IX

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Tezde kullanılan kabak (Cucurbita pepo L.) bitkilerinin seradaki görünümü... Şekil 3.2. Antesisten bir gün önce izole edilen çiçek. Şekil 3.3. (A)Anthesisten bir gün önce toplanan erkek çiçekler; (B) Taç ve çanak yaprakları ayrılarak ışınlanmak üzere hazırlanmış anterler... Şekil 3.4. Işınlanmış polenle tozlama; (A)ışınlanmış erkek çiçekler (B)dişi çiçeğin ışınlanmış polenle tozlanması (C) tozlamadan sonra pensle kapatılarak izole edilmiş dişi çiçek.. Şekil 3.5. Tozlamadan sonra tutan bir meyvenin birkaç gün sonraki görünümü... Şekil 3.6. Hasat aşamasına gelmiş meyveler. Şekil 3.7. Embriyoların çıkarılması... Şekil 3.8. Tohumların içinde embriyoların görünümü... Şekil 3.9. İklim odasında bulunan MS ortamı içeren büyük kavanozlardaki in vitro kabak bitkicikleri Şekil 3.10. İn vitro bitkiciklerin dış ortama transferi. (A) Besin ortamından ayırma; (B) Ortam kalıntılarından kurtarmak amacıyla su altında yıkama; (C) %0,2 lik Captan la hazırlanmış ilaçlı suya batırılan kökler; (D) Steril torf içeren plastik bardaklara dikim; (E) Dikilip, sulanan ve ilaçlanan bitkilerin nemli poşetle örtülmesi; (F) Lastiklerin gevşetildiği 4. günden sonraki dış koşullara alışmak üzere olan bitki... Şekil 3.11. Dış koşullara alıştırılmak amacıyla plastik bardaklara alınan bitki (A). Dış koşullara alışmış saksıya alınacak olan bitki (B). Şekil 4.1. Işın dozlarına göre meyve tutma oranı.. Şekil 4.2. Genotiplere göre meyve tutma oranı. Şekil 4.3. Kabuklu ve kabuksuz tohumlu genotiplerde meyve tutma oranı.. 16 17 18 18 19 19 20 20 20 23 24 30 31 32 X

Şekil 4.4. 50 Gray ışın dozuyla tozlanmış bir meyveden elde edilen tohumlar, içi boş tohum (a), içinde haploid olduğu tahmin edilen embriyo içeren tohum (b), diploid embriyo içeren tohum (c) Şekil 4.5. Kabuklu ve kabuksuz tohumlu genotiplerde ortalama tohum sayıları. Şekil 4.6. Işın dozlarına göre ortalama tohum sayıları.. Şekil 4.7. Genotiplere göre ortalama embriyo sayıları. Şekil 4.8. Işın dozlarına göre ortalama embriyo sayıları... Şekil 4.9. Kabuklu ve kabuksuz tohumlu genotiplerde ortalama embriyo sayıları... Şekil 4.10. Globüler, çubuk, yürek(kalp) ve torpedo aşamalarındaki embriyoların ışın dozlarına göre oranı Şekil 4.11. Genotiplerin globüler, çubuk, yürek ve torpedo aşamalarındaki embriyo oranları... Şekil 4.12. Kabuklu ve kabuksuz tohumlu genotiplerde embriyoların bitkiye dönüşüm oranları Şekil 4.13. Genotiplere göre embriyoların bitkiye dönüşüm oranları... Şekil 4.14. Işın dozlarına göre embriyoların bitkiye dönüşüm oranları Şekil 4.15. Saksılara aktarılan bina içindeki bitkiler. Şekil 4.16. Bitkilerin saksılardan seraya dikilmesi Şekil 4.17. Haploid ve diploid bitkilerin 4. yaprakları arasındaki boyut farkı Şekil 4.18. Haploid ve diploid bitkilerin seraya aktarılmadan önce saksılardaki görüntüsü Şekil 4.19. Diploid (a) ve haploid (b) bitkilerin stomalarındaki kloroplastlar 32 35 35 36 38 38 39 41 44 44 45 46 47 48 49 50 XI

1.GİRİŞ Meltem BERBER 1.GİRİŞ Anavatanı Kuzey ve Güney Amerika olan kabaklar (Cucurbita spp.) kültüre alınan ilk bitkiler arasında gösterilmektedir (Heiser 1973). 16.yüzyılda Amerika dan diğer kıtalara okyanusları aşarak yayılmıştır. Tropik, subtropik, sıcak, kurak bölgeler ve çöl koşulları gibi çok farklı ekolojilere adapte olabilen bu bitkinin Meksika, Kuzey Amerika ve Doğu Asya da ilk çağlardan beri yetiştirildiği yapılan arkeolojik çalışmalar sonucunda anlaşılmıştır (Robinson ve Decker-Walters 1997). Dünya da 1,5 milyon hektarlık alanda 20 milyon ton, Türkiye de ise 21 bin hektarlık alanda, 350 bin ton yıllık üretime sahip Cucurbita cinsi içerisinde ekonomik açıdan en önemli türler; Cucurbita pepo L. (yazlık kabak), Cucurbita maxima Duch. (kışlık kestane kabakları) ve Cucurbita moschata (Duch ex. Lam.) (kışlık bal kabakları) dır (Anonim 2007). Cucurbita pepo L. (yazlık kabak), meyve özellikleri açısından çok farklı çeşitleri bulunan ve dünya çapında büyük ekonomik öneme sahip bir türdür. En az 10 bin yıl önce kültüre alınmış olmasına rağmen Avrupa ya girmesi sadece 500 yıl kadar önce gerçekleşmiştir. Tüm ılıman ve subtropik bölgelerde yetişen bu tür, yenebilir meyvelilerin yanı sıra çoğunlukla acı, küçük meyveli yenilemeyen kabak tip ve formlarını da içine alır (Paris, 2001). Yüksek polimorfiziminden ötürü C. pepo ssp. pepo, C. pepo ssp. fraterna ve C. pepo ssp. ovifera olmak üzere 3 alt türe ayrılmıştır. Bu alt türlerinde birçok varyeteleri bulunmaktadır. Acı, küçük meyveli çeşitleri içeren C. pepo ssp. ovifera, C. pepo ssp. pepo ya göre daha küçük generatif ve vejetatif organlara sahiptir (Anonim 2008). Cucurbita pepo ssp. pepo nun filogenetik açıdan en genç üyesi olan kabuksuz çekirdek kabaklarının (Cucurbita pepo subsp. pepo var. styriaca) ilk olarak 1881 yılında Avusturya nın güney doğusunda bulunan Styria şehrinde kabuklu çekirdek kabaklarında meydana gelen doğal bir mutasyon sonucunda ortaya çıktığı bildirilmektedir (Fruhwirth ve Hermetter, 2007). Kabak tohumlarının kabuksuzluk karakteri ve genetiği üzerindeki çalışmalar 1950 yılında başlamış olup halen devam etmektedir. İlk çalışmalarda kabuk tabakalarındaki odunlaşmanın majör dominant bir gen tarafından kontrol edildiği ileri sürülmüştür. Buna göre, lokustaki her iki allel 1

1.GİRİŞ Meltem BERBER gen homozigot dominant ya da heterozigot olduğu durumlarda tohumlar sert ve kalın bir kabuk taşımakta, homozigot resesif olduğunda ise sert kabuk taşımamaktadır. Fakat çok ince ve zar şeklinde bir kabuk görülebilmekte ve bunun kalınlığı bakımından da çeşitlilik gözlemlenmektedir (Zraidi ve ark. 2003). Bu olay kabuksuzluk özelliğinin kalıtsal yapısının çok basit olmadığının, yalnızca bir çift genle yönetilmediğinin bir göstergesidir. Kabak türlerinin tarımı esas olarak meyveleri için yapılmaktadır. Bazı ülkelerde ve Türkiye de kabak, tohumları için de yetiştirilmektedir. Kabak tohumları A ve E vitaminleri açısından zengindir. Doymamış yağ oranı da yüksek olduğundan, birçok ülkede yağ üretimi için yetiştirilmekte, ayrıca çerez olarak da tüketilmektedir (Follet 2002). Bunlara ek olarak ilaç sanayisinde değerlendirilmektedir (Robinson ve Decker-Walters, 1997). Kabuksuz tohumlu kabaklar, yağ üretiminde özellikle tercih edilmekte ve bu nedenle yağlık styrian kabakları (styrian oil-pumpkin) olarak ta isimlendirilmektedir. 2006 yılı verilerine göre kabuksuz çekirdek kabaklarının yalnızca Avusturya da 13 bin hektar alanda yetiştirildiği, üretiminin 11 bin ton olduğu ve hektardan ortalama 500 600 kg ürün alındığı, 1 lt yağ üretimi için de 2,5 kg tohum kullanıldığı bildirilmektedir (Fruhwirth ve Hermetter, 2007). Avusturya da 2006 yılında toplam 6 bin ton tohum üretilip sadece yağ üretimi için kullanılmıştır. Yağ üretimi amacıyla tohumları çıkarılan meyveler, meyve eti kalitesi bakımından Cucurbita moschata ile Cucurbita maxima arasında olduğundan hayvan yemi olarak kullanılabilmektedir. Ayrıca kabak tohumu yağı Amerika ve Çin de yemek yapımında; Fransa da margarin yapımında (Follet 2002); Macaristan, Slovenya ve Avusturya da salatalarda ve prostatın tedavisi amacıyla fitoterapide (Mandl ve ark. 1999) yaygın kullanımı yanında tohumları yağda kızartılarak ya da fırında kavrularak tüketilmektedir (Stephens 2003). Yetiştiriciliğinin hayli geniş alanlarda yapılmasına rağmen Türkiye de çekirdek kabaklarında ve özellikle de kabuksuz çekirdekli kabaklarda mevcut herhangi bir çeşit bulunmamaktadır. Üretimde az veya çok karışıklıklar içeren populasyonlar kullanılmaktadır. Kabak yabancı tozlanan bir bitki olduğu için seleksiyon çalışmaları da uzun sürmektedir. Bu konuda Türkiye de ilk olarak Abak 2

1.GİRİŞ Meltem BERBER ve ark. (1990) tarafından seleksiyon çalışmaları başlatılmış ve uzun bir süreçte çeşit adayı hatlar üretilebilmiştir. Haploid bitkiler embriyo kesesi veya polen çekirdeğindeki gamet hücrelerinden meydana gelen gametofitik kromozom sayısına sahip (n) bitkilerdir (Khush ve Virmani, 1996). Normal bir bitkide bulunan tüm özelliklere sahip olmasına karşın diploidlere göre yaprakları küçük ve dar, çiçekleri küçük ve bitki boyları kısadır. Kısır oldukları için meyve tutma yetenekleri yoktur ve tohum oluşturamazlar. Haploid bitkilerin ürün vermeleri ve yeni döller oluşturabilmeleri için kromozom sayılarının kolhisin, azot protoksit, kafein, kloral hidrat, asenaften, sulfinilamid, etil merkuriklorid, hekzaklorosiklohekzan gibi bazı kimyasallarla katlanıp iki katına çıkarılması gerekmektedir. Dihaploidizasyon denilen bu yöntemle %100 homozigot saf hatlar elde edilmektedir (Çağlar ve Abak 1999). Haploidler klasik ıslah çalışmalarında 8 10 generasyon kendileme ile mümkün olan saflaştırma işlemini 5 6 yıldan 1 yıla indirerek ıslah çalışmalarının daha kısa sürede tamamlanması olanağını sunmaktadır. Haploidlerin doğada spontan olarak ortaya çıkma sıklığı çok nadir olup türlere ve hatta genotiplere göre değişmektedir. Birçok türde de spontan haploidi oluşumuna hiç rastlanmamaktadır. Bu nedenle yeni kuşaklara aktarılamayan haploidlerin üretimini gerçekleştirebilmek için pek çok yöntem denenmiştir. Belling ve Blakeslee tarafından 1922 de tanımlanan ilk spontan haploid Datura stramonium bitkisinde partenogenetik yolla oluşmuştur. Bunun ardından pek çok bitki türünde spontan haploid oluşumu üzerine çalışmalar yoğunlaşmıştır (Khush ve Virmani 1996). In vitro veya in situ uyartılı partenogenesiste normal döllenme meydana gelmemektedir. Temel olarak haploid embriyolar, yumurta hücresi veya embriyo kesesinde bulunan hücrelerden birinin bölünmesiyle (apogami) dişi gametten ya da erkek gametlerden meydana gelmektedir. Otuz yılı aşkın süredir bitki biyoteknolojisinde yaygın olarak uygulanan bu yöntemler erkek ve dişi gametlerin in vitro kültürlerinden haploid bitki elde edilmesi temeline dayanmaktadır. Erkek ve dişi gametler stres (sıcak, soğuk, kimyasal faktörler) altında yapay olarak uyarılarak doğal gelişim ve farklılaşma sürecinde etkilenirler (Juhasz ve Jakse 2005). İn situ haploid embriyo uyartımını teşvik amacıyla uzak akrabalar arası melezlemeler, 3

1.GİRİŞ Meltem BERBER tozlamanın geciktirilmesi, eksik veya yetersiz (ışınlanmış) polenle tozlama, değişik kimyasalların uygulanması, sıcaklık şokları, X ve UV ışınlarının uygulanması gibi yöntemler kullanılmaktadır (Yılmaz, 2005). Şu anda genotip, donör bitkinin gelişme koşulları ve kültür koşullarına göre farklı cevaplar veren, haploid bitki üretme denemeleri sonucu belirlenen dört ana yöntem bulunmaktadır: 1. Androgenesis: anterlerin veya izole edilmiş mikrosporların, in vitro kültüre alınması yöntemiyle haploid üretimidir. 2. Ginogenesis: döllenmemiş yumurtalığın ya da yumurta hücrelerinin in vitro kültüre alınması ya da eksik veya yetersiz polenlerle tozlanması yöntemiyle haploid embriyo ve bitki üretimidir. 3. Kromozom eliminasyonu: türler arası melezlemeler sonucunda oluşan embriyoda, ebeveynlerden birine ait kromozomların kaybolmasına dayanan yöntemdir. 4. Parthenogenesis: erkek gamet olmadan yumurtadan embriyo üretilmesidir. Erkek ve dişi eşey hücrelerinin birleşerek embriyo oluşumuna katıldığı ancak çekirdeksel erimenin gerçekleşmeyip ana ve babaya ait kimeralı haploidlerin oluşması (semigami) ya da embriyo kesesinde bulunan sinerjit hücrelerinden birinin bölünmesiyle (apogami) de mümkün olan, ginogenesisle kromozom eliminasyonu arasında bir yöntemdir (Khush ve Virmani 1996; Ellialtığolu ve ark. 2001; Palmer ve Keller 2005, Forster ve ark. 2007). Cucurbitaceae familyasında da haploidizasyon çalışmaları önceleri hem anterler, hem de ovül ve ovaryumlar in vitro kültüre alınarak denenmeye başlanmıştır. Anter kültüründen olumlu bir sonuç alınamamış, ovül ve ovaryum kültürlerinden elde edilen bitki sayıları ise çok az olmuştur. 1990 lı yıllara doğru gama ışını uygulanmış polenlerle tozlamalar yapılarak in situ haploid embriyo uyartımı ve bu embriyoların özel besin ortamları üzerinde in vitro kültüre alınarak bitkiye dönüştürülmesi araştırılmıştır. Bu yolla Cucurbitaceae familyasının ilk haploid embriyoları kavunda elde edilmiş ve bu embriyolar in vitro da bitkiye dönüştürülmüştür (Sauton ve Dumas de Vaulx 1987). Daha sonra aynı teknik hıyarda 4

