Kullanım manueli Doc. No.:W7.3IU-B2 Yayım Tarihi.:19/06/2008 Ürün Adı ANTISURASE B-96 (TMB) Ürün Kodu 4SBE3 4SBE11 Sınıflandırma Ek II, Liste A (98/79/EC) İnsan serumu ve plazmasındaki Hepatit B yüzey antijenine karşı oluşan Kullanım (Anti-HBs ) antikorların in vitro tespiti için Amacı Test, Hepatit B aşılamasından önce ve sonra bağışıklık durumunun tespiti ve Hepatit B infeksiyonunun izlenmesi amacıyla kullanılabilir. Yasal Üretici GENERAL BIOLOGICALS CORPORATION Adres #6, INNOVATION FIRST ROAD, SCIENCE- PARK, HSIN CHU, TAIWAN, R.O.C. E-mail Sales.group@gbc.com.tw Tel. +886-3-5779221 Faks +886-3-5779227 Avrupa Yetkili Temsilcisi Adres Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80, D-66386 St. Ingbert, Germany Tel. +49 (0) 6894-581020 Fax +49 (0) 6894-581021 E-mail info@mt-procons.com
İçerik Tablosu No İçerik Sayfa 1) Kullanım Amacı 1 2) Özet ve Test Açıklamaları 1 3) Test Prensibi 2 4) Kit İçeriği 2 4.1) Kit ve İçeriğinin Saklama Koşulları 3 5) Kullanım Talimatı 3 5.1) Uyarılar 3 5.2) Örnek Toplama ve Hazırlama 4 5.3) Reaktifleri Saklama Koşulları 4 5.4) Plate Yıkama Prosedürü 5 5.5) Test Prosedürü 5 5.6) Sonuçların Değerlendirilmesi 6 5.7) Test Sonuçlarının Geçerliliği 6 5.8) Sonuç Yorumlama 7 5.9) Sorun Giderme 7 5.10) Sınırlamalar ve Engellemeler 7 5.11) Performans Özellikleri 7 5.11.1) Diagnostik Özgünlük 7 5.11.2) Analitik Duyarlılık 8 5.11.3) Kan Örnekleri Kullanılarak Test Doğrusallığı 8 5.11.4) Diagnostik Duyarlılık 8 5.11.5) Kesinlik 8 5.11.6) İzlenebilirlik 9 5.12) Test Prosedürü İş Akış Şeması 9 6) Notlar 9 7) Bibliyografya 9 1) Kullanım amacı ANTISURASE B-96 (TMB) insan serumu ve plazmasındaki (heparinli, sitratlı ya da EDTAlı) Hepatit B yüzey antijenlerine (HBsAg) karşı üretilmiş antikorların in-vitro kalitatif tespiti için bir Enzim İmmunotest Kiti Bu test, Hepatit B virusu tanısı konmuş ve izlenmekte olan hastalara ek olarak Hepatit B aşısı öncesi ve sonrası immun durumun değerlendirilmesi için kullanılır. 2) Özet ve Test Açıklamaları Hepatit B yüzey antijeni (HBsAg), Hepatit B virusu ile enfeksiyondan sonra ilk görülen antijendir. HBsAg (anti-hbs) ye karşı gelişen antikorlar, HBV ile enkefte olmuş hastların 90% ında, iyileşme sürecinin 3 ila 4. aylarından sonra ve immunitenin korunması için oluşurlar. anti-hbs yokluğu HBV enfeksiyonuna karşı duyarlılık belirlenmesi ve aşının etkili olup olmadığının tanımlanmasını sağlar. Dünya Sağlık Örgütü nün (WHO) raporlarına göre; 10 miu/ml anti-hbs titresine sahip olan kişilerin HBV enfeksiyonuna karşı korunduğu kabul edilmektedir. Anti-HBs ölçümü; infeksiyon ya da aktif immune Hepatit B aşısını takiben serokonversiyon takibi yanında immunizasyon öncesi tarama için de yararlıdır. 100 miu/ml nin altında bulunan Anti-HBs titresi 1 yıl içinde yetersiz antikor gelişimi sonucu aşının tekrarlanması gerektiğini gösterir. Ayrıca, anti- HBs testi, akut HBV enfeksiyonunun seyrini takip edebilmek açısından da yararlıdır. 2
