0318 1 TR SP008: Klinik örneklerde Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae ve Legionella pneumophila nın kalitatif belirlenmesi için oligokromatografik test. 24 test. GİRİŞ: SPEED-OLIGO BACTERIAL PNEUMONIA COMBI Chlamydophila pneumoniae akut ve kronik hastalıkların geniş çeşitliliğiyle ilgisi olan zorunlu hücreiçi bir bakteridir. Pnömoni ve bronşit C. pneumoniae enfeksiyonlarının çok yaygın klinik belirtileridir. Toplulukta edinilen pnömoni vakalarının yaklaşık %10 u bu patojen ile ilgilidir. Solunum sistemine ait C. pneumoniae enfeksiyonu dünyaçapında ve tüm yaş gruplarında ortaya çıkmaktadır. Seroepidemiyolojik çalışmalar göstermiştir ki yetişkinlerin %50 ila 75 i C. pneumoniae'ye karşı antikora sahiptir. Çoğu insan hayatları boyunca bir veya birkaç kez enfekte olmuştur. C. pneumoniae enfeksiyonu tanısı için laboratuvar metodları hücre kültüründen organizmanın izolasyonu, serolojik testler ve DNA amplifikasyon testlerini kapsar. Tekniğin karmaşıklığı ve verimin değişkenliğinden dolayı C. pneumoniae kültürü birkaç laboratuvar ile sınırlıdır. Hücre kültürünün duyarlılığını düzeltmek için gösterilen çabaya rağmen, dünya çapında C. pneumoniae nın birkaç izolatı elde edilmiştir. Antikor testleri C. pneumoniae enfeksiyonlarının tanısı için halen kullanılmakta olan en yaygın testlerdir. Serolojik test doğru bir tanı, retrospektif bir tanı vermek için eşleşmiş serum örnekleri gerektirir. IgG belirlenmesi 6-8 hafta gerektirirken, IgM antikorları enfeksiyondan 2-3 hafta sonra ortaya çıkar. Bu durumda, PCR C. pneumoniae enfeksiyonunun belirlenmesi için daha hızlı bir alternatif sağlar, amplifikasyona dayanan yüksek duyarlılığından dolayı diğer direkt tanı metodlarının yerini almaktadır. Antikor yanıtı yokken, hastalığın ilk aşamalarında solunum salgılarındaki patojenin belirlenmesini sağlar. Çift hibridizasyon tabanlı metod ile arttırılmış ürünlerin belirlenmesi testin spesifikliliğini arttırır ve duyarlılığını güçlendirir. Mycoplasma pneumoniae toplumdaki kazanılmış pnömoni vakalarının %15-30 'una neden olan sık sık karşılaşılan bir patojendir. Çoğu nispeten hafif ve yaklaşık olarak enfeksiyonların %15 i asemptomatik olarak kalır, fakat daha ağır ve hatta ölümcül vakalar gerçekleşebilir. M. pneumoniae tarafından meydana gelen pnömoni en sık çocuk ve ergenlerde gözlenir. Kültürden organizmanın izolasyonu ve serolojik testler ile belirlenmesiyle klasik tanı metodları oluşmuştur. Patojenlerin titiz doğası ve yüksek seroprevalansı bu prosedürlerin temel dezavantajıdır. M. pneumoniae nın izolasyonu yavaş ve duyarsızdır. M. pneumoniae enfeksiyonunun tanısı için seroloji önemli bir araçtır. IgM belirlenmesi veya IgG serolojik değişiminin örneklerde eşleşmesi serolojik metodlarda tercih edilir. Birçok yetişkinde IgM cevabının eksikliği büyük bir dezavantajdır, IgG-tabanlı tanı sadece geçmişe yönelik elde edilebilir. PCR solunum sistemine ilişkin örneklerdeki M. pneumoniae nın belirlenmesi için seçme yöntemidir, amplifikasyona dayalı yüksek duyarlılığından dolayı tanıda kullanılan diğer direk metodların yerini almıştır. Antikor yanıtı yokken, hastalığın ilk aşamalarında solunum salgılarındaki patojenin belirlenmesini sağlar. Her ne kadar bazı hastalarda aylarca M. pneumoniae solunum sisteminde bulunabilsede, hastalığın geç safhalarında daha az sıklıkla belirlenir. Çift hibridizasyon tabanlı metod ile arttırılmış ürünlerin belirlenmesi testin spesifikliliğini