1.GİRİŞ Meltem BERBER (Sauton 1989), karpuzda (Gürsöz ve ark.1991; Sarı ve ark. 1994) ve kabakta (Kurtar ve ark 2002) denenmiş ve tüm bu bitkilerde başarılı sonuçlar alınmıştır. Kabak türlerinde şimdiye kadar spontan haploidi oluşumuna ilişkin bilgiye rastlanmamıştır. Kabaklarda haploid bitki elde edilmesi ile ilgili çalışmalar da oldukça azdır. Ayrıca bu türde haploid bitki elde etmek amacıyla anter ve ovül kültürü kullanılarak yapılan birçok çalışmada yeterli düzeyde başarı da sağlanamamıştır (Chambonet ve Dumas de Vaulx, 1985; Shail ve Robinson, 1987; Kwack ve Fujieda 1988). Daha sonraki çalışmalarda ise haploid bitkiler elde edilebilmiştir (Gémésné ve Venczel, 1996; Metwally ve ark., 1998; Shalaby 2007). Türkiye de bu konuda yapılan bir çalışmada da (Kurtar ve ark. 2002) kabakta ışınlanmış polenle tozlama yöntemi kullanarak diğer Cucurbitaceae familyası türlerinde olduğu gibi kabakta da olumlu sonuçlar alınmıştır. Burada sonuçları sunulan çalışmada, ekonomik değeri her geçen gün artan bir ürün olan kabuksuz çekirdek kabaklarında ışınlanmış polenlerle uyartımla haploid embriyo elde edilmesi ve in vitro koşullarda bitkiye dönüştürülmesi amaçlanmıştır. Daha önce normal kabuklu tohumlu kabaklarda uygulanan bu yöntemin kabuksuzlarda da çalışıp çalışmayacağı araştırılmış; ayrıca uygulanan farklı ışın dozlarının, haploid embriyo uyartımı üzerine etkileri de incelenmiştir. 5

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meltem BERBER 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Kabakgil bitkilerinde ilk haploidi çalışması Dumas de Vaulx (1979) tarafından yapılmış ve bu çalışmada Cucumis melo L.(2n=24) nun Cucumis ficifolius (2n=48) ile tozlanması yoluyla kavunda ilk haploid bitkiler elde edilmiştir. Daha sonra yapılan çalışmalarda uzun süre doku kültürü yöntemleri üzerinde durulmuş; hem anterler, hem de ovul ve ovaryumlar in vitro kültüre alınarak denenmiş; anter kültüründe başarı sağlanamayınca sonraki çalışmalarda ovül kültürüne ağırlık verilmiştir. Chambonet ve Dumas de Vaulx (1985), Cucurbita pepo nun döllenmemiş ovüllerini in vitro kültüre alıp bu ovüllerden haploid embriyolara ve sonra da bitkilere ulaşmışlardır. Araştırıcılar, oluşan bitkilerin çoğunun diploid olduğunu, bazılarının anoploid, diploid-haploid kimeralı ve bazılarının da poliploid olduğunu görmüşlerdir. Benzer bir çalışmayı da Shail ve Robinson (1987) Cucurbita pepo türüne ait 3 kabak çeşidinde yapmışlardır. Denenen çeşitlerden yalnızca Blackjack çeşidinde kalluslar elde edilmiş fakat bunlarda bitkiye dönüşüm gerçekleşmemiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda, anter veya ovül kültürü yöntemiyle elde edilen haploidler genetik ve ıslah çalışmalarında kullanılacak düzeyde olmadığından ışınlanmış polenle uyartımla haploid embriyoların elde edilmesi ve bunların bitkiye dönüştürülmesine yönelik başlayan araştırmalar, Cucurbitaceae familyası türlerinde de denenmiştir. Bu yöntemle, Cucurbitaceae familyasının ilk haploid embriyoları Sauton ve Dumas de Vaulx (1987) tarafından kavunda elde edilmiştir. Anılan çalışmada tozlamada kullanılan erkek çiçek tomurcuğu sayısı, çeşit ve ışın dozunun, ışınlanmış polen yöntemiyle haploid bitki elde edilmesi üzerine etkisini araştırmışlardır. Çalışmanın sonucunda, bu faktörlerin embriyo verimine etki ettiği, dört çiçek tomurcuğu ile tozlanarak elde edilen haploid embriyoların oranı ve meyve başına düşen ortalama tohum sayısının iki çiçek tomurcuğu ile tozlanarak elde edilenlerden önemli ölçüde daha fazla olduğu bildirilmiştir. Daha sonra hıyarda çalışan Sauton (1989), bu türde de ışınlanmış polenlerle tozlama yöntemiyle haploid bitki elde etmiştir. Çalışmasında polenlere Co 60 ışın kaynağından 300 1000 Gray arasında değişen dozlarda gama ışını uygulayan 6

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meltem BERBER araştırıcı, tozlamadan 3 hafta sonra hasat ettiği meyvelerden bir tanesi hariç tümünün tohumlarının içlerinin boş olduğunu görmüş, bir meyveden çıkan tohum sayısı az olmuş ve haploid embriyo sayısı % 0.3 olarak bulunmuştur. Aynı zamanda normal polenlerle yapılan tozlama sonucunda ise tohumların %30-60 ının diploid olduğu gözlenmiştir. Türkiye de kabakgil türlerindeki ilk çalışmalar Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü nde kavun ve karpuzda aynı anda başlatılmıştır. Kavundaki çalışmada üç farklı çeşit grubunda (C. melo var. inodorus, C. melo var. reticulatus ve C. melo var. cantalupensis) ışınlanmış (300 Gy) polenle haploid embriyo uyartımı üzerinde durulmuş, bu yöntemin ve ışın dozunun kavunda genotiplere göre değişmekle birlikte tüm çeşitlerde etkin olduğu sonucuna varılmıştır (Sarı ve ark. 1992a). Kavundaki çalışmaların yanında karpuzda (Citrullus lanatus) da benzer çalışmalara yönelen araştırıcılar Crimson Sweet, Halep Karası, Sugar Baby ve Pannonia F1 çeşitlerinde ışınlanmış (200 veya 300 Gy) polen tozlamaları yaparak haploid embriyo üretimine genotipin ve ışın dozunun etkisini araştırmışlardır. Bu amaçla, tozlamadan 2 5 hafta sonra hasat ettikleri meyvelerden globüler ve yürek şekilli embriyolar elde etmişler ve 100 tohumdaki en yüksek embriyo sayısına Halep Karası çeşidinde ulaşmışlardır. Araştırıcılar elde ettikleri 17 haploid bitkiyi kolhisin uygulayarak diploid bitkiler elde etmişlerdir. (Sarı ve ark. 1994). Daha sonra kavundaki haploid üretimini ve dihaploidizasyon tekniğini ıslah çalışmalarında kullanmaya başlayan Abak ve ark. (1996), kavunun (Cucumis melo) üç farklı grubuna (var. inodorus, var. reticulatus ve var. cantalupensis) ait 18 kavun çeşidinde ışınlanmış polen tozlamaları yaparak haploid embriyo uyartımında genotip etkisini araştırmışlardır. Bu çalışmalarda kavunun üç botanik varyetesine yayılmış olan 14 genotipte embriyo elde edildiğini ve bunların in vitro embriyo kurtarma yoluyla bitkiye dönüştürüldüğünü bildiren araştırıcılar, iki saat süre ile %0.5 lik kolhisin uygulamasıyla diploid hatlar oluşturulduğunu açıklamışlardır. Elde ettikleri bu bitkilerin ploidi seviyelerini sitolojik, sitometrik ve morfolojik olmak üzere üç farklı yöntemle belirlemişlerdir. 7

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meltem BERBER Yanmaz ve ark. (1997), altı adet acur (Cucumis melo var. flexuosus) hattında haploid embriyo uyartımına gama ışınının farklı dozlarının etkilerini araştırmışlardır. 250, 300 ve 350 Gy ışın dozları uygulanmış polenlerin ışınlamadan 1, 2 ve 3 gün sonraki canlılıklarını da araştırmışlardır. 250 Gy ışın dozu uygulanan polenlerle tozlanan bitkilerde meyve tutumu gerçekleşmemekle beraber, 300 ve 350 Gy ışın dozları uygulanarak elde edilen meyvelerden kurtarılan embriyoların büyük bir oranı nekrotik olarak bulunmuştur. 300 Gy ışın dozu uygulanarak elde edilen embriyolardan %17.39 u globüler, %23.91 i yürek aşamasında olup 8 inde bitkiye dönüşüm gerçekleşmiş ancak yaşatılamamıştır. Polen canlılığının ise ışın dozu ve polen yaşı arttıkça azaldığı bildirilmiştir. Sandı (1998), kabuksuz çerezlik kabakta haploid bitki elde etme olanaklarını araştırmak amacıyla ışınlanmış polen tekniği ve anter kültürü yöntemini kullanmıştır. Araştırıcı Sezyum 137 gama ışın kaynağını kullanarak 300 ve 350 Gray ışın dozları uygulanan polenlerle, ışın uygulanmamış polenleri kıyasladığında önemli bir farklılık bulunmadığını ve elde ettiği tohumların diploid olduğunu bildirmiştir. Benzer şekilde anter kültürü çalışmalarından da uygun aşamadaki anterlerin 5 mg/l 2,4-D içeren ortamlarda olumlu tepkiler verdiğini, 2,4-D X BA hormon kombinasyonlarının en iyi performansı göstermesine karşın haploid kallus ve embriyo elde edilemediğini bildirmiştir. Çağlar ve Abak (1999a), hıyarda ışınlanmış polen yöntemini yıl boyunca yetiştirdikleri dört çeşit üzerinde denemişler ve haploid uyartımına genotipin, ışın dozlarının ve mevsimin etkisini araştırmışlardır. 1992 1994 yılları arasında yapılan çalışmada Qamar F1, Seraset F1, Dere ve Çengelköy çeşitlerinde 300, 450 ve 600 Gy ışın dozları uygulanmış polenlerle yıl boyu yapılan tozlamalar sonucunda tüm genotiplerde başarı elde etmişlerdir. Çalışmada en yüksek embriyo uyartımı 300 Gy ışın dozu ile elde edilmiş; mevsim olarak da en iyi sonuçlar ilkbahar ve yaz aylarında (Mayıs Haziran) alınmıştır. Yine Çağlar ve Abak (1999b), bir öncekinin devamı niteliğindeki çalışmalarında haploid embriyoların in vitro kültürde bitkiye dönüştürülmesi üzerinde elde ettikleri araştırma sonuçlarını vermişlerdir. Bu çalışmada, farklı gelişme dönemlerindeki embriyolardan yürek şekli gibi daha ileri gelişim 8

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meltem BERBER safhalarındaki haploid embriyoların, globüler safhadakilere göre daha kısa zamanda ve daha yüksek oranda bitkiye dönüştüğü rapor edilmiştir. Ayrıca meyve başına elde edilen haploid bitki sayısının genotip olarak en çok Çengelköy çeşidinde ve dönem olarak Haziran ayında gerçekleştiği; bununla birlikte iki yılın sonunda 4 genotipten de yeterli bitki alındığı ve elde edilen toplam haploid bitki sayısının 190 olduğu belirtilmiştir. Bu iki çalışma ile hıyarda haploid embriyo uyartımı ve bitki elde edilmesi, bu bitkilerden dihaploid hatlar oluşturulması ile ilgili protokoller ortaya çıkartılmış, Türkiye için uygun takvimler belirlenmiştir. Faris ve ark. (1999), hıyarda haploid embriyo üretiminde mümkün olabilen en düşük gama ışın dozunu belirlemek ve etkilerini gözlemlemek amacıyla çalışmışlar ve buna yönelik olarak iki deneme kurmuşlardır. İlk denemede 5 hıyar hattı (Gy 3, M, Gin, B, Og) ve bunların melezlemesiyle oluşan 3 hibrite (Gy 3 x M, B x Gin, B x Og) 200 ve 300 Gy ışın dozları uygulanmıştır. Çalışılan genotipler arasında embriyo sayılarının toplamı açısından önemli bir fark olmadığı ve embriyoların bitkiye dönüşüm oranının yaklaşık % 3.3 olduğu bildirilmiştir. İkinci denemede, ilk denemede en yüksek bitkiye dönüşüm oranına sahip Gy 3 ve M genotipleriyle Gy 3 x M melezi kullanılmıştır. 100, 200 ve 300 Gy ışın dozları uygulanarak elde edilen embriyoların bitkiye dönüşüm oranı %7.7 olarak bulunmuş; 50 Gy ışın dozu uygulamasından ise elde edilen tüm embriyoların diploid olduğu belirlenmiştir. Daha sonra yapılan başka denemelerle de 100 Gy ışın dozunun yüksek sayıda haploid embriyo veren en düşük doz olduğu ancak başarının bitkinin genotipine, fizyolojik koşullarına ve kültür koşullarına göre değiştiği belirtilmiştir. Kavun, karpuz ve hıyarda olumlu sonuçlar vermesinin ardından Çukurova Üniversitesi nde kabakta (Cucurbita pepo) da ışınlanmış polen tekniğini kullanarak haploid bitkiler uyartımı üzerinde çalışmışlar ve başarılı sonuçlar elde etmişlerdir (Kurtar ve ark., 2002). Anılan çalışmada farklı gama ışını dozları (25, 50, 75, 100, 200, 300 ve 400 Gray) ile farklı genotipler (Eskenderany F1, Acceste F1, Sakız ve Urfa Yerli) kullanılmıştır. Daha önce kavun, hıyar ve karpuzda izlenen yöntemlere benzer bir şekilde yürütülen çalışmalar sonunda ışınlamadan 4 5 hafta sonra hasat edilen meyvelerden çıkarılan embriyoların farklı şekil ve dönemlerde (nokta, 9

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meltem BERBER globüler, ok ucu, çubuk, torpedo ve kalp) oldukları belirlenmiştir. En iyi partenogenetik uyartının 25 ve 50 Gy ışın dozlarında gerçekleştiği ve in vitro kültür sonrasında 93 adet haploid bitki üretildiği belirtilmiştir. Genotipler içinde de en çok haploid bitki veren Eskenderany F1 ve Sakız genotipleri olmuştur. Ploidi seviyesi, kök ucu kromozom sayımı yapılarak belirlenmiş; bu bulgular stoma özellikleri incelenip morfolojik gözlemler yapılarak ta desteklenmiştir. Lotfi ve ark. (2003), kavunda birçok virüse dirençli (CMV, ZYMV, WMV ve külleme) hatların melezlenmesiyle elde edilen uygun iki hibrit materyal kullanılarak haploid ve dihaploid bitki üretme protokolü geliştirmişlerdir. Bu amaçla ışınlanmış polen ile yapılan tozlamadan (250 Gy) sonra elde edilen tohumları çimlenene kadar sıvı ortama alıp ardından katı ortama transfer ederek ya da direk katı ortama alarak iki ortamı kıyaslamışlardır. Araştırıcılar 175 bitkiden seçilerek oluşturulan üç hatta ait bitkilerin yaprak dokularından örnekler alarak flow sitometri yöntemiyle ploidi düzeylerine bakmışlardır. Sonuç olarak 2 hattın doğal dihaploid, 3. nün ise hem haploid hem de diploid hücreler içerdiğini (miksoploid) bildirmişlerdir. Kalan bitkilerin çiçeklenme aşamasında, steril olanlarına yapılan flow sitometri analizleri ile 20 bitkinin tamamının haploid bulunduğunu bildirmişlerdir. Kolhisin uygulamalarının başarısız olması üzerine haploid bitkilerdeki sürgünler in vitro ortamda çoğaltılarak elde edilen 167 bitkiye kolhisin uygulamışlardır. Bunlardan elde edilen 156 bitkinin %64 ünün miksoploid, %6 sının ise dihaploid olduğu bildirilmiştir. İstenilen özellikleri taşıyan dihaploid hatların oluşturulmasının kavun ıslahçıları için değerli bir araç olacağı bildirilmiştir. Lim ve Earle (2008); üç genotipte dihaploid bitkiler elde etmek amacıyla ışınlanmış polenle tozlama yöntemini kullanarak elde ettikleri 63 partenogenetik kavun bitkiciğini boğumlarından keserek in vitro ortamda çoğaltmışlardır. Genel olarak Lotfi ve ark.(2003) tarafından izlenen yöntemleri temel alıp laboratuar ve arazi koşullarında kolhisin uygulamalarının hayatta kalma, ploidi düzeyi, polen üretimi ve meyve oluşumu üzerindeki etkilerini test etmişlerdir. En etkili yöntem olarak belirledikleri arazi koşullarında kökün 3cm lik uç kısmı 500 mg/l lik kolhisine 3 saat daldırma işlemi sonucunda eksplantların %83 ünün canlı kalabildiğini; %26 oranında diploidiye dönüşüm gerçekleştiğini ve polen üreten bitkilerde de meyve 10