ANTISURASE B-96 (TMB) insan serumu ve plazmasındaki (heparinli, sitratlı ya da EDTAlı) HBsAg antikorlarının kalitatif tespiti için hızlı bir testtir. Bu test katı fazda HBsAg ve peroksidaz konjugat kullanır. Aktive olmamış örnekler ANTISURASE B-96 (TMB) kiti tarafından Anti-HBs için negatif olarak sonuç verir. Pozitif reaksiyon veren örnekler tekrar test edilmelidir. 3) Test Prensibi ANTISURASE B-96 (TMB) "sandwich prensibi" ne dayanan bir solid fazlı enzim immunokitidir (ELISA). Mikrotiter pleytin solid fazı, HBsAg (alttip Ad ve Ay) ile kaplı; likid fazı, peroksidase konjugeli HBsAg (alttip Ad ve Ay) ile kaplı polistren kuyucuklardır. Anti-HBs içeren serum ya da plazma örneği peroksidase konjugeli HBsAg ile birlikte HBsAg kaplı kuyucuklara eklendiğinde ve inkübe edildiğinde kuyucuklarda (antijen)-(anti-hbs)-(antijen peroksidase) kompleksi meydana gelir. Bağlanmamış materyallerin uzaklaştırılması için mikrotiter pleyt yıkandıktan sonra TMB substrat solusyonu kuyucuklara eklenir ve inkübe edilir. Anti-HBs nin HBsAg ye bağlandığı bölgelerde bir renk oluşur. peroxidase-tmb reaksiyonu sülfirik asit eklenmesi ile son bulur. Oluşan rengin optik densitesi, 450nm ile 620 ila 690nm dalga boyları arasında seçilen bir referans dalga boyunda fotometrede okunur *1. Test prensibi aşağıdaki figürde de gösterilmektedir. A Anti-HBs içeren örnekler: 1. Pleyt kuyucukları (HBsAg) + örnek (Anti-HBs)+ HBsAg peroxidase HBsAg Anti- HBs (HBsAg peroxidase) sandwich kompleks 2. Sandwich kompleks + TMB substrat solusyonu açık maviden mavi renge 3. Renk oluşumunun önlenmesi için sülfirik asit eklenmesi 450nm de OD okunması (620-690 nm referans dalgaboyu *8 ) B Anti-HBs içermeyen örnekler: 1. Pleyt kuyucukları (HBsAg) + örnek (Anti-HBs içermeyen) + HBsAg peroxidase HBsAg (kuyucukta) 2. HBsAg (kuyucukta) + TMB substrat solusyonu Renksiz veya açık mavi renk 3. Renk oluşumunun önlenmesi için sülfirik asit eklenmesi 450 nm/620-690 nm de OD okunması *7 4) Kit İçeriği Aşağıdaki tabloda 1-6 maddeleri 2-8 C de saklanmalıdır. Yıkama solusyonu D (20X) ve 2N H2SO4 2-30 C de saklanabilir. NO (1) (2) (3) Materyal Kodu 3B040MPS G 3B071CON SGE3 3B090P3HS B3 Ürünler 3 Açıklama 96 test için miktar HBsAg Plate HBsAg ile kaplı mikrotiter plate 1 plate HBsAgPeroxi dase Solusyonu Anti-HBs Pozitif Kontrol HBsAgHRPO konjugat, bufferda protein stabilizatörü ile seyreltilmiş Koruyucular: 0.003% Gentamycin 0.01% Thimerosal. Anti-HBs pozitif inaktive edilmiş insan serumu, bufferda protein stabilizatörü ile seyreltilmiş Koruyucular: 0.003% Gentamycin ve 0.01% Thimerosal. 8 ml 1.5 ml
3B110N4H (4) D3 HB Negatif Kontrol 3B135TMB- TMB Substrat (5) A Solusyonu A 3B140TMB- TMB Substrat (6) B Solusyonu B Konsantre Yıkama (7) 3B112PBS3 Solusyonu D (20X) 3B155SACI (8) 2N D2N H2SO4 AKSESUARLAR: (ihtiyaç duyulduğunda) NO Materyal Kodu Ürünler (9) 2P951001 Yapışkan slipler (10) 2P505001 Emici tamponlar (11) 2P403001 Siyah kapak HBV markırları için aktif olmayan serum, bufferda protein stabilizatörleri ile seyreltilmiş. Koruyucular: 0.003% Gentamycin ve 0.01% Thimerosal. 0.6 mg/ml 3, 3, 5, 5 -tetramethylbenzidine (TMB), organik tabanlı Sitrik Asit Buffer, 0.03% H2O2 içeren.. Tween-20 ile konsantre Fosfat buffer 2N H2SO4 (sülfirik asit) 2 ml 12 ml 12 ml KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER NO Ürünler (1) 50µl, 100µl mikropipetler ve uçlar (2) +37 C ayarlanabilen su banyosu ya da inkübatör (3) Plate yıkama ekipmanları ELISA Mikroplate Okuyucu: (4) İkili dalgaboyu 450nm ile referans dalgaboyu olarak 620-690nm, bant genişliği 10nm *1. Opsiyonel olarak tam otomatik EIA mikroplate analizör. Kullanıcı otomatik EIA (5) mikro-plate analizörün kit ile validasyonlarını yapmalıdır. 