ÇEVRE MİKROBİYOLOJİSİ LABORATUVARI 5. HAFTA AKTİF ÇAMURUN MİKROBİYOLOJİK İNCELENMESİ
GENEL BİLGİ Aktif çamur flokları yaşayan ve ölü bakteri hücreleri kümeleridir. Bu kümeler aynı zamanda sıklıkla filamentöz türleri, tuz çökeleklerini, inorganik partikülleri (kum) ve organik yapıları içerirler. Flok bileşenleri yapışkan bir matriks ile birarada tutulurlar. Matriks hücreleri saran polimerik bileşiklerden ve Ca 2+ gibi iki değerlikli katyonların önemli rol oynadığı kimyasal bağ güçlerinden oluşur. Flokların etrafında ve floklar arasında suda serbest yaşayan bakteriler, protozoa ve bazen yüksek organizasyonlu organizmalar mevcuttur. Aktif Çamurun Mikroskop ile incelenmesi: Mikroskop ile alınan görüntü aktif çamurun görsel olarak incelenebilir çeşitli özellikleri hakkında bilgi sağlar. Bu bilgi çamurun nitel değerlendirilmesiyle ilgilidir. Ayrıca bu bilgi beklentiler doğrultusunda işlemeyen bir arıtma tesisin probleminin teşhisinde yardımcı olur. Ancak görüntüleme biyokütlenin aktivitesi ile ilgili bilgiyi sağlamaz. Biyokütle aktivitesi farklı analizlerle tayin edilir. Mikroskop ile yapılacak incelemenin sıklığı çamur yaşıyla ilişkilidir. Eğer çamur yaşı kısa ise (gün) çamur kompozisyonundaki değişimi tanımlayabilmek için mikroskobik inceleme haftada bir veya iki haftada bir yapılmalıdır. Daha uzun çamur yaşı ile işletilen tesislerde (hafta) 1 ila 2 ayda bir inceleme yapmak uygundur. Numuna Alma ve Numunenin Laboratuvara Taşınması: Mikroskobik inceleme havalandırma tankından alınan numune ile yapılır. Numune alma işleminin her zaman aynı yerden yapılması tavsiye edilmektedir. Aerobik koşulları olabildiğince uzun süre sağlamak için numune alma kabının üçte biri doldurulmalıdır. Çamur yoğunlaştırılmamalıdır. Numunenin saklanmasında soğutmadan başka bir yöntem uygulanmamalıdır aksi takdirde tüm yaşayan mikroorganizmalar ölecektir. Mikroskobik inceleme olabildiğince yeni çamur numunesiyle yürütülmelidir. Direk analiz edilemeyecek numuneler soğukta (4-7 o C) ve açık kaplarda saklanmalıdır. Numuneler flok yapısını etkileyebileceğinden dondurulmamalıdır. Saklama süresince çamurun özellikleri yavaş yavaş değişmektedir (yükleme hızı yüksek ise bu değişim daha hızlı gerçekleşir). Öncelikle Zoogloea kolonileri, spiroketler ve bazı protozoa/metazoa türleri yok olur. Flok parçalanmasından dolayı serbest hücrelerin sayısı artar. Anaerobik koşullara özgü mikroorganizmalar örneğin spiraller görülebilir. Dolayısıyla yükleme hızı yüksek arıtma tesislerinden (nitrifikasyon olmayan) alınan çamur numuneleri 2-3 gün içerisinde analiz edilmelidir. Yükleme hızı düşük olan tesislerden (nutrient giderimi) alınan numuneler 1-2 gün bekletilebilir bu süre zarfında çamur karakteristiği değişmeye başlamayacaktır. 1
Analiz Yöntemi: Numune kabı içeriği el ile nazikçe çalkalanarak uygun biçimde karıştırılmalıdır. İyi bir karıştırma sayesinde alınan 1 damla numune numune kabını temsil edecektir ve dolayısıyla havalandırma tankının tamamını temsil edecektir. Aktif çamur numunesinin kalitesiyle ilgili sonuçlar her zaman fazla sayıda gözleme dayandırılmalıdır yani sadece birkaç floğun incelenmesi yeterli değildir. Çamurdaki flokların kalitesi hakkında sonuca varmadan önce lam üzerindeki pekçok flok incelenmelidir. Bu koşul diğer pekçok özellik için de geçerlidir. Dolayısıyla lam sistematik bir şekilde incelenmelidir (Şekil.1). Eğer gözlem belirtilen tarzda yapılmazsa ve eğer mikroskop tablasının konumu gelişigüzel bir şekilde değiştirilirse preparatın yetersiz bir kısmı incelenmiş olacaktır. Lam Lamel Mikroskobik Görüntü: Şekil.1 Preparatın incelenme yolunun şematik gösterimi Alışık olmayan gözler mikroskop ile yapılan gözlemde heterojen yapıda ve düzensiz şekilde floklar görürler. Filamentli yapıları bazen floklar arasında görürken hareket eden partikülleri de dağılmış olarak görürler. Flok bileşenlerinin rengi gri-sarıdan kahverengi-siyaha