DİYABETLİ RATLARDA ZEYTİN YAPRAĞI EKSTRESİNİN ETKİLERİNİN İNCELENMESİ AHMET GÖKHAN AĞGÜL

DİYABETLİ RATLARDA ZEYTİN YAPRAĞI EKSTRESİNİN ETKİLERİNİN İNCELENMESİ AHMET GÖKHAN AĞGÜL Eczacılık-Biyokimya Anabilim Dalı Tez Danışmanı Yrd. Doç. Dr. Mine GÜLABOĞLU Yüksek Lisans Tezi 2012

I İÇİNDEKİLER Sayfa İÇİNDEKİLER... I TEŞEKKÜR... VI SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... VII TABLOLAR DİZİNİ... IX ŞEKİLLER DİZİNİ... X ÖZ GEÇMİŞ... XII ÖZET... XIII ABSTRACT... XV 1. GİRİŞ VE AMAÇ... 1 2. GENEL BİLGİLER... 3 2.1. Diabetes Mellitusun Tanımı... 3 2.2. Diabetes Mellitusun Epidemiyolojisi... 4 2.3. Diabetes Mellitusun Tanı Kriterleri... 6 2.4. Gestasyonel Diyabetes Mellitus Tanısı... 6 2.5. Oral Glukoz Tolerans Testi (OGTT)... 6 2.6. Diabetes Mellitusun Sınıflandırılması... 7 2.6.1. Tip I Diyabetes Mellitus (IDDM)... 8 2.6.2. Tip II Diabetes Mellitus (NIDDM)... 9 2.6.2.1. Tip II Diyabet Risk Faktörleri... 10 2.6.2.1.1. Etnik Gruplar:... 10 2.6.2.1.2. Ailede Tip II Diabet Öyküsü:... 11 2.6.2.1.3. Genetik Faktörler:... 11 2.6.2.1.4. Çevresel Faktörler:... 11

II 2.6.2.1.5. Obezite:... 11 2.6.2.1.6. Yaş:... 11 2.6.2.1.7. Düşük Fizik Aktivite:... 11 2.6.2.1.8. Diyet:... 11 2.6.3. Malnutrisyonla İlişkili Diabetes Mellitus... 11 2.6.4. Bozulmuş Glukoz Toleransı ile Beraber Seyreden Diyabet... 12 2.6.5. Gestasyonel Diyabet (GDM)... 12 2.7. Diyabet Oluşumuna Etki Eden Faktörler... 13 2.8. Diyabetin Komplikasyonları... 13 2.8.1.Diyabetin Akut Komplikasyonları... 13 2.8.1.1. Diyabetik Ketoasidoz:... 13 2.8.1.2. Hiperglisemik Hiperozmolar Nonketotik Koma:... 13 2.8.1.3. Hipoglisemi:... 14 2.8.2. Diyabetin Kronik Komplikasyonları... 14 2.8.3. Diyabetin Mikrovasküler Komplikasyonları... 14 2.8.3.1. Retinopati:... 14 2.8.3.2. Nöropati:... 14 2.8.3.3. Diyabetik Ayak:... 15 2.8.3.4. Nefropati:... 15 2.8.4. Diyabetin Makrovasküler Komplikasyonları... 15 2.9. Diyabetin Tedavisi... 15 2.9.1. Eğitim... 15 2.9.2. Diyet... 16 2.9.3. Egzersiz... 16 2.9.4. İnsülin Tedavisi... 16 2.9.4.1. İnsülin Yapısı... 17

III 2.9.4.2. İnsülin Metabolizması... 18 2.10. Serbest Radikaller ve Antioksidanlar... 19 2.10.1. Serbest Radikaller... 19 2.10.1.1. Süperoksit Anyon Radikali (O 2 )... 21 2.10.1.2. Hidrojen Peroksit (H 2 O 2 )... 22 2.10.1.3. Hidroksil Radikali (OH )... 22 2.10.1.4. Singlet Oksijen ( 1 O 2 )... 23 2.10.1.5. Nitrik Oksit (NO ) ve Nitrojen Dioksit (NO2 )... 23 2.10.1.6. Diğer Serbest Radikaller... 24 2.10.2. Serbest Radikallerin Kaynakları... 24 2.10.3. Serbest Radikallerin Etkileri... 26 2.10.3.1. Membran Lipidleri Üzerine Etkileri... 27 2.10.3.2. Proteinler Üzerine Etkileri... 31 2.10.3.3. Karbonhidratlar Üzerine Etkileri... 32 2.10.3.4. Nükleik Asitler ve DNA Üzerine Etkileri... 32 2.11. Oksidatif Stres... 33 2.11.1. Oksidatif Stres ve Diyabet Üzerine Etkisi... 33 2.12. Antioksidan Savunma Mekanizmaları... 38 2.12.1. Endojen (Doğal) Antioksidanlar... 40 2.12.1.1. Primer Antioksidantlar... 41 2.12.1.1.1. Süperoksit Dismutaz (SOD)... 41 2.12.1.1.2. Katalaz (CAT)... 43 2.12.1.1.3. Glutatyon Peroksidaz (GPx)... 43 2.12.1.1.4. Glutatyon S-Transferaz (GST)... 44 2.12.1.1.5. Glutatyon Redüktaz (GR)... 45 2.12.1.1.6. Miyeloperoksidaz (MPx)... 46

IV 2.12.1.2. Sekonder Antioksidanlar... 46 2.12.1.2.1. Glutatyon (GSH)... 46 2.12.1.2.2. Diğer Sekonder Antioksidantlar... 48 2.12.2. Eksojen Antioksidanlar... 49 2.12.2.1. Lipit Fazda Bulunanlar... 49 2.12.2.1.1. E vitamini:... 49 2.12.2.1.2. Karotenoidler ve Retinol:... 49 2.12.2.1.3. Ubikinonlar:... 50 2.12.2.1.4. Flavonoidler:... 50 2.12.2.1.5. Melatonin:... 50 2.12.2.1.6. Bilirubin:... 51 2.12.2.2. Sıvı Fazda Bulunanlar... 51 2.12.2.2.1. C Vitamini (Askorbik Asit):... 51 2.12.2.2.2. Ürik Asit:... 51 2.12.2.2.3. Transferrin:... 51 2.12.2.2.4. Ferritin:... 51 2.12.2.2.5. Albumin:... 51 2.12.2.2.6. Glutatyon:... 52 2.13. Botanik Bilgiler... 52 2.13.1. Olea europae L. nin Bilimsel Sınıflandırılması ve Binominal Adı... 52 2.13.2. Olea europaea L nin Genel Özellikleri... 52 2.13.2.1. Olea europaea L nin Antioksidan Aktivitesi... 54 2.13.2.2. Olea europaea L nin Fenolik Madde İçeriği... 55 2.13.2.2.1. Oleuropein... 58 2.13.2.2.1.1. Oleuropeinin Antimikrobiyel Etkisi... 61 2.13.2.2.2. Hidroksitirosol... 63

V 2.14. Olea europaea L. nin Farklı Kullanım Alanları... 64 2.15. Olea europaea L. nin Antidiyabetik ve Hipoglisemik Etkisi... 64 3. MATERYAL VE METOD... 66 3.1. Deney Bitkileri... 66 3.2. Hayvanlar... 66 3.3. Zeytin Yaprağı Ekstraktlarının Hazırlanması... 66 3.4. Streptozotocin ile Diyabet Modeli... 66 3.4.1. Streptozotocinin Yapısı ve Etki Mekanizması... 66 3.4.2. Diyabet Oluşumu... 67 3.5. İlaç Uygulaması... 68 3.6. Karaciğer Dokularının Biyokimyasal Analizi... 69 3.6.1. Numunelerin Hazırlanması... 69 3.6.2. Antioksidan Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi... 69 3.6.2.1. Süperoksit Dismutaz (SOD) Aktivitesinin Tayini... 69 3.6.2.2. Glutatyon Peroksidaz (GSH-Px) Aktivitesinin Tayini... 71 3.6.2.4. Glutatyon S-Transferaz (GST) Enzim Aktivitesinin Tayini... 72 3.6.2.5. Malondialdehit (MDA) Enzim Aktivitesinin Tayini... 73 3.6.3. Dokularda Protein Tayini... 75 3.7. Deneylerde Kullanılan Kimyasallar... 75 3.8. Deneylerde Kullanılan Cihazlar... 76 3.9. Deneylerde Kullanılan Çözeltiler ve Hazırlanışları... 77 3.10. İstatistiksel Analiz... 79 4. BULGULAR... 80 5. TARTIŞMA... 92 6. KAYNAKLAR... 97

VI TEŞEKKÜR Eğitimimin her aşamasında bilgilerinden ve deneyimlerinden yararlandığım, tezimin planlanmasında, yürütülmesinde ve hazırlanmasında yardım ve desteklerini esirgemeyen, bu çalışmanın ortaya çıkmasında büyük emeği olan, gösterdiği özveri ve anlayışdan dolayı değerli hocam sayın Yrd. Doç. Dr. Mine GÜLABOĞLU na; Yüksek lisans tezi olarak sunduğum ve Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi nde gerçekleştirilen bu çalışmada desteklerini esirgemeyen Fakülte Dekanı sayın Prof. Dr. Fatih AKÇAY a, Dekan Yardımcısı sayın H. İnci GÜL e, Temel Bilimler Bölüm Başkanı sayın Prof. Dr. Yücel KADIOĞLU na, Biyokimya A.B.D. Başkanı sayın Yrd. Doç. Dr. Fehmi ODABAŞOĞLU na, Yardım ve desteğini hiçbir zaman esirgemeyen sayın Doç. Dr. Zekai HALICI ya, sayın Doç. Dr. Zühal GÜVENALP e, sayın Yrd. Doç. Dr. Meltem Çetin e, sayın Yrd. Doç. Dr. Fatma GÜR e, sayın Yrd. Doç. Dr. Elif ÇADIRCI ya, sayın Yrd. Doç. Dr. Yasin BAYIR a, sayın Yrd. Doç. Dr. Mesut B. HALICI ya, sayın Yrd. Doç. Dr. Alptuğ ATİLA ya Uzm. Fadime ATALAY, Araş. Gör. Özlem AYDIN, Araş. Gör. Irmak FERAH, Araş. Gör. Beyzagül POLAT, Araş. Gör. M. Emrah YAMAN, Araş. Gör. Onur ŞENOL, Araş. Gör. Nihal ÇETİN, Araş. Gör. Hilal ÖZBEK, Seda ÖZALTIN, İrfan ÇINAR, Zerrin KUTLU, Hatice BAZ, Mesut DEMİR, Nurul HANCI, Mustafa İLERİTÜRK, Uğurcan KARTAL, Muhammed YAYLA, Berna ÖZTÜRK, Nurcan YÜKSEL e ve hiçbir zaman desteğini esirgemeyen AĞGÜL ailesine sonsuz şükran ve teşekkürlerimi sunarım. Ahmet Gökhan AĞGÜL Ocak 2012

VII SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ DM OGTT IDDM NIDDM GDM O 2 H 2 O 2 Diyabetes Mellitus Oral Glukoz Tolerans Testi Tip I Diyabetes Mellitus Tip II Diabetes Mellitus Gestasyonel Diyabet Süperoksit Anyon Radikali Hidrojen Peroksit OH Hidroksil Radikali 1 O 2 Singlet Oksijen NO Nitrik Oksit NO 2 SOD CAT GPx GST GR MPx GSH HbA1c APG ADA TBT CCl 3 Nitrojen Dioksit Süperoksit Dismutaz Katalaz Glutatyon Peroksidaz Glutatyon S-Transferaz Glutatyon Redüktaz Miyeloperoksidaz Glutatyon Hemoglobin A1C Açlık plazma glukozu Amerikan Diyabet Birliği Tıbbi Beslenme Tedavisi Triklorometil

VIII ROS LPO MDA HNE PCO PLGPx ALT AST ALP CDNB TURDEP DCCT UKPDS DG SG OLII DM+OLI DM+OLII Reaktif oksijen türlerinin Lipid peoksidasyonu Malondialdehit 4-hidroksinonenal Karbon merkezli radikallerden karbonillerin Fosfolipid hidroperoksit glutatyon peroksidaz Aspartat amino transferaz Alanin amino transferaz Alkalen fosfataz Klorodinitrobenzen Türkiye Diyabet Epidemiyoloji Diabetes Control and Complications Trial United Kingdom Prospective Diabetes Study Diyabetik grup Sağlıklı kontrol grup Etanol ekstresinin 0,5 g/kg dozunu ihtiva eden kontrol grubu Etanol ekstresinin 0,25 g/kg dozunu ihtiva eden diyabetli grup Etanol ekstresinin 0,5 g/kg dozunu ihtiva eden diyabetli grup

IX TABLOLAR DİZİNİ Sayfa No Tablo 1. Diyabetes Mellitus un sınıflandırması 7 Tablo 2. Bazı önemli reaktif oksijen ve azot türleri 21 Tablo 3. Hücredeki serbest oksijen radikali kaynaklar 25 Tablo 4. Bazı antioksidanlar 40 Tablo 5. Zeytin yaprağındaki bazı fenolik bileşenler ve kimyasal formülleri 56 Tablo 6. Zeytin yaprağı ekstraktında bulunan fenolik maddelerin miktarları 57 Tablo 7. Deneyde yapılan tüm detaylar 68 Tablo 8. SOD deneyinde kullanılan reaktif ve değerleri 70 Tablo 9. GSH-Px deneyinde kullanılan reaktif ve değerleri 71 Tablo 10. GST deneyinde kullanılan reaktif ve değerleri 72 Tablo 11. MDA deneyinde kullanılan reaktif ve değerleri 74 Tablo 12. Gruplar ve karaciğer enzim aktiviteleri 80 Tablo 13. Gruplar ve karaciğer doku antioksidan aktiviteleri 86

X ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa No Şekil 1. Proinsülin zincir yapısı 18 Şekil 2. Serbest radikal ve reaktiflerin oluşumu 20 Şekil 3. Moleküler oksijenin indirgenmesiyle oluşan reaktif oksijen türleri 21 Şekil 4. Antioksidan savunma sistemleri ve hücredeki etki yerleri 26 Şekil 5. Reaktif oksijen türlerinin artışına bağlı olarak iskeminin oluşturduğu hücre hasarı 27 Şekil 6. Lipid peroksidasyonunun kimyasal yolu 30 Şekil 7. Araşidonik asitin otooksidasyonunun öne sürülen mekanizması 31 Şekil 8. Oksidatif stres oluşumu ve organizmaya verdiği hasarlar 35 Şekil 9. Diyabette oksidatif stresin artış metabolizması 36 Şekil 10. Oksidatif stresin hiperglisemi ile bağlantısı 37 Şekil 11. Biyolojik sistemlerde antioksidan savunma sistemi 38 Şekil 12. Biyolojik sistemlerde ROS lere karşı oluşturulan antioksidan savunmanın gelişimi 39 Şekil 13. Oleuropein molekülünün kimyasal yapısı 58 Şekil 14. Oleuropein ile ilgili bileşiklerin kimyasal yapıları 60 Şekil 15. Oleuropein ß-glikozidaz enzimi ile hidrolizi 61 Şekil 16. Oleaceae familyasına ait bitkilerde oleuropeinin biyosentezi 62 Şekil 17. Hidroksitirosol (3,4-dihidroksifenil etanol) molekülünün kimyasal yapısı 63 Şekil 18. Rat gruplarındaki alkalen fosfataz (ALP) aktivitelerinin gösterilmesi 81

XI Şekil 19. Rat gruplarındaki alanin aminotransferaz (ALT) aktivitelerinin gösterilmesi 82 Şekil 20. Rat gruplarındaki aspartat aminotransferaz (AST) aktivitelerinin gösterilmesi 84 Şekil 21. Rat gruplarının karaciğer dokularındaki süper oksit dismutaz (SOD) aktivitelerinin gösterilmesi 87 Şekil 22. Rat grupların karaciğerlerindeki glutatyon s-transferaz (GST) aktivitelerinin gösterilmesi 88 Şekil 23. Rat grupların karaciğerlerindeki glutatyon peroksidaz (GSH-Px) aktivitelerinin gösterilmesi 89 Şekil 24. Rat grupların karaciğerlerindeki malondialdehit (MDA) aktivitelerinin gösterilmesi 91

XII ÖZ GEÇMİŞ 1985 yılında Erzurumda doğdum. 2006 yılında Atatürk Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümünde Lisans öğrenimime, 2009 yılında ise Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Biyokimya A.B.D de Yüksek Lisans öğrenimime başladım.

XIII ÖZET DİYABETLİ RATLARDA ZEYTİN YAPRAĞI EKSTRESİNİN ETKİLERİNİN İNCELENMESİ Diyabetes Mellitus (DM), mutlak ya da bağıl insülin eksikliği veya insülin direnci nedeniyle ortaya çıkan ve karbonhidrat, lipid ve protein metabolizması bozukluğu ile karakterize, endokrin ve metabolik bir hastalıktır. Zeytin dünyanın çeşitli bölgelerinde yaygın olarak bulunan uzun ömürlü bir ağaçtır. Zeytin yaprağının (Olea europaea L.) geleneksel antidiyabetik ve antihipertansif bitkisel bir ilaç olduğu ileri sürülmektedir. Çalışmamızda deney materyali olarak Doğu Karadeniz Bölgesindeki Artvin ilinin, Yusufeli ilçesinden topladığımız zeytin yapraklarını kullandık. Olea europaea L. yapraklarının etil alkoldeki ektresinin streptozotocin ile indüklenen diyabetik ve normal ratlardaki antidiabetik etkileri araştırıldı. Zeytin yaprağı ekstresi (0,25 ve 0,5 g/kg) 14 gün oral verildiğinde diyabetik kontrol (DG) gurupların aspartat amino transferaz (AST), alanin amino transferaz (ALT) ve alkalen fosfataz (ALP) seviyelerinde önemli azalma izlendi (p<0,001). Sağlıklı kontrol grubunun süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon s-transferaz (GST) ve glutatyon peroksidaz (GPx) antioksidan enzim aktiviteleri diyabetik kontrol grubundaki ratlara göre yüksek olduğu bulundu (p<0,05). Aynı şekilde etanol ekstresinin farklı dozlarını ihtiva eden gruplardaki SOD, GST, GPx enzim aktiviteleri diyabetik kontrol grubundaki ratlara göre yüksek bulundu (p<0,05). Sağlıklı kontrol grubunun malondialdehit (MDA) enzim aktivitesi diyabetik kontrol grubundaki ratlara göre düşük olduğu tespit edildi (p<0,05). Aynı şekilde etanol ekstresinin farklı dozlarını ihtiva eden gruplardaki MDA enzim aktivitesi diyabetik kontrol grubundaki ratlara göre düşük bulundu (p<0,05). Tek başına zeytin yaprağı ekstresinin 0,5 g/kg dozunu ihtiva eden kontrol grubunun antioksidan enzim seviyeleri

XIV sağlıklı kontrol grubunun antioksidan enzim seviyelerine yakın olduğu tespit edildi. Buna bağlı olarak zeytin yaprağının etil alkoldeki ekstresinin diyabet ve komplikasyonlarının neden olduğu oksidatif stresin azalması ve tedavisi üzerine etkisi olduğunu ileri sürmekteyiz. Anahtar Kelimeler: Antioksidan, Diabetes Mellitus, Olea europaea L, streptozotocin

XV ABSTRACT INVESTIGATING THE EFFECTS OF THE EXTRACTS OF OLIVE LEAVES IN DIABETIC RATS Diabetus mellitus is a disease that is caused because of relative insulin deficiency and resistance to insulin. In addition to this, it is endocrin and metabolic disorder characterized with carbonhydrate, lipid and protein metabolism. Olive is a long-lived and a very common tree all over the world. It is claimed that leaves of the olive is a traditional herbal drug for diabet and hypertension. In our study, we are used olive leaves of Artvin city Yusufeli town in Eastern Black Sea Region as experiment material. Antidiabetic effects of extracts of Olea europaea L. Leaves in ethanol were investigated in control group rats and diabetic rats that induced with streptocozin. Significant lower is observed in serum aspartate amino transferase (AST), alanine amino transferase (ALT) and alkaline phosphatase (ALP) (p<0.001), when extracts of olive leaves are given to rats for 14 days orally. It is found that enzyme activity levels of superoxide dismutase (SOD), glutathione S-transferase (GST) and glutathione peroxidase (GPx) antioxidant enzyme activity are lower in diabetic rats with respect to control groups (p<0.05). Similarly, groups including different doses of ethanol extracts have higher enzyme activity SOD, GST and GPx than diabetic control group (p<0.05). Malondialdehyde (MDA) enzyme activity of healthy control group exhibit lower enzyme activity than diabetic control group (p<0.05). Similarly, groups including different doses of ethanol extracts exhibit lower MDA activity with respect to diabetic control group (p<0.05). Antioxidant Enzyme activity level is found almost same in both healthy control group and experiment group adminstrating one single dose of olive leaves extracts (0.5 g/kg). It also proved that ethanol extracts of olive leaves