58 ml 12 ml 4.1) Kit ve İçeriğinin Saklama Koşulları* Kit/İçerik ANTISURASE B-96 (TMB) KIT Anti-HBs Pozitif Kontrol HB Negatif Kontrol HBsAg Plate HBsAg HRPO Konjugat Solusyonu Konsantre Yıkama Solusyonu D (20X) 20X Seyreltilmiş Yıkama Solusyonu TMB substrat Solusyonu A TMB substrat Solusyonu B Saklama Sıcaklığı Durum Saklanabilirl ik Orjinal 15 ay Bir defa açılmış 1 ay Orjinal 15 ay Bir defa açılmış 1 ay Orjinal 15 ay Bir defa açılmış 1 ay Orjinal 24 ay Bir defa açılmış 2 ay Orjinal 15 ay Bir defa açılmış 1 ay Oda Orjinal 24 ay sıcaklığı Bir defa açılmış 1 ay Oda sıcaklığı Seyreltilmiş 2 gün Seyreltilmiş 1 hafta Orjinal 24 ay Bir defa açılmış 1 ay Orjinal 24 ay Bir defa açılmış 1 ay 4
2N Sülfirik Asit Oda sıcaklığı Orjinal Bir defa açılmış 24 ay 1 ay 5) Kullanma Talimatı 5.1) Uyarılar: 5.1.1) Bu kit sadece prosefyonel kullanım içindir. 5.1.2) Bu kit sadece in-vitro teşhis içindir. 5.1.3) Kullanmadan önce bütün reaktifleri ve numuneleri oda ısısına çıkarın (20-30ºC) ve dikkatlice karıştırın. 5.1.4) Reaktifleri son kullanma tarihinden sonra kullanmayınız. 5.1.5) Farklı lottaki reaktifleri karıştırmayınız. 5.1.6) Ağızla pipetleme yapmayınız. 5.1.7) Örneklerin veya reaktiflerin kullanıldığı bölgede yemek yemeyiniz ya da sigara içmeyiniz. 5.1.8) Tüm kit içeriğinin ve örneklerin potansiyel sağlık riski taşıdığını göz önünde bulundurunuz. Kullanımları ve atılımları laboratuvarınızın güvenlik prensiplerine gore yapılmalıdır. Bazı güvenli ürünler koruyucu eldiven giyilmesini ve aerosol kullanımından kaçınılmasını gerektirebilir. 5.1.9) Enfeksiyonlu numuneler ve asit ihtiva etmeyen maddeler döküldüğünde %5 sodyum hipoklorid ile temizlenmelidir ya da sizin daha önceden biyo-zararlı ürünler için uygulamakta olduğunuz uygulamalar ile temizlenmelidir. 5.1.10) Bütün atık materyalleri atılmadan önce uygun olarak dezenfekte edilmelidir. Hem sıvı hem de katı faz en az 1 saat 121ºC de otoklavlanmalıdır. Katı faz aynı zamanda yakılabilir. Asitsiz likit atık %1 son konsantrasyona karşı seyreltilmiş sodium hipoklorid ile kullanılabilir. Asit içeren likit atıklar yukarıda belirtilen şekilde kullanılmadan önce nötralize edilmeli ve etkili dezenfeksiyon elde etmek için 30 dakika beklenmelidir. 5.1.11) 2N Sülfirik Asit; deri, gözler, solunum yolu ve mukoz membranlar için tahriş edicidir. 2N Sülfirik asitin deri ve mukoz membranlar ile temasından kaçınınız. Temas etmesi halinde bol miktarda su ile yıkayınız. İnhalasyonu olması halinde temiz hava alınız ve ağrı hissetmeniz durumunda mutlaka doktora başvurunuz. 5.1.12) TMB substrat solusyonu A yanıcı organik çözücüler içermektedir. TMB substrat solusyonu A deri ve mukoz membranlar için tahriş edicidir. 5.1.13) Tüm insan kaynaklı materyallerin Anti-HCV ve Anti-HIV aktivitelerinin olmadığı test edilmesine ve 1 saat içinde +56 C de inaktive 5
