Invitro Antijen Antikor Birlesmesi Özellikleri Antijenler organizmaya uygun yollardan girdiklerinde kendilerine karsi bagisik cevabin olusmasina yol açan, bu cevap sonucunda ortaya çikan ürünlerle özgül olarak birlesme özelliginde olan organizmanin kalitsal yapisina yabanci maddelerdir. Antikorlar ise antijenlere sivisal bagisik cevap sonucunda plazma hücreleri ve dolayisiyla duyarli B lenfositleri tarafindan olusturulan ve antijenleri ile özgül olarak birlesme özelliginde olan özgül globulinlerdir. Hastalandirici mikroplarin çogunlugu iyi bir ag yapisindadir. Bir mikroorganizmada birden çok antijen bulunur. Olusan antikorlar basta kan serumu olmak üzere tükürük, beyin omurilik sivisi(bos), diski, burun salgisi, göz yasi ve bunun gibi vücut salgilarinda bulunurlar. 1. Ag Ab birlesmesi özgüldür. Bu özgüllük elde ikisinden birisinin bulunmasi halinde, onu bir ayiraç olarak kullanarak digerini arastirmak, saptamak ve tanimak olanagini verir. Makro moleküller antikor yanitina sebep olurlar. Bu moleküller Kompleks karbonhidratlar, fosfolipidler, nükleik asitler, proteinlerdir. Antikorlar antijenlerin yüzeyindeki determinant veya epitop adi verilen yüzeyde yer alan hidrofil, genellikle sirali aminoasitlerden olusan bir bölüme baglanirlar. Epitop antijenin özgüllügünü saglayan yapidir. Antikorlarin antijenle baglanan kismina paratop adi verilir. 2. Ag Ab birlesmesi kimyasal bir reaksiyondur. Kovalent olmayan baglar rol oynar. Bu baglar kuvvetli degildir. Bu birlesmede baslica etkili kuvvetler sunlardir: A. Elektrostatik kuvvetler: antijenik antikorlarin aminoasitleri üzerinde bulunan zit elektrik yüklü (Amanyon ve Karboksil) determinant gruplarin, elektrostatik çekim kuvvetiyle birbirlerini çekerek birlesmesidir. B. Hidrojen baglari: Ag ve Ab moleküllerinin birbirine yaklasmasiyla gerçeklesen, hidrofilik gruplar arasinda meydana gelen geriye dönüsür zayif baglardir. C. Hidrofobik baglanma: yüzeylerinde glisin, alanin, losin, izolosin gibi hidrokarbon aminoasit içeren iki protein arasinda su moleküllerinin itilmesiyle olusan baglardir. Ag Ab birlesmesinde en önemli rolü bu baglar üstlenir D. Vander Walls kuvvetleriyle baglanma: bu kuvvetler antijen ve antikor molekülünü saran elektron bulutlariyla ilgili kuvvetlerdir. Ag Ab arasi uzaklik 1-2A inince 3. Ag Ab birlesmesi reaksiyonu geriye dönüsür bir reaksiyondur. Reaksiyon Ag +Ak «=»AgAk. Bunun Danyz olayi deneyi gösterile bilinir. Belli bir miktarda antitoksine belli miktarda toksin eklenirse nötralize olmaktadir. Ancak ayni miktar antitoksine onu nötralize edecek miktarda toksin bir defa degil de önce bir kismi, bir süre beklettikten sonra arta kalani eklenecek olursa toksinin tam nötralize olmadigi gözlenir. Bunun nedeni; ilk katilan toksinin nisbeten fazla sayida ve kuvvetli baglarca antitoksine baglanmasi ikinci kisim eklendiginde ise serbest antitoksinin azalmasi ve toksinin zayif baglarla baglanmasidir. 24 saat beklendiginde toksin zayif baglardan ayrilip kuvvetli baglarla antitoksine baglanir ve nötralize olur. [AgAk] Denge Sabiti=-------------------- = (k) [Ag] [Ak] bu reaksiyondaki K degeri ne kadar büyükse affinite o kadar fazladir. Affinite antikorun tek antijenik determinantla baglanma kuvvetidir. Antijenlerin çogu birden fazla determinanta sahiptir bundan dolayi birden fazla antikor baglar. Ayrica multivalan antijenlerde bir determinantin birden fazla kopyasi bulunur. Antikorlarin 2 valansi bulunur. Antikorlarin multivan antijenlerle baglanma gücüne Avidite denir. Bu baglanma gücü tek tek determinantlarin, antikordaki paratoplara baglanma güçlerinin toplamindan büyüktür.