XVI are not toxic. We claim that extract of olive leaves in ethanol lead to a reduction in oxidative stres which is caused because of diabet and its complicaitons. Keyword: Antioxidant, Diabetes Mellitus, Olea europaea L.,streptozotocin

1 1. GİRİŞ VE AMAÇ Diyabetes Mellitus (DM), en sık rastlanılan endokrinolojik hastalıktır. Günümüzde, birçok gelişmiş ve gelişmekte olan ülkede, epidemik hastalık olarak kabul edilmekte ve çoğu gelişmiş ülkenin, ilk beş ölüm nedeni arasında dördüncü sırada yer almaktadır. DM, genetik ve immün yapının neden olduğu bir seri patalojik olaylar sonucu, pankreas beta hücrelerinden salgılanan insülin hormonunun, mutlak veya göreceli azlığı veya etkisizliği sonucu karbonhidrat, protein ve yağ metabolizmasında bozukluklara yol açan, hemen tüm sistemlerde komplikasyonlara neden olan, kronik, hiperglisemik, metabolik bir hastalıktır. Diyabetik hastalarda serbest oksijen radikallerinin ve lipid peroksidasyonunun önemli derecede arttığı ve oksidatif stresin; diyabet etiyolojisinde ve ilerlemesinde rolü olduğu bilinmektedir. Biyolojik sistemlerde serbest radikal oluşumu, normal metabolik olayların seyri sırasında gelebildiği gibi, organizmada bazı yabancı maddelerin (ksenobiyotikler) metabolize edilmesi sırasında ve organizmanın radyasyon gibi dış etkenlere maruz bırakılmasıyla da meydana gelebilir. Serbest radikallerin zararlı etkilerine karşı organizmada koruyucu mekanizmalar vardır. Bu mekanizmalardan bir kısmı serbest radikal oluşumunu, bir kısmı ise oluşmuş serbest radikallerin zararlı etkilerini önler. Bu işlevleri yapan maddelerin tümüne birden genel olarak antioksidanlar denir. Dünya üzerinde farklı bitki türleri üzerinde bu bitkilerin terapötik etkinlikleriyle ilgili birçok araştırma yapılmaktadır. Güneş ışığı ve oksijenin neden olduğu oksidatif stresi kontrol etmek amacıyla bitkilerin antioksidan potansiyelleriyle ilgili çeşitli çalışmalar yapılmaktadır ve yeni antioksidan kaynakları aranmaktadır. DM ün görülme sıklığının ve tedavi masraflarının fazla olması, bunun yanında kesin tedavi yönteminin henüz geliştirilememiş olması onu çekici bir araştırma konusu

2 yapmaktadır. Bu sebeple bu hastalığın tedavisi için birçok araştırma yapılmakta ve yeni tedavi yöntemleri aranmaktadır. Bazı araştırmacılar yüksek antioksidan içerikli bitkilerin ekstrelerini diyabet hastalığında denemişler ve oksidatif stresi baskılamaya çalışmışlardır. Zeytin dünyanın çeşitli bölgelerinde yaygın olarak bulunan uzun ömürlü bir ağaçtır. Zeytin yaprağının (Olea europaea L.) geleneksel antidiyabetik ve antihipertansif bitkisel bir ilaç olduğu ileri sürülmektedir. Aynı zamanda hiperglisemi, hipertansiyon ve bazı bulaşıcı hastalıkları tedavi etmek için bitkisel bir ilaç olarak kullanılmaktadır. Aynı zamanda onun antioksidan etkiye sahip olduğu hayvan deneyleriyle de gösterilmiştir. Çalışmamızda streptozotocin (STZ) kullanılarak, ratlarda diyabet modeli oluşturulduktan sonra Olea europaea L. nin etil alkoldeki ekstrelerinin diyabet ve komplikasyonlarının neden olduğu oksidatif stresin azalması ve tedavisi üzerine etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır.

3 2. GENEL BİLGİLER Bilinen en eski hastalıklardan olan Diabetes Mellitus (DM), yirminci yüzyılın en büyük halk sağlığı problemlerinden olup, yirmibirinci yüzyılda da sorun olmaya devam etmektedir. İlk olarak Kapadokyalı Arataeus, çok idrar yapan ve kilo kaybeden insanları sifonlu fıçıya benzeterek hastalığa Diyabetes adını vermiş ve klinik bulgular ile tanı koymuştur. Yedinci yüzyılda Mısırlı, Hintli ve Çinlilerce idrarın şekerli olduğu tadılmış ve Lemadhumeha ballı idrar tanımlaması yapılmıştır. Onbirinci yüzyılda İbn-i Sina kaynatılan idrardaki tortuda bal tadını belirlemiştir. Daha sonraları laboratuar yöntemleri önem kazanmıştır. Thomas Willis 16. yüzyılda idrarda şeker tayinini yapmış ve Claude Bernard kan şekeri ölçümünü gerçekleştirmiştir. Fehling 1800 lü yıllarda idrarda glukozu kantitatif olarak tayin metodunu geliştirmiş ve aseton tayini yapılmaya başlanmıştır. Hastalığın etyopatogenezi ile ilgili pek çok bilgi ise 1900 lü yıllarda edinilmiştir. Halen immünolojik ve genetik çalışmalar sürdürülmektedir. Yaygın ve sık görülen bir endokrin ve metabolik hastalık olan DM, batı toplumlarında en önde gelen ölüm nedenlerindendir 1. 2.1. Diabetes Mellitusun Tanımı DM, hiperglisemi ile karakterize, karbonhidrat, protein ve lipid metabolizmalarının bozukluğu ile seyreden, kronik ve progressif bir hastalıktır. Seyri sırasında mikrovasküler, makrovasküler ve nöropatik komplikasyonlar gelişebilmektedir. Pankreas insülin sekresyonunun mutlak veya rölatif yetersizliği, insülin etkisikliği veya insülin molekülündeki yapısal bozukluklar sonucunda oluşan bu hastalık, etiyolojisi, genetik ve klinik tablosu ile heterojen özellikte olan bir sendromdur 1, 2.

4 2.2. Diabetes Mellitusun Epidemiyolojisi DM un dünyadaki prevalansı son 20 yılda dramatik olarak artmıştır. 1985 yılında 30 milyon, 2000 yılında 177 milyon diyabet vakası bulunmuştur. Güncel çalışmalarda 2030 yılında 360 milyondan fazla kişinin diyabet olacağı tahmin edilmektedir. Hem tip І hem de tip II DM prevalansı artmaktadır. Özellikle tip II DM ülkelerin endüstrileşmesi, fiziksel aktivitenin azalması ve obezitenin artmasıyla daha fazla artmaktadır. Amerika da 2005 yılında hastalıkları kontrol ve önleme merkezi 20,8 milyon DM vakası bildirmiştir. Popülasyonun % 7 sinin diyabetik olduğu anlaşılmıştır ve bu hastaların % 30 u daha önce diyabetik olduğunu bilmemektedir. Amerika da 2005 yılında 20 yaş üstü bireylerde 1,5 milyon yeni DM tanısı olan vaka vardır. Diyabet prevalansı yaşla artmaktadır. 2005 yılında Amerika da 20 yaş altında DM prevalansı % 0,22, 20 yaş üstünde % 20,9 dur. 20 yaş üzeri şahıslarda diyabet prevalansı kadın ve erkeklerde birbirine yakındır. Ancak, 60 yaş üstünde, erkeklerde diyabet prevalansı kadınlara göre belirgin olarak artmıştır. Dünyada diyabetik hastaların büyük kısmının 2030 yılında 45-65 yaş arasında olacağı tahmin edilmektedir. Hem Tip І hem de Tip ІІ DM insidansına sahiptir. Örneğin Finlandiya da 35/100000/yıl dır. Uzak Doğu da tip І DM insidansı düşüktür. Örneğin Japonya da ve Çin de 17/100000/yıl, Kuzey Avrupa ve Amerika da tip І DM insidansı 8-17/100000/yıl dır. Tip II DM prevalansı ve bozulmuş glukoz toleransı Uzak Doğu da en yüksektir. Hindistan ve Amerika Birleşik Devletleri gibi ülkelerde tip II DM daha azdır ve en düşük prevalans Rusya dadır. Bu değişiklik genetik, çevresel, davranışsal faktörlerden kaynaklanabilir.

5 Hastalıkları kontrol ve önleme merkezleri Amerika Birleşik Devletler inde ki 20 yaş ve üzeri DM prevalansı 2005 yılında Afrika kökenlilerde % 13,3, Latinler de % 9,5, Nativ Amerikalı larda % 15,1 ve İspanyol olmayan beyazlarda % 8,7 dir. DM 2002 yılında Amerika Birleşik Devletlerin de mortalite nedenleri arasında 6. sıradadır. Dünyada 3 milyon/yıl insan DM nedeniyle ölmektedir 3. Ülkemizde yapılan Türkiye Diyabet Epidemiyoloji (TURDEP) çalışmasının sonuçlarına göre; 20-80 yaş grubunda diyabet prevalansı % 7,2, bozulmuş glikoz toleransı oranı ise % 6,7 dir. Ülkemizde diyabetin kadınlarda ve kentsel yerleşim bölgelerinde yaşayanlarda daha sık görüldüğü saptanmıştır 3. Gökçel ve arkadaşları 4 tarafından Adana da yapılan çalışmada diyabet prevalansı % 11,6 olarak bulunmuştur. Prevalansın kadınlarda % 10,9 erkeklerde % 12,9 olduğu, kentsel ve kırsal yerleşim alanlarında diyabet görülme sıklığının birbirine yakın olduğu belirlenmiştir. 2025 yılında ülkemizde diyabet prevalansının % 8,9 a ulaşacağı tahmin edilmektedir. Dünyada 2,5 milyon kişide diyabete bağlı retinopati bulunmaktadır ve retinopati çalışma yaş aralığında (20-65 yaş) bulunan bireylerde, görme kaybına yol açan en önemli neden olarak gösterilmektedir. Her yıl diyabet nedeniyle bir milyondan fazla ampütasyonun yapıldığı belirtilmektedir. Ayrıca diyabetlilerin % 10-20 sinin böbrek yetersizliği nedeniyle kaybedildiği bilinmektedir 5. Diyabet, yaşamı tehdit edici özelliği olan ciddi bir sağlık sorunudur 6. Dünyada her yıl 3,2 milyon kişi diyabet nedeniyle yaşamını kaybetmektedir. Her 20 ölümden biri diyabete bağlı olup, 35-64 yaş arası yetişkinlerde her 10 ölümden birinin nedeni diyabettir 7. Fakat diyabetlilerin ölüm nedenleri arasında sıklıkla kardiyovasküler ve renal hastalıklar yer aldığından ve istatistiksel kayıtlarda da ölüm nedeni olarak tek

6 başına diyabet ile ilişkili nedenler (ketoasidoz, hipoglisemi gibi) belirtilmediğinden, diyabete bağlı ölümlerin tahmin edilenden daha fazla olduğu düşünülmektedir 6. 2.3. Diabetes Mellitusun Tanı Kriterleri 1-Hemoglobin A1C (HbA1c) düzeyinin % 6,50 nin üzerinde olması veya, 2-Açlık plazma glukozu (APG) 126 mg/dl (7,0 mmol/l) ve üzerinde olması veya, 3-Oral glukoz tolerans testi (OGTT) sırasında 2. saat plazma glukozu 200 mg/dl (11,1 mmol/l) ve üzerinde olması veya, 4-Diyabet semptomlarıyla birlikte herhangi bir andaki plazma glukoz değerinin 200 mg/dl (11,1 mmol/l) ve üzerinde olmasıdır. Çok ağır DM semptomlarının bulunmadığı durumlar dışında, DM tanısın konulabilmesi için yukarıdaki kriterlerden birinin olması ve daha sonraki bir gün başka bir yöntemle doğrulanması gerekir. 2.4. Gestasyonel Diyabetes Mellitus Tanısı Gebeliğin 24. ve 28. haftasında 75 gr ile OGTT yapılır. -Açlık kan şekeri > 92 mg/dl veya, -1 saat kan şekeri > 153 mg/dl olması kriterlerinden herhangi birinin varlığında gestasyonel DM tanısı konur 8. 2.5. Oral Glukoz Tolerans Testi (OGTT) Açlık kan glukozu 100-126 mg/dl olan kişilerde, glukoz yüklemesinden sonra kan şekeri (120. dakika) 140 mg/dl ve üzerinde bulunanlarda, ailesel diyabet hikayesi olanlarda, açıklanamayan nöropati, retinopati, ateroskleroz, koroner arter hastalığı, periferik vasküler hastalıkları (genellikle 50 yaşın altında) olanlarda, operasyon, stres, travma, kortikesteroid kullanımı sırasında kan glukoz değerinin yüksek çıktığı kişilerde metabolik sendrom düşünülen kişilerde, reaktif hipoglisemi düşünülen kişilerde (bu

7 kişilerde OGTT süresi daha uzun tutulur), vücut kitle indeksi>25 kg/m 2 olan hipertansif kişilerde, dislipidemisi olan (HDL-kolesterol<35 mg/dl veya trigliserid > 250 mg/dl) obez kişilerde, insülin direnci ile ilgili hastalıkları (polikistik over sendromu gibi) veya klinik bulguları (akandozis nigrikans) olan kişilerde ve gebelerde OGTT yapılır. Test 8-14 saat açlıktan sonra yapılır. Teste sabah saat 7.00 9.00 arası başlanır. Erişkinlerde 75 kg oral glukoz (maksimum insülin salınımının elde edildiği glukoz dozu) ile standart OGTT yapılır. Hamilelerde test gebeliğin 24-28. haftasında uygulanmaktadır 9, 10. 2.6. Diabetes Mellitusun Sınıflandırılması Diyabetes Mellitus için birçok sınıflandırma yapılmıştır. Ancak DM hakkındaki bilgilerin giderek artması sınıflandırmanın ve tanı kriterlerinin yeniden gözden geçirilmesi gerektirmiş ve 1997 de Amerikan Diyabet Birliği (ADA) yeni sınıflandırmayı bildirmiştir. Bu yenilik 1998 de yayınlanmıştır. Yeni sınıflandırma etiyolojiye dayanan ve kolay anlaşılır bir sınıflandırmadır. Burada 4 ana klinik grup yer almaktadır 1. Tablo 1. Diyabetes Mellitus un sınıflandırması (ADA 1997) 1. Tip І DM: İnsülin eksikliği ile birlikte olan DM dir. DM hastalarının % 15 ini oluşturur. a. Otoimmün tip DM b. İnsülin eksikliğinin diğer nedenlerle meydana geldiği tip 1 DM 2. Tip II DM: İnsülin direnci ile birlikte olan DM dir. DM hastalarının büyük kısmını (% 85) oluşturur. 3. Gestasyonel DM (GDM) 4. Özel DM tipleri

8 2.6.1. Tip I Diyabetes Mellitus (IDDM) İnsüline bağımlı, insulin dependent diyabetes mellitus (IDDM) veya genç tipi (juvenile onset) diyabet olarak anlatılmaktadır. Bu tip diyabet total veya kısmi insülin yetmezliği olarak da tanımlanmaktadır. Polidipsi, poliüre, zayıflama ve ketoasidoz gibi klasik diyabet semptomları gösterir. Hiperglisemi ve ketoasidoz oluşumunu engellemek için insülin tedavisine gereksinim gösteren diyabet tipidir. Bu tipte pankreasın insülin salgılayan β-hücrelerinin virütik enfeksiyonlar veya otoimmünitedeki değişimlerden dolayı tahrip olduğu gösterilmiştir 11. Diyabetes mellituslu bireylerin yaklaşık % 10-15 i Tip І diyabetiktirler. Semptomlar (örneğin; poliüri, polidipsi ve hızlı kilo kaybı) genellikle akut olarak ortaya çıkar. Pankreas adacık beta hücreleri kaybından dolayı diyabetik bireylerde insülin yetersizliği mevcut olduğundan yaşamlarını sürdürebilmek ve ketozu önlemek için insüline bağımlıdırlar. Bu hastalığın insidansı çocukluk ve genç erişkinlikte en fazladır. Yaklaşık olarak % 75 inde hastalık 30 yaşından önce başlar 12. Tip І diyabetes mellitus, insülin salgılayan pankreas beta hücrelerinin hücresel aracılı otoimmün harabiyeti sonucu oluşur. Diğer adacık hücreleri korunmuştur. Adacık hücreleri, mononükleer hücrelerce oluşturulan immün saldırıya maruz kalırlar ki; bu saldırının beta hücrelerindeki patolojik görünümü insülitis olarak adlandırılmaktadır. Tip І diyabete öncülük eden otoimmün olay klinik belirtilerin ortaya çıkmasından yıllar önce başlar. Semptomatik tip І diyabetin ortaya çıkması için beta hücreleri hacminde % 80-90 kadar azalma olması gereklidir 12. Tip І diyabeti olan bir annenin çocuğunda aynı tipte diyabet gelişmesi riski yüksektir. 25 yılda % 1 ile 2 civarında bir artış olur, eğer babada diyabet varsa bu risk üç kat artar. Eğer hem annede hem babada hastalık varsa

9 risk daha da artar ve bu nadir karşılaşılan çiftlere genetik danışmanlık verilmesi gerekmektedir 12. 2.6.2. Tip II Diabetes Mellitus (NIDDM) Bu tip diyabetes mellitusa ergin tipi diyabetes mellitus, sekonder (ikincil) diyabetes mellitus, insüline bağımlı olmayan diyabetes mellitus da denir. Genellikle orta yaşın üzerindeki yaşlarda görülmeye başlar. Fakat son dönemlerde genç erişkinlerde ve çocukluk çağında da görülmeye başlamıştır 13. Tip II diyabetli bireylerde en azından 2 ana grup altında tanımlanabilir. Bunlardan bir tanesi insülinin periferik dokuları etkileme yeteneğindeki azalmadır. Bu bozukluk insülin direnci olarak isimlendirilir ve bazı araştırmacılar tarafından primer patolojik olay olarak düşünülmektedir. Diğeri beta hücre disfonksiyonudur. Bu, insülin direncini kompanse etmek için yeterli insülin üretmede pankreasın yetersizliğidir. Böylece hastalıkta önce insülinin göreceli yetersizliği oluşur ve sonra mutlak insülin eksikliği gelişir. İnsülin direnci ve insülin sekresyonundaki temel moleküler defektler çevresel ve genetik faktörlerin kombinasyonundan kaynaklanmaktadırlar 12. Bu tip diyabetes mellitusta beta hücrelerinde insülin oluşumu, salınımı, depo edilmesi ve beta hücrelerinin sayısı normaldir. Kandaki insülin düzeyi biraz azalmış, normal ya da yüksek olabilir. Asıl bozukluk, insülinin etkilediği hedef hücrelerde insülin reseptörlerinin sayıca az olması ya da hücre içinde postreseptör düzeyde insülin etkinliğinin azalması ve insüline karşı direnç gelişmesinden kaynaklanmaktadır. Bunun sonucu olarak glukoz hücrelere yeterince giremez ve dolayısıyla hücrelerde glukoz kullanılamadığından bu tür diyabetus mellitus gelişir. Bu tür diyabetes mellitusta az miktarda olan insülin, kan glukozunu normal düzeyde tutamamakta ise de, yağları depo

10 edecek düzeydedir. Bu nedenle genellikle kilo artışı vardır. Ağır bir enfeksiyon ya da hastalık durumunda hastalar komaya girebilir 14, 15. Tip II diyabetes mellitusun nedenlerinden biri progesterondur. Seksüel siklusların hormonal denetimi ya da başka bir deyişle kızgınlığın bastırılması için kullanılan progesteron insülin salınımını azaltır, insülin etkinliği için zıt etki gösterir ve çevresel insülin direncine neden olur. İştahsızlık, güçsüzlük, hızlı solunum, kusma, sinirsel işlevlerdeki şiddetli çökkünlük (depresyon) sonucunda gözlemlenir 15. Hastalığın başlangıcı ve tanı koyulması arasında yaklaşık ortalama 4-7 yıl gibi bir zaman olduğu düşünüldüğünde, toplumda tanı koyulmamış diyabet hastalarının mevcut olduğu kolayca anlaşılabilir. Diyabet tanısı konulduğu esnada bu hastalarda bazı diyabetik komplikasyonlar gelişmiş olabilir 16, 17. Kontrol altına alınmamış ve yüksek seyreden kan glukozu uzun vadede çeşitli komplikasyonların ortaya çıkmasına yol açmaktadır. Lipit, protein ve karbonhidrat metabolizma bozuklukları ile seyreden kompleks metabolik bir hastalık olan tip II diyabetus mellitus, sıkça şişmanlıkla (obezite) birlikte gelişip, kalp-damar hastalıkları, böbrek yetmezliği ile sonuçlanan nefropati, sinir sistemi hastalığı nöropati, körlüğe kadar götüren retinopati ve ayak ülserleri gibi uzun vade komplikasyonları sonucu felç, gangren veya koroner hastalıkların meydana gelmesi riskini artırmaktadır 12, 16. 2.6.2.1. Tip II Diyabet Risk Faktörleri Risk faktörleri hem genetik hem de çevresel olanları içerir. Bu faktörlerin bilinmesi koruyucu girişimlerin uygulanacağı kitlenin saptanması açısından önem taşır 18. 2.6.2.1.1. Etnik Gruplar: Bazı etnik gruplarda Tip II diyabete daha sık rastlanır. Örneğin Amerika daki Pima yerlileri ve İngiltere deki Asya Orjinli insanlarda Tip II diyabet prevalansı aynı çevrede yaşayan diğer gruplara göre daha fazladır 18.