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meltem BERBER üretiminin %60 olduğunu bildirmişlerdir. Bir başka yöntem olarak ta genç bitkilerin tepe uçlarına 5000 mg/l kolhisini 2 4 saat uygulayarak meyve oluşumu sağlandığını ancak bu meyvelerin hayatta kalma oranının daha düşük olup morfolojik anormalliklere neden olduğunu belirtmişlerdir. Bu çalışmanın partenogenetik kavun bitkilerinden meyve ve tohum elde edilmesi üzerine yapılmış kapsamlı ilk çalışma olduğunu ve partenogenetik kavun bitkilerinden ürün elde edilmesi için stratejilerin geliştirilmesi gerektiğini ortaya koymuşlardır. Lotfi ve Salehi (2008); iki melez hıyar hattında 250 Gy ışın dozu uygulanan polenlerle yaptıkları tozlamalardan 3 hafta sonra elde ettikleri tohumların embriyolarını kurtarmak amacıyla tek tek açma yöntemine alternatif olarak tohumları 10 gün boyunca sıvı ortamda tuttuktan sonra embriyolarını almışlardır. Elde ettikleri embriyoların %51 inin bitkiye dönüştüğünü bildiren araştırıcılar, içinde embriyo olan tohumların 10 gün içinde çimlenmeye başladığından yeşile döndüğünü ve tek tek açmaya gerek kalmadan kolaylıkla ayırt edilebildiğinden hızlı embriyo elde ettiklerini ve bunun da embriyo verimliliğini arttırdığından haploid bitki sayısını arttırdığını belirtmişlerdir. Cucurbitaceae familyasında eski çalışmalara ek olarak özellikle hıyarda ve kabakta anter ve ovül- ovaryum kültürleri tekniklerinin geliştirilmesi üzerine de çalışmalar yapılmış ve olumlu sonuçlar alınmıştır: Kabakta anter kültürünü etkileyen etmenleri incelemek amacıyla Metwally ve ark. (1998a), kabağın (Cucurbita pepo ) Eskandarani çeşidinde sakkaroz ve 2,4-D (2,4-diklorofenoksi asetik asit) nin farklı konsantrasyonlarını deneyerek kültüre almışlardır. Sakkarozun 30, 60, 90, 120 ve 150 g/l ve 2,4-D nin 0.1, 1.0, 2.5 ve 5.0 mg/l konsantrasyonlarını kullanılarak sıvı MS anter kültürü ortamları hazırlamışlardır. Bu amaçla tek çekirdekli mikrosporları içeren anterler flamentleri ayrıldıktan sonra sterilize edilmiş ve 20 farklı modifiye MS ortamına her petride on anter olacak şekilde ekmiştir (iki ay). Bu ortamlarda gelişen kalluslar, 0.23µM kinetin ve 0.27µM NAA(2-α naftalin asetik asit) içeren MS ortamlarına (dört hafta) aktarılmıştır. Burada gelişen bitkicikler de büyüme hormanları olmayan MS ortamına kök gelişimi amacıyla transfer edilmiştir. Bitkiciklerin 150 g/l sakkaroz ve 5 mg/l 11

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meltem BERBER 2,4-D eklenmiş MS ortamında en iyi sonucu verdiği ve ışık mikroskobunda bakılarak yapılan sitolojik sonuçlara göre 20 bitkiden %50 sinin haploid olduğu bildirilmiştir. Metwally ve ark. (1998b), ikinci çalışmalarında in vitro ginogenesis aracılığıyla Cucurbita pepo L. dan haploid bitki üretmede ovül kültürü tekniğinin verimliliğini arttırmayı amaçlamışlardır. Bu amaçla antesisten bir gün önce topladıkları ovaryumları 4 C de 0, 2, 4 ve 8 günlük periyotlarla soğuk uygulamasına tabi tuttuktan sonra ovüllerini çıkarıp 2,4-D (2,4-diklorofenoksi asetik asit) nin farklı konsantrasyonlarının ( 0.1, 1.0, 5.0 ve 10 mg/l ) denendiği modifiye MS ortamlarına aktarmışlardır. Dört hafta boyunca 25 C (± 1) de 16 saatlik fotoperiyotta gelişmeleri beklenen ovülleri hormon içermeyen MS ortamına aktararak dört hafta daha bekletmişlerdir. Bu süre sonunda her bir petride bulunan kültüre alınmış 100 ovülden oluşan kallus, bitkicik ve ginogenetik ovül sayılarını belirlenmiş ve oluşan her bitkiciği kültür kaplarında bulunan MS ortamına transfer etmişlerdir. En iyi sonucu veren ortamın 1 ya da 5 mg/l 2,4-D içeren MS ortamı olduğu ve ön uygulamaların olumsuz etki gösterdiği, yapılan sitolojik gözlemler sonucunda da elde edilen bitkilerden her 3 bitkiden 1 inin haploid diğerlerinin ise diploid olduğunun belirlendiğini bildirmişlerdir. Kumar ve ark. (2003) hıyarın (Cucumis sativus L.) Calypso ve Green Long çeşitlerinde yaptıkları çalışmada anter kültürü tekniğiyle haploid bitki üretiminin hıyardaki etkinliğini arttırmada uygun ortam belirlemeyi amaçlamışlardır. Araştırıcılar çiçek tomurcuklarına uyguladıkları sıcak veya soğuk ( 4ºC de 0 10 gün ve 32ºC de bir gün) ön işlemlerinden sonra anterleri alarak farklı büyüme hormonlarının farklı konsantrasyonlarının denendiği B5 ortamlarına aktarmışlardır. 4ºC de 2 gün tutulan çiçek tomurcuklarından daha çok embriyo elde etmişlerdir. Büyüme hormanlarından da özellikle oksin konsantrasyonlarının türden türe değiştiğini ve hıyarda düşük konsantrasyonda sitokinin eklenmesinin androgenesisi teşvik ettiğini gören araştırıcılar IAA, IBA, BAP, KN ve TDZ hormonları eklemişlerdir. Hiç tepki vermeyen bu iki türde 2 µm 2,4-D ve 1µM BAP hormonları eklenerek modifiye edilen B5 ortamının en iyi sonucu verdiğini görmüşlerdir. Kültüre alınan anterleri iki hafta karanlık periyodun ardından 24 C (± 2) de 16 saatlik fotoperiyotta bekletmişlerdir. Ayrıca Green Long çeşitlerinde embriyogenik 12

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meltem BERBER kallus oluşumu gözlenirken Calypso çeşitlerinde direk embriyoların oluştuğunu bildirmişlerdir. Embriyo farklılaşmasında 0.09 M şeker, 0.025 µm NAA ve 0,25 µm KN; embriyo olgunlaşmasında 5 µm ABA; embriyoların çimlenmesi ve bitkicik oluşumunda da 0,09 M şeker eklenerek oluşturulan B5 ortamları en başarılı ortamlar olarak bulunmuştur. Bitkicikler kontrollü çevre koşullarında dışarıya alıştırılmışlardır. Her türden 24 er bitkicik alınarak kök uçlarındaki ploidi düzeyleri incelendiğinde Calypso çeşidinden 21, Green Long dan 17 haploid bitki bulunduğu bildirilmiştir. YoungQiang ve ark. (2004), Cucurbita pepo nun tozlanmamış ovüllerden rejenere olan bitkilerin ploidi tanımlanmasında bekçi hücrelerindeki kromozom ve kloroplast sayımını kullanmışlardır. Bekçi hücrelerindeki kloroplast sayılarını haploid, diploid ve tetraploitte sırasıyla oranladıklarında yaklaşık 1:2:4 e denk geldiğini belirlemişlerdir. Bekçi hücrelerindeki kloroplast sayılarının ve bekçi hücrelerinin boyutlarının ploidi seviyesini belirlemede güvenilir ve pratik bir yöntem olduğunu ortaya koymuşlardır. Shalaby (2007), Cucurbita pepo da in vitro ovül kültürü yöntemini kullanarak haploid bitki üretimine; genotipin, bitki gövdesindeki dişi çiçeğin durumunun, sıcaklığın ve sakkaroz konsantrasyonlarının etkilerini araştırmıştır. Bu amaçla 4 ayrı deneme kurmuş; bu denemelerde dişi çiçekleri antesisten bir gün önce toplayıp ovüllerini sterilize etmiştir. İlk denemede 12 genotip kullanarak % 3 sakkaroz, 1 mg/l kinetin ve 1 mg/l 2,4-D eklenmiş MS ortamında kültüre almış ve bu genotiplerden en fazla haploid bitki Raad F1 genotipinde bulunmuştur. İkinci denemede aynı ortama iki hibritin (Giad ve Road) 1. 2. ve 3. dişi çiçeklerinden ovülleri ayırarak kültüre almış ve en iyi performansı 2. dişi çiçeklerin ovüllerinden elde etmiştir. Üçüncü denemede Queen F1 hibrit çeşidini 0, 4, 7 ve 12 gün süreyle 4 C ve 32 C ye maruz bırakmıştır. Bu çalışma sonucunda ovüllerin en iyi tepkiyi 4 veya 32 C ye 4 gün maruz bırakıldıklarında verdikleri gözlenmiştir. Son deneme de ise üç sakkaroz konsantrasyonu (30, 60 ve 90 g/l) Eskandarani çeşidinde test edildiğinde en iyi sonuç 30 g/l sakkaroz içeren MS ortamında alınırken, 90 g/l sakkaroz içeren ortamdan sonuç alınamamıştır. Bu dört uygulama sonucunda elde 13

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meltem BERBER edilen bitkilerin % 65 inin haploid (2n=x=20); %35 inin ise diploid (2n=2x=40) olduğu sitolojik çalışmalarla bulunmuştur. Song ve ark. (2007); hıyarda farklı ekotiplere ve yetişme koşullarına sahip genotipler kullanılarak yaptıkları çalışmada özellikle anter kültüründe haploid bitki elde etmenin genotipler üzerindeki etkisi üzerinde durarak etkin bir anter kültürü protokolü hazırlamak için altı deneme (soğuk ve sıcak ön uygulama, embriyonik kallus, embriyo çimlendirme ortamı ve genotipik etki) kurmuşlardır. Sıcaklık genotiplere bağlı olarak değiştirilmiştir. Soğuk bölgelerdeki hıyarlar soğuk şokuna, sıcak bölgelerdeki hıyarlar sıcak şokuna iyi sonuç vermişlerdir. 16 genotipte kallus oluşumu sağlanırken, değerlendirilen 20 genotipten 3 ü bitki oluşturmuştur. Ningjia No.1 çeşidinde her anterden 3 haploid embriyo ve her 45 anterden 42 dihaploid elde edilmiştir (%93). Rejenere olan bitkilerin orijini sitolojik, morfolojik, AFLP analizleriyle belirlenmiştir. 14

3. MATERYAL VE YÖNTEM Meltem BERBER 3. MATERYAL VE YÖNTEM Araştırma, 2008 yılında Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümüne ait deneme arazileri ile Doku Kültürü Laboratuarı nda yürütülmüştür. 3.1. Materyal Çalışmada bitki materyali olarak toplam 15 farklı kabak genotipi kullanılmıştır. Bunlardan on tanesi kabuksuz çekirdekli kabak genotipi olup sekizi Çukurova Üniversitesi nde yapılmış seleksiyonlarla elde edilmiş, ikisi ise yurtdışından sağlanmıştır. Biri Yabancı Yeşil diğeri Geisdorfer Ölkürbis adlı olan yabancı çeşitlerin tohumları koyu yeşil renkli, yerli genotipler ise açık yeşil renklidir. Kabuksuz genotiplerin yanında, dördü populasyon biri de çeşit olan (Sakız 5801) beş de kabuklu tohumlara sahip genotip kullanılmıştır. Araştırmada kullanılan genotipler ve özellikleri Çizelge 3.1. de gösterilmiştir. Çizelge 3.1. Denemede kullanılan bitkisel materyal ve özellikleri Genotip Orijin Kabuk Özelliği ÇÜZF No.1 Çukurova Üniversitesi Kabuksuz ÇÜZF No.2 Çukurova Üniversitesi Kabuksuz ÇÜZF No.3 Çukurova Üniversitesi Kabuksuz ÇÜZF No.4 Çukurova Üniversitesi Kabuksuz ÇÜZF No.5 Çukurova Üniversitesi Kabuksuz ÇÜZF No.7 Çukurova Üniversitesi Kabuksuz ÇÜZF No.9 Çukurova Üniversitesi Kabuksuz ÇÜZF No.10 Çukurova Üniversitesi Kabuksuz Yabancı Yeşil Avusturya Kabuksuz Geisdorfer Ölkürbis Avusturya Kabuksuz İskenderun 1 İskenderun Kabuklu İskenderun 2 İskenderun Kabuklu Edirne Edirne Kabuklu Nevşehir Nevşehir Kabuklu Sakız 5801 Bursa Kabuklu 15

3. MATERYAL VE YÖNTEM Meltem BERBER 3.2. Yöntem 3.2.1. Bitkilerin Yetiştirilmesi Bitkilerin yetiştirilmesi amacıyla tohumlar 21.02.2008 tarihinde ekilmiştir. Bu amaçla, torf: perlit (2 v / 1 v) karışımı harç içeren 45 gözlü (9x5) viyoller kullanılmıştır. Gelişen fideler 2 3 gerçek yapraklı dönemde iken sıra arası 150 cm, sıra üzerleri 80 cm olacak şekilde plastik seraya tek sıralı olarak dikilmiştir. Dikim 12.03.2008 tarihinde yapılmıştır ve her genotipten 10 bitki olacak şekilde yapılmıştır (Şekil 3.1). Bitkilerin gelişimi için gerekli ilaçlama, sulama ve gübreleme yapılmıştır. Şekil 3.1. Tezde kullanılan kabak (Cucurbita pepo L.) bitkilerinin seradaki görünümü 3.2.2. Çiçeklerin İzolasyonu Çiçeklerin izolasyonu Şekil 3.2.'de de görüldüğü gibi dişi çiçeğin taç yaprağının uç kısmında başlayan renk değişimi ile ertesi gün açacağını 16

3. MATERYAL VE YÖNTEM Meltem BERBER belirlediğimiz dişi çiçeklerin uç kısımlarının pens ile kapatılmasıyla yapılmıştır. Işınlanmış polenlerle tozlanacak çiçekler bir gün önceden kapatılarak ışınlanmamış polen bulaşması engellenmiştir. Şekil 3.2. Antesisten bir gün önce izole edilen çiçek 3.2.3. Polenlerin Işınlanması Işınlama için anthesisten bir gün önceki aşamada olan, henüz açılmamış fakat iyi gelişmiş erkek çiçek tomurcukları seçilerek toplanmıştır (Şekil 3.3. (A)). Bu tomurcukların, taç ve çanak yapraklar ayrıldıktan sonra 9 cm çaplı cam petri kaplarına konulmuş ve γ ışını uygulamasına alınmıştır. Işınlama işlemi Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Radyoloji Onkolojisi Anabilim Dalı nda yapılmıştır. Işın kaynağı olarak Co 60 kullanılmış ve denemelerimizde 50 100 150 olmak üzere üç farklı ışın dozu denenmiştir. Işınlanan polenler ertesi sabaha kadar (oda koşullarında) bekletilmiştir (Şekil 3.3. (B) ). 3.2.4. Tozlama Işınlamadan sonraki gün sabahın erken saatlerinde, bir gün önce kapatılan dişi çiçekler açılmış ve her bir dişi çiçeğin stigmasına 1 2 erkek çiçek tomurcuğu (Şekil 3.4. (A)) sürtülerek tozlamalar gerçekleştirilmiştir (Şekil 3.4. (B)). A Tozlamalarda bütün genotiplere ait erkek çiçekler karıştırılarak kullanılmıştır. Tozlamadan sonra yabancı polen girişini engellemek amacıyla tozlanmış dişi 17