4. Ag Ak uygun oranlarda birlesirler. Ag ile Ak un uygun oranlarda birlesmesine esdeger bölge (optimalzon) denir eger Ak fazlaligi olursa prezon olayi, antijen fazlaligi olursa postzon olarak adlandirilir. 5. Ag Ak birlesmesinde önemli teori Marrack in kafes kuramidir. Bu teoriye göre tam antijenler çok valansli, tam antikorlar ise iki valanslidir. Bu temele dayanarak Aglerle antikorlar büyük bir ag veya kafes olusturacak sekilde birlesirler. 6. Ag Ak birlesmesi iki safhali bir reaksiyondur. 1. safha özgül antijen ile antikorun saniyeler içinde birlesmesidir. Bu reaksiyon sonucu Enerji açiga çikar 5 7 Kcal 1. safhadaki birlesme de ortamda elektrolitlerin bulunmasi Ag ve Ak tam Ag tam Ak niteliginde olmasi sart degildir. Bu safha gözle görülmez. 2. safhadaki reaksiyon daha yavas olur. Isi enerjisi çok az açiga çikar. Ortamda elektrolitlerin bulunmasi gereklidir. Nötral ph olmali, isi olmali. Bu safha gözle görülür, sonuçlanmasi saatler, hatta günler alir. Özet olarak Ag Ak birlesmesi 1. Özgüldür. 2. Kimyasal bir reaksiyondur. 3. Geriye dönüsür bir reaksiyondur. 4. Ag Ak birbirleriyle en uygun oranlarda birlesir. 5. Iki safhali bir reaksiyondur. Ag Ak reaksiyonlari invitro olarak serolojik deneylerle incelenir. Mikrobik hastaliklarinda tanisinda serolojik deneyler iki amaca yönelik olarak uygulanir 1. Infeksiyon hastaliklarinin tanisinda: Elimizde bilinen mikroorganizma antijenleri kullanarak insan serumunda yada diger vücut sivilarinda antikor arastirip ortaya çikarmak suretiyle hastaligin tanisi koymak, elimizde belirli antikorlari içeren bagisik serumlardan yararlanarak hastalik materyallerinde mikroorganizma antijenlerini saptamak dolayisiyla hastalik tanisi koymak 2. Elimizde bilinen antikorlari içeren bagisik serumlari kullanarak mikroorganizma antijenlerinin yapisini incelemek dolayisiyla üretilen mikroorganizmalarin identifikasyonu yapmak yani tanimaktir. Bir reaksiyon veya bagisiklamadan sonra antijenle verdikleri tepkimeye göre antikorlar çesitli serolojik reaksiyonlara neden olurlar. Antikorlar fonksiyonlarina yada verdikleri reaksiyonlara göre çesitli adlar altinda siniflandirilabilirler. 1. Antitoksin = Toksin veya toksoidlere karsi olusan antikor türüdür. Özgül Ag ile birlestiklerinde flokülasyon olusturur, toksini nötralize ederler. IgG bu türdendir. 2. Aglutinin = Bu tip antikorlar kendilerini olusturan antijenik partikülleri bir araya toplarlar sonra tüpün dip kismina çökerler. IgA, IgM, IgG. 3. Presipitin = IgG yapisinda erimis(solubl) durumdaki antijenlere karsi olusan antikor türüdür. Özgül antijenlerle birlestiklerinde flokulasyon olusturur ve toksini nötralize ederler 4. Amboseptör = Bu antikorlar (IgG türleri) kendi antijenleri ile birlestiginde taze serumlarda bulunan kompleman adi verilen maddeleri kullanarak antijenik hücreyi ya tamamen eritir yada komplemanin baglandigi antikoru yapisir. 