11 2.6.2.1.2. Ailede Tip II Diabet Öyküsü: Birinci derece akrabada Tip II diyabet olan bir insanın ömür boyunca herhangi bir anda diyabete yakalanma riski %40 dır 18. 2.6.2.1.3. Genetik Faktörler: Bugün için Tip II diyabete eğilimi belirleyen ve yeterince güçlü tek bir genetik lokuz belirlenememiştir 18. 2.6.2.1.4. Çevresel Faktörler: Toplumsal gelişme ve şehirleşmenin getirdiği değişiklikler özellikle kilo artışı ve fiziksel inaktivite Tip II diyabet için güçlü belirleyicilerdir 18. 2.6.2.1.5. Obezite: Tip II diyabetin en güçlü risk faktörlerinden biridir. Tüm toplumlarda beden kitle indeksi ile Tip II diyabet arasında ilişki vardır. Obezite arttıkça insülin direncide artmakta ve Tip II diyabete eğilim ortaya çıkmaktadır. Tip II diyabet gelişme riski obezlerde 2, orta derecedeki obezlerde 5, ileri derecedeki obezlerde ise 10 kat daha fazladır 19. 2.6.2.1.6. Yaş: Tip II diyabet prevelansı yaşla beraber artar 18. 2.6.2.1.7. Düşük Fizik Aktivite: Günlük fiziksel aktiviteleri az olan insanlarda Tip II diyabet gelişme riski fazladır 18. 2.6.2.1.8. Diyet: Yüksek oranda yağ, düşük kompleks karbonhidrat ve düşük lif içerikli batılı diyet obeziteye yol açarak ikincil olarak Tip II diyabet prevalansını artırır. Tip II diyabetten korunmada kabul edilen yöntem egzersiz yoluyla kilo kaybı ve buna bağlı insülin direncinin azalmasıdır 18. 2.6.3. Malnutrisyonla İlişkili Diabetes Mellitus Bu klinik alt grup tropikal ve gelişmekte olan ülkelerde genç erişkinler arasında görülür. Farklı klinik özellikleri, seyri ve belli bölgelerde çok fazla sayıda vakaların olması sınıflandırmada diyabete ayrı bir sınıfın girmesine yol açtı 20.

12 2.6.4. Bozulmuş Glukoz Toleransı ile Beraber Seyreden Diyabet Bozulmuş glukoz toleranslı kişilerin plazma glukoz konsantrasyonları normal değerler ile diyabet için tanı koydurucu olan değerler arasında seyreder. Bu gibi bireylerin plazma glukoz konsantrasyonları belli bir zaman periyodundan sonra belirgin diyabete doğru ilerler. Ancak büyük bir kısmında aynı kalır. Bazılarında ise glukoz konsantrasyonları normale döner 20. Bozulmuş gukoz toleransı sadece oral glukoz tolerans testi (OGTT) ile belirlenir. Bozulmuş glukoz toleransı, OGTT de ikinci saatteki plazma glukoz konsantrasyonunun 126-200 mg/dl (7-11,1 mmol/l) arasında olmasıyla belirlenir 20. 2.6.5. Gestasyonel Diyabet (GDM) Gebelik sırasında fark edilen diabettir. GDM, genellikle ilerleyen gebelik haftalarında görüldüğü için gebeliğin ilk trimesterinde görülen diyabet, overt diyabet olarak kabul edilir. Gebeliğin en sık görülen medikal komplikasyonu olup, tüm gebelerin yaklaşık % 2-3 ünde görülür. Her ne kadar gestasyonel diyabet doğumdan sonra kaybolsa da GDM li kadınların % 30 u 7-10 yıl içinde diyabet veya bozulmuş glukoz intoleransı tanısı alırlar 21. Tanı konulmaz ve önlem alınmaz ise perinatal morbidite ve mortalite riski artar. Gestasyonel diyabeti olan annelerin doğurduğu bebekler sıklıkla makrozomiktir. Daha önemlisi bu gibi hastaların sonraki hamilelik dönemlerinin yaklaşık % 2 sinde gestasyonel diyabet oluşur. Gestasyonel diyabetli kişilerin doğumdan sonra glukoz düzeyleri genellikle normale döner veya bozulmuş glukoz toleransına sahip olurlar ya da diyabet oluşur. Tanı için her hamile bayanda 26 ile 28. haftalarda rutin kan glukoz ölçümleri yapılmalıdır 20.

13 2.7. Diyabet Oluşumuna Etki Eden Faktörler Diyabet oluşumuna etki eden faktörler 22 ; a. Genetik sendromlar (Tip A ve Tip B insulin direnç sendromları, glikojen depo hastalığı, wolfram sendromu, down, klinefelter ve turner sendromları). b. Endokrin hastalıkları (Agromegali, glukagonoma, hipertiroidi, hiperparatiroidi, pankreatik kolera sendromu, büyüme hormonu yetersizliği). c. Pankreatik hastalıklar (Pankreatektomi, pankreatit, hemokromatozis). d. İlaçlar, kimyasal ajanlar, toksinler (Tiyazid grubu diüretikler, beta adrenerjik reseptör blokerleri, glukokortikosteroidler, psikoaktif ajanlar, antineoplastik ajanlar, katyonlar). 2.8. Diyabetin Komplikasyonları 2.8.1.Diyabetin Akut Komplikasyonları Akut komplikasyonlar kan şekerinin aşırı yükselmesi veya aşırı düşmesi sonucu ortaya çıkar 23. 2.8.1.1. Diyabetik Ketoasidoz: İnsülin ile insülin karşıtı hormonlar arasındaki dengenin insülin aleyhine bozulması sonucu oluşan ve ketoasidoz, hipovolemi, dehidratasyon semptom ve bulguları ile kendini gösteren, sonuçları komaya kadar varabilen, şuur değişikliklerine sebep olabilen akut metabolik bir diyabetik komplikasyondur. Diyabetik hastalarda en sık ortaya çıkan hiperglisemik acil durum ketoasidozudur. Tedavide ilk hedef koma ve ölüme neden olan hiperozmolarite ve dehidratasyonun düzeltilmesidir 23. 2.8.1.2. Hiperglisemik Hiperozmolar Nonketotik Koma: Tipik olarak ilk kez diyabet tanısı konan, yaşlı, ciddi derecede dehidrate, çoğunlukla komada ve ciddi hastalığı bulunan ve kötü prognoza sahip bir durumdur 23.

14 2.8.1.3. Hipoglisemi: Biyokimyasal bir tanı olup, kan şekerinin <50 mg/dl (2.8 mmol/l) olarak tanımlanabilir. Hafif ataklar hasta tarafından tedavi edilebilirken ciddi hipoglisemi atakları hastanın hayatını tehdit edebilir, bu nedenle erken tanınması ve tedaviye derhal başlanması gerekir 23. 2.8.2. Diyabetin Kronik Komplikasyonları TipІdiyabetlilerde yapılan Diabetes Control and Complications Trial (DCCT) ve Tip II diyabetiklerde yapılan United Kingdom Prospective Diabetes Study (UKPDS) çalışmaları ile düzelmiş glisemi kontrolünün, diyabet hastalarında retinopati, nöropati ve nefropati gelişimini yavaşlattığı gösterilmiştir 24. 2.8.3. Diyabetin Mikrovasküler Komplikasyonları 2.8.3.1. Retinopati: Diyabetik hastaların yaşam kalitesini en çok düşüren neden diyabetik retinopatinin yol açtığı görme kaybıdır. Diyabetli hastalarda tanı sonrası; 10 yıl içinde % 50 oranında diyabetik retinopati, 15 yıl sonrası ise; % 80 hastada bazı retina hastalıklarının görüldüğü bildirilmiştir 25. Diyabetik retinopatinin ortaya çıkışı ve prognozunu etkileyen sistemik faktörler içinde en önemlisi diyabetin metabolik kontrolüdür 26. Tedavi görmenin kötüleşmesini önleyebilir. Ancak görme kaybı gelişen birçok hastada geri dönüş olmamaktadır. Dolayısıyla göz muayeneleri çok önemlidir. Lazer cerrahisi birçok diyabetik göz komplikasyonunun tedavisinde kullanılabilmektedir 27. 2.8.3.2. Nöropati: Diyabetik nöropati, diyabetik hastalığın vücudumuzun çeşitli yerlerine dağılan sinirler üzerinde yaptığı değişik derecelerdeki tahribatın yol açtığı bir hastalıktır. Ağrı bazen cildin herhangi bir yerine iğne batıyor gibi, bazen tabanlarda yanıcı bir ağrı, bazen de dizlerden aşağı doğru sızı şeklinde olur 28.

15 2.8.3.3. Diyabetik Ayak: Diyabetik ayak problemlerinin en önemli sonucu ayak ülserleri ve ampütasyonlardır. Nontravmatik ayak ampütasyonlarının % 40-60 ı diyabetiklerde yapılmaktadır. Birçok çalışma ayak ülserlerinin korunma, hasta eğitimi ve çok yönlü tedavi ile % 43 85 azaltılabileceğini göstermiştir 24. 2.8.3.4. Nefropati: Diyabetik nefropati diyabetik bir hastada başka bir neden olmadan idrarla 300 mg/gün veya 200 mg/gün üzerinde albüminin atılması olarak tanımlanabilir 29. 2.8.4. Diyabetin Makrovasküler Komplikasyonları Diyabet hastaları, aterosklerotik kardiyovasküler, periferik arteriyel ve serebrovasküler hastalık sıklığının arttığı bir gruptur 30. 2.9. Diyabetin Tedavisi Diyabet tedavisinin amaçları; kan şekerinin normal ya da normale yakın değerde tutulması, semptomların ortadan kaldırılması, yaşam kalitesinin iyileştirilmesi, akut ve kronik komplikasyonların önlenmesi, mortalitenin azaltılmasıdır. DM ün tedavi basamakları; eğitim, diyet, egzersiz, oral antidiyabetikler ve insülindir 25. 2.9.1. Eğitim Diyabet gibi kronik hastalıkların takibinde ilaç tedavisinin yanı sıra hasta eğitimi ve tedavi uyumu ayrı bir önem kazanmaktadır 31. Diyabetik hasta eğitimi ile diyabetlinin kendini daha iyi hissetmesini sağlamak, hastalığın daha iyi kontrolü ile oluşabilecek yan etkilerden korumak, tedavi gider ve hatalarını azaltmak, tedaviye uyumu arttırmak gibi çok önemli faydalar sağlanır. Eğitimle hastaların kan şekeri regülâsyonunda belirgin bir düzelme, tedaviye, diyete ve egzersize uyumda artma olduğu görülmüştür 32. Diyabetik hasta eğitimi, gelişmiş ülkelerde tedavinin bir basamağı olarak sağlık hizmetlerinde son 10 yıldır rutin olarak uygulanmaktadır. Yapılan çalışmalar diyabet

16 eğitimi verilen hastalarda uzun vadede gelişebilecek olan diyabet komplikasyonlarının en az % 50 oranında önlenebileceğini ortaya koymuştur 33. Sonuç olarak, DM tedavi edilebilen, iyi bir tedavi ile normal, kaliteli bir yaşam sürdürülmesi mümkün olabilen bir hastalıktır. Bunun başarılmasında ise en ucuz ve en etkili tedavi basamaklarından biri diyabetik hasta eğitimidir 33. 2.9.2. Diyet Obezite diyabet gelişme riski olan kişilerde insülin direncini arttırarak Tip II diyabet gelişimini kolaylaştırır 34. Tip II diyabet hastalarının % 80-90 ı obezlerden oluşmaktadır 35. Tıbbi Beslenme Tedavisi (TBT) diyabet tedavisinin ve diyabet yönetimi için gerekli eğitimin en önemli bölümünü oluşturur. Kan glikoz, lipid düzeyleri ve kan basıncı ile ilişkili tedavi hedeflerine ulaşmak için TBT nin etkili olduğu bilinmektedir 36. 2.9.3. Egzersiz Egzersiz diyabet kontrolünün önemli bir bölümüdür 37. Düzenli ve uygun fiziksel aktivitelerin vücudumuzda birçok sistemi olumlu yönde etkilediği bilinen bir gerçektir 38. Egzersiz, insülin duyarlılığını arttırarak kan şekerinin düşürülmesi, bunun yanı sıra kan kolesterolü ve trigliseritlerin azaltılmasına ve şişmanlığın tedavisine yardımcı olur. Dolayısı ile diyabette görülen komplikasyonları azaltmakta yardımcıdır 39. 2.9.4. İnsülin Tedavisi İnsülin anabolik bir hormondur. Glukozun, yağların, proteinlerin ve nükleik asitlerin sentezine ve/veya depolanmasına yönelik metabolik reaksiyonları stimüle eder. Pek çok endojen maddenin hücre membranında taşınmasını, membrandaki insülin reseptörlerini aktif hale getirmek suretiyle düzenler 40.

17 İnsülin türleri hızlı-etkili, kısa-etkili, orta-etkili ve uzun-etkili insülinler olmak üzere etki süreleri bakımından değişkenlik gösterirler. İnsülinler sıklıkla deri altı enjeksiyon şeklinde insülin enjektörleri veya insülin kalemleri kullanılarak uygulanırlar. Diğer bir uygula yolu ise insülin pompası kullanımı ile sürekli deri altı infüzyondur 41. 2.9.4.1. İnsülin Yapısı İnsülin, doğrudan ya da dolaylı olarak vücuttaki bütün dokuları etkileyen glukoz, amino asitler, lipidler gibi besin maddelerinin hücre içinde tutulup depolanmasını sağlayan ve hemeostazına katkıda bulunan antikatabolik bir hormondur. İlaç olarak kullanılmaya 1922 yılında başlanılmıştır. Pankreas langerhans adacıklarında bulunan hücrelerde üretilir ve ada içerisinde yaklaşık olarak % 70 oranında bulunur. İnsülin A ve B polipeptid zincirinden oluşmuş 51 amino asit içeren bir yapıya sahiptir. A 7, B 7, A 20 polipeptid zincirlerini B 19 zincirine bağlayan, iki disülfit köprüsü ile birleşmiştir. Üçüncü bir zincir içi disülfit köprüsü ile de A zincirinde 6. Ve 11. Amino asitleri birleştirir. A ve B zincirinde sırası ile 21 ve 30 amino asit yer almaktadır. İnsan insülin geni, 11. Kromozomun kısa olanında yerleşmiştir. Molekül ağırlığı 5808 daltondur. Domuz insülini insan insülininden, B zincirinin C terminalinde threonin yerine alanin gecmesiyle farklı iken, sığır insülini 3. amino asidin pozisyonuyla farklıdır 42, 43.

18 Proinsülin zincir yapısı şekil 1 de gösterilmektedir 44 ; Şekil 1. Proinsülin zincir yapısı 2.9.4.2. İnsülin Metabolizması İnsülin; karaciğer, böbrek ve plasenta gibi ilgili olduğu organlarda, plazmada ve yıkımdan sorumlu enzimleri içeren periferik dokularda yıkılmalıdır. İnsülin spesifik proteaz; iskelet kasında saflaştırılmış olup, Fizyolojik p H da aktif ve sülfidril bağlarına spesifiktir. Hepatik glutatyon-insülin transhidrogenaz enzimi; enzimin katalitik etkisi altında A ve B zincirleri arasında disülfür köprüleri yıkılmakta, birbirinden ayrılan zincirler ise proteolitik enzimler tarafından yıkılmaktadır 45, 46.

19 2.10. Serbest Radikaller ve Antioksidanlar 2.10.1. Serbest Radikaller Serbest radikaller, bir veya daha fazla sayıda eşleşmemiş elektron içeren atomik veya moleküler yapıdaki maddelerdir. Radikaller eşleşmemiş elektronlarından dolayı kimyasal olarak çok aktiftirler ve ortamdaki diğer biyomoleküllere saldırarak onların biyolojik yapılarını bozarlar. Bu radikalik ve reaktif ara ürünler nükleik asitler, proteinler ve lipitleri oksitleyebilir ve metabolizmada olumsuz neticeler oluşturabilirler. Antioksidan sistemler bu radikal ve reaktif ara ürünleri gidererek olumsuz etkilerini yok ederler 47-49. Bir serbest radikal 3 yolla ortaya çıkabilir 50 : 1. Molekülün hemolitik yıkımı sonucu bağ parçalanması ile bir elektronun bir molekülden diğerine transfer edilmesi sonucu oluşan serbest radikaller. En yaygın görülen serbest radikal oluşumu bu bağ parçalanmasıdır: X : Y X + Y 2. Bir molekülden tek bir elektronun kaybı veya bir molekülün heterolitik parçalanması. Heterolitik parçalanmada kovalent bağı oluşturan her iki elektronda atom veya atom gruplarının sadece birinde kalır. Bu parçalanma sonucu zıt yüklü iyonlar oluşur. X : Y X + Y + 3. Bir moleküle tek bir elektronun eklenmesi sonucu oluşan serbest radikaller. A + e - A Biyolojik sistemlerdeki en büyük radikal kaynağı oksijendir. Serbest radikaller reaktif oksijen türlerinden oluşmaktadır. Reaktif oksijen türleri ise metabolik kaynaklı ve dış kaynaklı olabilmektedir. Bunlardan elektron transport sistemi, bazı enzimatik

20 reaksiyonlar ve oksidasyon reasiyonları metabolik kaynaklı iken UV ışınları, radyasyon, hava kirliliği, ilaç yan etkileri, sigara, beslenme, kanserojen maddeler ise dış kaynaklardır 51, 52. Metabolizmada oluşan ve dış kaynaklı radikal ve reaktiflerin oluşum yolları aşağıdaki şekil 2 de gösterilmiştir 53. Şekil 2. Serbest radikal ve reaktiflerin oluşumu Glikoliz, yağ asitleri ve TCA devrinde oluşan NADH ve FADH 2 de bulunan yüksek indirgeme potansiyeline sahip elektronlar, mitokondri iç membranında elektron transport sistemi adı verilen bir yolla moleküler oksijene (O 2 ) transfer edilir. Mitokondrial elektron transport sisteminde, elektronların O 2 ye transferi sırasında oksijenin kısmi indirgenmiş ürünleri oluşur. Bu ürünler çok reaktif yapıdadırlar ve biyomoleküllerin yapılarına girerek dönüşümsüz zarar görmelerine sebep olurlar 54.