3. MATERYAL VE YÖNTEM Meltem BERBER çiçekler penslerle yeniden kapatılmıştır (Şekil 3.4. (C)). İlerleyen günlerde çiçeklerdeki yumurtalığın gelişme durumu kontrol edilerek, dişi çiçeğin şişkinleşmeye başladığı ve stigmanın kuruduğu dönemde (Şekil 3.5.) pensler çıkarılmıştır. (A) (B) Şekil 3.3. (A)Anthesisten bir gün önce toplanan erkek çiçekler; (B) Taç ve çanak yaprakları ayrılarak ışınlanmak üzere hazırlanmış anterler (A) (B) (C) Şekil 3.4. Işınlanmış polenle tozlama; (A) ışınlanmış erkek çiçekler (B) dişi çiçeğin ışınlanmış polenle tozlanması (C) tozlamadan sonra pensle kapatılarak izole edilmiş dişi çiçek. 3.2.5. Embriyoların Çıkartılması ve Kültürü 3.2.5.1. Dezenfeksiyon Tozlamalardan 25 35 gün sonra hasat edilen meyveler laboratuara getirilmiştir (Şekil 3.6). Laboratuvara gelen meyveler önce çeşme suyuyla yıkanıp 18

3. MATERYAL VE YÖNTEM Meltem BERBER kurulanmış; daha sonra steril kabin içerisinde, % 96 lık saf etil alkol kullanılarak kuru yakma yöntemi ile dezenfekte edilmiştir. Şekil 3.5. Tozlamadan sonra tutan bir meyvenin birkaç gün sonraki görünümü. Şekil 3.6. Hasat aşamasına gelmiş meyveler 3.2.5.2. Embriyoların Çıkarılması Steril kabin içinde kuru yakma sonrası meyveler steril bir bıçak yardımıyla ve içerisindeki tohumlara zarar verilmemesine özen gösterilerek kesilmiştir (Şekil 3.7). Her meyvenin içinden çıkan tohumlar sayılarak steril bir pens ve bisturi yardımıyla tek tek açılmış ve incelenmiştir. Boş (embriyo içermeyen) veya içi tam dolu (çok iri ve diploid olduğu kesin embriyo içeren) (Şekil 3.8.) olan tohumlar atılmış, olgunlaşmamış embriyolar kurtarılarak E20A ortamına aktarılmıştır. Bu embriyolar embriyogenesis aşamalarına göre aşağıdaki gibi gruplandırılmıştır: Globüler aşama; zigotun şekilsiz bir hücre yığını şeklinde olduğu proembriyo aşamasından sonra küre şeklinde ki gelişmekte olan embriyolar Globüler embriyonun çubuk aşaması; bazı genotiplerde küre şeklindeki 3 5 hücreden oluşan suspensoru çubuk görünümünde olan embriyolar Yürek aşaması; yanlara doğru yayvanlaşarak kalp şeklini alan embriyolar Torpedo aşaması; kotiledonların belirerek iki kanat halinde uzadığı görülen embriyolar ( Eti, 2009). 19

3. MATERYAL VE YÖNTEM Meltem BERBER Şekil 3.7. Embriyoların çıkarılması Şekil 3.8. Tohumların içinde embriyoların görünümü 3.2.5.3. Besin Ortamları ve Kültür Koşulları Embriyo kurtarma çalışmalarında iki farklı besin ortamından yararlanılmıştır. Kurtarılan embriyolar önce 4 cm çapında ve 5 cm yüksekliğindeki küçük kavanozlarda kültüre alınmış ve besin ortamı olarak E20A kullanılmıştır (Çizelge 3.2). Embriyoların bitkiye dönüşmesi, köklenip mikroçoğaltım aşamasına gelmesinden sonra ise 5 cm çaplı ve 9 cm yükseklikteki kavanozlara aktarılmıştır. Bu aşamada ise besin ortamı olarak daha zengin içerikli olan MS besin ortamı kullanılmıştır (Çizelge 3.3). Tüm kültürler sıcaklığı 25±1 C olan ve fotoperiyodu 16 saat aydınlık 8 saat karanlık olacak şekilde hazırlanmış iklim odasında inkübe edilmiştir (Şekil 3.9.). Şekil 3.9. İklim odasında bulunan MS ortamı içeren büyük kavanozlardaki in vitro kabak bitkicikleri 20

3. MATERYAL VE YÖNTEM Meltem BERBER Çizelge 3.2. E20A Besin Ortamının Bileşimi (Sauton, 1987) Makro elementler Miktarı (mg/l) KNO 3 1075.0 NH 4 NO 3 619.0 MgSO 4. 7H 2 O 206.0 CaCl 2. 2H 2 O 156.5 KH 2 PO 4 71.0 Ca(NO 3 ). 4 H 2 O 25.0 NaH 2 PO 4. 4 H 2 O 19.0 (NH 4 ) 2 SO 4 17.0 KCl 3.5 Mikro elementler Miktarı (mg/l) MnSO 4. 7H 2 O 11.065 ZnSO 4. 7H 2 O 1.812 H 3 BO 3 1.575 KI 0.345 Na 2 MgO 4. 2H 2 O 0.094 CuSO 4. 5H 2 O 0.008 CoCl 2. 6H 2 O 0.008 Vitaminler ve Aminoasitler Miktarı (mg/l) Myo-İnositol 50.300 Pyridoxine-HCl 5.500 Nikotinik asit 0.700 Thiamine-HCl 0.600 Calcium Pantothenate 0.500 Biotine 0.005 Glycine 0.100 Demir şelat 37.3 FeSO 4 7H 2 O 27.8 Büyümeyi Düzenleyiciler Miktarı (mg/l) IAA 0.01 21

3. MATERYAL VE YÖNTEM Meltem BERBER Çizelge 3.3. MS Besin Ortamının Bileşimi (Murashige ve Skoog, 1962) Makro elementler Miktarı (mg/l) KNO 3 1900 NH 4 NO 3 1650 MgSO 4. 7H 2 O 370 CaCl 2. 2H 2 O 440 KH 2 PO 4 170 Mikro elementler Miktarı (mg/l) H 3 BO 3 6.2 MnSO 4 H 2 O 15.6 ZnSO 4. 7H 2 O 8.6 Na 2 MoO 4. 2H 2 O 0.25 CuSO 4. 5H 2 O 0.025 CoCl 2. 6H 2 O 0.025 KI 0.83 FeSO 4 7H 2 O 27.8 Na 2 EDTA 37.3 Organik Maddeler Miktarı (mg/l) Thiamine-HCl 0.1 Pyridoxine-HCl 0.5 Nikotinik asit 0.5 Myo-inositol 100 Sakkaroz 30000 Agar 8000 ph 5.8 3.2.6. İn Vitro Bitki Gelişmeleri ve Dış Koşullara Alıştırma MS besin ortamı içeren büyük kavanozlara aktarılan kabak bitkiciklerinden gelişmiş olanlar dış koşullara alıştırılmıştır. Bu amaçla ilk olarak büyük kavanozlarda gelişmesi iyi olan bitkilerin üzerindeki streç filmlere delikler açılmıştır. Bu delikler her gün biraz daha büyütülmüştür. 4 6 gün sonunda streç filmler tamamen açılarak bitkiler küçük plastik bardaklarda toprağa aktarılmıştır. Şaşırtma işlemi için ortamdan çıkarılan bitkiciğin köklerine yapışmış olan besin ortamı, köke zarar verilmeden çeşme suyunda yıkanmıştır (Şekil 3.10.(A), (B)). 22

3. MATERYAL VE YÖNTEM Meltem BERBER A B C D E F Şekil 3.10. İn vitro bitkiciklerin dış ortama transferi. (A) Besin ortamından ayırma; (B) Ortam kalıntılarından kurtarmak amacıyla su altında yıkama; (C) %0,2 lik Captan la hazırlanmış ilaçlı suya batırılan kökler; (D) Steril torf içeren plastik bardaklara dikim; (E) Dikilip, sulanan ve ilaçlanan bitkilerin nemli poşetle örtülmesi; (F) Lastiklerin gevşetildiği 4. günden sonraki dış koşullara alışmak üzere olan bitki. Mantar enfeksiyonlarından korumak amacıyla kökleri %0,2 lik Captan a daldırıp çıkarılan bitkicikler steril toprağa dikilmişlerdir (Şekil 3.10.(C), (D)). Toprak sulanıp, Captan ile ilaçlandıktan sonra saksıların ve bitkilerin üzeri su kaybını engellemek amacıyla plastik örtüyle kapatılmıştır (Şekil 3.10.(E)). İlk 24 saat kapalı tutulan bitkiciklerin (Şekil 3.11.(A)) daha sonra kısmi olarak havalanmaları sağlanmıştır (Şekil 3.10.(F)). Gün içinde de kontrol edilerek sulanmıştır. 4.-7. günler sonunda bitkilerin durumuna göre plastik örtü yavaş yavaş kaldırılarak dış koşullara alıştırılan bitkiler bu sürenin sonunda tamamen açık bırakılmıştır (Şekil 3.11.(B)). Bu günler içinde de bitkiler, düzenli olarak kontrol edilerek sulanmıştır. Dış 23

3. MATERYAL VE YÖNTEM Meltem BERBER koşullara tam olarak alışmış olan bitkiler iklim koşulları sebebiyle (dışarıda sıcaklık çok yüksek olduğu için) araziye aktarılamamış ve büyük saksılara alınarak bina içinde büyütülmüştür. (A) (B) Şekil 3.11. Dış koşullara alıştırılmak amacıyla plastik bardaklara alınan bitki (A) ve dış koşullara alışmış saksıya alınacak olan bir bitki (B). 3.2.7 Ploidi Seviyesinin Belirlenmesi ve Morfolojik Gözlemler Büyük saksılarda yaklaşık bir ay kadar tutulan bitkilerin bir kısmı (toplam 75 adet) daha sonra plastik seraya dikilmiştir. Seraya dikilen bitkilerin ploidi seviyelerini belirlemek üzere polen tozu varlığı baz alınarak stomaların bekçi hücrelerinde bulunan kloroplastların sayımı yapılmış ve ayrıca birim alandaki (mm 2 ) stoma sayıları belirlenmiştir. Bunlara ek olarak altı yaprak örneği alınıp Flow sitometri yöntemini de uygulamak amacıyla Hollanda ya gönderilmiştir. Ancak tanık olarak gönderdiğimiz bitkide bir yanlışlık yapılarak haploid bir bitkinin yaprak örneği gönderilmiştir. Bu nedenle sonuçlar birbirinin aynısı çıkmış ve kıyaslama imkanımız olmadığından tezin sonuçları kapsamında değerlendirilememiştir. Stomaların incelenmesi amacıyla her bitkiden birkaç yaprak alınarak laboratuara getirilmiştir. Bir mikroskop lamının üzerine bir damla su damlatılarak yaprakların soyulan alt epidermisi yerleştirilmiş ve lamel hava kabarcıklarının 24

3. MATERYAL VE YÖNTEM Meltem BERBER oluşumunu önlemek amacıyla materyalin üzerine 45 derecelik açıyla gelecek şekilde kapatılarak preparatlar hazırlanmıştır. 3.2.7.1 Birim Alandaki Stoma Sayısı (adet) Hazırlanan preparatların 40x100 büyütmeli mikroskoba birim kare objektifi yerleştirilerek adet olarak stoma sayımları yapılmıştır. Objektif mikrometreyle alanı bulunarak mm 2 deki stoma sayısı hesaplanmıştır. 3.2.7.2 Kloroplast Sayıları (adet) Hazırlanan preparatlar daha sonra 40x10, 100x10 büyütmeli mikroskopta incelenmiş ve stomaların bekçi hücrelerinde bulunan kloroplastlar sayılmıştır. Üç farklı alanda stoma sayılarak her bir bitki için ortalama stoma sayısı belirlenmiştir. 3.2.7.3 Morfolojik Gözlemler Haploid ve diploid bitkileri kıyaslamak amacıyla araziye dikilmiş olan bitkilerde ayrıca aşağıdaki morfolojik özellikler incelenmiştir: Yaprak genişliği; her bitkinin büyüme uçlarından itibaren dördüncü yapraklarının eni cetvel yardımıyla ölçülerek bulunmuştur. Yaprak uzunluğu; her bitkinin büyüme uçlarından itibaren dördüncü yapraklarının uzunluğu, yaprağın uç kısmından sapına kadar olacak şekilde cetvel yardımıyla ölçülerek bulunmuştur. Yaprak indeksi; yaprak uzunluğu yaprak genişliğine bölünerek yaprak indeksi hesaplanmıştır. Yaprak sap çapı; ; her bitkinin büyüme uçlarından itibaren dördüncü yapraklarının sapının eni kompas yardımıyla ölçülmüştür. Yaprak sap uzunluğu; her bitkinin büyüme uçlarından itibaren dördüncü yapraklarının sapının uzunluğu bir cetvel yardımıyla ölçülmüştür. 25

3. MATERYAL VE YÖNTEM Meltem BERBER Erkek çiçek çapı; her bitkide antesis dönemindeki erkek çiçeğin en şişkin olan orta yerinin çapı kumpas yardımıyla ölçülmüştür. Erkek çiçek uzunluğu; her bitkide antesis dönemindeki erkek çiçeğin sapından ucuna kadarki uzunluğu cetvel yardımıyla ölçülmüştür. Erkek çiçek sap çapı; her bitkide antesis dönemindeki erkek çiçeğin sapının tam orta yerinin çapı kumpas yardımıyla ölçülmüştür. Erkek çiçek sapı uzunluğu; her bitkide antesis dönemindeki erkek çiçeğin sapının uzunluğu kumpas yardımıyla ölçülmüştür. Çiçek tozu varlığı; her bitkideki tüm çiçekler tek tek incelenerek çiçek tozu varlığına bakılmış ve var ya da yok şeklinde not alınmıştır. 3.2.9 Yapılan Sayım, Ölçüm ve Gözlemler Araştırmada başarıyı ölçebilmek, genotipler ve ışın dozları arasındaki farklılıkları görebilmek için aşağıdaki gözlem ve sayımlar yapılmıştır: Meyve tutma oranı: Her ışın dozunda ve genotipte tutan toplam meyve sayısının, tozlanan çiçek sayısına oranının 100 ile çarpımıyla hesaplanmıştır. MTO = TTMS/ TTÇS x 100 Her meyveden çıkarılan tohum sayısı (TS) (adet): Steril kabinde kesilen meyvelerden çıkarılan tohumların sayısı ayrı ayrı kaydedilmiş ve bunların genotip ve dozlara göre ortalamaları hesaplanmıştır. Meyve başına düşen ortalama tohum sayısı (OTS) (adet/meyve): Her genotipte elde edilen toplam tohum sayısının o genotipteki toplam meyve sayısına oranı ile hesaplanmıştır. Toplam embriyo sayısı (TES): Her meyveden elde edilen embriyoların sayısı kaydedilmiştir. Araştırma sonunda her bir genotip ve ışın dozu için ortalamalar hesaplanmıştır. Farklı gelişme safhalarındaki embriyo sayıları (Globüler, çubuk, yürek, torpedo): Her meyveden elde edilen embriyoların embriyogenesis aşamalarına bakılarak gelişme durumları kaydedilmiştir. 26

