S. Boulardii uygulamalarının H. Pylori nin mide ve duedonal epitelyumda oluşturduğu enfeksiyonların eradikasyonundaki rolünün in vitro hücre kültürü yöntemleri ile belirlenmesi Serhan Sakarya, Necati Günay Adnan Menderes Üniversitesi
Genel bilgi H. pylori ilk 1982 yılında tanımlanmış, gastirik ve peptik ülser için etyolojik, maligniteler için önemli bir risk faktörüdür. Gelişmekte olan ülkelerde %70-90, gelişmiş ülke %25-50 oranında prevalans göstermektedir. Gastirik epitele aderansında fukosialiye, sialiye veya sulfatlı oligosakkaritler, glikolipidler, glikoproteinler, müsin ve lipid benzeri moleküller rol oynamaktadır. Halen aderansda rol oynayan 2 reseptör tanımlanmıştır; Kan gurup antijenlerine bağlanan adhesin (BabA) H-1 ve Lewis b Kan grubundaki fukosialiye oligosakkaritlere bağlanır. Sialiye Lewis X antijen bağlanan adhesin (2-3) sialik asit yapısındaki oligosakkaritlere bağlanır, kronik inflame mide epitelinde oluştuğu için kronik enfeksiyonlarda önemlidir.
H. Pylori tedavisinin gelişen direnç ve yan etkiler alternatif tedavi gereksinimini ortaya çıkartmıştır. Probiyotiklerin birçok GIS patojenine etkinlikleri, alternatif tedavide kullanımı üzerine çalışmalar yapılmasına neden olmuştur. L. acidophilus 4356 ve LB, L. johnsonii La1, L casei 393, L. lactis BH5, L. reuteri TM 105, W. confuse, B. subtilis gibi probiyotik bakterilerin laktik ve asetik asit ve hidrojen peroksit gibi salgıları ile H. Pylori yi in vitro koşullarda öldürmektedir. L. Johnsonii La1, L. salivarius, L. acidophilus, W. confuse ve L. reuteri, H. pylori nin gastrik hücre aderansını in vitro olarak kompetetif inhibisyona uğratmaktadır. Ayrıca mukozal bariyer ve immünolojik mekanizmalar ile de H. pylori infeksiyonlarını engellemektedir.
Amaç Bakteri cinsi probiyotiklerin in vitro etkinliklerine karşın in vivo başarılarının yeterli olmaması. Bir maya probiyotik olan S. boulardii nin; Mide ve ince barsaktaki ph ve enzimler gibi çevresel koşullardan etkilenmememsi Klinik çalışmalarda eradikasyonda etkili olması Tedavi yan etkilerini azaltması S. boulardii nin in vitro hücre kültürü yöntemler ile H. pylori canlılığı ve epitele aderansı üzerine etkileri ve mekanizmasını araştırmak
Kimyasallar Metod Materyal Clostridium perfringens den ekstrakte edilmiş Neuraminidase tip V Sambucus Nigra (SNA), Maackie amurensis (MAA) ve Archis hypogea (PNA) lektin, calcein AM (CaAM) Hücre dizini ve mikroorganizmalar: HuTo-70 duodenal ve AGS mide hücre dizini (ATCC Manassas, VA, USA), Lactobacillus acidophilus (ATCC 11975), Lactobacillus reuteri (DSM 17938) ve Helicobacter pylori (NCTC 11637) Refik Saydam Hıfzısıha Merkezi, Sccharomyces boluardii (Biocodex Fransa) Koloni sayımı, fluoresan mikroskobi, florometrik teknikler kullanılarak probiyotiklerin H.pylori nin, canlılığı ve epitele aderansı üzerine etkisi ve S. Boulardii nin hücre yüzey sialik asit üzerine etkisi test edildi.
Sonuçlar
Probiyotik mikroorganizmaların H. Pylori canlılığı üzerine etkinliği S boluardii, L acidophilus ve L. Reuteri sıvı besiyerinde üretilerek, bakterilerin 10 7, 10 6, 10 5, 10 4, 10 3 ve süpernatantlarının 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 dilüsyonları eş zamanlı olarak, zımbalanarak kuyucuklar oluşturulmuş %7 at kanlı BHI agara ekilmiş olan 10 7 /ml H pylori ile birlikte ekilerek 35 0 C mikroaerofilik jar içinde 24 s inkübe edildi. İnkübasyon sonrası zonları ölçüldü.