21 Moleküler oksijenin indirgenmesiyle oluşan reaktif oksijen türleri şekil 3 te gösterilmektedir 55. e - e - + 2H + e - + H + e - + 2H + O 2 O 2.- H 2 O 2 OH H 2 O süperoksit hidrojen peroksit hidroksil hv O 2 1 O 2 1 O 2 +O 2.- Şekil 3. Moleküler oksijenin indirgenmesiyle oluşan reaktif oksijen türleri. Bu reaktif oksijen türlerinden süperoksit radikali (O 2 ), hidrojen peroksit (H 2 O 2 ), hidroksil radikalinin (OH ) oluşum reaksiyonları aşağıda verilmiştir. Tablo 2. Bazı önemli reaktif oksijen ve azot türleri Reaktif oksijen türleri Süperoksit radikali O 2 Reatif azot türleri Nitrik oksit radikali NO Hidrojen peroksit H 2 O 2 Azot dioksit radikali NOO Hidroksit radikali OH Peroksinitrit radikali ONOO Hipokloröz asit HOCl Nitröz asit HNO 2 Singlet oksijen 1 O 2 Nitrozil katyonu NO + Organik radikaller RO, R, R-S Nitroksi anyonu NO - Peroksil radikali RCOO Peroksinitrit ONOO - 2.10.1.1. Süperoksit Anyon Radikali (O 2 ) Süperoksit radikalleri hücrede enerji metabolizmasında oksidasyon sırasında ya da oksidazlar gibi bazı enzimlerin aktivitesi sonucu oluşurlar. Süperoksit radikalleri süperoksit dismutaz adı verilen bir enzimle inaktive edilirler. Fagositlerin bakterisit

22 etkilerinin temel mekanizmasıdır. Moleküler oksijenin (O 2 ) mitokondrial elektron transport sisteminde bir elektron alması sonucunda oluşur. O - e 2 2 O 2.10.1.2. Hidrojen Peroksit (H 2 O 2 ) Hidrojen peroksit eşleşmemiş elektrona sahip olmadığı için nonradikal özelliğe sahip bir reaktif oksijen türüdür. Ancak demir ve bakır gibi atomlarla tepkimeye girerek çok güçlü bir reaktif olan hidroksil radikalini (OH ) oluşturur. Hidrojen peroksit kolayca hücre içerisine girebilir ve hem gruplarında Fe 2+ in yapısına girerek bunları güçlü oksitleyici durumlarına getirebilmektedir. 2O Süperoksit dismutaz 2 2H H2O2 O2 Ayrıca hidrojen peroksit reaktif bir ürün olan hipokloröz asiti (HOCl) oluşturmaktadır 54, 56. H Cl H2O2 HOCl H2O 2.10.1.3. Hidroksil Radikali (OH ) Hidroksil radikali; lipidler, proteinler ve nükleik asitler gibi biyomoleküllere çok güçlü bir şekilde saldırarak oksitleyip yapılarında kalıcı hasarlar bırakan ve yarı ömrü 10-9 saniye gibi çok kısa olan bir reaktif oksijen türüdür. Hidroksil radikali, hidrojen peroksitin indirgenmesi sonucunda açığa çıkar. Fenton ve Haber-Weiss reaksiyonları olarak adlandırılan bu tepkimeler aşağıda gösterilmiştir 47, 57, 58. Fenton reaksiyonları: H H 2 3 2O2 Fe OH OH Fe 2 2O2 Cu OH OH Cu

23 Haber-Weiss reaksiyonu: H H2O2 O2 OH O2 H2O Ayrıca hidrojen peroksitin UV ışınlarının etkisiyle hidroksil radikaline dönüştüğü bilinmektedir. H 2 O 2 UV 2OH Metabolizmada süperoksit radikali, hidrojen peroksit ve hidroksil radikalinden başka reaktif oksijen türleri ile reaktif azot türleri de vardır. 2.10.1.4. Singlet Oksijen ( 1 O 2 ) Singlet oksijen eşleşmemiş elektron ya da elektronlara sahip olmadığından dolayı bir serbest radikal değildir. Oksijenin eşleşmemiş elektronlardan birinin verilen enerji sonucu bulunduğu orbitalden başka bir orbitale veya kendi spininin ters yönünde yer değiştirmesiyle oluşur. Ancak orbitalinde içerdiği elektronların aynı yönlü olması singlet oksijenin diğer reaktif oksijen türleri ile okside olmasını artırmaktadır. Singlet oksijen özellikle fotokimyasal reaksiyonlar için oldukça önemlidir 59, 60. 2.10.1.5. Nitrik Oksit (NO ) ve Nitrojen Dioksit (NO2 ) Nitrik oksit ve nitrojen dioksit eşleşmemiş elektronları ile birer radikaldirler. Nitrojen dioksit, nitrik oksitin oksijen ile reaksiyona girmesi sonucu meydana gelir. NO 2 oldukça zehirli ve çok güçlü bir oksidantdır. Oksijen redüksiyonu sırasında NO 2 ye maruz kalması durumunda araşidonik asit metabolizmasının NO 2 konsantrasyonuna bağlı olarak değiştiği görülmektedir. Düşük miktarda NO 2 nin araşidonik asit metabolizmasını büyük oranda artırdığı gözlenmiştir 61-63. Nitrik oksit L-arjinin amino asitinden in vivo olarak üretilmektedir. NO kokusuz, renksiz ve az indirgenebilen oksidant bir gazdır. Son yıllarda radikal olan nitrik oksit üzerinde oldukça fazla durulmaya başlanmıştır. Nitrik oksit eşleşmemiş elektronları

24 sayesinde süperoksit, tiyol grupları ve nitrojen dioksit ile hızlı reaksiyonlar oluşturmaktadır. Diğer radikallerle birlikte diabetes mellitus, septik şok, kalp bozuklukları, Alzheimer hastalığı ve gastrik ülserlerin oluşumunda etkili olduğu düşünülmektedir 61, 62, 64. 2NO + O 2 2NO 2 NO + O 2 NO 2 O 2 + NO ONOO ( peroksinitrit) ONOO + H + OH + NO 2 2.10.1.6. Diğer Serbest Radikaller Serbest oksijen radikallerinin etkisi sonucu karbon merkezli radikaller (R ), peroksil radikalleri (ROO ), alkoksil radikalleri (RO ), tiyol radikalleri (RS ) gibi önemli serbest radikallerde oluşabilir. Bunlardan özellikle polidoymamış yağ asitlerinden meydana gelen peroksil radikali yarı ömrü uzun olan bir radikaldir. Tiyol radikalleri de tekrar oksijenle reaksiyona girerek sülfonil (RSO ) veya tiyol peroksil (RSO 2 ) vb. gibi radikalleri oluşturabilirler 65. 2.10.2. Serbest Radikallerin Kaynakları Biyolojik sistemlerde serbest radikal oluşumu, normal metabolik olayların seyri sırasında gelebildiği gibi, organizmada bazı yabancı maddelerin (ksenobiyotikler) metabolize edilmesi sırasında ve organizmanın radyasyon gibi dış etkenlere maruz bırakılmasıyla da meydana gelebilir. Bu nedenle serbest radikal oluşturan mekanizmalar endojen ve ekzojen olarak ikiye ayrılmaktadır 66. Hücredeki serbest oksijen radikal kaynakları tablo 3 te gösterilmektedir 67.

25 Tablo 3. Hücredeki serbest oksijen radikali kaynakları Serbest radikal üretimini bazı toksik maddeler artırabilir. Bu maddeler dört gruba ayrılır 68, 69. 1. Toksinin kendisi bir serbest radikaldir. 2. Toksin bir serbest radikale metabolize olabilir. Örneğin toksik bir madde olan karbontetra klorür (CCl 4 ) karaciğerde sitokrom P 450 tarafından triklorometil ( CCl 3 ) serbest radikaline dönüştürülür. Bu radikalin oksijenle reaksiyona girmesi neticesinde meydana gelen peroksil radikali güçlü lipid peroksidasyonu başlatıcısıdır. 3. Toksinin metabolizması sonucu serbest oksijen radikali meydana gelir. Bunun en basit örneği paraquattır. 4. Toksin antioksidant aktiviteyi düşürebilir. Örneğin parasetamol karaciğerde sitokrom P 450 tarafından glutatyonla reaksiyona girerek ve miktarını azaltan bir ürün meydana getirir.

26 2.10.3. Serbest Radikallerin Etkileri Serbest radikaller hücrelerin lipid, protein, DNA, karbonhidrat ve enzim gibi tüm önemli bileşiklerine etki ederler. Serbest radikallerin etkisiyle proteinlerdeki sistein sülfhidril grupları ve diğer amino asit kalıntıları okside olarak yıkılır, nükleer ve mitokondriyal DNA okside olur. Serbest radikallerin etkisiyle oluşan DNA hasarı şekil 4 te gösterilmiştir 70. Şekil 4. Serbest radikallerin etkisiyle oluşan DNA hasarı Serbest oksijen radikallerinin tüm bu etkilerinin sonucunda hücre hasarı olur. Hücrede reaktif oksijen türlerinin (ROS) ve serbest radikallerin artışı hücre hasarının önemli bir nedenidir. İskemi sonrasında reperfüzyon da reaktif oksijen türlerinin (ROS) artışına bağlı olarak iskeminin oluşturduğu hücre hasarını artırır. Reaktif oksijen türlerinin artışına bağlı olarak iskeminin oluşturduğu hücre hasarı şekil 5 te gösterilmiştir 71-73.

27 Şekil 5. Reaktif oksijen türlerinin artışına bağlı olarak iskeminin oluşturduğu hücre hasarı Serbest oksijen radikallerinin neden olduğu hücre hasarının birçok kronik hastalığın komplikasyonlarına katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Aterogenez, amfizem/bronşit, Parkinson hastalığı, Duchenne tipi musküler distrofi, gebelik preeklampsisi, serviks kanseri, alkolik karaciğer hastalığı, hemodiyaliz hastaları, diabetes mellitus, akut renal yetmezlik, Down sendromu, yaşlanma, retrolental fibroplazi, serebrovasküler bozukluklar, iskemi/reperfüzyon injürisi gibi durumlarda serbest oksijen radikallerinin neden olduğu hücre hasarı söz konusudur 71-73. 2.10.3.1. Membran Lipidleri Üzerine Etkileri Serbest radikallerin en belirgin etkileri, lipid peroksidasyonu (LPO) na neden olarak, DM un da aralarında bulunduğu bir dizi hastalığın komplikasyonlarının ortaya çıkmasında ve progresyonunda rol oynamalarıdır. Lipidler serbest radikallerin etkilerine karşı en hassas olan biyomoleküllerdir. Hücre membranlarındaki kolesterol ve yağ asitlerinin doymamış bağları, serbest radikallerle kolayca reaksiyona girerek peroksidasyon ürünleri oluştururlar. LPO, membranlara yakın bölgelerde ortaya çıkan. OH radikalinin membran fosfolipidlerinin yağ asidi yan zincirlerine saldırmasıyla oluşur 74.

28 LPO reaksiyonu,. OH radikalini ortadan kaldırır, fakat membranda - CH- merkezli lipid radikali oluşur. Oluşan lipid radikali dayanıksız bir bileşiktir ve bir dizi değişikliğe uğrar. Molekül içi çift bağların pozisyonlarının değişmesiyle konjuge dien yapıları ve daha sonra lipid radikallerinin moleküler oksijenle etkileşmesi sonucu lipid peroksil radikali meydana gelir. Lipid peroksil radikalleri, membran yapısındaki diğer poliansatüre yağ asitleri ile reaksiyona girerek yeni karbon merkezli radikaller oluştururken, kendileri de açığa çıkan H. parçacığı ile birleşerek lipid hidroperoksitlerine dönüşürler. Böylece olay kendi kendine katalizlenerek devam eder 75. Lipid hidroperoksitlerinin membranlarda birikimi sonucu, membran fonksiyonları bozulur ve hücre kollabe olur. Ayrıca lipid hidroperoksitleri geçiş metalleri katalizi ile yıkıldığında çoğu zararlı olan aldehitler oluşurlar. LPO sonucunda ortaya çıkan aldehitlerden en iyi bilinenleri Malondialdehit (MDA) ve 4-hidroksinonenal (HNE) dir. MDA ölçümü ile LPO nun değerlendirilmesi yapılabilmektedir. Bu bileşikler ya hücresel olarak metabolize olurlar ya da başlangıçta etkili oldukları bölgeden diffüze olup, hasarı hücrenin diğer bölümlerine yayarlar. Lipid radikallerinin hidrofobik yapıda olması dolayısı ile reaksiyonların çoğu membrana bağlı moleküllerde meydana gelir. Peroksil radikalleri ve aldehitler, membran komponentlerinin çapraz bağlanma ve polimerizasyonuna neden olur. Böylece membranlarda, reseptörleri ve membrana bağlı enzimleri inaktive etmek suretiyle membran proteinlerinde de ciddi hasarlar meydana getirebilirler. İyon transportunu etkileyebilirler. Plazma lipoproteinleri ve özellikle düşük dansiteli lipoproteinler de oksidasyona uğrayabilirler. Okside lipoproteinler hücre fonksiyonlarının bozulmasına aracılık edebilirler 76, 77.

29 LPO reaksiyonu ya toplayıcı antioksidant reaksiyonlarla sonlandırılır veya otokatalitik yayılma reaksiyonları ile devam eder 61. LPO sonucunda memran yapısında çeşitli değişiklikler meydana gelir. Bunlar kısaca 78 : 1. Membran üzerindeki yağ asiti miktarında azalma meydana gelir. 2. Lipid peroksidasyonu sırasında oluşan lipid hidroperoksitleri biomemranlar üzerinde yerleşmiş halde bulunan bazı enzimleri inhibe eder. 3. Tiyol gruplarını oksidasyona uğratarak membran üzerindeki protein-lipid ilişkisini bozar. 4. Memranın yapı taşlarından olan lipitlerin akışkanlığını bozar. 5. Lipid peroksidasyonu sonucu oluşan serbest radikaller membran dışında da çeşitli yapısal moleküllerde bozulmalara neden olurlar. Lipidlerden, araşidonik asit metabolizması sonucu serbest radikal üretimine enzimatik lipid peroksidasyonu, diğer radikallerin sebep olduğu LPO na ise nonenzimatik lipid peroksidasyonu adı verilir 74, 79.

30 Lipid peroksidasyonunun kimyasal yolu şekil 6 da gösterilmiştir 80. Şekil 6. Lipid peroksidasyonunun kimyasal yolu.

31 Araşidonik asitin otooksidasyonunun öne sürülen mekanizması şekil 7 de gösterilmiştir 81. Arasidonik Asit -H COOH COOH COOH O 2 OO COOH RH O O OOH R COOH O O Siklik peroksit COOH COOH Siklik endoperoksit O 2 Hidroliz ya da isi O O MDA + diger ürünler Şekil 7. Araşidonik asitin otooksidasyonunun öne sürülen mekanizması 2.10.3.2. Proteinler Üzerine Etkileri Proteinler, lipitlere göre serbest radikallerden daha az etkilenirler. Proteinlerin etkilenme dereceleri içerdikleri aminoasit kompozisyonuna bağlıdır. Doymamış bağ ve sülfür içeren amino asitlerden (triptofan, tirozin, fenil alanin, histidin, metiyonin, sistein gibi) meydana gelmiş proteinler serbest radikallerden daha çabuk etkilenirler. Proteinlerin radikaller ile reaksiyona girmesi sonucu karbon merkezli radikaller ve

32 sülfür radikalleri meydana gelir. Bu karbon merkezli radikallerden karbonillerin (PCO) ölçülmesi ile proteinlerde meydana gelen oksidatif hasar ölçülebilir. Serbest radikallerin oluşturduğu hasar sonucunda proteinlerde fragmantasyon, çapraz bağlanmalar ve proteinlerin agregasyonu meydana gelebilir. Birçok biyokimyasal yapının ve özellikle enzimlerin yapısında bulunan proteinlerin hasar görmesi sonucu hücrenin normal fonksiyonlarında bozukluklar ve enzim aktivitelerinde aksaklılar meydana gelir 77, 79, 82. 2.10.3.3. Karbonhidratlar Üzerine Etkileri Serbest radikallerin karbonhidratlar üzerine de önemli etkileri vardır. Glukoz, mannoz ve deoksi şekerler fizyolojik şartlarda otooksidasyona uğrayarak, süperoksit ve hidrojen peroksiti meydana getirirler. Monosakkaritlerin otooksidasyonunun, protein çapraz bağlanmalarına yol açarak agrega olmalarına sebep olduğu gibi bazal membran kalınlaşmasına ve sonuçta katarakt, mikroanjiopati gelişimine de sebep oldukları ileri sürülmektedir 66. Serbest radikaller, bu kabil etkilerinden dolayı çok çeşitli hastalıkların patogenezinde önemli rol oynarlar. Diabet ve diabet komplikasyonlarının gelişimi, koroner kalp hastalığı, hipertansiyon, psoriasis, romatoid artrit, behçet hastalığı, çeşitli deri, kas ve göz hastalıkları, kanser ve yaşlılık gibi birçok hastalıkta serbest radikal üretiminin arttığı ve antioksidan savunma mekanizmalarının yetersiz olduğu gösterilmiştir 83. 2.10.3.4. Nükleik Asitler ve DNA Üzerine Etkileri İyonize edici radyasyona bağlı hücre ölümünün başlıca nedeni nükleik asitlerin reaktif oksijen türleri ile reaksiyonudur. Reaktif oksijen türleri DNA çift sarmalının ayrılmasına veya nükleik asit baz değişimlerine neden olabilir. Bu da kromozal mutasyonlar ve sitotoksisite ile sonuçlanabilir 66, 83.

33 Hidroksil radikali, deoksiriboz ve bazlarla kolayca reaksiyona girer ve değişikliklere yol açar. Eğer hidroksil radikali DNA nın yakınında meydana gelirse pürin ve primidin bazlarını atake edebilir ve mutasyonlara neden olabilir. Hidroksil radikali, nükleik asitlerde doymuş karbon atomlarından hidrojen çıkarır veya çift bağlara katma tepkimeleri ile sonuçlanan tepkimelere girerler. Singlet oksijenin nükleik asitlerle tepkimeye girme yeteneği daha sınırlıdır. Süperoksit anyonu güçlü bir oksitleyici olduğundan, guanin gibi yüksek elektron yoğunluklu bölgeler içeren moleküllerle daha kolay tepkimeye girer 66. Aktive olmuş nötrofillerden kaynaklanan hidrojen peroksit membranlardan kolayca geçerek ve hücre çekirdeğine ulaşarak DNA hasarına, hücre disfonksiyonuna ve hatta hücre ölümüne yol açabilir 84, 85. Reaktif oksijen türleri, DNA nın oksidative hasarı sonucu karsinogenesis, hastalıklar ve yaşlanmada önemlidir 86. 2.11. Oksidatif Stres Organizmada serbest radikallerin oluşum hızı ile bunların ortadan kaldırılma hızı bir denge içerisindedir ve bu durum oksidatif denge olarak adlandırılır. Oksidatif denge sağlandığı sürece organizma, serbest radikallerden etkilenmemektedir. Bu radikallerin oluşum hızında artma ya da ortadan kaldırma hızında bir düşme bu dengenin bozulmasına neden olur. Oksidatif stres olarak adlandırılan bu durum; serbest radikal oluşumu ile antioksidan savunma mekanizması arasındaki ciddi dengesizliği göstermekte olup, doku hasarına yol açmaktadır 87. 2.11.1. Oksidatif Stres ve Diyabet Üzerine Etkisi Diyabet ve diyabet komplikasyonlarının reaktif oksijen türleri ile olan ilişkisi gösteren çalışmalarda non enzimatik glikasyon, enerji metabolizmasındaki değişikliklerden

34 kaynaklanan metabolik stres, sorbitol yol aktivitesi, hipoksi ve iskemi-reperfüzyon sonucu oluşan doku hasarının serbest radikal üretimini artırdığı 88 ve antioksidan savunma sistemini değiştirdiği vurgulanmaktadır 89-91. Oksidatif stres oluşumu ve organizmaya verdiği hasarlar şekil 8 de gösterilmiştir 92.