3. MATERYAL VE YÖNTEM Meltem BERBER Meyve başına kurtarılan ortalama embriyo sayısı (OES) ( adet/meyve): Her genotipin toplam embriyo sayısının meyve sayısına bölünmesiyle hesaplanmıştır. Embriyoların bitkiye dönüşüm oranları (%): Her meyveden elde edilen bitki sayısının, meyveden elde edilen farklı safhalardaki toplam embriyo sayısına oranının 100 ile çarpımıyla hesaplanmıştır. BDO = BDES/ TBS x 100 27

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4.1. Araştırma Bulguları Kabuksuz ve kabuklu farklı kabak genotiplerinin kullanılarak üç farklı ışın dozunun haploid embriyo uyartımına etkilerinin incelendiği bu araştırmadan elde edilen bulgular yapılan gözlemlere göre gruplandırılarak aşağıda sunulmuştur. 4.1.1. Meyve Tutma Oranları Çizelge 4.1. de 50, 100 ve 150 Gy ışın dozları uygulanarak ışınlanan on beş farklı genotipin tozlanan çiçek sayısı, tutan meyve sayısı ve meyve tutma oranı verilmiştir. 16.04.08 tarihinde yapılan ilk tozlamayı 18.04.08, 20.04.08, 23.04.08, 25.04.08 ve 30.04.08 tarihlerinde yapılan tozlamalar izlemiş ve toplam altı kez tozlama gerçekleştirilmiştir. İlk tozlamalarda her üç ışın dozundan da eşit sayıda olacak miktarda çiçekle çalışılmıştır. Daha sonraki tozlamalarda ise her üç ışın dozunda daha önceki tozlamalardaki meyve tutma oranlarına bakılarak, tutmayan dozlara ağırlık verilecek şekilde tozlamalar yapılmıştır. Kapatılan dişi çiçek sayısı genotiplere göre değiştiğinden eksik kalan doza ağırlık verilecek şekilde çiçekler tozlanmıştır. Farklı genotiplerde çiçeklenme tarihleri de değiştiği için çalışılan genotiplerde tozlama başlangıç tarihleri de farklı olmuştur. Genel olarak kabuklu tohumlu kabaklar, kabuksuz tohumlu kabaklara göre daha çabuk çiçeklenmiştir. Özellikle İsk 1 genotipinin çiçek ve meyve sayısının diğer genotiplere göre daha fazla olduğu belirlenmiştir. Kabuksuz tohumlu kabaklardan ÇÜZF No.5 hattı ile beraber Y.Yeşil ve G.Ölkürbis genotiplerinin çiçekleri de diğer genotiplere göre daha geç açtığından ilk ışınlamalarda bu çeşitlerde tozlama yapılamamıştır. Genotiplerin tamamında, 50 Gy ışın dozu uygulanan polenlerle tozlanan 60 çiçeğin 38 i; 100 Gy ışın dozu uygulanan polenlerle tozlanan 57 çiçekten 40 ı ve 150 Gy ışın dozu uygulanarak tozlanan 58 çiçekten 41 i tutmuştur. Meyve tutma oranları sırasıyla % 63.3, % 70.1 ve % 70.6 olarak gerçekleşmiştir (Şekil 4.1.). 28

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER Çizelge 4.1. Meyve tutma oranı Genotip Işın Dozu Tozlanan Çiçek Sayısı Tutan Meyve Sayısı Meyve Tutma Oranı(%) ÇÜZF No.1 50 6 2 33.3 100 4 4 100.0 150 3 2 66.6 ÇÜZF No.2 50 7 2 28.5 100 4 2 50.0 150 4 3 75.0 ÇÜZF No.3 50 4 3 75.0 100 5 3 60.0 150 6 5 83.3 ÇÜZF No.4 50 4 2 50.0 100 5 3 60.0 150 4 3 75.0 ÇÜZF No.5 50 2 1 50.0 100 4 3 75.0 150 2 2 100.0 ÇÜZF No.7 50 6 4 66.6 100 3 1 33.3 150 3 1 33.3 ÇÜZF No.9 50 4 3 75.0 100 4 4 100.0 150 3 2 66.6 ÇÜZF No.10 50 3 3 100.0 100 3 1 33.3 150 3 3 100.0 Y.Yeşil 50 5 1 20.0 100 2 1 50.0 150 3 1 33.3 G.Ölkürbis 50 2 2 100.0 100 2 1 50.0 150 3 1 33.3 İskenderun 1 50 4 4 100.0 100 6 6 100.0 150 7 4 57.0 İskenderun 2 50 3 3 100.0 100 3 2 66.6 150 5 4 80.0 Edirne 50 4 2 50.0 100 4 4 100.0 150 5 4 80.0 Nevşehir 50 3 3 100.0 100 4 1 25.0 150 4 3 75.0 Sakız 5801 50 3 3 100.0 100 4 4 100.0 150 3 3 100.0 29

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER Toplamda da tozlanan 175 çiçekten 119 meyve oluşmuştur ve ortalama meyve tutma oranı % 68 olarak bulunmuştur. En yüksek meyve tutumu % 100 oranı ile kabuklu tohumlu Sakız genotipinde olmuş; bunu İsk 1, İsk 2 ve ÇÜZF No.9, ÇÜZF No.10, Edirne,,ÇÜZF No.5, ÇÜZF No.3, Nevşehir, ÇÜZF No.1 ve ÇÜZF No.4, G.Ölkürbis, ÇÜZF No.7, ÇÜZF No.2 genotipleri sırasıyla izlemiştir. En düşük meyve tutumu ise kabuksuz tohumlu Y. Yeşil genotipinde % 30 oranında gerçekleşmiştir (Şekil 4.2.). Kabuklu ve kabuksuz tohumlu kabakların ortalama meyve tutma oranları kıyaslandığında kabuksuz tohumlu kabaklarda meyve tutumunun kabuklu tohumlu genotiplere göre biraz daha düşük olduğu görülmüştür (Şekil 4.3.). Kabuksuz tohumlu kabak genotiplerinden tozlanan toplam 113 çiçekten 69 u meyve oluşturmuştur ve meyve tutma oranı % 61.0 bulunmuştur. Kabuklu tohumlu kabak genotiplerinde ise 62 çiçekten 50 si meyve tutmuş ve ortalama % 81 oranında meyve tutumu gerçekleşmiştir. Bununla birlikte bazı kabuksuz hatlarda (ÇÜZF No.9 ve ÇÜZF No.10) bazı kabuklu genotiplerden (Nevşehir) daha yüksek meyve tutma oranı da gerçekleştiğini belirtmemiz gerekir. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 50 Gy 100 Gy 150 Gy Şekil 4.1. Işın dozlarına göre meyve tutma oranı (MTO: Meyve tutma oranı) 30

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 62 47 73 62 73 50 82 78 ÇÜZF-1 ÇÜZF-2 ÇÜZF-3 ÇÜZF-4 ÇÜZF-5 ÇÜZF-7 ÇÜZF-9 ÇÜZF-10 30 YY GÖ İsk-1 Şekil 4.2. Genotiplere göre meyve tutma oranı 57 82 82 77 İsk-2 Ed-1 Nev-1 64 SK 100 (%) 90 80 70 60 50 40 % 30 20 10 0 Kabuksuz Kabuklu Şekil 4.3. Kabuklu ve kabuksuz tohumlu genotiplerde meyve tutma oranı 31

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER 4.1.2. Meyve Başına Düşen Ortalama Tohum Sayıları Üç farklı ışın dozu kullanılarak ışınlanmış polenlerle yapılan tozlamalar sonucunda elde edilen meyvelerden çıkan tohumların kabuklarının, kabuksuz genotiplerde çok ince bir zar şeklinde kaldığı ve kabuklu genotiplerden çok daha yumuşak olduğu gözlenmiştir. Çoğunlukla kabukların içi boş ya da farklı aşamalarda olgunlaşmış embriyo olanlarla beraber içi dolu tohumlar da aynı meyvede bulunabilmiştir (Şekil 4.4.). (a) (b) (c) Şekil 4.4. 50 Gray ışın dozuyla tozlanmış bir meyveden elde edilen tohumlar, içi boş tohum (a), içinde haploid olduğu tahmin edilen embriyo içeren tohum (b), diploid embriyo içeren tohum (c). Genel olarak 50 Gy ışın dozuyla tozlanan meyvelerde tohumların çoğunun içi dolu çıkmıştır. Buna karşılık 100 ve 150 Gy ışın dozlarıyla tozlanan meyvelerde ise tohumların çoğunun içinin boş olduğu görülmüştür. Ayrıca bunlarda tohumların sık ve düzgün şekilde dizilmiş oldukları da gözlenmiştir. Bu durum genotipten genotipe hatta aynı genotip içindeki meyvelerde dahi farklılık gösterdiğinden tohum sayıları değişken olmuştur. Işın dozlarına ve genotiplere göre meyve sayıları, tohum sayıları ve meyve başına düşen ortalama tohum sayıları standart sapmalarıyla beraber Çizelge 4.2. de gösterilmiştir. Denenen üç ışın dozuyla tozlanarak elde edilen toplam 119 meyveden çıkarılan ortalama tohum sayısı 247.1 adet/meyve dir. Çizelgede de görüldüğü gibi ÇÜZF No.7 genotipinin ortalama tohum sayısı, ortalama tohum sayılarından iki katından daha yüksek çıkmıştır. İsk 1 ve İsk 2 genotiplerinin 32

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER Kabuksuz tohumlu kabak genotiplerinde toplam 69 meyveden elde edilen toplam tohum sayısı 19 656 olup ortalama tohum sayısı 285.6 adet/ meyve dir. Kabuklu tohumlu genotiplerde ise 50 meyvenin toplam tohum sayısı 9698 olup ortalama tohum sayısı 193.96 adet/meyve dir (Şekil 4.5.). 350 300 250 200 150 100 50 0 Kabuksuz Kabuklu Şekil 4.5. Kabuklu ve kabuksuz tohumlu genotiplerde ortalama tohum sayıları Işın dozları ile ortalama tohum sayıları arasındaki ilişki incelendiğinde ışın dozu arttıkça ortalama tohum sayısının düştüğü görülmektedir. 50 Gy ışın dozuyla tozlanan meyvelerin ortalama tohum sayıları 299.9 adet/ meyve iken, 100 Gy de 247.9 adet/ meyve, 150 Gy de ise 198.1 adet/meyve dir (Şekil 4.6.). 33

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER Çizelge 4.2. Meyve başına düşen ortalama tohum sayıları Genotip Işın Dozu Meyve Sayısı Tohum Sayısı Ortalama Tohum Sayısı 50 2 790 395.0 ÇÜZF No.1 100 4 1378 344.5 150 2 486 243.0 50 2 555 277.5 ÇÜZF No.2 100 2 420 210.0 150 3 892 297.3 50 3 694 231.3 ÇÜZF No.3 100 3 947 315.6 150 5 1160 232.0 50 2 604 302.0 ÇÜZF No.4 100 3 720 240.0 150 3 577 192.3 50 1 320 320.0 ÇÜZF No.5 100 3 907 302.3 150 2 782 391.0 50 4 1591 397.8 ÇÜZF No.7 100 1 291 291.0 150 1 304 304.0 50 3 1289 429.6 ÇÜZF No.9 100 4 1251 312.7 150 2 229 114.5 50 3 886 295.3 ÇÜZF No.10 100 1 264 264.0 150 3 647 215.6 50 1 358 358.0 Y.Yeşil 100 1 189 189.0 150 1 178 178.0 50 2 671 335.5 G.Ölkürbis 100 1 210 210.0 150 1 121 121.0 50 4 593 148.3 İskenderun 1 100 6 1096 182.7 150 4 546 136.5 50 3 710 236.7 İskenderun 2 100 2 306 153.0 150 4 540 135.0 50 2 470 235.0 Edirne 100 4 844 211.0 150 4 746 186.5 50 3 1081 360.4 Nevşehir 100 1 200 200.0 150 3 740 246.7 50 3 757 252.3 Sakız 100 4 891 222.8 150 3 178 059.3 Toplam Ortalama Tohum Sayıları 331.75 ± 131.73 266.71 ± 89.55 280.10 ± 122.64 237.63 ± 59.81 334.83 ± 88.86 364.33 ± 85.75 307.66 ± 145.97 256.71 ± 97.81 241.67 ± 100.90 250.50 ± 107.77 159.64 ± 102.82 155.67 ± 78.87 206.00 ± 63.71 288.71 ± 79.80 182.67 ± 99.60 34

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER 350 300 250 200 150 100 50 0 50 Gy 100 Gy 150 Gy Şekil 4.6. Işın dozlarına göre meyve başına ortalama tohum sayıları 4.1.3. Meyve Başına Kurtarılan Ortalama Embriyo Sayıları Işınlanmış polenlerle uyartım sonucu elde edilen embriyo sayıları ile meyve başına kurtarılan embriyo sayılarına ilişkin sonuçlar, ışın dozlarına ve genotiplere göre Çizelge 4.3. te verilmiştir. Her üç ışın dozuyla tozlanarak elde edilen 119 meyveden 2073 embriyo kurtarılmış olup bir meyveden elde edilen ortalama embriyo sayısı 17.4 olarak bulunmuştur. Meyve başına kurtarılan embriyo sayıları ışın dozlarına ve genotiplere göre sınıflandırılmış olarak Şekil 4.7. de sunulmuştur. Görüldüğü gibi meyve başına kurtarılan embriyo sayısı en fazla olan genotip ÇÜZF No.9 (26.7) dur. Ardından sırasıyla Y.Yeşil, ÇÜZF No.1, ÇÜZF No.3, ÇÜZF No.5, ÇÜZF No.10, İsk 1, G.Ölkürbis, ÇÜZF No.7, ÇÜZF No.4, Sakız, ÇÜZF No.2, İsk 2, Nevşehir gelmiştir. En az meyve başına kurtarılan embriyo sayısına sahip olan genotip de Edirne (11.7) olmuştur. Işın dozları ile embriyo uyartımı arasındaki ilişki incelendiğinde en fazla embriyonun 100 Gy ışın dozundan, en az embriyonun ise 150 Gy ışın dozundan elde edildiği anlaşılmaktadır. Bunun nedeni içi dolu olan diploid embriyoları içeren 35

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER tohumların atılması ve bu embriyolarında çoğunlukla 50 Gy de olmasıdır. 50 Gy ışın dozu uygulanarak yapılan tozlamalarda toplam 38 meyveden 667 embriyo; 100 Gy de 40 meyveden 916 embriyo ve 150 Gy de ise 41 meyveden 490 embriyo elde edilmiş olup meyve başına kurtarılan embriyo ortalamaları sırasıyla 17.5, 22.9 ve 11.9 şeklinde olmuştur (Şekil 4.8.). 30 25 20 15 10 5 0 25 14 20 16 19 16 27 19 26 17 19 14 12 13 16 ÇÜZF-1 ÇÜZF-2 ÇÜZF-3 ÇÜZF-4 ÇÜZF-5 ÇÜZF-7 ÇÜZF-9 ÇÜZF-10 YY GÖ İsk-1 İsk-2 Ed-1 Nev-1 SK Şekil 4.7. Genotiplere göre ortalama embriyo sayıları Kabuksuz tohumlu kabak genotiplerinden elde edilen 69 meyveden 1348 embriyo kurtarılmış olup meyve başına 19.5; kabuklu tohumlu kabak genotiplerinden ise elde edilen 50 meyveden 725 embriyo kurtarılmış olup meyve başına 14.5 embriyo kurtarılmıştır. Kabuksuz tohumlu kabakların kabuklu tohumlulara göre biraz daha fazla embriyo verdiği görülmektedir ( Şekil 4.9.). 36