5. Opsonin ve bakteriopin = Bu antikorlar bakterilerin veya diger bazi hücrelerin yüzeylerine yapisarak, makrofajlar tarafindan kolayca fagosite olmalarini saglarlar IgG antikorlari bu özelligi tasirlar. 6. Nötralizan veya koruyucu antikorlar = Daha çok virüs infeksiyonlarinda olusan IgA ve IgM, IgG yapisinda antikorlardir. Kendilerini meydana getiren patojen mikroorganizmalarin hastalik yapma yeteneklerini önlerler yani nötralize ederler. Organizmaya giren bir Ag ne kasi olusan antikorlar suda, tuzlarda ve degisik eriticilerde erirlik dereceleri, elektroforez hizlari, molekül agirliklari, ultrasantrifüjlemede çökme hizlari ve diger özellikleri yönünden çesitli ayirimlar gösterirler. Buna göre IgA, IgD, IgE, IgG ve IgM diye adlandirilan degisik immunoglobulinler ortaya çikar.
Çesitli serolojik tepkimelerle bu antikorlarin birisi yada birkaçi bir arada veya infeksiyonun türüne ve dönemine göre degisik oranlarda yer alirlar. Antijen ile antikor arasinda reaksiyonlarin invitro yapilmasina serolojik reaksiyonlar denir. Serolojik deneyler kalitetif ve kantatif temele dayali olarak yapilir. Serolojik Yöntemler 1. Aglutinasyon Deneyleri Bakteriler, eritrosit, lökosit gibi hücreler yada inorganik maddelerden yapili parçaciklarin yüzeylerinde doga olarak bulunan yada yapay olarak yapistirilan antijenler kendilerine karsi olusturulmus antikorlarla birlesecek olursa bu hücre veya parçaciklarin birbirlerine yapisip gözle görülebilecek büyüklükte çökmesi olayina aglutinasyon denir. Aglutinasyonda IgG, IgM ve IgA cinsinden antikorlar rol oynar. Aglutinasyonun gerçeklesmesi için antijen tasiyan hücre yada parçaciklarin elektrolitli ortamda(fizyolojik tuzlu su) süspansiyon halinde olmalari gerekir. Böyle bir ortamda küçük parçaciklar negatif yüklü olduklarindan birbirlerini iterek ayri ayri kalirlar. Antikorlar bu parçaciklara yapisinca birbirlerine yapisip gözle görülen kümeler olusturur. Uygulamada lam aglutinasyon yöntemi, tüp aglutinasyon yöntemi vardir. Hastaliklarin tanisinda(infeksiyon); a. Gruber Widal aglutinasyojn deneyi b. Wright aglutinasyon deneyi c. Weil Felix aglutinasyon deneyi d. Vi aglutinasyon deneyi e. Leptospirozda aglutinasyon deneyi f. Soguk aglutinasyon deneyi g. Paul Bunnell aglutinasyon deneyi.. gibi Bazi mikroorganizmalar eritrositlerin aglutinasyonuna sebeb olur. Mikroplarin antikorlari veya diger faktörleri olmadan eritrositleri aglutine etmelerine direkt hem aglutinasyon, mikropantijenin eritrositle birlesip homolog antikor ilavesinde eritrositlerin aglutine olmasina indirekt hem aglutinasyon adi verilir. Bazi virüs infeksiyonlarinda hem aglutinasyona engel olan antikorlar olusur. Bu antikorlar invitro deneylerde eritrositlerin virüsler tarafindan aglutine olmalarina engel olurlar. Bu antikorlarin varligi hem aglutinasyon inhibisyon(hai) deneyi ile saptanir. Örnegin influenzae, kabakulak, suçiçegi, kizamikçik. gibi 2. Presipitasyon Deneyleri Suda erimis durumda bulunan antijenlerin özgül antikorlari ile birlesmeleriyle önce bulaniklik,sonra çökme olayi seklinde sonuçlanan olaya presipitasyon denir. 