35 Oksidatif Stres GSH azalması DNA Hasarı Sitoskeletal hasar Membran Hasarı Hücre İçi Demirin Salınması Protein Hasarı Hücre içi Serbest Ca +2 artışı NAD(H) Azalması Lipid Peroksidasyonu ATP Sentezinin İnhibisyonu Poli (ADP) Riboz Sentetaz Aktivasyonu Membran Peroksidasyonu ve yapısal bozulma DNA, Proteinler ve Lipidlerde Hasarın Artması Metal İyonlarının Çevredeki Dokulara Salınması ve Komşu Hücrelerde Hasarın Oluşması Şekil 8. Oksidatif stres oluşumu ve organizmaya verdiği hasarlar

36 Süperoksit dismutaz, katalaz, glutatyon peroksidaz gibi antioksidan enzimlerin ekspresyonlarının ve antioksidan kapasitenin pankreas adacık hücrelerinde, karaciğer, böbrek, iskelet kası ve adipoz doku gibi diğer dokularla kıyaslandığında en düşük düzeyde olduğu bilinmektedir 93. Oksidatif strese en duyarlı yapılardan biri olduğu da bilinen beta hücrelerinde gözlenen hasarın, hipergliseminin toksik etkilerinden kaynaklandığı düşünülmektedir 94. Hidrojen peroksidin, yüksek reaktiviteye sahip bir ROS ürünü olan OH radikaline dönüşmesi sonrası insülin reseptör sinyal sistemi üzerinde etkili olduğu ve insülin tarafından reseptör aracılığı ile düzenlenen sinyal transdüksiyonlarında anahtar bir rol oynayabileceği görüşü araştırmacıların savları arasında bulunmaktadır 95. Glikasyon aracılı serbest radikal üretiminin insülinin gen transkripsiyonunu azalttığını ve beta hücre apoptozuna yol açtığını gösteren çalışmaların bulguları bu görüşü destekler niteliktedir 95, 96. Şekil 9 da diyabette oksidatif stresin artış metabolizması görülmektedir 97. Şekil 9. Diyabette oksidatif stresin artış metabolizması.

37 Metabolik stres oksidatif olayların artmasına neden olmaktadır. Diyabet komplikasyonlarının gelişimini kolaylaştıran bu durum, yapısal ve fonksiyonel hasarı oluşturmaktadır. Normalde çok düşük olan HbA1C düzeyinin kan konsantrasyonu, yüksek kan glukozu ile seyreden kişilerde total hemoglobinin %12 kadarına veya daha üzerine çıkabilmektedir. Ortalama eritrosit ömrü 120 gün olduğundan HbA1C düzeyleri son dört aylık süreyi kapsayacak şekilde dolaşımdaki kan şeker düzeyi için iyi bir gösterge olmaktadır 98. Oksidatif stresin hiperglisemi ile bağlantısı şekil 10 da gösterilmiştir 98 Şekil 10. Oksidatif stresin hiperglisemi ile bağlantısı Hiperglisemideki aşırı oksidatif stresin vasküler duvarlarda ve plazmada lipit peroksidasyonunu artırmasıyla aterosklerozis oluşumu arasında ilişki olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca diabette vasküler ve diğer komplikasyonların sebebi olarak sigara, hipertansiyon ve dislipitemi gibi faktörler gösterilmektedir. Bazı araştırıcılar bu risk

38 faktörlerinin oksidatif stresi artırarak diyabetin patofizyolojisine ve komplikasyonların gelişimine katkıda bulunduğunu bildirmektedirler 99. Vücutta serbest radikallerin bu etkilerini engellemek maksadıyla antioksidan sistemler gelişmiştir. Fakat bu sistemler vücudun korunmasını tamamen sağlayamadıkları için oksidatif stres kaynaklı veya etkili bazı hastalıklarda dışarıdan antioksidan ilave edilmelidir. Antioksidanlar günümüzde başta kanser olmak üzere birçok hastalığın tedavisinde ve yaşlanmanın geciktirilmesi için yapılan bazı araştırmalarda sıkça kullanılmaktadır. 2.12. Antioksidan Savunma Mekanizmaları Canlılar serbest radikallerin zararlı etkilerini engellemek için hem hücre içerisinde hem de hücre membranında etki gösteren birçok koruyucu mekanizmaya sahiptirler. Bu mekanizmalar gerek radikal üretimini engellemek gerekse oluşan radikallerin zararlı etkilerini ortadan kaldırmak için tasarlanmıştır. Canlı organizmaların oluşturduğu bu sisteme antioksidant savunma sistemi veya kısaca antioksidantlar denilmektedir 100. Biyolojik sistemlerde antioksidan savunma sistemi şekil 11 de gösterilmiştir 66. Şekil 11. Biyolojik sistemlerde antioksidan savunma sistemi.

39 Canlı organizmanın serbest radikallere ve normal oksijen metabolizmasının toksik etkilerine karşı kendini koruması gerekir. Bunun için de antioksidan mekanizmaya sahiptir 101. Antioksidanlar vücudumuzda lipid peroksidasyonu ve diğer serbest radikal aracılı reaksiyonları inhibe ederek radikal süpürücü olarak görev görürler. Dolayısıyla radikallerden kaynaklanan çeşitli hastalıkları engellerler 102. Şekil 12 de biyolojik sistemlerde ROS lere karşı oluşturulan antioksidan savunmanın gelişimi gösterilmiştir 103. Glukoz 6-fosfat NADP + 2GSH HO 2 2 O 2 G 6 P D G R CAT GP S O D 6-Fosfo glukonat NADPH+H + GSSG 2H O O2-2 Şekil 12. Biyolojik sistemlerde ROS lere karşı oluşturulan antioksidan savunmanın gelişimi. Biyolojik sistemlerde antioksidanlar aşağıdaki şekillerde etkilerini göstermektedir 104 : a. Toplayıcı etki; serbest oksijen radikallerini etkileyerek onları tutma veya reaktif olmayan yeni bir moleküle çevirme işlemidir. b. Bastırıcı etki; serbest oksijen radikalleri ile etkileşip, onlara bir hidrojen vererek, aktivitelerini azaltma veya inaktif şekle dönüştürme işlemidir. c. Onarıcı etki; özellikle DNA daki hasarların tamir edilmesinde bu etki devamlı geçerlidir. d. Zincir kırıcı etki; serbest oksijen radikallerini kendilerine bağlayarak zincirlerini kırıp, fonksiyonlarını engelleme şeklinde gösterdikleri etkidir.

40 Antioksidanlar vücutta sentezlenebildiği gibi diyet ile dışarıdan da alınabilirler. Canlılarda antioksidan savunma sistemi iki ana gruba ayrılır. Bunlar; metabolizmada üretilen (endojen) ve dışarıdan diyet ile alınan (ekzojen) antioksidan sistemlerdir. 2.12.1. Endojen (Doğal) Antioksidanlar Endojen antioksidan sistemi, antioksidan enzimler, hasarlı molekülleri uzaklaştırıcı proteazlar ve fosfolipaz gibi enzimler, yeni bileşikleri sentezleyen sistemler, glutatyon, ürik asit ve çeşitli metal bağlayıcılarından oluşmaktadır. Enzim yapısında olan endojen antioksidanlar, radikal ve reaktifleri gidererek oluşabilecek oksidadif hasarları giderirler 100. Tablo 4. Bazı antioksidanlar Antioksidan enzimler Süperoksit dismutaz Katalaz Süperoksit redüktaz Peroksiredoksinler Peroksidazlar Glutatyon redüktaz Glutatyon S-transferaz Enzim yapısında olmayan antioksidanlar A Vitamini ( -Karoten) C Vitamini (Askorbik asit) E Vitamini ( -Tokoferol) Proteinler (transferin, ferritin, albumin, bilirubin) Hormonlar (serotonin, melatonin) Fenolik bileşikler (polifenoller, flavonoitler) Lipoik asit, ürik asit, glutatyon Bu mekanizmalar, birbirinden bağımsız veya bir arada işleyebilmektedirler. 1. Oksijen ile reaksiyona girerek ya da onun yerini alarak lokal oksijen konsantrasyonunu azaltabilirler. 2. Hidroksil (OH. ) radikali yapısında yer alan hidrojen atomları bağ oluşturabilecek yapıdaki ürünleri temizleyerek peroksidasyonun başlamasını önleyebilirler. 3. Membran lipidlerine direkt etkiyerek peroksit oluşturabilen singlet oksijenini

41 ( 1 O 2 ) baskılayabilir ya da temizleyebilirler 67. 4. Metal iyonlarını bağlamak yoluyla reaktif grupların (OH., ferril ya da Fe +2 /Fe +3 /O 2 kompleksleri gibi) ve/veya lipid peroksitlerden peroksil ve alkoksil radikallerinin oluşumunu önleyebilirler. Membranlarda LPO nun başlamasına hangi reaktif ürünlerin neden olduğu tartışılmaktadır, ancak hem başlangıç için ve hem de oluşan lipid peroksitlerinin dekompozisyonu için transisyonel metal iyonlarına ihtiyaç olduğu konusunda genel bir kanı vardır 105. 5. Peroksitleri, alkol gibi nonradikal ürünlere çevirebilirler. Örneğin; GSH-Px, peroksitleri bu yolla temizleyen bir antioksidandır 105. 6. Zinciri kırabilirler; zincir oluşumuna neden olabilen serbest radikallerle reaksiyona girebilirler ve yağ asidi zincirlerinden sürekli hidrojen iyonu salınımını önleyebilirler. Zincir kırıcı antioksidanlar için de fenoller, aromatik aminler ve en yaygın olanı α-tokoferol yer almaktadır 105. 2.12.1.1. Primer Antioksidantlar 2.12.1.1.1. Süperoksit Dismutaz (SOD) Süperoksitin, hidrojen peroksit ve moleküler oksijene dönüşümünü katalizleyen enzimdir. SOD nin aktivitesi yaş artışıyla beraber artar. Süperoksit dismutaz enziminin mitokondri ve sitozolde bulunan farklı türleri vardır. Memelilerde üç tipi vardır. Bunlar sitozolde bulunan dimerik Cu ve Zn ihtiva eden Cu-ZnSOD, extraselüler etki gösteren ECSOD ve mitokondride bulunan tetramerik Mn ihtiva eden Mn-SOD izomerlerdir. SOD nin Fe ihtiva eden izomeri Fe-SOD ise sadece mikroorganizmalarda ve bazı bitkilerde bulunmaktadır. SOD nin tüm çeşitleri süperoksitin dismutasyon reaksiyonunu katalizleyebilirler 106, 107. 2O SOD 2 2H H 2O2 O2

42 Süperoksit radikallerinin dismutasyonunu katalizleyen bu enzim ilk olarak inek eritrositlerinden saflaştırılmış ve daha sonraki çalışmalarda insan eritrositlerinde de tesbit edilmiştir. Birçok deney sisteminde çalışılan bu enzimin ksantin-ksantin oksidaz deney sistemine eklendiğinde sitokrom c nin indirgenmesini inhibe ettiği görülmüştür. Hemen hemen bütün canlılarda bulunan ve süperoksit gibi oldukça saldırgan bir radikalin etkisini ortadan kaldıran SOD nin canlılarda önemli roller üstlendiği ve yaşamsal etkiye sahip olduğu düşünülmektedir 82, 108, 109. Cu-Zn SOD; ilk kez 1969 yılında Mc Cord ve Fridovich tarafından tanımlanmıştır. Cu-Zn SOD, hayvansal hücrelerin sitozolünde yer alan enzim olup molekül ağırlığı yaklaşık olarak 32000 Daltondur. Birbirinin aynı olan iki alt üniteden meydana gelir. Her alt ünitede bir Cu atomu ve bir Zn atomu, bir zincir içi disülfür köprüsü, bir sülfidril grubu ve bir asetilenmiş terminal amino grubu bulunduğu tesbit edilmiştir 108, 110. Mn-SOD; prokaryotik hücrelerde molekül ağırlığı 40000 dalton olan, birbirinin aynı olan iki alt birimden oluşan ve enzimin alt birimi başına birer atom Mn bağlı olan enzimdir. Mitokondri dismutazı da diğer prokaryotik hücrelerdeki dismutaza benzer, ancak 80000 molekül ağırlığında tetramer yapıdadır. Mitokondri ve diğer prokaryotların dismutazlarının pek çok ortak özelliği primer yapıları da birbirine çok benzerdir. Ancak aynı tepkimeyi katalizlemeleri dışında Mn-SOD ile Cu-Zn SOD arasında hiçbir ortak yapısal özellik yoktur 111. Bazı bakteriler birden fazla SOD içerirler. Bunlardan biri bütün prokaryotlarda bulunan Mn-SOD olup, hücre sitoplazmasında bulunur. Bazı bakteriler periplazmik bölgelerinde demir içeren bir SOD (FeSOD) bulundurur 112. Serbest radikallerin oluşturduğu yıkıcı etkinin önlenmesinde SOD enziminin katalaz enzimi ile birlikte incelenmesi gerektiği ve hatta iki enzimin bir kompleks haline

43 getirilip fenton reaksiyonu sonucu oluşan radikallerin giderilmesinde daha etkili olacağı düşünülmektedir. Çünkü SOD ile katalizlenen tepkime sonunda oluşan hidrojen peroksit oksijenin toksik türlerinden biridir ve katalaz tarafından birikimi önlenmektedir 113-115. 2.12.1.1.2. Katalaz (CAT) Katalaz, tüm canlı hücre tiplerinde değişik konsantrasyonlarda bulunan, molekül ağırlığı 248000 Dalton olan ve her bir alt grubu 60000 Dalton ağırlığında olan dört tane alt grup içeren enzimdir. Bu enzimin en önemli görevi hidrojen peroksiti moleküler oksijen ve suya katalizlemektir 116, 117. 2H 2 O 2 CAT 2H 2 O + O 2 Katalaz enzimi daha çok peroksizomlarda lokalizedir. CAT ın indirgeyici aktivitesi hidrojen peroksit ile metil, etil hidroperoksitleri gibi küçük moleküllere karşıdır. Büyük moleküllü lipid hidroperoksitlerine etki etmez. Kan, kemik iliği, mukoz membranlar, karaciğer ve böbreklerde yüksek miktarda bulunmaktadır 68, 118, 119. 2.12.1.1.3. Glutatyon Peroksidaz (GPx) Hücrelerde oluşan hidroperoksitlerin uzaklaştırılmasından sorumlu olan bir enzimdir. Molekül ağırlığı ise yaklaşık olarak 85000 Dalton dur. Birbirinin aynı dört subünitten oluşan tetramerik bir enzimdir. Her subünit bir selenyum atomu içerir. Bu nedenle hücreleri çeşitli hasarlara karşı koruyan bir selenoenzim olduğu düşünülmektedir 120-123. Enzim aktivitesinin % 60-75 i ökaryot hücrelerin sitoplazmasında bulunur. % 25-40 ı ise mitokondridedir. GPx, intrasellüler mesafede lipidleri peroksidasyondan koruyan en önemli enzimdir. Bu nedenle hücrenin özellikle sitozolik kompartmanında

44 yer alan bu enzim hücrenin yapısını ve fonksiyonunu korur 124, 125. GPx, aşağıdaki reaksiyonları katalizler 120, 126. H 2 O 2 + 2GSH GPx GSSG + H 2 O ROOH + 2GSH GPx GSSG + ROH + H 2 O Membran fosfolipid hidroperoksitlerini alkole indirgeyen fosfolipid hidroperoksit glutatyon peroksidaz (PLGPx) da selenyum atomu içerir ve monomerik yapıdadır. Ayrıca sitozolik bir enzimdir. Membrana bağlı antioksidan olan vitamin E nin yetersiz olduğu durumlarda GPx membranın peroksidasyonuna karşı korunmasını sağlar 127, 128. H 2 O 2 + 2GSH PLGPx GSSG + H 2 O ROOH + 2GSH GPx GSSG + ROH + H 2 O PLOOH + 2GSH PLGPx GSSG + PLOH + H 2 O Hidroperoksitlerin redükte olması ile meydana gelen okside glutatyon (GSSG), glutatyon redüktazı (GR) katalizlediği reaksiyon ile tekrar glutatyon (GSH) a dönüşür. GSSG + NADPH + H + GR 2GSH + NADP. GPx ın, hücredeki dağılımı, GR a bağımlıdır. Her iki enzim de sitozolde en yüksek konsantrasyonlarda bulunur 128. 2.12.1.1.4. Glutatyon S-Transferaz (GST) Selenyuma bağlı olmayan GPx olarak adlandırılır. GST ler, sisteinin sülfür atomu üzerinden çeşitli elektrofillere glutatyonu aktaran proteinlerdir. E.coli den insana kadar çok çeşitli türlerden GST saflaştırılabilirken en çok da sıçan karaciğerinden saflaştırılmıştır 129.

45 GST ler başta araşidonik ve lineolat hidroperoksitleri olmak üzere LPO lara karşı Se-bağımsız GSH peroksidaz aktivitesi koruyucu mekanizma oluştururlar 74. GST ler antioksidan aktivitelerine ilave olarak çok önemli biyokimyasal fonksiyonlara da sahiptirler. Katalitik ve katalitik olmayan çok sayıda fonksiyona sahip GST lerin tüm canlı hücrelerde bulunması hayati önemlerinin bir göstergesidir. Hem detoksifikasyon yaparlar, hem de hücre içi bağlayıcı ve taşıyıcı rolleri vardır. Katalitik olarak, yabancı maddeleri glutatyonda ki sisteine ait -SH grubu ile bağlayarak onların elektrofilik bölgelerini nötralize eder ve ürünün daha fazla suda çözünür hale gelmesini sağlarlar. Oluşan bu GSH konjugatları böylece organizmadan atılabilir ve daha ileri bir ürüne metabolize olabilirler. GSH dan glutamat ve glisinin koparılmasından sonra sisteinin serbest amino grubu asetillenerek merkaptürik asitlere dönüştürülür 74. ROOH + 2GSH GST GSSG + ROH + H 2 O 2.12.1.1.5. Glutatyon Redüktaz (GR) Glutatyon redüktaz 50.000 daltonluk alt birimlere sahip bir dimerdir. Görevi yükseltgenmiş glutatyonu (GSSG) indirgenmiş (GSH) hale çevirmektir. Bu indirgenme işlemi sırasında NADPH dan gelen elektronlar okside glutatyonun disülfid bağına direkt olarak transfer edilemezler. Sıklıkla önce NADPH dan sıkıca bağlı bulunan Fenil adenin difosfat (FAD) a transfer edilirler. Daha sonraki alt birimlerdeki 2 sistein arasında bulunan disülfid köprüsüne transfer edilmek suretiyle okside glutatyona aktarılmış olurlar. Her bir subunit 3 tane yapısal alan içerir, bunlar: FAD bağlayıcı olan, NADPH bağlayıcı olan ve ara yüz alanıdır. FAD alanı ve NADP + alanı birbirine benzer ve diğer dehidrojenazlardaki nükleotid bağlayıcı alanlara benzerler. FAD ve NADP + nin izoalloksozin ve nikotinamid halkaları birbirine geçecek şekilde geniş ölçüde

46 aralarında bağlanırlar. Oksidize glutatyon için bağlayıcı alanın bir alt biriminin FAD alanı ile diğer alt birimin ara yüz alanından meydana gelmektedir 130. GSSG + NADPH + H + GR 2GSH + NADP + Alyuvarlardaki pentoz fosfat yolu ise, GR nin yükseltgenmiş glutatyonu indirgenmiş glutatyona çevrilmesi için gereken NADPH ı sağlamaktadır 131. 2.12.1.1.6. Miyeloperoksidaz (MPx) Nötrofil granüllerde bol mitarda bulunan MPx enzimi H 2 O 2 den hipoklorik asit (HOCl) oluşturmak üzere etki eder. Asidik ph oluşumuna bağlı olarak MPx aktivitesi artmakta ve membranı kolayca geçen H 2 O 2 bakteriye toksik etki yapmakta ya da hidroksil (OH. ) radikaline dönüşmektedir. Bu tepkimede HOCl yer almaktadır. H 2 O 2 ile MPx Cl - iyonlarını HOCl ye dönüştürmektedir. Çok reaktif olan HOCl birçok biyolojik molekülü oksitlemektedir 131, 132. H 2 O 2 + Cl - + H + HOCl + H 2 O HOCl + O 2.- O 2 + OH. + Cl - 2.12.1.2. Sekonder Antioksidanlar 2.12.1.2.1. Glutatyon (GSH) GSH, birçok hücrede bulunur ve bir tripeptiddir. GSH L-glutamat, L-sistein ve glisinden iki basamakta sentezlenir. Oluşan her peptid bağı için bir molekül ATP harcanır. Glutatyon un molekül yapısı;