değişiklik gösterebilir. Deneyimli gözlemci tüm flokların benzer olmadığını bunların belirgin farklılıkları olduğunu fark edecektir. İncelenebilir görsel değişiklikler aşağıda belirtilenlerdir: Floğun şekli, yapısı, boyutları Floğun kompozisyonu (mikroorganizmalar, ölü partiküller, organik ve/veya inorganik partiküller vb.) Filamentöz mikroorganizmalar Floklara bağlı olmayan bakteriler Diğer Organizmalar (protozoa vb) Mikroskop ile gözlemde doğru büyütme ile çalışmak önemlidir. Büyütme oranı çalışılacak numunenin boyutlarına uyum sağlamalıdır. Örneğin, çapı 1 μm olan bir partikülün 100X büyütmede incelenmesi partikül 0,1 mm ye büyütülmüş olacağından gözlem açısından anlamlı olmayacaktır, partikülün incelenmesi zor olacaktır. 2
Doğru Objektif Seçimi: Analize başlamak için 100X-200X büyütme kullanılabilir. Bu büyütme aşağıda belirtilen bilgilerin toplanması için uygundur: Çamur floklarının şekil, yapı ve boyutları Protozoa ve metazoa nın sayılması ve tanımlanması Filamentöz populasyonun değerlendirilmesi (Filament indeks) Filamentlerin çeşitli özelliklerinin belirlenmesi (Filamentlerin şeklinin, uzunluğunun, diğer mikroorganizmaların yüzeyine tutunup tutunmadığının, floklara bağlı olup olmadığının, sıvıda serbest olup olmadığının tayini. Bu özelliklerin tayini yüksek büyütmede veya boyanmış preparatlarda filamentlerin tanımlanmasında yardımcı olacaktır.) Monokolonilerin incelenmesi. Bunlar flok veya flokların bileşenleri olarak tanımlanır ve tek tip hücreden meydana gelmişlerdir. Monokolonilerin karakteristik bir şekli vardır. Ancak monokoloniler her zaman mevcut değildir (Fosfor akümüle eden organizmalar genellikle monokolonilerde gelişirler). Akabinde 400X büyütmeye geçilir. Bu büyütmede 0,5μm ila 1,0 μm çapa sahip partiküller incelenebilir. Bu büyütmede aşağıdaki hususlara dikkat edilmelidir: Filamentlerin yapısı ve boyutları, flagellatler gibi küçük protozoa. Floklara bağlı olmayan bakteriler. Bunlar bazen karakteristik bir şekle sahiptir (spiroket ve spiral). Flokların dayanıklılığı. Floktaki hücre şekillerinin çeşitliliği ve küçük monokolonilerin varlığı. 3
UYGULAMA Deney Konusu: Aktif çamur numunesinde mikrobiyolojik inceleme ve aktif çamur kalitesinin belirlenmesi. Deney Amacı: Aktif çamurda bulunan bakteri, protozoa ve metazoa tanıları ve flokların şekil, yapı ve sağlamlık tayinleri yapılarak aktif çamur kalitesinin ortaya konması. Deneyin Sonucu: Öğrenci tarafından rapor edilecek. Materyal: Plastik pastör pipet Mikroskop Aktif çamur numuneleri Lam ve lamel Deney: Lam-Lamel Arası Direkt İnceleme Tam karışımlı aktif çamur numunesinden pastör pipet ile 1 damla alınır lam üzerine damlatılır ve üzerine lamel kapatılır. Preparat mikroskopta incelenir. 4
FLOK ŞEKLİ: Kenarı düz veya yuvarlak Kenarı düzensiz FLOK YAPISI: Dağınık Kompakt FLOK SAĞLAMLIĞI: Gevşek Sağlam FLOK OLUŞTURAN BAKTERİLER: GRAM (-) ÇUBUK BAKTERİLER: Zoogloea ramigera Enterobacter aerogenes Escherichia coli Escherichia intermedium Pseudomonas sp. 5
FİLAMENTLİ (İPLİKSİ) BAKTERİLER: FİLAMENT TİPLERİ: Doğrusal Filament Eğrisel Filament Kıvrımlı Filament PROTOZOA: Aktif çamurda yaygın olarak bulunan flagellat ve amoebaların mikrografları. (a) Monas sp. (b) Bodo sp. (c) Polychaos sp. (d) Arcella sp. (Büyütme 1000X, (a) ve (b); 400X (c) ve (d)) 6
Serbest yüzen ve bir yere bağlı siliatların mikrografları. (a) Aspidisca sp. (b) Paramecium sp. (c) Tokophyra sp. (d) Podophyra sp. (Büyütme 400X, (a); 200X (b), (c) ve (d)) Bir yere bağlı siliatların mikrografları (a) Opercularia sp. (b) Vaginicola sp. (c) Vorticella sp. (d) Epistylis sp. (Büyütme 100X, (a); 200X (b), (c) ve (d)) 7
METAZOA: Rotiferlerin mikrografları (Büyütme 100X) Omurgasızların mikrografları (a) Aelosoma sp. (dikenli solucan) (b) Macrobiotus sp. (Tardigrada = su ayıları) (c) Chaetonotus (Gastrotricha = karnı kıllı solucanlar) (d) Nematode (yuvarlak solucanlar) 8