olmasına rağmen, reaktifler potansiyel enfeksiyon ajanı olarak değerlendirilmelidir *2. 5.2) Örnek Toplama ve Hazırlama 5.2.1) Kan alımından önce hastalarda özel bir hazırlık yapılması gerekmemektedir. Kan, Kabul görmekte olan medikal yöntemler ile alınmalıdır. 5.2.2) Bu kit ile serum ve plazma kullanılabilir. Tam kan örnekleri hemolizi önelemek için hemen ayrılmalıdır. Pıhtılar (fibrin ağı, eritrositler, ) kullanımdan önce uzaklaştırılmalıdır. 5.2.3) Örnekler kullanılmadan önce 2-8 Cde saklanmalı ve bozulmaları önlemek için ısı inaktivasyonundan kaçınılmalıdır. Uzun süreli saklamalar için -20 C nin altında dondurulmalıdır. Kendi kendine buz çözücü özelliği olan soğutucular kullanılması önerilmez. 5.2.4) Dondurulmuş örnekler çalışılmadan önce tamamen çözdürülmeli ve homojen olarak karıştırılmalıdır. 5.2.5) Arka arkaya dondurup çözdürmekten kaçınınız. 5.2.6) UYARI 1. Örnekler peroksidaz aktivitesini önleyici bir AZID içeriği ihtiva etmemelidir. 2. Tam olarak koagüle olmamış serumlar ve mikrobiyal içeriği olan örnekler kullanılmamalıdır. 5.3) Reaktiflerin Saklama Koşulları 5.3.1) Kit 2-8 C de saklanmalıdır. Dondurmayınız. 5.3.2) Plate stripleri orjinal aliminyum folyosu açıldıkan sonra 1 ay içinde kullanılmalıdır. Kullanılmayan stripler aliminyum folyo içinde saklanmalı ve ağzı sıkıca bantlanmalıdır. 5.3.3) Kullanımdan hemen sonra reaktifleri 2-8 C de saklayınız. 5.3.4) Yıkama solusyonu D (20X) konsantre, kristalleşmeyi önlemek için oda ısısında saklanmalıdır. Eğer kullanımdan önce kristal çökelme yaparsa kristallenme çözülünceye kadar 37 C su banyosu içinde bekletilmelidir. 5.4) Plate Yıkama Prosedürü 5.4.1) Yıkama Solusyonu Hazırlanması: Yıkama Solusyonu D (20X) Konsantreyi distile veya deiyonize su ile 1:20 oranında seyreltiniz. Musluk suyu kullanmayınız. 5.4.2) Plate Yıkanması: (a) Aspire/dağıtım fonksiyonlu cihazlar ile plate yıkanması: Herbir siklusta herbir kuyucuk en az 0.5ml yıkama solusyonu ile 6 kez yıkanmalıdır. Ya da (b) Aspire/dağıtım fonksiyonlu cihazlar kullanılmadan plate yıkanması: Herbir siklusta herbir kuyucuk en az 0.35ml yıkama solusyonu ile 8 kez yıkanmalıdır. 5.4.3) Pleyti tersyüz ederek sıvılarını akıtınız ve absorbent kâğıt üzerinde kurutunuz. Çok fazla atık yıkama solusyonu kalması test sonuçlarınızı olumsuz etkileyecektir. 6
UYARI Uygun olmayan yıkamalar hatalı sonuçlara neden olacaktır. 5.5) Test Prosedürü 5.5.1) Kullanmadan önce tüm reaktifleri ve örnekleri oda ısısına (20-30 C) getiriniz. Su banyosu ya da inkübatörü +37±1 C ye ayarlayın. 5.5.2) Blank için bir tane kuyucuk bırakın. Mikrotiter pleytin uygun olan kuyucuklarına kontrol ve örneklerden 50 µl ekleyiniz. (3 Negatif kontrol ve 2 Pozitif Kontrol). NOT: a) Çapraz kontaminasyonu önlemek için herbir örneği yüklerken yeni ve temiz pipet ucu kullanınız. b) Herbir pleyt ayrı negatif kontrol, pozitif kontrol ve blank kuyucuğu yüklemesine ihtiyaç duyar. c) Farklı kesim noktası değeri kurulmuş diğer Anti-SURASE B-96 (TMB) pleytlerini kullanmayınız. 5.5.3) Blank haricindeki herbir kuyucuğa 50 µl HBsAg Peroksidaz Solusyonu ekleyiniz. NOT: Olası kontaminasyonları önlemek için pleyt duvarlarına değmeden yükleme yapınız. 5.5.4) Pleyti yavaşça sallayınız. 5.5.5) Yapışkan slipten arka kısmını ayırın ve sıkıca reaksiyon pleytin üzerini kaplayacak şekilde bastırınız. 