47 L-Glutamat + L-Sistein + ATP -Glutamil sistein + Glisin +ATP -Glutamilsistein sentetaz Glutatyon sentetaz -Glutamil sistein + ADP +P i GSH + ADP + P i GSH, hemoglobin ve diğer eritrosit proteinlerinde bulunan sistein rezidülerini indirgenmiş halde tutarak sülfhidril tamponu görevini görür. Eritrosit hücrelerinde GSH/GSSG oranı yaklaşık 500 dür. İndirgenmiş glutatyon yani GSH, aktif bölgesinde selenyum iz elementini içeren bir enzim olan GPx enzimi katalizörlüğünde H 2 O 2 ve organik peroksitlerle reaksiyona girerek antioksidan etki sergiler ve H 2 O 2 yi alyuvarlardan uzaklaştırır. H 2 O 2 birikmesi hemoglobinin methemoglobine oksidasyon hızını artırarak alyuvarların yaşama süresini azaltabildiğinden bu tepkime çok önemlidir. Ayrıca alyuvarlarda hemoglobinin methemoglobine otooksidasyonu ile süperoksit oluşurken diğer dokularda ise bu sitokrom P-450 redüktaz ve ksantin oksidaz gibi enzimlerle oluşur 131, 133, 134. GSH, hidrojen peroksidi veya organik oksitleri kimyasal olarak detoksifiye edebilir. GSH yi peptid bağından dolayı düşük enerjili bileşikler arasında kabul edebiliriz. GSH, hücre proteinlerini indirgemiş şekilde tutan disülfit-sülfidril değişimi tepkimelerinde etki gösterir. Belirli oksidaz tepkimeleriyle oluşan hidrojen peroksidi uzaklaştıran enzim GPx e substratlık yaparak proteinlerin sülfidril gruplarını da korur. GSH yokluğunda hidrojen peroksit birikir. GSSG, GR tarafından sürekli GSH ye indirgenerek GSH miktarı düzenlenir 135. Moleküler oksijenden türeyen oksidatif radikaller iki mekanizmayla uzaklaştırılır. Birincisi, toksik radikallerin enzimatik inaktivasyonudur. Örneğin GPx ve CAT, reaktif oksijen ara ürünlerini suya indirger. İkinci mekanizma ise oksijen radikallerini kimyasal

48 olarak inaktive eden askorbik asit, α-tokoferol ve ß-karoten gibi diyetle alınan antioksidantlarla ilgilidir 109, 136. Birçok enzimin şayet sistein tiyol grubu ( SH) oksitlenecek olursa enzim inaktive ya da inhibe olur. GSH, γ-glutamilsisteinilglisin, duyarlı ve esansiyel SH gruplarını içeren enzimlerin doğal aktivatörüdür. Glutatyon hücrede bir ko-enzimden ziyade var olan amino asit öncüllerinden kolayca sentezlenen doğal bir antioksidandır. Fenilalanin ve tirozinin oksidatif yıkımında görev alan maleilasetoasetat izomeraz da dahil olmak üzere glutatyon çok az sayıda enzim için spesifik bir koenzimdir. Glutatyonun hücre içi derişimi kontrol edilerek birçok enzimin aktivitesi düzenlenebilir 135. 2.12.1.2.2. Diğer Sekonder Antioksidantlar Canlı vücudunda oldukça az miktarlarda bulunmasına rağmen vitaminlerin vücuttaki görevleri oldukça fazladır. Vitaminlerin bir bölümü, besinlerle aldığımız karbonhidrat, yağ ve proteinden enerji ve hücrelerin oluşması ile ilgili biyokimyasal olayların düzenlenmesine yardımcı olurlar. A, E ve C vitaminleri vücut hücrelerinde serbest radikallerin meydana getirebileceği hasarları önleyerek hücrelerin normal işlevlerini sürdürmelerinde ve bazı zararlı maddelerin etkilerinin azaltılmasında (antioksidan etki) yardımcı olurlar. Antioksidanlar, hücremizi, serbest radikalleri nötürleştirerek korurlar. Bunlar uyum içerisinde çalışan bir takım gibi radikalik saldırılara karşı koyarlar. ß-Karotenin, askorbik asitin ve tokoferolün (E vitamini) antioksidant etkileri yıllardan beri bilinmektedir. ß-Karoten organizmada A vitaminin parsiyal oksijen öncülü olmasının yanı sıra bir antioksidant olarak görev yapar. Bununla beraber, 15 torr da 150 torr dan daha iyi antioksidant olduğu, 760 torr da ise prooksidan olarak davrandığı bildirilmiştir. Hücrelerin dışında ß-Karoten nöbet tutarken; hücre

49 duvarından içeri girmek isteyen saldırganlara karşı savunmayı ise eser elementlerden selenyumun da yardımıyla E vitamini üstlenmiştir 60, 137. Suda çözünen vitaminlerden birisi olan askorbik asit yapı itibariyle en basit vitaminlerden biridir. Bir şeker asidinin laktonundan ibarettir. Yüksek yapılı hayvanların pek çoğu ve bitkiler kolayca askorbik asidi glukozdan sentezleyebilmektedirler. Hücre içerisindeki C vitamini serbest radikallere son darbeyi vurmakta ve bu şekilde radikallerin tesirlerini ortadan kaldırmaya çalışmaktadır. E vitamini yağda çözünen bir vitamin olup temel görevi lipitleri oksidatif hasardan korumaktır. İnce barsaklardan kolayca emilir ve vücudun tüm dokularına taşınarak hücre membranları etrafında depolanır. Böylece hücre membranında koruyucu bir tabaka oluştururlar 60, 82, 109, 138, 139. 2.12.2. Eksojen Antioksidanlar 2.12.2.1. Lipit Fazda Bulunanlar 2.12.2.1.1. E vitamini: E vitaminleri 8 adet dogal olarak mevcut tokoferollerdir. Tokoferoller içersinde biyolojik açıdan en önemli olanı α-tokoferoldür. Tokoferoller, gıda maddelerinin bozulmasını engelleyen ve uzun ömürlü olmalarında rol oynayan önemli bir doğal antioksidan guruptur 140. Mitokondri membranında yaklaşık 2000 fosfolipid başına bir α-tokoferol bulunmaktadır. E vitamini eksikliğinde birçok canlıda bazı olumsuz etkiler görülmüştür. Bu etkiler ise ekzojen antioksidanlar tarafından tolere edilmektedir. Bu durum, E vitamininin in vivo olarak lipit peroksidasyonunu önleyici bir rol üstlendiğini göstermektedir 81. 2.12.2.1.2. Karotenoidler ve Retinol: Bitkilerde karotenoidler, hayvanlarda ise retinol esteri bulunur. Isıya dayanıksızdırlar. Et, balık, karaciger, havuç, domates, yeşil yapraklı bitkiler, portakal gibi narenciyelerde bol miktarda bulunur. Retinol

50 bagırsaklardan tamamen emilmesine rağmen karotenoitlerin yaklasik 1/3 kadarı absorbe edilir 141. Karotenoidlerden başlıcası, A vitaminin öncül maddesi olan betakarotendir. Beta-karotenin singlet oksijeni baskılama, süperoksit radikalini temizleme özelliklerine ek olarak peroksit radikali ile etkileşerek antioksidan etki gösterdiği belirlenmiştir. Antikanserojenik ve antiarterosklerotik olduğu gösterilmiştir 142, 143. 2.12.2.1.3. Ubikinonlar: Lipitlerde çözünen ve izoprenoid içeren kinon türevleridir. Soya yağı, et, balık gibi besinlerde ve bazı sebzelerde bulunur. Indirgenmiş şekilleri olan ubikinoller, ubikinonlara kiyasla antioksidan olarak çok daha etkilidirler. İnsanda bulunan temel ubikinon, koenzim-q dur. Esas görevi olan solunum zincirindeki redoks taşıyıcılığının yanında, oksijen kaynaklı radikaller ve tekil oksijen ile etkileşerek lipit peroksidasyonunun başlamasını ve biyomoleküllerin hasar görmesini engeller 142. 2.12.2.1.4. Flavonoidler: Bitkilerdeki kırmızı, sarı ve mavi renk pigmentlerini, oluşturan polifenollerdir. Başlıca; elma, portakal, limon gibi meyveler; patates, karnabahar gibi sebzelerde bulunur. Çay gibi bitkisel kaynaklı içeceklerde yer alırlar. Flavonoidlerin farklı yollarla lipit peroksidasyonunu engellediği belirlenmiştir. 1. Peroksidasyonu başlatan radikalleri tutar. 2. Metal iyonlarını bağlar. 3. Radikal oluşturucu enzimleri inhibe eder. Ancak bazı flavonoitlerin metal iyonlarıyla bağlanarak pro-oksidan etki yaptığı saptanmıştır 143. 2.12.2.1.5. Melatonin: En zararlı radikallerden hidroksil radikalini ortadan kaldıran güçlü bir antioksidandır. Melatonin hidroksil radikalleri ile reaksiyona girdikten sonra indolil katyon radikaline dönüştüğü ve bu radikallerinde süperoksit radikalini tutarak antioksidan etki yaptığı bildirilmiştir. Diğer bir önemli bir özelliği de lipofilik

51 olmasıdır. Böylece hücrenin bütün önemli organellerine ve çekirdeğine ulaşabildiği gibi kan-beyin engelini de kolayca geçer. Melatonin in yüksek dozda ve uzun süreli kullanımında bile toksik etkisi görülmemiştir. Ayrıca bazı antioksidanlarda bulunan prooksidan aktivitesin de yoktur 143. 2.12.2.1.6. Bilirubin: Ankonjuge bilirubin, dolaşımda albümine bağlanır ve albümine bağlı yağ asitlerini lipit peroksidasyona karşı korur 105. 2.12.2.2. Sıvı Fazda Bulunanlar 2.12.2.2.1. C Vitamini (Askorbik Asit): Suda eriyen güçlü bir antioksidandır. İnce bağırsakta kolayca emilir. C vitamini ısı, ışık, bakır varlığı ve özellikle alkali ortamlarda kolaylıkla okside olur. Arterioskleroz, iskemik kalp hastalığı ve kansere karşı koruyucu etkisi olduğunu gösteren çalışmalar vardır. Süperoksit ve hidroksil radikali ile kolayca reaksiyona girer ve ortamdan uzaklaştırır. Tokoferoksil radikalinin alfa-tokoferole redüklenmesini sağlar. Süperoksit radikali gibi feri demiri ferro demire indirgeyen ikinci bir sellüler ajandır. Bu nedenle peroksidan olarak değerlendirilir ve antikanserojen etkisi gösterilmiştir 144. 2.12.2.2.2. Ürik Asit: Normal plazma konsantrasyonunda hidroksil, süperoksit, peroksi radikallerini ve singlet oksijeni temizler, bakır ve demir iyonlarıyla oluşan oksidasyona karşı şelat yaparak C vitaminin oksidasyonunu engeller 70. Hemoglobin ve eritrositleri peroksidatif hasara karşı korur 145. 2.12.2.2.3. Transferrin: Vücutta demir taşıyan proteindir. Bağlı demir, hidroksil radikali oluşumunu veya lipit peroksidasyonunda rol almamaktadır 105, 1 4 2. 2.12.2.2.4. Ferritin: Dokuda demir bağlar. 2.12.2.2.5. Albumin: Plazmanın zincir kırıcı antioksidan aktivitesine yol açan plazma

52 sülfidril gruplarının komponentidir. Plazmada hipokloröz asidin güçlü bir temizleyicisidir 146. 2.12.2.2.6. Glutatyon: Glutamik asit, sistein ve glisin amino asitlerinden oluşmustur. -SH gruplarını redükte halde tutarak, fonksiyonel protein ve enzimlerin inaktivasyonunu engeller 142. 2.13. Botanik Bilgiler 2.13.1. Olea europae L. nin Bilimsel Sınıflandırılması ve Binominal Adı; Alem: Plantae Bölüm: Magnoliophyta Sınıf: Magnoliopsida Takım: Lamiales Familya: Oleaceae Cins: Olea Tür: O. Europae Binomina adı: Olea europaea L. 2.13.2. Olea europaea L nin Genel Özellikleri Zeytin (Olea europae), zeytingiller (Oleaceae) familyasından meyvesi yenen, sık dallı, yayvan tepeli, devamlı yeşil yapraklı narin bir ağaçtır. Geniş, kıvrımlı, yamru yumru bir gövdesi vardır. Ağaç yaşlandıkça, düzgün gri renkli gövde kabuğu giderek çatlar. Ağacın tacı (tepesi), yaklaşık olarak artan boy kadar her sene genişler. Ağır ve zahmetli büyümesine karşın oldukça uzun ömürlüdür. Bir zeytin ağacının ortalama ömrü 300-400 yıldır, ancak 3 bin yaşında zeytin ağaçlarına da rastlanmıştır. Bu nedenle zeytin ağacının adı mitoloji ve botanikte ölümsüz ağaç tır. Verimli topraklarda taç;

53 açık ve asimetrik, verimsiz topraklarda ise daha yoğun ve yuvarlaktır. Sürgünleri gri renkli, dikensiz ve hemen hemen üç köşelidir 147. Derinlere uzanan kökleri sayesinde kalkerli, çakıllı, taşlı ve kurak topraklarda yetiştirilmeye elverişli olan zeytin ağacı için en verimli ortam yazları sıcak, kışları ise ılıman geçen iklimlerdir. Çünkü zeytin ağacı; ışığı, güneşi ve 15 C üstündeki sıcaklığı sever. Yıllık ortalama 220 mm yağış, zeytin ağacının verimli bir şekilde büyümesi için yeterlidir. Zeytin ağacı genellikle rakımı düşük coğrafyalarda yetişir. Ancak denizden 1000 metre yükseklikte de zeytin tarımı yapılabilmektedir. Ortalama 40-50 cm genişliğindeki gövde çürümeye karşı çok dayanaklıdır. Ağaç yaşlanınca yamrulardan gelişen yeni uçlar gövdeyi tazeler. Çalı görünümündeki zeytin ağacının yapraklarının üst yüzü koyu, alt yüzü ise gümüş rengindedir. Yapraklar mükemmel bir düzen içinde dalın iki tarafından karşılıklı olarak çıkar. Mızraksı, çok kısa saplı, deri gibi sert yaprakları sürgünlere karşılıklı çiftler halinde dizilmiştir. Yaprakları basit, tam kenarlı ve kenarlar alt yüze doğru hafif kıvrıktır. Yaprağın boyu 20-86 mm, genişliği de 5-17 mm dir. Yaprakların ucunda sivri bir çıkıntı bulunur. Yaprağın üst yüzü koyu gri-yeşil ve tüysüz, alt yüzü mavimsi gümüşi renkte ve beyaz sık ipeksi tüylerle kaplıdır 148. Zeytin meyvesi ve yağının antioksidan aktivitesi ve kimyasal kompozisyonunun incelendiği çok sayıda çalışma bulunmaktadır 149-151. Fakat zeytin yaprağında bulunan bazı bileşenlerin izolasyonu, tanımlanması ve antioksidan aktivitesinin saptanması ile ilgili çok az sayıda çalışma bulunmaktadır. Zeytin yaprağı başlıca flavonoidler, sekoiridoitler ve triterpenler olmak üzere üç farklı etkili madde grubuna ait bileşikleri içerir. Ayrıca kolin de mevcuttur. Triterpenlerin oranı % 3-4 kadar olup en çok bilinen; oleonik, krataegolik asitler, homoolestranol ile bunların glikozitleridir. En önemli etkili madde oleuroperozit

54 (oleuroperoside) adıyla bilinen bir sekoiridoit glikozittir. Yaprakta bulunan fenolik ve flavonait bileşikler vücudun bağışıklık sistemini güçlendirip hastalıklara karşı dirençli olmasını sağlar 152. Bunların dışında hastalık ve zararlılara karşı direnç kazandıran "oleuropein" adlı bir madde ürettiklerinden zeytin ağaçları dünyadaki en dayanıklı ve uzun ömürlü ağaçlardandır. Zeytin ağacının tamamında bulunan ve acı-buruk bir tadı olan oleuropein, zeytinin işlenmesi sırasında uzaklaştırılır. Oysaki zeytin ağacının hastalık ve zararlılara karşı direncini sağlayan en önemli savaşçının oleuropein olduğu düşünülmektedir. Oleuropein'in içeriğinde bulunan "elenolik asit" ve oleuropein türevi olan "kalsiyum elenolat" çok çeşitli mikroorganizma gruplarını uzak tutma özelliğine sahiptir. Yaprakta 60-90 mg/g oranında oleuropein bileşiği bulunmaktadır. Oleuropein yaprağın en etken fenolik bileşiğidir. Bu bileşik aynı zamanda terapötik etkiye sahip sekoiridoit bir glikozitdir. Zeytin yaprağı çay ya da ekstrakt formunda alındığında oleuropein insan vücudunda bulunan iki enzim tarafından (esteraz ve beta glukozidaz) elenoik aside dönüştürülür. Bu bileşik güçlü bir antibakteriyal etkiye sahiptir, özellikle patojen bakteriler üzerinde öldürücü bir etki yapar 153. 2.13.2.1. Olea europaea L nin Antioksidan Aktivitesi Reaktif oksijen ve nitrojen türleri; detoksifikasyon, kimyasal sinyalizasyon, enerji gereksinimi ve bağışıklık fonksiyonları için gereklidir. Onlar sürekli olarak insan vücudunda üretilir ve SOD, GPx ve CAT gibi endojen enzimler tarafından kontrol edilir. Bu reaktif türlerin aşırı bir üretim olursa, dış oksidant maddelere maruz kalma ya da savunma mekanizmasında anormal bir durum ve çeşitli biyomoleküllerde (DNA, lipidler, proteinler) hasar meydana gelebilir. Bu hasar kardiovaskular, kanser ve diğer kronik hastalıkların artan riskiyle ilgilidir. Antioksidanlar bu hasarı önlerken, aynı zamanda diyetle alınan antioksidanların artışı kronik hastalıkların riskini düşürür.

55 Kardiovaskular hastalıklara ve belli kanserlere karşı sebze ve meyvelerdeki zengin diyetlerin koruyucu etkileri kısmi olarak antioksidanlara bağlıdır 154. 2.13.2.2. Olea europaea L nin Fenolik Madde İçeriği Yapılan çalışmalarda zeytin yaprağı ekstraktında bulunan temel fenolik maddelerin oleuropein ve onu takiben hidroksitirosol olduğu belirlenmiştir 154. Zeytin yaprağı ekstraktında belirleyici fenolik maddenin oleuropein olmasına rağmen oluropeinin saf haldeki antioksidan kapasitesi sınırlıdır. Ancak zeytin yaprağı ekstraktının antioksidan kapasitesi güçlü bir antioksidan olan hidroksitirosol ile yakın, C ve E vitamininden ise çok daha yüksek düzeydedir. Bu durum iki farklı şekilde açıklanabilir 154, 155 ; 1.Oleuropein ekstrakt içerisinde kendisinden çok daha güçlü olan hidroksitirosole parçalanmaktadır ve ekstraktın toplam antioksidan kapasitesini yükseltmektedir. 2.Ekstrakt içerisindeki fenolik maddeler sinerjistik etki göstermektedir.

56 Zeytin yaprağındaki bazı fenolik bileşenler ve kimyasal formülleri tablo 5 te ve miktarları ise tablo 6 da gösterilmiştir 155. Tablo 5. Zeytin yaprağındaki bazı fenolik bileşenler ve kimyasal formülleri Fenolik bileşen Kimyasal formül Oleuropein Hidroksitirosol Verbaskosid Apigenin-7-glukosit Luteolin-7-glucosit

57 Tablo 6. Zeytin yaprağı ekstraktında bulunan fenolik maddelerin miktarları. Zeytin yaprağının fenolik madde içeriği zeytin ağacının türüne, zeytin yaprağının olgunluğuna, yaprağın hasat dönemine kadar geçirdiği evrelere bağlı olarak değişmektedir. İtalya da yetiştirilmekte olan 7 farklı ağaç tipinde, 2 farklı dönemde zeytin yaprakları hasat edilmiş ve fenolik maddelerin değişimini incelenmiştir. Çalışmanın sonucunda; oleuropein içeriğinin temel olarak genetik faktörlere bağlı değiştiği, yani ağaç tipinin etkili olduğu, genç yapraklarda oleuropein içeriğinin daha fazla olduğu ve mart ayında yapılan hasattaki oleuropein miktarının ekim ayındaki hasattan biraz daha yüksek olduğu belirlenmiştir 156.