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER Çizelge 4.3. Meyve başına kurtarılan ortalama embriyo sayıları Genotip Işın Dozu Meyve Sayısı Toplam Embriyo M. B. K. O. E. S. 50 2 62 31.0 ÇÜZF No.1 100 4 98 24.5 150 2 38 19.0 50 2 25 12.5 ÇÜZF No.2 100 2 35 17.5 150 3 40 13.3 50 3 37 18.5 ÇÜZF No.3 100 3 87 29.0 150 5 78 26.0 50 2 35 17.5 ÇÜZF No.4 100 3 74 24.6 150 3 17 05.6 50 1 14 14.0 ÇÜZF No.5 100 3 67 22.3 150 2 31 15.5 50 4 44 11.0 ÇÜZF No.7 100 1 27 27.0 150 1 25 25.0 50 3 74 24.6 ÇÜZF No.9 100 4 118 29.5 150 2 49 24.5 50 3 70 23.3 ÇÜZF No.10 100 1 30 30.0 150 3 30 10.0 50 1 32 32.0 Y.Yeşil 100 1 31 31.0 150 1 14 14.0 50 2 46 23.0 G.Ölkürbis 100 1 18 18.0 150 1 2 02.0 50 4 41 13.6 İskenderun 1 100 6 159 26.5 150 4 41 10.2 50 3 53 17.6 İskenderun 2 100 2 32 16.0 150 4 38 09.5 50 2 31 15.5 Edirne 100 4 38 09.5 150 4 48 12.0 50 3 44 14.6 Nevşehir 100 1 14 14.0 150 3 31 10.3 50 3 59 19.6 Sakız 100 4 88 22.0 150 3 8 02.6 M.B. K.O.S.: Meyve başına düşen kurtarılmış embriyo sayısı 37

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER 25 20 15 10 5 0 50 Gy 100 Gy 150 Gy Şekil 4.8. Işın dozlarına göre ortalama embriyo sayıları 25 20 15 10 5 0 Kabuksuz Kabuklu Şekil 4.9. Kabuklu ve kabuksuz tohumlu genotiplerde ortalama embriyo sayıları 38

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER 4.1.4. Elde Edilen Embriyoların Gelişme Safhaları Işınlanan polenlerle tozlanarak elde edilen meyvelerdeki tohumlardan kurtarılan embriyoların globüler, çubuk, yürek ve torpedo aşamalarına ilişkin sonuçlar ışın dozlarına ve genotiplere göre Çizelge 4.4. te verilmiştir. Elde edilen toplam 2073 embriyodan 502 sinin globüler, 563 ünün çubuk, 227 sinin yürek ve 781 inin torpedo aşamasında oldukları anlaşılmıştır. Bu aşamalardaki embriyoların toplam embriyoya oranları sırasıyla %24.23, %27.18, %10.96 ve % 37.67 dir. 50 Gy ışın dozu uygulanarak elde edilen 667 embriyodan 130 u globüler; 156 sı çubuk, 89 u yürek ve 292 si torpedo aşamasındayken; 100 Gy de elde edilen 916 embriyodan 250 si globüler, 258 si çubuk, 88 i yürek ve 320 si torpedo aşamasındadır. 150 Gy de ise 490 embriyo tüm genotiplerde elde edilmiş olup bunun 122 si globüler,149 u çubuk, 50 si yürek ve 169 u torpedo aşamasındadır. Her üç ışın dozunda da en fazla embriyo torpedo aşamasında bulunurken bunu çubuk, globüler ve en az embriyo da yürek aşaması izlemiştir (Şekil 4.10.). 350 300 250 200 150 100 50 0 G Ç K T 50 Gy 100 Gy 150 Gy Şekil 4.10. Globüler, çubuk, yürek(kalp) ve torpedo aşamalarındaki embriyoların ışın dozlarına göre oranı 39

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER Çizelge 4.4. Farklı genotiplerden denenen ışın dozlarında elde edilen embriyoların gelişim aşamaları Genotip MS Işın Embriyo TES Dozu Aşamaları G Ç K T ÇÜZF No.1 2 50 8 25 8 21 62 4 100 21 34 10 33 98 2 150 5 12 5 16 38 ÇÜZF No.2 2 50 4 1 6 14 25 2 100 18 7 3 7 35 3 150 16 11 4 9 40 ÇÜZF No.3 3 50 8 8 1 20 37 3 100 17 25 11 34 87 5 150 14 28 5 31 78 ÇÜZF No.4 2 50 2 8 5 20 35 3 100 13 16 5 40 74 3 150 7 3 1 6 17 ÇÜZF No.5 1 50 1 - - 13 14 3 100 13 19 9 26 67 2 150 8 9 1 13 31 ÇÜZF No.7 4 50 9 12 4 19 44 1 100 6 6 2 13 27 1 150 8 10-7 25 ÇÜZF No.9 3 50 14 17 9 34 74 4 100 39 43 6 30 118 2 150 3 20 7 19 49 ÇÜZF No.10 3 50 5 15 6 44 70 1 100 6 10 5 9 30 3 150 9 8 4 9 30 Y.Yeşil 1 50 6 5 9 12 32 1 100 8 3 6 14 31 1 150 7 2-5 14 G.Ölkürbis 2 50 10 6 9 21 46 1 100 3 6 1 8 18 1 150-2 - - 2 İskenderun 1 4 50 12 15 5 9 41 6 100 48 53 18 40 159 4 150 12 14 3 12 41 İskenderun 2 3 50 13 18 3 19 53 2 100 16 9-7 32 4 150 6 13 3 16 38 Edirne 2 50 7 9 3 12 31 4 100 12 5 4 17 38 4 150 21 7 9 11 48 Nevşehir 3 50 13 11 2 18 44 1 100 3 4 3 4 14 3 150 6 10 8 7 31 Sakız 3 50 18 6 19 16 59 4 100 27 18 5 38 88 3 150 - - - 8 8 Toplam 502 563 227 781 2073 40

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 ÇÜZF-1 ÇÜZF-2 ÇÜZF-3 ÇÜ-4 ÇÜ-5 ÇÜ-7 ÇÜ-9 ÇÜ-10 YY GÖ İsk-1 İsk-2 Ed-1 Nev-1 SK G Ç K T Şekil 4.11. Genotiplerin globüler, çubuk, yürek ve torpedo aşamalarındaki embriyo oranları. 41

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER Kurtarılan olgunlaşmamış embriyoların globüler, çubuk ve yürek aşamalarında en fazla embriyo sayısına İsk 1 genotipi, torpedo aşamasında ÇÜZF No.3 genotipi; en az embriyo sayısına ise globüler ve torpedo aşamalarında G.Ölkürbis; çubuk aşamasında Y.Yeşil; yürek aşamasında da İsk 2 genotipi sahip olmuştur (Şekil 4.11.). Kabuksuz tohumlu kabak genotiplerinden kurtarılan embriyoların %21.5 i globüler, %27.7 si çubuk, %9.8 i yürek,%40.8 i ise torpedo aşamalarındadır. Kabuklu tohumlu kabak genotiplerinden kurtarılan embriyolardan ise %29.1 i globüler, %26.1 i çubuk, %12.9 u yürek ve %31.8 i torpedo aşamalarındadır. 4.1.5. Embriyoların Bitkiye Dönüşüm Oranları In vitro kültüre alınan embriyoların bitkiye dönüşüm oranları Çizelge 4.5. da verilmiştir. Her üç ışın dozunda ve tüm genotiplerde toplam olarak 2073 embriyodan 979 bitkicik elde edilerek %47.2 oranında bitkiye dönüşüm gerçekleşmiştir. Genotiplerin bitkiye dönüşüm oranları incelendiğinde kabuksuz tohumlu 1348 adet embriyodan 604 bitkicik elde edilerek %44.8 oranında; kabuklu tohumlu kabak genotiplerinde ise 725 adet embriyodan 375 bitkicik elde edilerek % 51.7 oranında bitkiye dönüşüm gerçekleşmiştir. Kabuklu genotiplerin bitkiye dönüşüm oranlarının kabuksuz genotiplere göre daha fazla olduğu Şekil 4.12. de de görülmektedir. Genotiplerden bitkiye dönüşüm oranı en fazla olan genotip kabuklu tohumlu kabak genotiplerinden Nevşehir dir. Bu genotipi, ÇÜZF No.4, ÇÜZF No.7, ÇÜZF No.2, İsk 2, Edirne, ÇÜZF No.10, İsk 1, ÇÜZF No.3, ÇÜZF No.5, G.Ölkürbis, ÇÜZF No.1, Sakız, Y.Yeşil ve ÇÜZF No.9 genotipleri takip etmektedir. Genotiplerin embriyolarının bitkiye dönüşme oranları sırasıyla 70.7, 58.7, 58.3, 56.0, 55.2, 54.7, 53.8, 50.2, 49.5, 48.7, 45.5, 42.0, 36.7, 32.4 ve 21.5 tir. ÇÜZF No.9 genotipinin 150 Gy ışın dozu uygulamasında enfeksiyonla karşılaşıldığı için bitkiye dönüşüm az olmuştur (Şekil 4.13.). 42

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER Çizelge 4.5. Bitkiye dönüşüm oranları Genotip Işın Dozu Toplam Embriyo Sayısı Toplam Bitki Sayısı Bitkiye Dönüşme Oranı(%) 50 62 18 29.0 ÇÜZF No.1 100 98 47 47.9 150 38 19 50.0 50 25 19 76.0 ÇÜZF No.2 100 35 24 68.5 150 40 13 32.5 50 37 27 72.9 ÇÜZF No.3 100 87 30 34.4 150 78 43 55.1 50 35 15 42.8 ÇÜZF No.4 100 74 49 66.2 150 17 10 58.8 50 14 14 100 ÇÜZF No.5 100 67 30 44.7 150 31 13 41.9 50 44 20 45.5 ÇÜZF No.7 100 27 11 40.7 150 25 25 100 50 74 29 39.1 ÇÜZF No.9 100 118 23 19.4 150 49-0* 50 70 43 61.4 ÇÜZF No.10 100 30 8 26.6 150 30 19 63.3 50 32 13 40.6 Y.Yeşil 100 31 2 06.4 150 14 10 71.4 50 46 20 43.4 G.Ölkürbis 100 18 8 44.4 150 2 2 100 50 41 24 58.5 İskenderun 1 100 159 71 44.6 150 41 28 68.2 50 53 26 49.0 İskenderun 2 100 32 22 68.7 150 38 20 52.6 50 31 24 77.4 Edirne 100 38 23 60.5 150 48 17 35.4 50 44 31 70.4 Nevşehir 100 14 8 57.1 150 31 24 77.4 50 59 27 45.7 Sakız 100 88 23 26.1 150 8 7 87.5 * Bu uygulamada enfeksiyonla karşılaşıldığı için bitkiye dönüşüm olmamıştır. 43

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER 25 20 15 10 5 0 Kabuksuz Kabuklu Şekil 4.12. Kabuklu ve kabuksuz tohumlu genotiplerde embriyoların bitkiye dönüşüm oranları 80 70 60 50 40 30 20 10 0 42 56 50 59 49 58 22 54 32 46 50 56 55 71 37 ÇÜZF-1 ÇÜZF-2 ÇÜZF-3 ÇÜZF-4 ÇÜZF-5 ÇÜZF-7 ÇÜZF-9 ÇÜZF-10 YY GÖ İsk-1 İsk-2 Ed-1 Nev-1 SK Şekil 4.13. Genotiplere göre embriyoların bitkiye dönüşüm oranları 44

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER 50 Gy ışın dozu uygulanarak elde edilen meyvelerdeki toplam 667 embriyodan 350 si bitkiye dönüşmüştür. 100 Gy de 913 embriyodan 379 u 150 Gy de ise 493 embriyodan 250 si bitkiye dönüşmüştür. Işın dozlarının bitkiye dönüşme oranları sırasıyla %52.5; %41.5 ve %50.7 olarak hesaplanmıştır (Şekil 4.14). 60 50 40 30 20 10 0 50 Gy 100 Gy 150 Gy Şekil 4.14. Işın dozlarına göre embriyoların bitkiye dönüşüm oranları. 4.1.6. Dış Ortama Alıştırma ve Bitkiye Dönüşüm Elde edilen 2073 embriyodan gelişmeyen, enfekte olan, vitrifiye olan, bitkiye dönüşen ve saksıya alıştırılan bitki sayıları ve saksıda gelişen bitki oranları Çizelge 4.6. da toplu şekilde verilmiştir. Bitkiye dönüşüm sırasında embriyoların %12.1 i gelişmemiş, % 37.0 si vitrifikasyona uğramış, % 03.6 sı da enfeksiyon nedeniyle ölmüştür. Kalan ve bitkiye dönüşen 979 bitkinin % 50.8 i saksıda gelişimine devam ederken, kalan % 49.2 si (481 bitki) alıştırma sırasında bu işlemin yapıldığı dönemin Ağustos ayına denk gelmesi, yüksek hava sıcaklığı ve uygun koşullarda tutulamama nedeniyle ölmüştür. Saksıda gelişmesi iyi olan bitkilerden 75 adedi daha sonra bir plastik seraya aktarılmıştır. 45

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER Çizelge 4.6. Embriyoların bitkiye dönüşümleri sürecinde gelişmeyen, enfekte olan ve vitrifiye olan bitki sayıları ve kalan bitkilerin saksıya aktarılma oranları. Genotip ETES GS VS ES BG SGBS SGBO (%) ÇÜZF 1 198 9 91 4 84 46 54.7 ÇÜZF 2 100 4 39 1 56 31 55.3 ÇÜZF 3 202 31 66 3 100 59 59 ÇÜZF 4 126 20 27 5 74 39 52.7 ÇÜZF 5 112 26 29-57 53 92.9 ÇÜZF 7 96 17 23-56 32 57.1 ÇÜZF 9 241 64 113 49 52 40 76.9 ÇÜZF 10 130 15 24-70 16 22.9 Y.Yeşil 77 3 49-25 22 88.0 G.Ölkürbis 66 7 28 1 30 23 76.6 İSK 1 241 12 103 2 123 34 27.6 İSK 2 123 17 31 5 68 29 42.6 Edirne 117 7 45 1 64 39 60.9 Nevşehir 89-24 1 63 8 12.6 Sakız 155 19 76 3 57 27 47.3 Toplam 2073 251 768 75 979 498 50.8 ETES: Elde edilen toplam embriyo, GS: Gelişmeyen sayısı, VS: Vitrifiye sayısı, ES: Enfekte sayısı, BG: Bitkiye gelişen, SGBS: Saksıda gelişen bitki sayısı, SGBO: Saksıda gelişen bitki oranı. (A) Şekil 4.15. Saksılara aktarılan bina içindeki bitkiler. 46

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER Şekil 4.16. Bitkilerin saksılardan seraya dikilmesi 4.1.7. Seçilen Bitkilerde Morfolojik gözlemler ve Ploidi Seviyesinin Belirlenmesi Seraya dikilen toplam 75 bitkide çiçekler açılmaya başladıktan sonra erkek çiçeklerde çiçek tozu varlığına bakılmış ve çiçek tozu verenler diploid, vermeyenler haploid olarak ayrılmıştır. Yapılan bu ilk inceleme sonucunda 75 bitkiden 32 si haploid (% 42.7), 43 ü diploid (% 57.3) görüntüsü vermiştir. Haploid görüntüsü veren bitkilerden 8 bitkinin (% 25.0) 50 Gray, 10 bitkinin (% 31.3) 100 Gray ve 14 bitkinin (% 43.8) 150 Gray; diploid görüntüsü verenlerden 31 bitkinin 50 Gray, 9 bitkinin 100 Gray ve 3 bitkinin de 150 Gray olduğu belirlenmiştir. Bu iki grup bitkiden daha sonra seçilen 15 er adedinde yaprak eni, yaprak boyu, yaprak indeksi, yaprak sapının çapı, yaprak sapının uzunluğu, erkek çiçek çapı, erkek çiçek uzunluğu, erkek çiçek sap çapı, erkek çiçek sap uzunluğu ölçülmüştür. Bu gözlem ve ölçümlerin sonuçları da Çizelge 4.7. ve Çizelge 4.8. da gösterilmiştir. Çizelge 4.7. ve Çizelge 4.8. daki değerlerin incelenmesinden görüleceği gibi iki grup bitki arasında incelenen parametreler bakımından önemli farklılıklar bulunmuş; çiçek tozu verenler grubunda yaprak eni, yaprak boyu, yaprak sapı uzunluğu (Şekil 4.17.) ve erkek çiçek sapı uzunluğu yaklaşık iki kat; erkek çiçek uzunluğu yaklaşık iki buçuk kat; yaprak sapı çapı yaklaşık üç kat daha yüksek 47