arttırır ve duyarlılığını güçlendirir. Legionellosis klasik olarak iki farklı klinik prezantasyona sahiptir: Legionnaires hastalığı, pnömoni nin diğer tiplerinden klinik olarak seçilemeyen pnömoni nin ağır bir biçimidir ve Pontiac ateşi grip benzeri bir hastalıktır. Ek olarak, serolojik olarak Legionella ya dönüştüren çoğu kişi tamamen asemptomatik olacaktır. Her ne kadar 50 den fazla türü raporlanmış olsa da, L. pneumophila Legionnaires' hastalığı vakalarının %90 dan fazlasından sorumludur. Tanının direk metodları kültürleme, direk floresan boyama ve idrarda antijen belirlenmesini kapsamaktadır. İlk iki metod düşük ve değişken duyarlılık göstermektedir, sonuncusu çoğu laboratuvarda referans teknik olmuştur, kolay ve legionellosis in erken tanısına olanak sağlamaktadır. Ancak, antigenuria daima tüm hastalarda bulunmaz ve bu tanı testine toplam bağlılığı legionellosis vakalarının %40 kadar çok yakalayamayabilir. Her ne kadar serolojik verimliliği duyarlılığı ve spesifiklik verisi iyi olsa da, IgM belirlemesinin özellikle direkt metodların uygun tamamlayıcısı olduğu ispatlanmış olsa da, ölçülebilir antikor cevabı oluşumundaki gecikme akut hastada tanı için büyük bir eksiklik oluşturmaktadır. Balgam, idrar ve kanda L. pneumophila genlerinin PCR-tabanlı belirlenmesi referans ve araştırma laboratuvarlarında başarıyla kullanılmıştır. Çoğu hızlı test sadece L. pneumophila serogrup 1 nedeniyle oluşan enfeksiyonları belirlediği için, doğru PCR testi tüm serogrupları kapsayarak bu enfeksiyonların tanı yeteneğinde büyük bir artış sağlar. Çift hibridizasyon tabanlı metod ile arttırılmış ürünlerin belirlenmesi testin spesifikliliğini arttırır ve duyarlılığını güçlendirir. Çoğu PCR testi yoğun çalışma veya duyarsız belirleme sistemlerinin ikisinden birinin kullanımına sahiptir. SPEED-OLIGO BACTERIAL PNEUMONIA COMBI daldırma şeritiyle birleştirilmiş bir PCR-tabanlı metodtur, klinik örneklerde C. pneumoniae, M. pneumoniae ve L. pneumophila nın hızlı, yüksek duyarlılıkta ve spesifik olarak belirlenmesine olanak sağlar. Temin edilen PCR karışımları C. Pneumoniae nın ompa gen fragmanları amplifikasyonu için, M. pneumoniae nın P1 gen fragmanları amplifikasyonu için ve L. pneumophila nın MIP gen fragmanları için spesifik oligo çiftlerini içerir. Belirleme aralığı L. pneumophila nın tüm serogruplarını kapsar fakat diğer non-pneumophila türlerini kapsamaz. Kit kolaylıkla kullanılacak şekilde tasarlanmıştır. PCR thermocycler kullanımına bağlı olarak amplifikasyon adımı 15 ila 75 dakika kadar bir zaman alır, oysa daldırma şeriti ile belirlemek için sadece 5-10 dakika gereklidir. PCR karışımının liyofilize sunumu kontaminasyonu önlemek için kullanım ve pipetleme prosedürlerini minimize eder. TESTİN PRENSİBİ: Testin prensibi spesifik C. pneumoniae, M. pneumoniae ve L. pneumophila gen fragmanlarının amplifikasyonuna dayanır ve C. pneumoniae, M. pneumoniae ve L. pneumophila enfeksiyonlarının hızlı tanısına olanak sağlar. Test, örnekte amplifikasyon inhibitörlerinin taşınmadığı durumların kontrolü için iç amplifikasyon kontrolü içermektedir ve doğru amplifikasyon oluşmaktadır. Kontrol, DNA fragmanı ve onun amplifikasyonu için spesifik oligo çiftinden oluşmaktadır. Teknik üç ana adıma bölünmüştür: DNA ekstraksiyonu, spesifik oligo çiftiyle amplifikasyonu ve çoğaltılmış ürünlerin belirlenmesi. Belirleme daldırma şeriti ile gerçekleştirilir. İki defa amplifikasyon