58 2.13.2.2.1. Oleuropein Zeytin meyvesinin ilk dönemlerinde meyvede daha fazla bulunan, olgunlaşmanın ilerlemesi ile zamanla metabolize olarak miktarı azalan ve meyveye acılık veren bir maddedir 157-160. Zeytin yaprağında en çok bulunan biyoaktif bileşik oleuropein ve 156, 161- rutindir. Oleuropein doğada en yoğun olarak zeytin yapraklarında bulunmaktadır 163. Oleuropein ilk kez 1908 yılında Bourquelot ve Vintilesco tarafından tespit edilmiştir 154. Yapısı ise 1960 yılında tanımlanabilmiştir 164. Oleuropein molekülünün kimyasal yapısı şekil 13 te gösterilmiştir 154, 155. Şekil 13. Oleuropein molekülünün kimyasal yapısı Oleuropein antioksidan kapasitesinin yüksek olduğu bilinmektedir. Ortodifenolik yani kateşolik yapıya sahip moleküllerin antioksidan kapasitesi yüksektir ve oleuropeinde de antioksidan kapasitenin yüksekliğinin temel nedeni kimyasal yapısında bulunan o-dihidroksi grubudur 154. Önemli bir başka nokta ise E vitamininin indirgeyemediği süperoksit anyonlarını indirgeyebilmesidir. Bundan dolayı oleuropein sadece tıp, ilaç ve kozmetikle ilgili önemli çalışmaların konusu olmamakta, aynı

59 zamanda gıda ile ilgili çalışmalar da yapılmakta ve özellikle yüksek düzeyde O 2 ye maruz kalan gıda ürünlerinde kullanılabilecek doğal bir katkı maddesi olma potansiyeli taşımaktadır 156. Oleuropeinin kendisi insan vücudunda direkt emilememekte, ancak sindirim sisteminde parçalandıktan sonra emilebilmektedir. Buna karşın insan vücuduna giren oleuropein vücutta tamamen hidroksitirosole ve diğer alt ürünlere metabolize olduğu, insan plazmasında ve dışkısında bulunmadığı bilinmektedir 165. Oleuropein 166-168 ; Antimikrobiyal Antioksidatif Antiatherojenik Yüksek antioksidan potansiyeli Hipotansif aktivitesi (Kan basıncını düşürücü) Antienflamatuvar etkisi (5- lipoksigenaz enzimini inhibe ederek) Kardiyopropektif (LDL oksidasyonu inhibisyonu ve trombosit-kan hücresi aggregasyonu) Hipoglisemik (Kan şekeri düşürücü) Antihipertansif (Vasodilatator-hipertansiyon tedavisinde kullanılan ilaçlar) Antiviral (HIV vrüsüne karşı etkili) Stostatik (McCoy hücrelerine karşı) Mollusisidal (Salyangozlara karşı olan toksik etki) Endokrinal-hormonal Enzim modülatörü.

60 Oleuropein ile ilgili bileşiklerin kimyasal yapıları şekil 14 te gösterilmiştir 156. Şekil 14. Oleuropein ile ilgili bileşiklerin kimyasal yapıları Oleuropein, ß-glikozidaz enzimi ile glukoz ve oleuropein aglukonuna parçalanır. Hidroliz sonucu oluşan hidroksitirosol yüksek biyoaktif fenolik moleküldür. Ortamdaki aglikon yapısı açılan elenolik halkasına girer ve dekarboksilasyon, metilasyon ve oksidasyon gibi tepkimelerin artmasını sağlayarak yeni fenil aglikon yapılarını oluşturur 164, 169. Enzimatik hidroliz yönteminde oleuropein ß-glikozidaz enzim aktivitesiyle glikoz ve oleuropein aglikona parçalandıktan sonra esteraz enziminin etkisiyle hidroksitirosol ve elenolik asit oluşmaktadır. Oleuropein ß-glikozidaz enzimi ile hidrolizi şekil 15 te gösterilmektedir 170.

61. Şekil 15. Oleuropein ß-glikozidaz enzimi ile hidrolizi. 2.13.2.2.1.1. Oleuropeinin Antimikrobiyel Etkisi Mikrobiyel gelişmeyi kontrol altına almak amacıyla kullanılan katı maddeler, antimikrobiyel olarak adlandırılmaktadır. Ancak son yıllarda bu amaçla kullanılan sentetik kökenli maddelerin insan vücudunda istenmeyen ve beklenmedik yan etkiler oluşturmasının yanı sıra, mikroorganizmaların bunlara karşı direnç kazanması alternatif olarak doğal antimikrobiyel maddelerin arayışına neden olmuştur 160. Doğal antimikrobiyel maddeler arasında gösterilen oleuropeinin, mikroorganizmaların gelişme hızını geciktirdiği ve inhibe ettiği bilinmektedir 160, 171-173. Bu konuda yapılan birçok çalışmada fenolik glikozit oleuropein ve parçalanma ürünlerinin Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumonie, Lactobacillus plantarum, Moraxella catarrhalis, Pseudomonas fragi, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Staphylococcus carnosus, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Vibrio alginolyticus ve küfler üzerinde inhibe edici etkisinin olduğu ileri sürülmektedir 153, 174-177.

62 Oleuropeinin biyosentezi şekil 16 da gösterilmiştir 178 ; Şekil 16. Oleaceae familyasına ait bitkilerde oleuropeinin biyosentezi.

63 2.13.2.2.2. Hidroksitirosol Hidroksitirosol, oleuropeinin kateşol yan ürünüdür ve sekoiridoid gruba sahiptir. Zeytin yaprakları veya zeytin olgunlaştıkça ya da işlem gördükçe veya depolandıkça bileşimlerindeki oleuropein miktarı azalırken hidroksitirosol miktarı artar. Hidroksitirosol, fenil alkol içeren hidrofilik ekstrakttır. Hidroksitirosol (3,4-dihidroksifenil etanol) molekülünün kimyasal yapısı şekil 17 de gösterilmektedir 154. Şekil 17. Hidroksitirosol (3,4-dihidroksifenil etanol) molekülünün kimyasal yapısı. Hidroksitirosolün emilimi bağırsaklarda gerçekleşmektedir. Bu emilimin pasif difüzyon mekanizmasıyla gerçekleştiği ve tamamının bağırsaklarda emildiği belirlenmiştir 179. Hidroksitirosol 180, 181 ; Antimikrobiyal Antioksidatif İnsan eritrositlerini oksidatif zararlara karşı koruyucu İnsan promonosit hücrelerinde süperoksit anyon üretimini azaltıcı Peroksinitrite bağlı oluşan zararları inhibe edici Sitokrom C ye bağlı apopostis-hücre ölümüne neden olur Tümör hücrelerinin gelişimini durdurucu 180, 181.

64 2.14. Olea europaea L. nin Farklı Kullanım Alanları Antioksidan özellikteki fenollerin fakirliği nedeniyle aşırı olgun zeytinlere yağ üretimi sırasında aromayı geliştirmek, oksidasyonu engellemek ve elde edilen zeytin yağının stabilitesini artırmak amacıyla zaman zaman % 2-3 oranında zeytin yaprağı karıştırılmaktadır 182, 183. Zeytin yaprağı ekstraktı tabletler haline getirilerek diyetetik ürünler veya gıda destek ürünleri olarak pazarlanmaktadır 184. Zeytin yapraklarından önemli miktarda (yaklaşık olarak kuru ağırlıkta % 3 kadar) oleanolik asit geri kazanımını hedefleyen çalışmalarda; oleanolik asit ilave edilmiş yağların fonksiyonel gıdaların hazırlanmasında yararlı olduğu bulunmuştur 185. Zeytinden yağ elde edilmesi sırasında zeytinle birlikte işletmeye gelen yapraklar endüstriyel olarak kullanılmamakta, yan ürün olarak ayrılarak kurutulup yakıt olarak ya da hayvan yemi olarak kulanılmaktadır 156. Yapılan başka bir çalışmada toz haline getirilmiş zeytin yapraklarının sulu ekstraktında bulunan fenolik bileşikler, HPLC/DAD kullanarak analiz edilmiş ve antimikrobiyel özellikleri incelenmiştir. Elde edilen ekstraktın farklı konsantrasyonlarının mikroorganizmalar üzerindeki inhibe edici etkisi sırasıyla; Bacillus cereus ~ Candida albicans > Escherichia coli > Staphylococcus aureus > Cryptococcus neoformans ~ Klebsiella pneumoniae ~ Pseudomonas aeruginosa > Bacillus subtilis olarak bulunmuştur 186. 2.15. Olea europaea L. nin Antidiyabetik ve Hipoglisemik Etkisi Zeytin yaprakları, antidiyabetik ve antihipertansif bir bitkisel ilaç olarak bilinir 187. Aynı zamanda diyabetik hiperglisemi, hipertansiyon ve bulaşıcı hastalıkları tedavi etmede kullanılır, hipertansiyon ve diyabet için geleneksel bir tedavi olarak

65 tanımlanır 188. Diyabette oleuropeinin hipoglisemik etkisini açıklamak için iki mekanizma ileri sürülmektedir 161. 1. Glukoz kaynaklı insülin salınımını etkileme potansiyeli 2. Periferik glukoz alınımını artırma etkisi Al Azzawie ve Alhamdani 161 alloxan ile diyabet oluşturulan tavşanlarda oleuropeinin antioksidan ve hipoglisemik etkilerini incelemişler. Tavşanlar 16 hafta boyunca oleuropein ile tedavi edilmiş. Tedaviden sonra oleuropein ile tavşanların kan glukoz seviyelerinin önemli bir şekilde azalttığı ve oleuropinin diyabet ve hipoglisemiyi engellemede faydalı olabileceğini belirtmişlerdir. Komaki ve arkadaşları 188 diyabetik ratlara yemlendikten sonra zeytin yaprağı ekstresi vererek kan glukozundaki değişmeleri incelemişler ve hem luteolin hem de alealonik asitin yemlenme sonrası diyabetik ratlardaki kan glukozunun artmasını engellediğini tespit etmişlerdir.

66 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Deney Bitkileri Bu araştırma için çalışma materyali olarak kullandığımız zeytin yaprağı, ülkemizin Doğu Karadeniz Bölgesindeki Artvin ilinin, Yusufeli ilçesinden eylül ayında toplanmıştır. 3.2. Hayvanlar Çalışmamızda Atatürk Üniversitesi Tıbbi Uygulama ve Araştırma Merkezi (ATADEM) den temin edilen ve ağırlıkları 200-215 gram arasında değişen toplam 25 adet Albino Wistar erkek sıçan kullanıldı. Hayvan deneyleri ve bakımı ATADEM de yapıldı. Hayvanlar deney öncesi gruplar halinde laboratuvarda normal oda sıcaklığında (22 o C) barındırıldı ve beslendi. Çalışmalarımızın tüm aşamaları Atatürk Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu tarafından 22.04.2009 tarih ve B.30.2.ATA.0.22.02.00-208 sayılı yazısı ile etik kurallara uygun olduğu onaylanmıştır. 3.3. Zeytin Yaprağı Ekstraktlarının Hazırlanması Doğu Kardeniz Bölgesindeki Artvin ilinin, Yusufeli ilçesinden Eylül ayında toplanan zeytin yaprakları temizlenip 25 ºC de kurutuldu. Yapraklar sıvı azot ile toz haline getirildikten sonra 31,5 o C de etanolde Soxhlet aparatürde 72 saat bekletildi, süzüldü ve evaparatürde buharlaştırıldı. Hayvanlara zeytin yaprağının etil alkol ekstreleri 0,25 ve 0,5 g/kg dozlarda hazırlandı 189. 3.4. Streptozotocin ile Diyabet Modeli 3.4.1. Streptozotocinin Yapısı ve Etki Mekanizması Formülü C 8 H 15 N 3 O olan streptozotocin moleküler ağırlığı 265,2 dalton olup, streptozocin olarak da adlandırılır. Beyaz ve açık sarı arasında değişen sarı renkli bir

67 tozdur. Anhidre olarak 115 o C de bozunur. Maddenin potansiyel kanserojen, mutajen ve toksik özelliği oldugu bilinmektedir. Donmuş olarak hava ve nemden korunarak muhafaza edilirse aynı anomerik oranı ve saflık derecesini aylarca koruyabilir. Streptozotocin; suda, alkollerde ve ketonlarda çözünür. Çözeltideki çözünenler kararsız olduğundan dolayı kullanım sırasında hazırlanmalıdır 145. Bir streptomyces türünden veya sentetik yollardan elde edilen bir antibiyotik olan streptozotocin, pankreasin beta (ß) hücrelerini selektif bir şekilde ve irreversibl olarak tahrip eder. İnsülinoma tedavisinde kullanilabilir. Belirgin hepatotoksik ve nefrotoksik etkisi nedeniyle yaygın kullanılmamaktadır. Laboratuar çalışmalarında intravenöz verilerek deneysel diyabet modeli oluşturmak için kullanılabilir. Pankreas üzerinde STZ benzeri etki gösteren alloxan da deneysel diyabet modeli oluşturmak için kullanilabilir 145. Deney hayvanlarında streptozotocinin veya alloxanın kullanılması, ß hücrelerinin tahribine, insülin üretiminin veya salgılanmasının durmasına yol açar. Çeşitli hayvan türlerinin alloxana karşı duyarlılıkları farklıdır. Mesela, sıçanlar çok duyarlı oldukları halde kobaylar nispeten duyarsızdırlar. Streptozotocin ise genelde bütün türler için etkindir 190. 3.4.2. Diyabet Oluşumu Sıçanlarda 40 mg/kg tek doz Streptozotocin çözeltisi intraperitoneal olarak uygulandı ve diyabet modeli oluşturuldu. Bu amaçla taze hazırlanan Streptozotocin ph sı 4,5 olan sitrat tamponu içindeki çözeltisi bir gece aç bırakılan sıçanların peritonuna enjekte edildi. Diyabet oluşturulmayan sıçan grubuna ise aynı miktarda sitrat tamponu çözeltisi sıçanların peritonuna enjekte edildi. Streptozotocin uygulamasına bağlı olarak pankreastan yoğun insülin salgılanmaktadır. Bundan dolayı öldürücü hipoglisemi gelişmesi olasılığı vardır. Bunu önlemek için sıçanlara streptozotocin

68 uygulamasından 4-6 saat sonra 5 ml kadar % 20 lik glukoz solüsyonu periton içi yolla uygulandı. 72 saat sonra kuyruk veninden alınan kan örnekleri Accu-Check Active kan glukoz monitörü ile değerlendirilerek sıçanların açlık kan şekeri ölçüldü. 3. günün sonunda serum glukoz seviyeleri 200 mg/dl nin üzerinde olan sıçanlar diyabetik olarak kabul edilip, deneye alındı 191. Sıçanlar 5 guruba ayrıldı. Bunlar tablo 7 de verilmektedir. Tablo 7. Deneyde yapılan tüm detaylar Deneyin Gruplar 1. günü Deneyin 2. günü Deneyin 5. günü Deneyin 18. günü Grup-I SK grup Aç bırakıldı Sitrat tamponu su + yem Tedavi yok Grup-II DG grup Aç bırakıldı Sitrat tamponunda çözünen Streptozotocin (40 mg/kg) Tedavi yok Grup-III DM+OLI grup Grup-IV DM+OLII grup Grup-V OLII grup Aç bırakıldı Aç bırakıldı Sitrat tamponunda çözünen Streptozotocin (40 mg/kg) Sitrat tamponunda çözünen Streptozotocin (40 mg/kg) Tedavi yok su + yem Zeytin yaprağı etanol ekstresi (0,25 g/kg) Zeytin yaprağı etanol ekstresi (0,5 g/kg) su + yem Zeytin yaprağı etanol ekstresi (0,5 g/kg) su + yem SG: Sağlıklı kontrol grubu, DG: Diyabetik grup, OLII: Zeytin yaprağı etanol ekstresinin 0,5 g/kg dozunu ihtiva eden kontrol grubu, DM+OLI: Zeytin yaprağı etanol ekstresinin 0,25 g/kg dozunu ihtiva eden diyabetik grup, DM+OLII: Zeytin yaprağı etanol ekstresinin 0,5 g/kg dozunu ihtiva eden diyabetik grup 3.5. İlaç Uygulaması Sağlıklı (grup 1) ve streptozotocin ile diyabet oluşturulan (grup 2) kontrol gruplarına sadece su ve yem verilirken, diğer kontrol grubuna (grup 5) 0,5 g/kg etanol ekstresi verildi. Sıçanlarda diyabet modeli oluşturulduktan sonra ekstre uygulamasına

69 geçildi. Zeytin yaprağı etanol ekstresi 14 gün boyunca intragastrik gavaj yardımıyla günde tek sefer uygulandı. Grup 3 ve grup 4 e sırasıyla 0,25 g/kg etanol ekstresi, 0,5 g/kg etanol ekstresi oral yoldan gavajla uygulandı. Ekstre uygulamasının 14. gününden sonra ratlardan intrakardiak kan örnekleri alındıktan sonra yüksek doz tiopental uygulaması sonucu ötanazi edilen tüm rat gruplarından karaciğer doku örnekleri alındı. Kan örnekleri vakumlu normal biyokimya tüplerine alındı. Oda sıcaklığında 5-10 dakika bekletildikten sonra 3500 rpm de 5 dakika santrifüj edildi. Elde edilen serum örneklerinde aspartat amino transferaz (ALT), alanin amino transferaz (AST) ve alkalen fosfataz (ALP) biyokimyasal parametrelerine Roche marka c501 otoanalizör ile spektrofotometrik olarak analiz edildi. 3.6. Karaciğer Dokularının Biyokimyasal Analizi Karaciğer dokularındaki enzim aktivitelerini ölçmek için, bu dokularından homojenatlar hazırlandı. Bu homojenatlardan elde edilen süpernatantlarda GPx, GST, SOD, MDA enzim aktiviteleri literatüre dayalı, uygun metotlar kullanılarak belirlendi. 3.6.1. Numunelerin Hazırlanması Ratların karaciğer dokularından 0,2 gramlık örnekler alındı. MDA tayini için % 1.15 lik KCI çözeltisi, SOD ve GPx tayini için % 0,9 NaCI çözeltisi, GST tayini için 1,5 N HCIO 4 çözeltisi ile 2 ml ye tamamlanarak buzlu ortamda homojenize edildi. Daha sonra +4 C de 10000 rpm de 30 dakika santrifüj edildi. Süpernatant kısmı analiz numunesi olarak kullanıldı. 3.6.2. Antioksidan Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi 3.6.2.1. Süperoksit Dismutaz (SOD) Aktivitesinin Tayini Prensip: Enzimatik reaksiyon sonucu üretilen serbest radikallerin reaksiyon ortamında bulunun nitro blue tetrazolium (NBT) u indirgemesinin numunede bulunan süperoksit

70 dismutaz (SOD, EC 1.15.1.1) enzimi tarafından engellenmesi prensibine dayanır. Süperoksit radikali üretimi ksantin oksidaz enzimatik reaksiyonu ile sağlanır. Üretilen süperoksit radikalleri NBT ile reaksiyona girerek 560 nm de absorbans veren formazon oluşturur. Reaksiyon ortamına ilave edilen numunede bulunan SOD üretilen radikalleri dismutasyona uğratır ve bundan dolayı NBT redüksiyon reaksiyonu yavaşlar ve sonuçta spektrofotometrede okunan absorbans değerleri düşer. Deneyin yapılışı: -80 o C den çıkarılan doku homojenatının önce -20 o C ye sonra +4 o C ye alınarak yavaş yavaş çözülmesi sağlandı. Sun ve arkadaşlarının 192 metoduyla SOD tayini yapıldı. Kullanılan reaktif ve değerleri tablo 8 de açıklanmıştır. Tablo 8. SOD deneyinde kullanılan reaktif ve değerleri Numune Kör Assay Reaktifi (ml) 2,450 2,450 Numune (ml) - 0,5 Bidistile su (ml) 0,5 - Ksantin Oksidaz (µl) 50 50 Deney tüpleri birer dakika arayla inkübasyona bırakıldı ve inkübasyon sonunda renkli bileşiğin absorbansı 560 nm dalga boyunda tespit edildi. Hesaplamalar: % İnhibisyon = Körün absorbansı Numunenin absorbansı Körün absorbansı x 100 Bir SOD ünitesi, NBT redüksiyonunu % 50 oranında inhibe eden aktivite olarak kabul edilmektedir. Dolayısıyla;

71 Aktivite (EU/ml) = % İnhibisyon 50 x Numune hacmi (ml) 3.6.2.2. Glutatyon Peroksidaz (GSH-Px) Aktivitesinin Tayini Prensip: Glutatyon peroksidaz (GPx, EC 1.11.1.19) GSH ın GSSG ye oksidasyonunu hidrojen peroksit kullanarak katalizler. Reaksiyon ortamındaki t-butilhidroperoksidin her bir molekülünün substratı için 1 mol GSSG oluşur. GSSG nin GSH a redüksiyonu ise GR enziminin katalizlediği reaksiyonla oluşur. Bu reaksiyonda GSSG nin her bir molünün redüksiyonu için 1 mol NADPH okside olur. GPx aktivitesi de NADPH oksidasyonunu takiben spektrofotometrik olarak 340 nm deki sistemin optik dansitesindeki düşüşten hesaplanır. Deneyin yapılışı: Karaciğer homojenatında GSH-Px aktivitesi, Paglia ve arkadaşının 123 tarif ettiği metoda göre yapılmıştır. GSH-Px deneyinde kullanılan reaktif ve değerleri tablo 9 da verilmiştir. Tablo 9. GSH-Px deneyinde kullanılan reaktif ve değerleri Numune Kör Fosfat tamponu (ml) 2,650 2,650 GSH (µl) 100 100 NADPH (µl) 100 100 Numune (µl) - 20 Distile su (µl) 20 - Glutatyon redüktaz (µl) 10 10 37 o C de 30 dk. inkübasyon H 2 O 2 (µl) 100 100