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER bulunmuştur (Şekil 4.18.). Yaprak indeksi ve erkek çiçek sapının çapı bakımından ise iki grup arasındaki farklar çok fazla çıkmamıştır. Şekil 4.17. Haploid ve diploid bitkilerin 4. yaprakları ve erkek çiçekleri Her iki grup bitkinin yapraklarında sayılan stoma yoğunluğu ve stoma bekçi hücrelerindeki kloroplast sayıları ise Çizelge 4.9 da verilmiştir. Beklendiği gibi bu parametreler bakımından da iki grup bitki arasında önemli farklar görülmüş; çiçek tozu vermeyenlerde verenlere göre stoma yoğunluğu iki kat daha fazla, kloroplast sayısı yarıya yakın daha az bulunmuştur. İki grup bitkinin stomalarından birer görüntü Şekil 4.19 da sunulmuştur. Çizelge 4.7. Seraya şaşırtılan bitkilerden diploid oldukları düşünülenlerde yaprak ve çiçek özellikleri Genotip I.D. YE YB Yİ YSÇ YSU EÇÇ EÇU EÇ SE EÇ SU 1 2 50 18.2 17.0 0.93 0.71 2.15 1.51 5.50 0.3 32.0 1 3 50 19.7 19.9 1.01 1.18 1.46 1.31 4.82 0.3 34.0 2 1 50 27.4 25 0.98 1.30 2.15 1.56 5.00 0.59 28.0 2 2 100 24.5 25.5 1.04 0.77 2.25 0.99 2.36 0.38 25.0 3 1 50 27 22.5 0.83 0.89 2.20 1.23 6.2 0.69 36.0 3 2 100 22.5 24 1.06 1.04 1.85 1.49 4.43 0.40 20.0 5 1 100 32 18 0.56 0.93 2.2 1.78 9.00 0.59 24.0 7 1 50 22 21.5 0.97 0.93 1.95 1.60 4.0 1.12 23.0 7 1 50 26.5 21 0.79 0.75 0.19 1.30 7.44 0.5 29.0 9 1 50 22.5 21.5 0.95 0.97 2.00 1.37 2.6 0.55 16.0 10 1 50 18.5 16.2 0.87 0.66 1.70 1.27 5.85 0.33 17.0 YY-1 50 24 20 0.83 0.54 1.4 1.76 8.5 0.42 24.0 Ed-1 100 22 20.5 0.93 0.57 1.35 1.18 5.5 0.50 28.0 9-1 50 22.5 19.5 0.86 1.08 1.9 1.13 5.5 0.46 14.5 Kontrol - 19.5 18.5 0.94 1.00 1.8 1.44 6.5 0.30 15.0 Ort. 23.2 20.7 0.89 0.97 1.77 1.39 5.54 0.49 24.3 48

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER I.D. :Işın dozu, YE: Yaprak eni, YB: yaprak boyu, Yİ: Yaprak indeksi, YSÇ.: yaprak sap çapı,ysu.: Yaprak sapının uzunluğu, EÇÇ.: Erkek çiçek çapı, EÇU.: Erkek çiçek uzunluğu, EÇSÇ.: Erkek çiçek sapı çapı, EÇSU.: Erkek çiçek sapı uzunluğu Çizelge 4.8. Seraya şaşırtılan bitkilerden haploid oldukları düşünülenlerde yaprak ve çiçek özellikleri Genotip I.D. YE YB Yİ YSÇ YSU EÇÇ EÇU EÇ SE EÇ SU 1 1 100 14.5 16.5 1.13 0.47 1.5 1.41 2.68 0.32 2.90 2 2 100 10.5 10.1 0.96 0.43 0.9 1.05 2.75 0.20 23.3 2 3 50 5.6 4 0.71 0.33 0.45 - - - - 3 3 150 10.1 9.0 1.12 0.31 1.55 1.01 2.96 0.19 5.8 5 1 100 3.5 4 1.14 0.12 0.27 - - - - 5 2 100 9.5 6 0.63 0.25 1.50 - - - - 7 2 150 6 4.5 0.75 0.37 0.25 0.71 1.42 0.65 0.20 9 2 50 9 7 0.77 0.42 0.5 0.76 2.17 0.23 29.1 9 1 50 17.2 15.5 0.90 0.77 1.15 1.40 3.8 0.40 21.0 10 1 50 6.5 6 0.92 0.21 0.27 1.44 1.26 0.80 6.98 Nev 1 50 14 16.5 1.17 0.55 0.75 0.91 1.71 0.39 18.0 Nev 2 100 12.5 13.5 1.08 0.41 1.15 - - - - Ed 1 100 10.5 10 0.95 0.30 1.6 0.89 2.0 0.32 21.0 Ed 2 150 12 11 0.91 0.41 0.85 - - - - Sk 1 100 7.5 5.5 0.73 0.17 0.6 - - - - Ort. 9.92 9.27 0.93 0.36 0.88 1.06 2.30 0.38 14.3 I.D. :Işın dozu, YE: Yaprak eni, YB: yaprak boyu, Yİ: Yaprak indeksi, YSÇ.: yaprak sap çapı,ysu.: Yaprak sapının uzunluğu, EÇÇ.: Erkek çiçek çapı, EÇU.: Erkek çiçek uzunluğu, EÇSÇ.: Erkek çiçek sapı çapı, EÇSU.: Erkek çiçek sapı uzunluğu Şekil 4.18. Haploid ve diploid bitkilerin seraya aktarılmadan önce saksılardaki görüntüsü. 49

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER Çizelge 4.9. Diploid (solda) ve haploid (sağda) bitkilerin stoma ve kloroplast sayıları DİPLOİDLER HAPLOİDLER Genotip I. D. Kloroplast Sayısı S. Y. (adet/mm²) Genotip I. D. Kloroplast Sayısı S. Y. (adet/mm²) (ad/ stoma) (ad/ stoma) 1 1 50 12 233.2 1 3 100 6 466.4 1 2 50 14 266.5 2 2 100 7 466.4 2 1 50 14 216.2 2 3 50 8 399.8 2 2 100 12 299.8 3 3 150 8 416.4 3 1 50 12 183.2 5 1 100 6 516.4 3 2 100 16 283 5 2 100 8 416.4 5 1 100 12 166.5 7 2 150 8 599.7 7 1 50 10 233.2 9 2 50 6 733.0 7 1 50 12 316.5 9 1 50 6 499.7 9 1 50 12 183.2 10 1 50 6 533.1 10 1 50 12 249.8 Nev 1 50 8 433.1 YY 1 50 14 299.8 Nev 2 100 8 483.1 Ed 1 100 14 199.9 Ed 1 100 8 516.4 SK 1 50 14 266.5 Ed 2 150 8 566.4 Kont. - 12 316.5 SK-2 100 6 366.5 Ort. - 12.8 247.5 Ort. - 7.13 494.1 I.D.: Işın dozu, S.Y.: Alana düşen stoma yoğunluğu, adet/ stoma (a) (b) Şekil 4.19. Diploid (a) ve haploid (b) bitkilerin stomalarındaki kloroplastlar 50

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER 4.2. Tartışma Cucurbitaceae familyasına giren türlerde haploid bitki üretimi amacıyla ışınlanmış polenlerle yapılan tozlamalarda, uygulanan radyasyon dozunun ve genotipin etkili olduğu birçok araştırıcı tarafından belirtilmiştir (Çağlar ve Abak, 1996; Faris ve ark., 1999). Uygun ışın dozu generatif çekirdeğin zarar görebildiği ancak çiçek tozunun tamamen ölmediği doz olarak bilinmektedir. Değişik araştırmacılar tarafından Cucurbitaceae familyasına mensup bazı türlerde uygun ışın dozlarının belirlenmesi üzerine araştırmalar yapılmıştır. Yapılan bu araştırmalar sonucunda kavunda 300 Gy (Sauton ve Dumas de Vaulx, 1987), hıyarda 300 Gy (Çağlar ve Abak, 1996), karpuzda 200-300 Gy (Sarı ve ark., 1994) ve acurda 300 Gy (Yanmaz ve ark., 1997) ışın dozunun bu türlere ait en fazla embriyonun elde edildiği ışın dozları olduğu bildirilmiştir. Kurtar ve arkadaşları (2002) ise, 25, 50, 100, 200, 300 ve 400 Gy ışın dozlarını uygulayarak kabakta yaptıkları çalışmalarında en etkin ışın dozunun 25 ve 50 Gy olduğunu belirlemişler; ayrıca 200 Gy ve üzeri dozlarda meyve tutumu ve tohum sayısında azalmalar olduğunu da bildirmişlerdir. Buna karşılık bu yöntemi kullanan bazı özel tohum firmalarının ıslahçıları ile yapılan görüşmelerde, 25 ve 50 Gy dozlarında çok sayıda tohum oluştuğu fakat bunların tamamına yakın çoğunlukta diploid çıktığı, çok az haploid elde edildiği dile getirilmiştir. Bu nedenle bizim de denememizde Kurtar ve ark. (2002) nın belirlediği en etkin dozlardan 50 Gy başlangıç dozu olarak seçilmiş ve 100 Gy ile 150 Gy ışın dozlarının on beş genotip üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Denememizde kullanılan genotiplerin tümünde, her üç ışın dozundan da embriyo elde edilebilmiştir. On beş genotipte polenlere uygulanan 50, 100 ve 150 Gy ışın dozlarında meyve tutma oranlarının birbirine yakın olduğu görülmektedir. Kurtar ve ark. (2002) ı 200 Gy ve üzerindeki uygulamalarda meyve tutumunun düştüğünü bildirmişlerdir. Kullandığımız ışın dozları yüksek olmadığı için meyve tutumunu önemli derecede etkilememiştir. Çağlar ve Abak (1996) da hıyarda yaptıkları araştırmada benzer bir sonuç bularak kullandıkları ışın dozlarının meyve tutma oranını etkileyecek düzeyde yüksek olmadığını bildirmişlerdir. 51

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER Kabuklu tohumlu çekirdek kabağı genotiplerinde meyve tutma oranı, kabuksuz tohumlu çekirdek kabağı genotiplerinden fazla bulunmuştur. Ancak kabuksuz genotiplerden ÇÜZF No.9 ve ÇÜZF No.10 genotiplerinin meyve tutma oranları Edirne ve Nevşehir genotiplerinden; ÇÜZF No.5 ve ÇÜZF No.3 genotiplerinin meyve tutma oranları ise Nevşehir genotipinden daha yüksek oldukları da dikkati çekmiştir. En yüksek meyve tutma oranı kabuklu tohumlu Sakız genotipinde, en düşük meyve tutma oranı ise kabuksuz tohumlu ÇÜZF No.2 genotipinde görülmüştür. Işınlanmış polenlerle tozlanan ve aynı genotipe ait olan meyvelerin ortalama tohum sayıları arasındaki farklılığın istatistiksel açıdan önemli olup olmadığını belirlemek amacıyla standart sapmaları belirlemiştir. Sonuçlar bu farkın önemli olmadığını gösterir nitelikte bulunmuştur. Kabuklu tohumlu çekirdek kabağı genotiplerinde aynı genotipe ait meyveler arasında boyut ve bazılarında renk farkı gözlemlenmekle birlikte meyveden meyveye değişen tohum sayıları arasındaki farklar kabuksuz tohumlu çekirdek kabağı genotiplerinden daha az bulunmuştur. Bununla beraber istatistiksel açıdan önemli olmasa da meyveler arasındaki tohum sayılarının değişmesinin, meyveler arasındaki homojenliğin az olmasıyla ilgili olabileceği düşünülmektedir. Kabuklu tohumlu çekirdek kabağı genotiplerinin ortalama tohum sayısı kabuksuz tohumlu çekirdek kabağı genotiplerinden daha az çıkmıştır. Kabuklu tohumlu Nevşehir genotipi diğer kabuklu genotiplere göre fazla sayıda tohum içermekte ve kabuksuz tohumlu ÇÜZF No.3, ÇÜZF No.2, ÇÜZF No.10, GÖ, YY ve ÇÜZF No.4 genotiplerinden daha fazla sayıda tohum içermektedir. Işın dozu arttıkça ortalama tohum sayısının düştüğü açık şekilde görülmektedir. Bu durumu açıklamak oldukça kolaydır. Çünkü ışın dozu yükseldikçe polenlerin canlılığında da azalma olabilmekte, bu da doğal olarak tohum oluşumuna yansımaktadır. Polen canlılığının ışın dozu arttıkça azaldığı, karpuz, hıyar ve kabakta yapılmış daha önceki çalışmalarla da belirtilmiştir (Sarı ve ark. 1992b, Çağlar ve Abak, 1999; Kurtar ve ark., 2002). Meyve başına kurtarılan embriyo sayıları da ışın dozlarına göre değişmektedir. 50 Gy ışın dozunda % 17.5, 100 Gy ışın dozunda %22.9, 150 Gy ışın 52

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER dozunda ise %11.9 olarak hesaplanmıştır. Çağlar ve Abak (1996) hıyarda yaptıkları çalışmada ışın dozunun artmasıyla birlikte embriyo sayısının düştüğünü bildirmişlerdir. Bizim çalışmamızda 50 Gy ışın dozu uygulamasından elde edilen embriyo oranı 100 Gy ışın dozu uygulamasından elde edilen embriyo oranından daha düşük olmuştur. Bunun nedeni 50 Gy ışın dozu uygulamasında meydana gelen fazla sayıdaki diploid olduğu düşünülen olgunlaşmış embriyoların atılması olarak düşünülmektedir. Araştırmamız boyunca elde ettiğimiz embriyoların bitkiye dönüşüm oranları 50 Gy ışın dozu uygulamasında %51.8, 100 Gy ışın dozu uygulamasında %41.5, 150 Gy ışın dozu uygulamasında % 50.7 olarak bulunmuştur. Tüm ışın dozlarında embriyoların bitkiye dönüşüm oranları birbirine yakın bulunmuştur. Elde ettiğimiz sonuçlar hıyarda yapılan çalışmalarla elde edilmiş olanlarla uyumlu görülmektedir (Çağlar ve Abak, 1996; Faris ve ark.,1999). Araştırmamızda kullanılan tüm genotiplerde embriyo elde edilip bitkiye dönüşüm gerçekleşmekle beraber kabuksuz tohumlu genotiplerin meyve başına kurtarılan embriyo sayıları daha yüksekken, kabuklu tohumlu genotiplerin bitkiye dönüşüm oranlarının daha fazla olduğu görülmektedir. ÇÜZF No.9 genotipi meyve başına embriyo sayısı en fazla, bitkiye dönüşüm oranı ise en az olan genotip olmuştur. Bunun nedeni ÇÜZF No.9 genotipinden elde edilen embriyoların büyük bir kısmının enfeksiyon nedeniyle ölmesidir. En az kurtarılan embriyo sayısına Edirne genotipi, en fazla bitki dönüşümüne ise Nevşehir genotipi sahip olmuştur. Nevşehir genotipi Edirne den sonra en az meyve başına kurtarılan embriyo sayısına sahip olan genotiptir. Sonuçlara göre genotipin haploid embriyo uyartımında ve dolayısıyla bitkiye dönüşümünde etkili olduğu görülmektedir. Önceki çalışmalarda da kavun (Sarı ve ark.,1992a), karpuz (Sarı 1994) ve kabakta (Kurtar ve ark., 2002) embriyo uyartımının genotipe göre değiştiği bildirilmiştir. Kurtarılan 2073 embriyonun %10.96 sı yürek safhasında, %24.29 u globüler safhada, % 27.18 i çubuk safhasında ve % 37.67 si torpedo safhasında bulunmuştur. Ancak bu farklı grup embriyolardan hangilerinde bitkiye dönüşüm oranlarının daha çok, hangilerinde daha az olduğu sayısal bakımdan tam olarak tespit edilememiştir. Bununla birlikte embriyogenesisin daha ileri safhaları olan torpedo ve yürek 53