1. Sivi ortamda(halka deneyi=ring test) : Bir sivida belirli bir antikora özgül antijenin bulunup bulunmadigi veya besin maddelerinde bulunan yabanci proteinlerin,kuskulu lekelerin insan yada hayvan kani olup olmadiginin anlasilmasinda,ayrica ölmüs bir hayvanin sarbondan ölüp ölmediginin (Ascoli termopresipitasyon) anlasilmasinda kullanilabilir. 2.Yari-Kati Ortamda(JEL de) Presipitasyon: Agar jel içinde yayilan Ag ve Ak un birbirlerine uygun olduklari bölgelerde bulaniklik presipitasyon bantlari meydana getirerek çökmeleri söz konusudur.yari kati presipitasyon teknikleri iki gruba ayrilir: a.basit diffüzyon teknigi:antijen yada antikorun birinin diffüze olmasidir. b.çift diffüzyon teknigi: Hem Ag, hemde Ak un diffüze olmasi deneyidir.örnek:mancini teknigi;bir petri kutusunda jeloz içine antikor karistirilmistir.jelozda açilan çukurlara konan Ag arasinda gerçeklesir.inkübasyon sonunda dairesel bir presipitasyon bandi meydana gelir. Presipitasyon halkasinin çapi ne kadar büyükse çukurdaki Ag miktari o kadar fazladir.bu yöntem ile serumda Ig lerin, komplemanin, transferin gibi proteinlerin miktar tayinleri yapilir.
Diger Presipitasyon uygulamalari: Oudin tüp teknigi,ouchterlony teknigi, immunelektroforez teknigi,roket elektroforezi,karsit immunoelektroforez teknigi..vardir. 3. Kompleman Birlesmesi Deneyi Komplemanin,ag ile ak kompleksi ile birlesip aktive olarak antikorla duyarlasmis eritrositlerive diger hücreleri eritmesine sitoliz denir.kompleman yalniz ag le veya yalniz ak la birlesmez.ag Ak kompleksi ile birlesir bu olaya komleman birlesmesi denir.deneyde;hasta serumu,ag,komleman,koyun eritrositleri ve buna karsi hazirlanmis bagisik serum kullanilir. Komplemani baglayan antikorlar IgM veigg antijenkarsisnda komplemani aktif hale geçirirler.hücreye baglanmis olan en az 2 IgG veya 1 adet IgM molekülü komplemani baglayip hücre erimesine yol açarlar. 4. Nötralizasyon Deneyleri Toksinin invitro nötralizasyonunun kullanildigi deney ASO deneyidir.hasta serumu ile karistirilan Streptolizin-O,antikoru ile nötralize olur ise,sonradan ortama ilave edilen eritrositleri hemolize edemez.ayni sekilde invivo SCHICK deneyinde;difteri toksini bagisik olan kisinin derisi içine siringa edildiginde antikoru ile nötralize olur ve deride bir belirti meydana gelmez.dick deneyide kizil hastaligina karsi bagisikligin arastirilmasi amaciyla yapilir. 5. Fluoresan Antikor Yöntemi Flöresein izosiyanat veya Flöresein izotiyosiyanat gibi flöresans veren bir madde ile isaretlenmis antikor molekülleri kullanilir.konjugat denilen antikor özgül antijenine baglanarak ultraviyole isik mikroskopta flöresan veren Ag-Ak kompleksinin görülmesini mümkün kilar.direkt Flöresan ve Indirekt Flöresan Antikor teknikleri vardir. 6. ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Teknigi Bu yöntemde, Ag-Ak reaksiyon sonucu kati faza baglanan enzim isaretli reaktiflerden yararlanilir.degerlendirmeler ise enzim ile substratinin olusturacaklari renk reaksiyonuna göre yapilir.beliren renkli reaksiyon ürünlerinin miktari enzim isaretli reaktiflerin ve dolayisiyla kati faza baglanan Ag ve Ak un miktarini belirler.elisa da kullanilan reaktifler: 1. Solid faz(kati faz): sellüloz, poliakrilamid, polistiren, polipropilen. 2. Konjugat(Enzimle isaretli Ak,Ag): En çok kullanilan enzimler; Alkaline phosphatase(calf-mukoza), Horseradish peroxidase(y.lahana turbu), Glukoz oksidase(aspergillus niger), Beta-galactosidase(E.coli). 3. Substrat(P-nitrophenol, O-phenylene daimin, Tetrametilbenzidine-hidrochloride, 5- aminosalicylic asit, methyl-umbelliferyl galactosidase, nitroblue tetrazolium..gibi). 4.Reaksiyon durdurucu solusyon(0.1m H2SO4,0.1N NaOH). 5. Hasta serumu veya vücut sivisi 6. Spesifik Ag. 7. Yikama solusyonu(fosfat tamponlu tuzlu su) 8. Spektrofotometre(450nm-490nm). ELISA ile Ag aranmasi: Direkt yöntem(çift Ak Sandviç Yöntem): Antikor ile duyarli kati faza içinde Ag aranacak muayene maddesi isaretli antikorlar ve substrat Ilave edilir;olusan renk siddeti Ag miktari ile orantilidir. ELISA ile antikor aranmasi: Indirekt yöntem: Antijen ile duyarli kati faza, içinde antikor aranacak muayene maddesi ilave edilir. Antikor var ise antijen ile reaksiyona girerek baglanir. Reaksiyona girmeyen maddelerin yikama ile uzaklastirilir. Sonra ortama enzimle isaretli antiglobulin(konjugat) ilave edilir. Antijen antikor kompleksindeki antikora baglanir. Bu birlesme enzime özgül substratin ilavesi ile renklenmenin siddeti muayene maddesindeki antikor miktari ile orantilidir. Kullanilan konjugat IgG, IgM ve IgA larla olabilir.
7. Moleküler Yöntemler Son yillarda patojenlerin nükleik asidin kodladigi moleküller(antijenler) yerine direkt olarak patojenlerin nükleik asitlerinin arastirilmasi mümkün olmustur. Nükleik asit çogaltma yöntemleri olarak; 1. Polimeraz zincir reaksiyonu(pcr=pzr) 2. Ligaz zincr reaksiyonu(lcr) 3. Dallanmis prob teknigi(branched DNA) 4. Nükleik asit sekansina dayali çogaltma(nasba) 5. Western Blot deneyi 6. Southern Blot deneyi 7. Northern Blot deneyi 8. Dot Blot hibridizasyonu deneyi 9. In situ hibridizasyon deneyi Moleküler tani yöntemleri infeksiyon hastaliklarinin tanisinda tedavisinde ve takibinde seroimmunolojik yöntemlere göre sayisiz avantaj içerirler bu tür tekniklerle infeksiyonlarin: 1. Patojenlerin tanisinda 2. Etkenlerin RNA/DNA kalitatif ve kantitatif tayin etmede 3. Aktif vireminin gösterilmesinde 4. Mutasyonlarin belirlenmesinde 5. Seronegatif olgularda 6. Genotiplemede 7. Bakterilerin antibiyotiklere direnç genlerini saptanmasinda 8. Antiviral tedavinin etkinligini izlemede 9. Yeni etkenlerin saptanmasinda kullanilmaktadir.