5.5.6) Reaksiyon pleytini +37±1 C deki su banyosunda ya da inkübatörde 80 dakika inkübe ediniz. 5.5.7) İnkübasyon periyodunun sonunda yapışkan slipi çıkarıp atın ve 5.4)de belirtilen pleyt yıkama prosedürüne gore pleyti yıkayınız. 5.5.8) Renk gelişimi için aşağıdaki iki yöntemden birini seçiniz: A. Kullanmadan önce temiz bir kapta TMB Substrat Solusyonu A ve B yi eşit miktarlarda karıştırınız. Blank kuyucuğu da dahil olmak üzere herbir kuyucuğa 100 l karıştırdığınız mix solusyondan ekleyiniz. B. Blank kuyucuğu da dahil olmak üzere herbir kuyucuğa önce 50 l TMB Substrat Solusyonu A, sonra 50 l TMB Substrat Solusyonu B ekleyiniz. Dikkatlice pleyti çalkalayınız. NOT: TMB Substrat Solüsyon A renksiz veya açık mavi renkli olmalıdır.aksi takdirde dökülmelidir. TMB Substrat Solusyonu A ve B nin karışımı miks hazırlandıktan sonraki 30 dakika içinde uygulanmalıdır. Miks solusyon yoğun ışıktan uzak tutulmalıdır. 7
5.5.9) Pleytin üzerini siyah kapak ile kapatıp oda sısında 30 dakika bekletiniz. 5.5.10) Reaksiyonu durdurmak için blank de dâhil herbir kuyucuğa 100 µl 2N H2SO4 eklenmelidir. 5.5.11) Hassas bir spektrofotometre ile 30 dakika içinde kontrollerin ve test örneklerinin 450/620-690nm de absorbanslarını ölçünüz *7. Blank kuyucuğu için blank spektrometre uygulayınız. NOT: Blankin rengi renksizden açık sarıya dönmelidir; aksi takdirde test sonuçları geçersizdir. 5.6) Sonuçların Değerlendirilmesi 5.6.1) NCx Hesaplanması (Negatif Kontrol Absorbansı). Örnek: Örnek No. Absorbans 1 0.015 2 0.016 3 0.014 NCx = (0.015+0.016 + 0.014) / 3 = 0.015 NCx 0.2 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir. 5.6.2) PCx Hesaplanması (Pozitif Kontrol Absorbansı) Örnek: Örnek No. Absorbans 1 0.846 2 0.902 PCx = (0.846 + 0.902) /2 = 0.874 PCx 0.5 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir. 5.6.3) P - N Değeri Hesaplanması P - N = PCx NCx Örnek: NCx = 0.015 PCx = 0.874 P - N = 0.874-0.015 = 0.859 P - N Değeri 0.3 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir. 5.6.4) Kesim Noktası (Cutoff) Değeri hesaplanması Kesim Noktası Değeri = NCx + 0.025 Örnek: Kesim Noktası Değeri = 0.015 + 0.025 = 0.040 5.6.5) Yeniden Test Aralığı Hesaplanması Yeniden Test Aralığı = Kesim Noktası Değeri ± 10% Örnek: Kesim Noktası Değeri = 0.040 Yeniden Test Aralığı = (0.040-0.004) den (0.040 +0.004) = 0.036 dan 0.044 8
5.7) Test Sonuçlarının Geçerliliği 5.7.1) NCx 0.2 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir. 5.7.2) PCx 0.5 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir. 5.7.3) P - N Değeri 0.3 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir. 5.8) Sonuç Yorumlama 5.8.1) (0.9 x Kesim (Cutoff) Noktası Değeri) den daha düşük absorbans değerine sahip örnekler aktive olmamış ve Anti-HBs için NEGATİF olarak değerlendirilir. 5.8.2) (1.1 x Kesim (Cutoff) Noktası Değeri) den daha yüksek absorbans değerine sahip örnekler aktive olmuş ve Anti-HBs için POZİTİF olarak değerlendirilir. 5.8.3) (Kesim (Cutoff) Noktası Değeri ± 10%) absorbans değerine sahip örnekler tekrar test edilmeli ve yukarıdaki maddelere gore değerlendirilmelidir. Tekrar edilen sonuçlarda da yeniden test aralığı sonuçları elde edilirse bu hastalar bilinmeyen olarak rapor edilmelidir. 