yapıldığında, amplifikasyon kontrol ve spesifik test amplicon denatüre olur ve stripte ilerlemesine olanak sağlar. PCR fragmanları, altın partiküllerinin kolloidal süspansiyonu ile birleştirilmiş spesifik oligonükleotidler ile reaksiyon verir. Sonra PCR ürünleri ve kolloidal altın kompleksi spesifik problara (test çizgisi ve PCR amplifikasyon kontrol çizgisi) ulaşana kadar membrandan yukarı doğru ilerler, ikinci hibridizasyonun meydana geldiği yer. Altın probun tamamlayıcı oligonükleotidler ile hibridizasyonundan artan kısmın membran tarafından absorbe edilmesinden dolayı ürün kontrol çizgisi ortaya çıkar. Altın reaksiyonunun olduğu konumda kırmızı çizgiler görünür hale gelir. Bu teknik geleneksel PCR dan daha duyarlı ve daha spesifiktir. Çift hibridizasyon spesifik ve spesifik olmayan amplifikasyon fragmanları arasındaki ayırımı sağlar.
2 Hassas mikropipet (10-200 µl) Aerosol bariyerli steril uçlar Tek kullanımlık eldivenler 55ºC±2ºC ısıtıcı blok 1.5 ml lik mikrosantrifüj tüpleri Mikrosantrifüj PCR odası (tavsiye edilen) Vorteks KİT ÖZELLİKLERİ: Kit DNA amplifikasyonu ve hibridizasyon prensiplerine dayanmaktadır. Kontaminasyon riskinden dolayı Tavsiyeler ve önlemler bölümünün dikkatle okunması önemlidir. PCR karışımı ve pozitif kontrol reaktifleri liyofilizedir. Kullanımdan önce kullanıma hazır forma getirilmeleri gerekmektedir (Reaktiflerin ön hazırlığına bakın). Geri kalan reaktifler kullanıma hazırdır. KİT İÇERİĞİ: 1A VIRCELL CPN PCR MIX: Liyofilize PCR tamponu, Cl 2Mg, M. Pneumoniae için spesifik primerler, dntp ler, Taq polimeraz ve amplifikasyonu için spesifik primerler ile birlikte PCR amplifikasyon kontrolü için DNA fragmanları içeren 1 şişe. 1B VIRCELL MPN PCR MIX: Liyofilize PCR tamponu, Cl 2Mg, M. Pneumoniae için spesifik primerler, dntp ler, Taq polimeraz ve amplifikasyonu için spesifik primerler ile birlikte PCR amplifikasyon kontrolü için DNA fragmanları içeren 1 şişe. 1C VIRCELL LPN PCR MIX: Liyofilize PCR tamponu, Cl 2Mg, L. pneumophila için spesifik primerler, dntp ler, Taq polimeraz ve amplifikasyonu için spesifik primerler ile birlikte PCR amplifikasyon kontrolü için DNA fragmanları içeren 1 şişe. 2A VIRCELL CPN POSITIVE CONTROL: Pozitif kontrol olarak kullanılan enfekte olmamış liyofilize C. pneumoniae DNA sı içeren 1 şişe. 2B VIRCELL MPN POSITIVE CONTROL: Pozitif kontrol olarak kullanılan enfekte olmamış liyofilize M. pneumoniae DNA sı içeren 1 şişe. 2C VIRCELL LPN POSITIVE CONTROL: Pozitif kontrol olarak kullanılan enfekte olmamış liyofilize L. pneumophila DNA sı içeren 1 şişe. 3 VIRCELL NEGATIVE CONTROL: Negatif kontrol olarak kullanılan 200 µl deiyonize su içeren 1 şişe. 4A VIRCELL CPN STRIPS: Spesifik C. pneumoniae DNA sı belirlenmesi için 8 strip. 4B VIRCELL MPN STRIPS: Spesifik M. pneumoniae DNA sı belirlenmesi için 8 strip. 4C VIRCELL LPN STRIPS: Spesifik L. pneumophila DNA sı belirlenmesi için 8 strip. 5 VIRCELL PCR MIX RECONSTITUTION SOLUTION: Triton X-100 içeren, PCR karışımını kullanıma hazırlamak için 1 ml sulu çözelti 1 şişe. 6 VIRCELL POSITIVE CONTROL RECONSTITUTION SOLUTION: Triton X-100 içeren, pozitif kontrolü kullanıma hazırlamak için 1 ml sulu çözelti 1 şişe. 7A VIRCELL CPN RUNNING SOLUTION: C. pneumoniae için Proklin içeren hibridizasyon çözeltisinin 400 µl sini içeren 1 şişe. 7B VIRCELL MPN RUNNING SOLUTION: M. pneumoniae için Proklin içeren hibridizasyon çözeltisinin 400 µl sini içeren 1 şişe. 7C VIRCELL LPN RUNNING