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Meltem BERBER safhalarında daha yüksek olduğu bir gözlem olarak tespit edilmiştir. Tüm embriyoların bitkiye dönüşüm oranı % 47.2 olarak bulunmuştur. Elde edilen bitkilerde ploidi düzeyleri direkt yöntemle yapılamamış; haploid ve diploid bitki ayrımları çiçek tozu varlığı, yaprak özellikleri, çiçek özellikleri ve stoma özellikleri incelenerek belirlenmiştir. Bu özellikler oldukça anlamlı sonuçlar vermiş ve elde edilen bulgular daha önce hıyar, kavun, karpuz ve kabakta yapılan çalışmalarda elde edilenlerle büyük paralellik göstermiştir (Sarı ve ark.1992a; Abak ve ark.,1994; Sarı ve Abak, 1995; Çağlar ve Abak 1996; Metwally ve ark., 1998; Faris ve ark., 1999; Kurtar ve ark. 2002 ) Bu sonuçlara göre dış ortama alınıp yetiştirilen bitkilerden % 42.6 sı haploid, % 57.3 ü diploid olduğu sonucuna varılmıştır. Haploid oranı 50 Gray dozundaki elde edilenlerde % 20.5, 100 Gray dozundan elde edilenlerde % 52.6 ve 150 Gray dozundan elde edilenlerde % 82.4 bulunmuştur. 54

5. SONUÇ VE ÖNERİLER Meltem BERBER 5. SONUÇ VE ÖNERİLER Bu araştırmadan elde edilen bulgular, haploid bitki üretimi için diğer kabakgil sebzelerinde başarılı şekilde kullanılan ve yazlık kabaklarda da iyi sonuç veren ışınlanmış polenle tozlama yönteminin kabuksuz çekirdekli kabak (Cucurbita pepo var. styriaca) genotiplerinde de başarılı şekilde uygulanabilmesini göstermiştir. Kullandığımız on beş genotipte, her üç ışın dozunda da meyve tutumu ve tohum oluşumu gerçekleşmiş ve tüm genotip X ışın dozu kombinasyonlarının embriyo elde edilmiştir. Kabuklu tohumlu çekirdek kabağı genotipleri ile kabuksuz tohumlu çekirdek kabağı genotipleri arasında meyve tutumu, tohum sayısı embriyo sayıları açısından az da olsa farklılıklar gözlemlenmiştir. Denenen ışın dozları olan 50, 100 ve 150 Gray arasında meyve başına ortalama tohum sayısı ve meyve başına düşen ortalama embriyo sayıları bakımından önemli farklılıklar çıkmamıştır. Ancak doz azaldıkça oluşan embriyolarda diploid embriyo oranı artmaktadır. 50 Gray ışın dozundan elde edilen bitkilerin çoğu diploid olarak belirlenirken, 150 Gy ışın dozundan elde edilen bitkilerin hemen hemen hepsi haploid olarak belirlenmiştir. Bu nedenle bizim önerimiz bundan sonraki çalışmalarda da en uygun doz olarak 150 Gray ışın dozunun tercih edilmesidir. Araştırmamızdan çıkan bir önemli sonuç da daha önce Kurtar ve ark. (2002) nın yapmış olduğu çalışmada en uygun ışın dozu olarak 25 ve 50 Gy in belirlenmiş olmasına karşılık, bizim çalışmamızda daha yüksek dozlarda daha başarılı sonuçlar elde edilmesidir. Kurtar ve ark. (2002) nın çalışmasında 75 ve 100 Gy ışın dozlarında çok az tohuma rastlandığı ve bu tohumların da tamamının boş olduğu belirtilmiştir. İki çalışma arasında ortaya çıkan bu farklılığı açıklamak oldukça zor görünmektedir. Bu konuda akla gelen en güçlü olasılık, ışınlamanın yapıldığı yerlerin farklı olması ve ışın dozunu hesaplayan teknisyenlerin hesaplamada bir hata yapmış olabileceğidir. Denememizde ploidi seviyesini belirlemede kullandığımız indirekt yöntemlere alternatif olan direkt yöntemler (Kromozom sayımı, flow sitometri yöntemi) uygulanamamıştır. Bizim önerimiz daha sonraki çalışmalarda, ploidi 55

5. SONUÇ VE ÖNERİLER Meltem BERBER seviyesinin belirlenmesi amacıyla günümüzde yaygın ve güvenilirliği yüksek bir yöntem olan flow sitometri tekniğinin tercih edilmesidir. (b) (c) 56

KAYNAKLAR ABAK, K., SARI, N., PAKSOY, M., YILMAZ, H., AKTAŞ, H., TUNALI, C., 1996. Kavunda ışınlanmış polen tozlamaları ile haploid embriyo uyartımında genotip etkisi, diploid hatların oluşturulması, haploid ve diploid bitkilerin değişik yöntemlerle ayrımı., Tr. J. of Agriculture and Forestry, 20:425 430. ABAK, K., SAKİN, M., KARAKULLUKÇU, Ş., 1990. Improvement of Pumpkin for Naked Seeds. Abstracs of Contributed Papers. 2: Poster. XXIII. International Horticultural Congress, 31 Aug.- 3 Sept. 1990, Frenze- Italy. ANONYMOUS, 2007. FAO Statistical Database, http:www.fao.org. ANONYMOUS, 2008. http:// www.ars-grin.gov/ cgi-bin/npgs/html/taxon. CHAMBONNET, D., DUMAS DE VAULX, R., 1985. Obtention of embriyos and plant from in vitro culture o un fertilized ovules of Cucurbita pepo. Cucurbits Genetic Cooperative Rep., 8: 66. ÇAĞLAR, G., ABAK, K., 1999. Hıyarda (Cucumis sativus L.) ışınlanmış polenlerle tozlama yoluyla in situ haploid embriyo uyartımı. Tr. J. of Agriculture and Forestry, 23: 63-72. ÇAĞLAR, G., ABAK, K., 1999. Hıyarda (Cucumis sativus L.) in situ uyartım sonucu elde edilen haploid embriyolardan in vitro haploid bitki oluşturma. Tr. J. of Agriculture and Forestry, 23: 283 290. ELLİALTIOĞLU, Ş., SARI, N., ABAK, K., 2001. Bitki Biyoteknolojisi Doku Kültürü ve Uygulamaları. Selçuk Üniversitesi Vakfı Yayınları. ETİ, S., 2009. Kişisel görüşme. FARİS, N.M., NİKOLOVA, V., NIEMIROWICZ-SZCYTT, K.,1999. The effect of gamma irradiation dose on cucumber (Cucumis sativus L.) haploid embryo production. Acta Physıologiae Plantarum Vol.21. No. 4 1999:391 396. FOLLET, J.,2002. New Zelland Institute for crop and food research ltd a crown research institute (Broad Sheet) number:70 www.crop.cri.nz 57

FORSTER, B.P., HEBERLE-BORS, E., KASHA, K.J., TOURAEV, A., 2007. Obtention des The resurgence of haploids in higher plants. Trends in Plant Science Vol.12, No.8. FRUHWIRTH G.O., HERMETTER A., 2007. Seeds and oil of the Styrian oil pumpkin: Components and biological activities. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 109 (2007) 1128 1140. GEMESNE, J.A., VENCZEL, G., 1996. In vitro gynogenesis ınduction in zucchini( Cucurbita pepo L. convar. giromontiina Duch) Lines. Proceedeings of the VI. Eucarpia Meeting on Cucurbit Genetics and Breeding, 200-201. HEISER, C.B.,1973. Seed to civilization: The story of man s food. W. H. Freeman and Company, San Francisco 243 p. JUHASZ, A.G., JAKSE, M.,2005. Haploids in the Improvement of Miscellaneous Crop Species (Cucurbitaceae, Liliaceae, Asparagaceae, Chenopodiaceae, Araceae and Umbelliferae). Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol.56 Haploids in Crop Improvement (ed. by C.E. Palmer, W.A. Keller, and K.J. Kasha). KHUSH, G.S., VIRMANI, S.S.,1996. İn vitro haploid production in higher plants. Vol.1,11-33 (ed.by S.M. Jain, S.K.Sopary ve R.E. Veilleux). Somatic Embriyogenesis in Cultured Unfertilized Ovules of Cucurbita moschata. J. Japan. Soc. Hort. Sci., 57(1): 34-42. KUMAR, A.G.A., MURTHY, H.N., PAEK, K.Y., 2003. Embryogenesis and plant regeneration from anther cultures of Cucumis sativus L. Scientia Horticulturae 98 ( 2003) 213 212. KURTAR, E.S., SARI, N., ABAK, K., 2002. Obtention of haploid embryos and plants through irradiated pollen technique in squash (Cucurbita pepo L.).Kluwer Academic Publishers. Euphytica 127: 335 344. KWACK, N.S., FUJIEDA, K., 1988. Somatic Embriyogenesis in Cultured Unfertilized Ovules of Cucurbita moschata. J. Japan. Soc. Hort. Sci., 57(1): 34-42. 58

LIM, W., EARLE, E.D., 2008. Effect of in vitro and in vivo colchicine treatments on polen production and fruit set of melon plants obtained by pollination with irradiated polen. Plant Cell Tiss Organ Cult 95: 115-124. LOTFI, M., ALAN, A.R., HENNING, M.J., JAHN, M.M., EARLE, E.D., 2003. Production of haploid and double haploid plants of melon (Cucumis melo L.) or use in breeding for multiple virus resistance. Plant Cell Rep 21: 1121-1128. LOTFI, M., SALEHİ, S., 2008. Detection of cucumber parthenogenic haploid embryos by floating the immature seeds in liquid medium. Proceedings of the IX th EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae (Pitrat M, ed), INRA, 375 379. Avignon, France. MANDL, A., REICH, G., LINDNER, W., 1999. Detection of adulteration of pumpkin seed oil by analysis of content and composition of specific Δ7- phytosterols. Eur Food Res Technol (1999) 209 :400 406. METWALLY, E.I., MOUSTAFA S.A, EL-SAWY, B.I., HAROUN, S.A., SHALABY, T.A.,1998.Production of haploid plants from in vitro culture of unpollinated ovules of Cucurbita pepo. Plant cell, Tissue and Organ Culture 52: 117 121. METWALLY, E.I., MOUSTAFA S.A, EL-SAWY, B.I., SHALABY, T.A.,1998. Haploid plantlets derived by anther culture of Cucurbita pepo. Plant cell, Tissue and Organ Culture 52: 171 176. MURASHIGE and SKOOG, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Phys., 15, 473-497. PALMER, C.E.D., KELLER,W.A.,2005. Overwiev haploidy. Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol.56 Haploids in Crop Improvement (ed. by C.E. Palmer, W.A. Keller, and K.J. Kasha). PARIS, H.S., 2001. Characterization of the Cucurbita pepo collection at the Newe Ya ar Research Center, Israel. PGR Newsletter, FAO -Bioversity. Issue No.126, 41-45. ROBINSON,R.W.,DECKER-WALTERS, D.S.,1997. Cucurbits In Crop Production Science İn Horticultures Series.CAB international Depertmant of 59

Horticultural Science. Cornell University and D.S. Decker-Walters, The Cucurbit Network.U.S.A. SANDI, B., 1998. Kabuksuz çerezlik kabakta (Cucurbita pepo L.) haploid bitki elde etme olanakları. A. Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi, 66 s. SARI, N., ABAK, K.,PITRAT, M.,DUMAS DE VAULX, R.,1992a. Kavunlarda (Cucumis melo L. var.inodorus Naud ve C. Melo L. var.reticulatus Naud) partenogenetik haploid embriyo uyartımı ve bitki eldesi. Doğa-Tr. J. of Agriculture and Forestry 16, 302-314. SARI, N., ABAK, K.,PITRAT, RODE J.C., M.,DUMAS DE VAULX, R.,1992b. Karpuzda (Citrullus lanatus (Thunb) Mansf) ışınlanmış polenle haploid bitki eldesi: Işınlanmış polenlerde çimlenme yeteneğinin değişimi. Kükem Dergisi Cilt:15 Sayı:2, Sayfa: 15-21. SARI, N., ABAK, K.,PITRAT, M., RODE, J.C., DUMAS DE VAULX, R.,1994. Induction of parthenogenetic haploid embryos after pollination by irradiated polen in watermelon. Hortscience 29 (10): 1189 1190. SARI, N., 1994. Karpuzlarda ışınlanmış polen uyartımıyla haploid bitki eldesi üzerine genotipin ve mevsimin etkisi ile ışınlama yerine geçebilecek uygulamalar üzerine araştırmalar. Doktora tezi, Ç.Ü. Fen Bil. Ens., Adana, 244 s. SAUTON, A., 1987. Recherce d Haploides chez le Melon (Cucumis melo L.): Etude et Application á la Sélection de la Parthénogenése Induite par du Polen Irradié. Thése (Docteur Nouveau Régime), Spécialité: et Techniques du Languedoc, Montpellier, 123 p. SAUTON, A., DUMAS DE VAULX, R., 1987. Obtention de plantes haploides chez le melon (Cucumis melo L.) par gynogénése induite per du polen irradié. Agronomie, 7 : 141 148. SAUTON, A.,1989. Haploid gynogenesis in Cucumis sativus induced by irradiated polen. Cucurbit Genetics Cooperative, 12: 22 23. SHAIL, J.W., ROBINSON, R.W.,1987. Anther and ovule culture of Cucurbita. Cucurbit Genetic Coop.,10,92. 60

SHALABY, T.A.,2007. Factors affecting haploid induction through in vitro gynogenesis in summer squash (Cucurbita pepo L.).Scientia Horticulturae, 115, 1-6. SONG, H., LOU, Q-F., LUO, X-D., WOLUKAU, J.N., DİAO, W-P., QİAN, C-T., CHEN, J-F., 2007. Regeneration of doubled haploid plants by androgenesis of cucumber (Cucumis sativus L.). Plant Cell Tiss Organ Cult (2007) 90:245 254. STEPHENS, J.M.,2003. H5650, one of the horticultural science department,florida Cooperative Extension Service,İnstitute of Food and Agricultural Sciences, Univercity of Florida. http://edis.ifas.ufl.edu. YANMAZ,R.,ELLIALTIOGLU,S.,TANER,K.Y.,1997. The effects of gama ırradiation on polen viabilty and haploid plant formation in snake cucumber (Cucumis melol.var.flexuosus Naud.). Proceedings of the first international symposium on cucurbits. (Editors K. Abak& S. Büyükalaca) Acta Horticulturae 492, 307-310. YILMAZ, Ö.E.,2005. Yazlık kabakta (Cucurbita pepo L.) ovaryum kültürü yoluyla haploid bitki elde edilmesi. Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi, 57 s. YOUNGQIANG, G., JİANSHE, W., HUİLİNG, Z., CAİXİANG, W., HAİZHEN, L., MİNHUA, C.,2004. Studies on the methods for ploidy identification in regenerated plant from unpollinated ovules of Cucurbita pepo. Acta Articulturae Boerali- Sinica. ZRAIDI, A., PACHNER, M., LELLEY, T.,2003. On the genetics and histology of the hull-less character of Sytrian oil-pumpkin (Cucurbita pepo L.). Cucurbit Genetics Cooperative, 26: 57 61. 61

ÖZGEÇMİŞ 1985 yılında Antakya da doğdum. İlkokul, ortaokul ve lise öğrenimimi Antakya da tamamladıktan sonra 2002 yılında Çukurova Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji bölümünü kazandım. 2007 yılında bu bölümü bitirdim. Aynı yıl Çukurova Üniversitesi Biyoteknoloji Anabilim dalında tezli yüksek lisans öğrenimine başladım. Halen bu bölümde öğrenimine devam etmekteyim. 62