5.9) Sorun Giderme Eğer sonuç alınamazsa, aşağıdaki sorun giderme maddelerini kontrol ediniz: 5.9.1) Yanlış yıkama prosedürü uygulanması. 5.9.2) Pozitif örnekler ile kontaminasyon. 5.9.3) Örnek, konjugat ya da substrattan yanlış miktarlarda uygulama. 5.9.4) Kuyucuk kenarının konjugat ile kontamine olması. 5.9.5) Örneğin; sediment içeren örnek, hemolize olmuş serum ya da plazma gibi yanlış örneklerin kullanılması ya da kullanımdan önce örneklerin iyi karıştırılmaması. 5.9.6) Yanlış inkübasyon zamanı ya da sıcaklığı uygulanması. 5.9.7) Aspiratör/dağıtıcı cihazların başlıklarının ya da iğnelerinin tıkanması. 5.9.8) Yetersiz aspirasyon. 5.10) Sınırlamalar ve Engellemeler 5.10.1) Bu reaktif kiti sadece insan serumu ve plazması için kullanılır. 5.10.2) Bu reaktif kiti kadavra örnekleri için kullanıma uygun değildir. 5.10.3) Teknisyenden ya da bozuk cihazlardan kaynaklanan büyük teknik hatalardan ötürü her enzim immunotest kiti ile tekrar edilemez yanlış pozitif sonuçlar alınabilir. 5.10.4) Bazen tekrar edilebilir yanlış sonuçlar ( 2%) görülebilir. 5.10.5) Anti-HBs negatif bulunan sonuçların olası Hepatit B enfeksiyon riskini yok ettiği söylenemez. 5.10.6) ANTISURASE ile bulunan düşük pozitif sonuçlar Hepatit B virusune karşı korunduğuna ve Hepatit B virus enfeksiyonu olmayacağına kanıt olarak kullanılamaz. 5.10.7) Anti-HBs pozitif örnekler, standart materyaller ile seyreltmelerde daima doğrusal seyreltme özellikleri göstermeyebilirler. 5.10.8) Çeşitli Karışımlar: Çeşitli denemeler sonucunda elde edilen sonuçlar aşağıdadır: 9
1. Lityum heparinli, EDTA lı, sitratlı gibi farklı antikoagülantlar karıştırılmamalıdır. 2. Isı ile muamele edilmiş örneklerin (+60 C, 10 saat) HBsAg titresini azalttığı görülmüştür. 3. Aşağıdaki durumların oluştuğu örnekler kullanılarak yapılan testlerde çapraz reaksiyon oluşmadığı gözlemlenmiştir: a) HAV, EBV, CMV, HSV, VZV, Lyme Borreliosis, HCV, HIV enfeksiyonları, b) Kronik renal bozukluk, hemodiyaliz, otoimmun hepatit, karaciğer sirozu, c) HAMA, GAD, IA2, APS gibi antikorların kesin varlığı. 4. Çeşitli karışımlar içeren örnekler [trigliserit (lipemia), hemoglobin (hemolizis), bilirubin (sarılık), monoklonal immunoglobulin komponentleri, yüksek oranda otoimmun antikorlar (rheumatoid factor-rf, antinuclear antibodies-ana ya da antimitochondrial antibodies-ana)] ve hamile bayanlardan alınmış örnekler ile yapılan çalışmalar ANTISURASE B-96 (TMB) kiti ile çalışmalarda kullanılabilir. 5.11) Performans Özellikleri 5.11.1) Diagnostik Özgünlük HBV Negatif "Donor" ve "Klinik" örneklerinin GB ANTISURASE B-96 (TMB) AntiHBs - Reaktivitesi Avrupa Performans Değerlendirme sonuçları Anti-HBs Negatif Örnek Örnek Sayısı Negatif Seçilmemiş donor örnekleri 400 400 Hastaneye kaldırılan örnekler 134 134 Müdahale edilen örnekler 50 49 Toplam 584 583 Diagnostik özgünlük = 583/584 = 99.83% 5.11.2) Analitik Duyarlılık Seyreltilmiş Anti-HBs Standartları kullanılarak tespit etme sınırı tanımlanmıştır. Diğer PEI Anti-HBs Standartları kullanılarak GB ANTISURASE B-96 (TMB) kiti için 3.6 miu/ml anti-hbs analitik duyarlılığı tanımlanmıştır. 