72 Spektrofotometrede, 37 o C de 340 nm dalga boyunda 3 dakikalık kinetik okutma programına ayarlandı. İnkübasyon sonrası her tüpe 0,100 ml H 2 O 2 ilave edilerek reaksiyon başlatıldı ve 3 dakika süreyle numunelerdeki absorbans azalışı kaydedildi. Hesaplamalar: Enzim aktivite (U/L) = ΔA/dk x 10 6 ε x SK Formülde; SK: Seyreltme katsayısı ΔA/dk: Dakikadaki absorbans değişimi ε: NADPH ın 340 nm deki molar absorbtivite katsayısı (6,22 x 10-3 ) 10 6 : Molü mikromole çevirme katsayısı 3.6.2.4. Glutatyon S-Transferaz (GST) Enzim Aktivitesinin Tayini Prensip: Glutatyon S-transferaz (GST, EC 1.5.1.18) enzimi 1-kloro-2,4-dinitrobenzen ile glutatyon grubunun reaksiyonunu katalizler. CDNB + GSH GST CDNB-S-glutatyon Deneyin yapılışı: Konjüge CDNB 340 nm de absorbans verir ve bu nedenle enzim aktivitesi bu dalga boyundaki optik dansite değişimi ile ölçülür. GST deneyinde kullanılan reaktif ve değerleri tablo 10 da verilmiştir. Tablo 10. GST deneyinde kullanılan reaktif ve değerleri Numune Kör Fosfat Tamponu (µl) - 25 Numune (µl) 25 - *Assay reaktifi (µl) 300 300

73 *Assay reaktifi: 36,20 ml 0,1 M fosfat tamponu (ph: 6,5), 1 ml GSH, 1 ml triton X-100, 1 ml etanol içinde çözünmüş 0,8 ml CDNB den oluşan homejen bir karışım. Bu karışım deney öncesinde 37 o C de 3 dk inkübe edilir. Yukarıdaki tabloda belirtilen işlemlerden sonra spesifik enzim aktivitesi aşağıdaki formüle göre hesaplanır 193. Hesaplama: Aktivite (EU/ml) = ΔA/dk ε x SK x 1/(mg protein) Formülde; A: Spesifik enzim aktivitesi (EU/gHb) ΔA/dk: 340 nm de optik dansitenin dakika başına değişimi ε: 9,6 mmol -1 x cm -1 SK: Seyreltme katsayısı 3.6.2.5. Malondialdehit (MDA) Enzim Aktivitesinin Tayini Prensip: Yüksek sıcaklıkta (95 C de) tiyobarbitürik asit (TBA) ile MDA nın oluşturduğu pembe renkli kompleksin absorbansının 532 nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak ölçülmesi esasına dayanır 194. Deneyin yapılışı: Karaciğer homojenatında MDA aktivitesi Jain ve arkadaşlarının 194 tayin ettiği metodla tayini yapıldı. MDA deneyinde kullanılan reaktif ve değerleri tablo 11 de verilmiştir.

74 Tablo 11. MDA deneyinde kullanılan reaktif ve değerleri Numune Kör Fosfat tamponu (ml) 0,8 0,8 Numune (ml) 0,2 - BHT çözeltisi (ml) 0,025 0,025 TCA çözeltisi (ml) 0,5 0,5 Vorteksle karıştırılır, 4 o C de 2 saat inkübasyon sonrası 2000 g de 15 dk santrifüj edilir. Süpernatant (µl) 1000 1000 EDTA çözeltisi (ml) 0,075 0,075 TBA çözeltisi (ml) 0,25 0,25 95 o C de 15 dakika inkübe edilir. İnkübasyon sonrası tüpler musluk suyunun altında tutularak soğutulur. Absorbsiyon iki farklı dalga boyunda (532 ve 600) köre karşı okutulur ve 600 nm dalga boyunda çıkan sonuçlar 532 nm dalga boyunda okutulan değerlerden çıkarılarak sonuçlar hesaplanır. Hesaplama: Enzim aktivite (U/L) = Absorbans x 10 6 1,52 x 10 5 x SK Formülde; 1,52 x 10 5 : Molar absorbtivite katsayısı SK: Seyreltme katsayısı 10 6 : Molü mikromole çevirme katsayısı

75 3.6.3. Dokularda Protein Tayini Kör olarak 100 µl distile su ve 5ml Commassie Brillant Blue E-250 renk reaktifinden oluşan karışım kullanıldı. 5ml Commassie Brillant Blue E-250 renk reaktifi ve 10 µl numune pipetörle deney tüplerine konduktan sonra vortexle karıştırıldı. 10 dk sonra 595 nm de 3 ml lik küvetlerde köre karşı absorbans değerleri okunur 195. 3.7. Deneylerde Kullanılan Kimyasallar Deneylerde kullanılan bütün kimyasal malzemeler Sigma ve/veya Merck firmalarından temin edilmiştir. Maddenin adı Temin edildiği firma 1. Stereptozotocin Sigma 2. Potasyum dihidrojen fosfat Sigma 3. Dipotasyum hidrojen fosfat Sigma 4. Glutatyon Sigma 5. Triton X-100 Sigma 6. Klorodinitrobenzen Sigma 7. Xantin Sigma 8. Etilen diamintetraasetikasit Sigma 9. Nitrobluetetrazolium Sigma 10. Sodyum karbonat Merck 11. Bovin serum albumin (BSA) Sigma 12. Xanthin oksidaz Sigma 13. Amonyum Sülfat Sigma 14. Sodyum dodesil sülfat Sigma 15. Asetik asit Sigma

76 16. Tiyobarbitürik asit Merck 17. n-bütanol/piridin Sigma 18. Disodyum hidrojen fosfat Sigma 19. Sodyum azid Sigma 20. NADPH Sigma 21. GSH-Redüktaz Sigma 22. Hidrojen peroksit Sigma 23. Commassie Brillant Blue E-250 Sigma 24. Etanol Merck 25. Potasyum ferrisiyanür Sigma 26. Sodyum bikarbonat Sigma 27. Potasyum siyanür Sigma 28. Sodyum hidroksit Sigma 29. Perklorik asit Merck 30. Potasyum klorür Sigma 31. Sodyum klorür Merck 3.8. Deneylerde Kullanılan Cihazlar 1. UV-Visible Spektrofotometre: Thermo Spectronic-HEλIOS β 2. ph metre: Schott CG 842 3. Hassas terazi: Scaltec SPB 31 4. Derin dondurucu: Sanyo MDF 235 5. Homojenizatör: OMNI TH İnternational 6. Magnetik karıştırıcılar: Boeco MSH 300 7. Otomatik pipetler : Eppendorf, Microlit, Socorex

77 8. Buzdolabı: Profilo 9. Saf su cihazı: GFL 2012 10. Çalkalayıcılı su banyosu: Memmert 11. Döner Buharlaştırıcı (Evaporatör): BSI 12. Vortex: Vortex Genie-Model K-550-GE 13. Etüv: Heraeus, Germany 3.9. Deneylerde Kullanılan Çözeltiler ve Hazırlanışları 1. 0,1 M Fosfat Tamponu, ph= 6,5: 8,349 g KH 2 PO 4 ve 6,732 g K 2 HPO 4 alınıp, bir miktar saf suda çözüldü ve ph=6,5 e ayarlandıktan sonra, son hacim 1000 ml ye saf su ile tamamlandı. 2. 0,1 M Fosfat Tamponu, ph= 7,4: 2,267 g KH 2 PO 4 ve 14,515 g K 2 HPO 4 alınıp, bir miktar distile su içerisinde çözüldü ve ph=7,4 e ayarlandıktan sonra son hacim 1000 ml ye saf su ile tamamlandı. 3. GSH: 0,138 g GSH 3 ml ph=7,4 olan 0,1 M Fosfat tamponu içerisinde çözdürülür. 4. % 0,66 Triton X-100: 0,66 ml Triton X-100 alınır, distile su ile 100 ml ye tamamlanır. 5. CDNB (Klorodinitrobenzen): 0,005 g CDNB alınıp 1 ml etanol içerisinde çözülür. 6. 0,3 mm Xanthin: 9,13 mg xantin 200 ml distile suda çözülür. 7. 0,6 mm EDTA: 25 mg EDTA 100 ml distile suda çözülür. 8. NBT (Nitroblue tetrazolium): 12,3 mg nitrobluetetrazolium 100 ml distile suda çözülür. Renkli şişede ışıktan korunmalıdır. 9. 0.4 M Na 2 CO 3 : 2.54 g sodyum karbonat 60 ml distile suda çözülür.

78 10. 1 g/l BSA(Bovin serum albumin): 30 mg bovin serum albumin 30 ml distile suda çözülür. 11. 167 U/L Xanthin Oksidaz (Sigma X-1875): 50 µl xanthin oksidaz alınır ve 600 µl 2 M (NH 4 ) 2 SO 4 ilave edilir. 12. 0,02 mol (NH 4 ) 2 SO 4 : 2,64 g amonyum sülfat alınır ve 10 ml distile suda çözülür. 13. % 8,1 Sodyum dodesil sülfat: 8,1 g SDS alınır, 100 ml distile suda çözülür. 14. % 20 Asetik asit: 100 ml % 100 lük asetik asitten alınır, 400 ml distile suda çözülür. 15. % 0.9 TBA: 2,25 g TBA alınır, 250 ml distile suda çözülür. 16.15/1( v/v) n-bütanol/pridin: 150 ml n-bütanol 10 ml pridin ile çözeltisi hazırlanır. 17. Fosfat Tamponu: 0,988 g/l Na 2 HPO 4 2H 2 O, 0,379 g/l KH 2 PO 4, 0,062 g EDTA ve 0,011 g NaN 3 karıtırılıp, karışım ph: 7 ye ayarlandıktan sonra, distile suyla 100 ml ye tamamlanır. 18. Ko-substrat: 0,008 g NADPH, 0,016 g GSH, 100 µl GSH-redüktaz alınır, 10 ml distile suda çözülür. 19. 1 mm Sitrat Tamponu ph: 4,5: 0,480 g citrate tamponu alınır, ph: 4,5 e ayarlandıktan sonra distile suyla 250 ml ye tamamlanır. 20. 50 mm Fosfat tamponu: 8,85 g/l Na 2 HPO 4 2H 2 O çözeltisinden 600 ml alınır, 6,81 g/l KH 2 PO 4 çözeltisinden 400 ml alınır, temiz bir kaba konur ve ph: 7 ye ayarlanır. 21. %30 luk H 2 O 2

79 22. Commassie Brillant Blue E-250 renk reaktifi: 100 mg Commassie Brillant Blue E-250, 50 ml % 95 lik etanolde çözülür. Bu çözeltiye 100 ml % 95 lik fosforik asit ilave edilir. Çözeltinin hacmi distile su ile 1 litreye tamamlanır. 23. 0,05 N NaOH: 2 g sodyum hidroksit alınır ve distile suyla 1000 ml ye tamamlanır. 24. 1,5 N HCIO 4 : 12,89 ml HCIO 4 alınır, 87,11 ml distile su içerisinde çözülür. 25. % 1,15 KCI: 1,15 g KCI alınır, distile suyla 100 ml ye tamamlanır. 26. % 0,9 NaCI: 0,9 mg NaCI alınır, distile suyla 100 ml ye tamamlanır. 3.10. İstatistiksel Analiz İstatistiksel analizler SPSS 15,0 software programı kullanılarak yapıldı. Bütün ölçümlerde istatistiksel farklılıklar ve önem seviyeleri one-way variance analyzes (ANOVA) testi ile belirlendi. Sonuçlar, rat gruplarındaki ölçümün ortalaması (ortalama ± SD) olarak gösterildi. * diyabetik gruba (DG) göre p<0,05 seviyesinde anlamlı, ** diyabetik gruba (DG) göre p<0,001 seviyesinde anlamlı kabul edildi. Çoklu karşılaştırmalarda LSD testi uygulandı.

4. BULGULAR 80

ALP 81 525 450 375 300 225 150 75 ** ** ** ** 0 DM+OLII (0,5 g/kg) DM+OLI (0.25 g/kg) OLII (0.5 g/kg) DG SG g/kg Şekil 18. Rat gruplarındaki alkalen fosfataz (ALP) aktivitelerinin gösterilmesi. Sonuçlar, rat gruplarındaki ölçümün ortalaması (ortalama ± SD) olarak gösterildi. * diyabetik gruba (DG) göre p<0,05 seviyesinde anlamlı, ** diyabetik gruba (DG) göre p<0,001 seviyesinde anlamlı kabul edildi. Çoklu karşılaştırmalarda LSD testi uygulandı. Diyabetik (DG) grubun ALP aktivitesi sağlıklı kontrol (SG) gruba göre yüksek bulundu. Bu istatistiksel olarak anlamlıydı (p<0,001). Bu iki grubun ALP aktiviteleri sırasıyla 505,80 ± 19,50, 225,20 ± 25,10 olarak bulundu. Sağlıklı kontrol (SG) grubun ALP aktivitesi etanol ekstresinin düşük dozunu ihtiva eden (DM+OLI) diyabetli gruba oranla düşük bulundu. Bu istatistiksel olarak anlamlıydı (p<0,001). Aynı şekilde sağlıklı kontrol (SG) grubun ALP aktivitesinin OLII kontrol grubun ALP aktivitesinin istatistiki değerlendirmede anlamlı olması (p<0,05) ilacın diyabet ve komplikasyonlarının neden olduğu oksidatif stresin azalması ve tedavisi üzerine etkisinin olduğunu göstermiştir. OLII kontrol grubun ALP değeri etanol ekstresinin farklı dozlarını ihtiva eden diyabetli gruplara oranla düşük bulundu. Bu istatistiki değerlendirmede anlamlıydı (p<0,001). Aynı şekilde etanol ekstresinin farklı dozlarını ihtiva eden gruplar arasında da istatistiksel olarak anlamlı bir farkın olduğu tespit edildi (p<0,001).

ALT 82 OLII kontrol grubun ALP aktivitesi diyabetik (DG) gruba göre düşük bulundu. Bu istatistiksel olarak anlamlıydı (p<0,001) ve OLII kontrol grubun ALP aktivitesi 172,60 ± 44,30 olarak bulundu. Etanol ekstresinin düşük dozunu ihtiva eden diyabetli (DM+OLI) grubun ALP aktivitesi diyabetik (DG) gruba göre çok daha düşük bulundu. Bu istatistiki değerlendirmede anlamlıydı (p<0,001). Etanol ekstresinin düşük dozunu ihtiva eden diyabetli (DM+OLI) grubun ALP aktivitesi 338,40 ± 28,80 olarak bulundu. Aynı şekilde etanol ekstresinin yüksek dozunu ihtiva eden diyabetli (DM+OLII) grubun ALP aktivitesi diyabetik (DG) gruba düşük bulundu. Bu iki grup arasındaki fark istatistiki değerlendirmede anlamlıydı (p<0,001). Etanol ekstresinin yüksek dozunu ihtiva eden diyabetli (DM+OLII) grubun ALP aktivitesi 247,20 ± 23,31 olarak bulundu. 150 125 100 75 50 ** ** ** ** 25 0 DM+OLII (0,5 g/kg) DM+OLI (0.25 g/kg) OLII (0.5 g/kg) DG SG g/kg Şekil 19. Rat gruplarındaki alanin aminotransferaz (ALT) aktivitelerinin gösterilmesi. Sonuçlar, rat gruplarındaki ölçümün ortalaması (ortalama ±SD) olarak gösterildi. * diyabetik gruba (DG) göre p<0,05 seviyesinde anlamlı, ** diyabetik gruba (DG) göre p<0,001 seviyesinde anlamlı kabul edildi. Çoklu karşılaştırmalarda LSD testi uygulandı.

83 Diyabetik grup olan (DG) nin ALT aktivitesi sağlıklı kontrol (SG) gruba göre yüksek bulundu. Bu istatistiksel olarak anlamlıydı (p<0,001). Bu iki grubun ALT aktiviteleri sırasıyla 144,00 ± 4,69, 47,40 ± 6,50 olarak bulundu. Diyabetik (DG) grubun ALT aktivitesi etanol ekstresinin düşük dozunu ihtiva eden diyabetli (DM+OLI) gruba göre yüksek bulundu. Bu istatistiki değerlendirmede anlamlıydı (p<0,001). Etanol ekstresinin düşük dozunu ihtiva eden diyabetli (DM+OLI) grubun ALT aktivitesinin 62,20 ± 21,83 olduğu tespit edildi. Etanol ekstresinin yüksek dozunu ihtiva eden diyabetli (DM+OLII) grubun ALT aktivitesi diyabetik (DG) gruba göre daha düşük bulundu. Bu istatistiki değerlendirmede anlamlıydı (p<0,001) ve etanol ekstresinin yüksek dozunu ihtiva eden diyabetli (DM+OLII) grubun ALT aktivitesi 43,40 ± 9,34 olarak bulundu. Etanol ekstresinin 0,25 g/kg dozunu ihtiva eden (DM+OLI) diyabetli grubun ALT aktivitesi etanol ekstresinin 0,50 g/kg dozunu ihtiva eden (DM+OLII) diyabetli grubun ALT aktivitesine oranla daha yüksek bulundu. Bu istatistiki değerlendirmede anlamlıydı (p<0,001). Diyabetik (DG) grubun ALT aktivitesi OLII kontrol grubun ALT aktivitesine oranla çok daha yüksek bulundu. Bu istatistiksel olarak anlamlıydı (p<0,001). OLII kontrol grubun ALT aktivitesinin 49,00 ± 8,24 olduğu tespit edildi ve böylece ilacın diyabet ve komplikasyonlarının neden olduğu oksidatif stresin azalması ve tedavisi üzerine etkisinin olduğu belirlendi.

AST 84 250 200 150 ** ** ** ** 100 50 0 DM+OLII (0,5 g/kg) DM+OLI (0.25 g/kg) OLII (0.5 g/kg) DG SG g/kg Şekil 20. Rat gruplarındaki aspartat aminotransferaz (AST) aktivitelerinin gösterilmesi. Sonuçlar, rat gruplarındaki ölçümün ortalaması (ortalama ±SD) olarak gösterilmiştir. * diyabetik gruba (DG) göre p<0,05 seviyesinde anlamlı, ** diyabetik gruba (DG) göre p<0,001 seviyesinde anlamlı kabul edildi. Çoklu karşılaştırmalarda LSD testi uygulandı. Diyabetik (DG) grubun AST aktivitesi sağlıklı kontrol (SG) gruba göre yüksek bulundu. Bu istatistiksel olarak anlamlıydı (p<0,001). Bu iki grubun AST aktiviteleri sırasıyla 210,00 ± 15,81, 151,20 ± 5,26 olarak bulundu. Sağlıklı kontrol (SG) grubun AST aktivitesi etanol ekstresinin düşük dozunu ihtiva eden (DM+OLI) diyabetli gruba oranla düşük bulundu. Bu istatistiksel olarak anlamlıydı (p<0,001). Etanol ekstresinin farklı dozlarını ihtiva eden diyabetli grupların AST aktiviteleri diyabetik (DG) gruba göre çok daha düşük bulundu. Bu istatistiki değerlendirmede anlamlıydı (p<0,001). OLII kontrol grubun AST aktivitesi diyabetik (DG) grup ve etanol ekstresinin düşük dozunu ihtiva eden (DM+OLI) diyabetli gruba göre düşük bulundu. Bu istatistiksel olarak anlamlıydı (p<0,001) ve OLII kontrol grubun AST aktivitesi 155,00 ± 7,91 olarak bulundu.

85 Etanol ekstresinin farklı dozlarını ihtiva eden diyabetli gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farkın olduğu tespit edildi (p<0,05). 0,50 g/kg dozunu ihtiva eden grubun AST değerinin 174,00 ± 8,25 olduğu ve 0,25 g/kg dozunu ihtiva eden grubun AST değerinin ise 158,00 ± 9,06 olduğu belirlendi.

86