Bacteria (CFU) Bacteria (CFU) Probiyotiklerin HuTo-70 hücrelerine H.pylori aderansı üzerine etkisi A 1.5 10 05 HP HP+SB 1.0 10 05 5.0 10 04 p=0.032 Kantitatif: HuTo 70 ve AGS hücreleri 24 kuyucuklu hücre kültürü plaklarına uygun besiyerleri ile ekilerek (0,5X10 5 hücre/cm 2 ) plağı kaplayana kadar inkübe edildi. Mikroorganizma suspansiyonları 10 7 CFU olacak şekilde hazırlandıktan sonra gruplara göre birlikte veya tek tek hücre üzerine eklenerek 2.5 saat inkübe edilip 3 kez antibiyotikli PBS ile yıkanarak probiyotik mikroorganizmalar öldürüldü. Hücreler parçalama solüsyonu ile parçalandı. Solüsyon dilüe edilerek %7 BHİ agara ekilip inkübasyon sonunda koloni sayımı yapıldı. 0.0 10-00 C B 6.0 10 07 HP HP+SB 4.0 10 07 p=0.029 2.0 10 07 0.0 10-00
S. boulardii nin HuTo-70 hücrelerine H. pylori aderansı üzerine etkisi
Bacteria (CFU) Bacteria (CFU) Probiyotiklerin AGS hücrelerine H.pylori aderansı üzerine etkisi A 7.5 10 04 HP SB+HP 5.0 10 04 2.5 10 04 0.0 10-00 B 2.0 10 06 HP SB+HP 1.0 10 06 0.0 10-00
S. boulardii nin HuTo-70 hücre yüzey sialik asid kompozüsyonu üzerine etkisi Absolute fluorescence unit Absolute fluorescence unit Absolute fluorescence unit A Cont NANase A 1.00 0.75 cont NANase SB TR-SNA lektin; (2-6) galactose, (2-6)GalNAc ve -galactose bağlı sialik asitler Yüzeye bağlanan laktin SB 0.50 0.25 0.00 p<0.01 B Cont Yüzeye bağlanan lektin SB NANase B 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 p<0.01 p<0.05 TR-MAA lektin; (2-3) galactose bağlı sialik asitler 0.0 C Cont Yüzeye bağlanan lektin SB NANasa C 1.00 0.75 0.50 0.25 p<0.001 p<0.05 TR-PNA lektin; Sialik asit uzaklaştırıldıkdan sonra subterminal -galactose Fluoresan mikroskopi 0.00 Fluorometri
S. boulardii nin AGS hücre yüzey sialik asid kompozüsyonu üzerine etkisi Absolute fluorescence Unit Absolute fluorescence Unit Absolute fluorescence Unit A Cont NANase A 0.3 0.2 cont NANase S.B p<0.05 TR-SNA lektin; (2-6) galactose, (2-6)GalNAc ve -galactose bağlı sialik asitler Yüzeye lektin bağlanma SB 0.1 0.0 B Cont NANase B 0.4 0.3 TR-MAA lektin; (2-3) galactose bağlı sialik asitler SB 0.2 Yüzeye lektin bağlanma 0.1 0.0 compared to the media alone at P <0.05 HuTo cells with NANase, S. boulardii and media alone., signi?cantly decreased/increased Figure 11: Fluorometric values of SNA (A), MAA (B) and PNA (C) prior to treatment of C Cont NANase C 0.75 0.50 p<0.05 TR-PNA lektin; Sialik asit uzaklaştırıldıkdan sonra subterminal -galactose Yüzey lektin bağlanma SB 0.25 Fluoresan mikroskopi 0.00 Fluorometri
S. Boulardii; İnce barsak epiteli; Yorum I H. Pylori nin epitele aderansını azaltmaktadır İnce barsak epitelinde MAA lectin bağlanmasını, PNA lectin bağlanmasını ve SNA lectin üzerinde etksiz = (2-3) galaktoza bağlı sialik asitler üzerine etkil Nöraminidaz aktivitesi. Mide epiteli; H. Pylori nin epitele aderansını etkilememekte Hiçbir lektinin bağlanmasını etkilememkte + NANase MAA lektin bağlanmasını etkilememekte= Mide epitelin yüzeyinde yapısal olarak (2-3) galaktoza bağlı sialik asit bulunmamaktadır.
Sonuç II Mide ve duedonum epitelinin yüzey sialik asit kompozüsyonun farklı olduğu, S. Boulardii nin (2-3) galaktoza bağlı sialik asitler üzerine etkil Nöraminidaz aktivitesinin olduğunu, Yüzey sialik asitler üzerine etkileyerek H. Pylori aderansı üzerine etkili olduğunu, Gösteren ilk çalışmadır SabA reseptörüne bağlanan (2-3) sialik asit yapı kronik mid ülserinde oluşan inflamasyonda ortaya çıktığından, S. Boulardii nin inflame mide epitelinde H. Pylori aderansında etkili olarak eredikasyonda etkili olabilir.
Teşekkür ederim