10 miu/ml anti-hbs için S/CO yaklaşık 1.60 dır. Rutin testlerde, 10 miu/ml Anti-HBs ( koruyucu titre ) nin yaklaşık kesim noktası değerini yakalayabilmek için pozitif sonuçların 1.6x standard/co değerinde kalmasını sağlamak için kesim noktasının artırılması için kullanılabilir. 5.11.3) Kan Örnekleri için Test Doğrusallığı Sınırlı dilusyon adımlarında kesim noktası seviyesi civarından ve testin ölçüm aralığı boyunca seyreltilmiş iki adet yüksek titrede Anti-HBs pozitif serum örnekleri kullanılarak doğrusallık ölçülmüştür. GB ANTISURASE B-96 (TMB) kiti, 3.6 ve 240 miu/ml dilusyonlar arasında doğrusal davranışlar sergilemektedir. 5.11.4) Diagnostik Duyarlılık 5.11.4.1) HBV ile enfekte olmuş kişiler 10
Anti-HBs pozitif örnekler Örnek sayısı Pozitif sonuçlar Doğal olarak enfekte olmuş kişiler 125 125 Hepatit B aşısı olmuş kişiler 111 111 Toplam 235 235 Diagnostik duyarlılık= 235/235= 100% 5.11.4.2) Ticari HBV serokonversiyon paneli 4 ticari geçerli HBV serokonvensiyon paneli, akut hepatit B hastalarından aylık ya da haftalık periyotlarla örnek alınmasının takibini yapmaktadırlar. GB ANTISURASE B-96 (TMB) kiti, Anti-HBs referans kitlerinden daha duyarlıdır. 5.11.4.3) Takip Edilen Örnekler Hepatit B aşısı olan 22 sağlıklı kişiden alınan örnekler gözlemlenmiştir. Bu test Hepatit B aşısından önce ve 3-6 ay sonra alınan örneklere uygulanmıştır. 22 kişide de aşıdan 3 ay sonra alınan tüm örneklerde ANTISURASE B-96 (TMB) kiti ile Anti-HBs için serokonversiyon belirlenmiştir. Diğer taraftan; Anti-HBs referans kitleri ile yapılan çalışmalar sonucunda 20 kişide aşıdan 3 ay sonra alınan örneklerde, 2 kişide ise aşıdan 6 ay sonra serokonversiyon belirlenmiştir. Bu da ANTISURASE B-96 (TMB) kitinin Anti-HBs referans kitlerine gore daha duyarlı olduğunu göstermektedir. 5.11.5) Kesinlik 5.11.5.1) Doğruluk: çalışma içi tekrar edilebilirlik ve çalışmalar arası çoğalabilirlik ANTISURASE B-96 kiti pozitif kontrolü (800 miu/ml) ve Anti-HBs seviyesi kesim noktasının hemen üzerinde ve orta seviyede olan iki serum örneği 3 gün içinde tek bir çalışma ile 20 replikasyonda test edilmiştir. Aşağıdaki tabloda çalışma içi tekrar edilebilirlik ve çalışmalar arası çoğalabilirlik değerleri görülmektedir: Test edilmiş Ürünler Örnek Boyutu Kesinlik Pozitif çalışma-içi N = 20 CV 10.27% Kontrol çalışmalar arası N = 60 CV 7.11% Hasta çalışma-içi N = 20 CV 7.57% Serumu #1 çalışmalar arası N = 60 CV 7.17% Hasta Serumu #2 çalışma-içi N = 20 CV 9.05% çalışmalar arası N = 60 CV 7.71% 5.11.6) İzlenebilirlik GBC Anti-HBs Uzman Kalibratörü, İngiliz Çalışma Standartlarına karşı, ANTISURASE B-96 (TMB) kitini kullanarak Anti-HBs için kalibrasyon yapılmıştır (W1042). İngiliz Çalışma Standartlarının Anti-HBs rölatif oranına karşı GBC Anti-HBs Uzman Kalibrasyonu 1.205 dir (1.117-1.297 95% CI). ANTISURASE B-96 (TMB) kiti Pozitif Kontrol konsantrasyonu GBC Anti-HBs Uzman Kalibratörüne karşı 800 miu/ml ±20% olarak saptanmış ve yayınlanmıştır. 11
5.12) Test Prosedürü İş Akış Şeması 6) Notlar Kuyucuklara önce 50 µl kontrollerden (3 x NC, 2 x PC) ve sonra kalan kuyucuklara 50 µl herbir örnekten ekleyin. Bir kuyucuk blank için ayırın. Blank kuyucuğu hariç herbir kuyucuğa 50 µl HBsAgPeroksidase Solusyonu ekleyin. Pleyti 1 saat +37±1 de inkübe edin. Pleyti yıkayın. (Renk gelişimi için iki enzimatik reaksiyondan birini seçin) Pleyti oda ısısında 30 dakika inkübe edin. Herbir kuyucuğa 100 µl 2N sülfirik asit ekleyin. 450 nm de ve referans dalga boyu olarak 620-690 nmde absorbanslarını ölçün. *1 Referans dalga boyu fotometrede 620 nm den 690 nm ye kadar kullanılabilir. Buna rağmen, kullanımdan önce fotometre değeri ANTISURASE B-96 (TMB) ile kombine edilmelidir. *2 +60 C de 10 saat muameleden sonra hepatit B virusunun tamamlanmamış inaktivasyonu, J. Infect. Dis. 138:242-244. 7) Bibliyografya TMB Substrat Solusyonu A ve B den eşit miktarlarda karıştırın.karışımda n herbir kuyucuğa 100 µl ekleyin. Herbir kuyucuğa önce 50 µl TMB Substrat solusyonu A, sonra 50 µl TMB Substrat Solusyonu B ekleyin. Dikkatlice pleyti sallayın. 1. Hoofnagle JH, Di Bisceglie AM. Serologic diagnosis of acute and chronic viral hepatitis. Sem Liver Disease. 1991;11:73 83. 2. Lander JJ, Holland PV, Alter HJ, Chanock RM, Purcell RH. Antibody to hepatitis-associated antigen. Frequency and pattern of response as detected by radioimmunoprecipitation. J Am Med Assoc. 1972;220:1079 1082. 3. Deinhardt F, Zuckerman AJ. Immunization against hepatitis B: Report on a WHO meeting on viral hepatitis in Europe; J Med Virology 1985;17:209 217. 4. Ambrosch F, Courouce AM, Coursaget P et al. International Group. Immunisation against hepatitis B. Lancet 1988;16: 875-876. 5. Jilg W, Schmidt M, Deinhardt F. Persistence of specific antibodies after hepatitis B vaccination. Hepatol. 1988; 6:201-207. 6. European Consensus Group on Hepatitis B immunity: Are booster immunisations needed for lifelong hepatitis B immunity? Lancet. 2000;355:561 565. 12
Spektrometre in referans dalga boyu 620nm ile 690nm olmalıdır. Böylece, kullanıcı kullanım öncesi bu kit ile spektrometre ile valide edilmelidir. Symbols Key / Symbolschlussel / Explication des Symboles / Interpretazione simboli / Clave dos Simbolos / İşaret Açıklamaları Manufacturer / Hersteller / Fabricante / Fabbricante / Fabricant / Fabricante / Üretici In Vitro Diagnostic Medical Device / In-Vitro-Diagnostikum / Producto sanitario para diagnóstico in vitro / Dispositivo medico-diagnostico in vitro / Dispositif médical de diagnostic in vitro / Dispositivo médico para diagnóstico in vitro / İn-vitro Diagnostik Tıbbi Bakım Batch code / Chargenbezeichnung / Código de lote / Codice del lotto / Code du lot / Código do lote / Parti Kodu Use By / Verwendbar bis / Fecha de caducidad / Utilizzare entro / Utiliser jusque / Prazo de validade / İle kullanım Temperature limitation / Temperaturbegrenzung / Límite de temperatura / Limiti di temperatura /Limites de température / Limites de temperatura / Sıcaklık Limitleri CE Mark / CE-Zeichen / Marquage CE / Marchio CE / CE Marca / Marca CE / CE İşareti Catalogue number / Bestellnummer / Número de catálogo / Numero di catalogo / Référence du catalogue / Referência de catálogo / Katalog Numarası Consult Instructions for Use- / Gebrauchsanweisung beachten / Consulte las instrucciones de uso / Consultare le istruzioni per l'uso / Consulter les instructions d'utilisation / Consulte as instruções de utilização / Kullanım için Danışma Bilgileri 13