SOLUTION: L. pneumophila için Proklin içeren hibridizasyon çözeltisinin 400 µl sini içeren 1 şişe. 2-8ºC de saklayın ve son kullanma tarihini kontrol edin. Gerekli materyal, temin edilmemiştir: DNA ekstraksiyon kitleri (tavsiyeler için test prosedürüne bakın) Thermocycler Mineral yağ (ısıtılmış kapağı olmayan thermocycler için) SAKLAMA KOŞULLARI: 2-8ºC de saklayın. Kit reaktiflerini son kullanma tarihinden sonra kullanmayın. Bu reaktifler kapalı ve 2-8ºC de saklandığında geçerlidir. VIRCELL PCR MIX ve VIRCELL POSITIVE CONTROL kullanıma hazırlandığında, -20ºC nin altında saklanmalıdır ve tekrarlayan dondurup çözme işleminden kaçınılmalıdır. AÇILDIĞI ZAMAN REAKTİFLERİN KARARLILIĞI: REAGENTREAKTİF VIRCELL PCR MIX ve VIRCELL POSITIVE CONTROL kullanıma hazırlandığında Diğer bileşenler KARARLILIK -20ºC nin altında saklayın ve son kullanma tarihine kadar kullanın 2-8ºC de saklayın ve son kullanma tarihine kadar kullanın. KARARLILIK VE REAKTİFLERİN KULLANIMI: Kit 2-8ºC de son kullanma tarihine kadar kararlılığını korur. VIRCELL PCR MIX ve VIRCELL POSITIVE CONTROL kullanıma hazırlandıktan sonra, -20ºC'nin altındaki sıcaklıkta son kullanma tarihine kadar kararlılığını korur. Mikrobiyal kontaminasyondan kaçınmak için reaktifleri aseptik koşullarda kullanın. Reaktifleri sadece test için gereken miktarda kullanın. Artan çözeltiyi şişeye geri koymayın. VIRCELL, S.L. kit içeriğindeki reaktiflerin hatalı kullanımına dair sorumluluk kabul etmemektedir. TAVSİYELER VE ÖNLEMLER: 1. Sadece laboratuvar içi kullanım içindir. Sadece profesyonel kullanım içindir. 2. Sadece kit bileşenlerini kullanın. VIRCELL PCR MIX RECONSTITUTION SOLUTION, VIRCELL POSITIVE CONTROL RECONSTITUTION SOLUTION ve VIRCELL NEGATIVE CONTROL farklı Vircell SPEED-OLIGO kitleri ile kullanılabilir. VIRCELL PCR MIX, VIRCELL POSITIVE CONTROL, VIRCELL STRIP ve VIRCELL RUNNING SOLUTION lotlar ve kitler arasında değişim yapmayın. 3. Aerosol bariyerli steril uçlar DNA ekstraksiyonu esnasında kontaminasyonu engellemek ve PCR performansı için zorunludur. 4. Numuneler bulaşıcı örneklerdeki gibi laboratuvar güvenlik prosedürleri uygulanarak kullanılmalıdır. Tüm çalışma alanlarını taze olarak hazırlanmış deiyonize veya distile suda %0.5 lik sodyum hipoklorit çözeltisi ile tamamen temizleyin ve dezenfekte edin. 5. Tüm örneklerin alındıktan sonraki en kısa aralıkta test edilmesi en doğru test sonuçlarının elde edilmesine yardımcı olacaktır. Numunenin yollanması sırasında saklama süresindeki değişimler değerlendirilmemiştir. 6. Numuneleri kullanırken koruyucu tek kullanımlık eldivenler, laboratuvar kıyafetleri ve göz koruyucu kullanın. Örnekler ile çalıştıktan sonra ellerinizi tamamen yıkayın. 7. Reaktif tüplerinden numune alırken reaktiflerin mikrobiyal kontaminasyonundan kaçının. 8. Testi gerçekleştirirken üç farklı alan olması zorunludur: Amplifikasyon öncesi, Amplifikasyon ve Amplifikasyon sonrası veya Belirleme alanı. Laboratuvardaki iş akışı Amplifikasyon öncesi başlangıcından ve Amplifikasyon sonrası alana doğru hareket ederek tek yönlü biçimde ilerlemelidir. Herbir alanda eldiven giyilmeli ve
3 herbir alandan ayrılırken eldiven atılmalıdır. A) Amplifikasyon öncesi alan: Sadece örneğin toplanması ve DNA ekstraksiyonu içindir. Yalnızca amplifikasyon öncesi faaliyetler için spesifik ekipmanlar belirlenmelidir (eldivenler, steril tüpler, bariyer uçlar, mikropipetler, mikrosantrifüj veya diğer gerekli ekipman) ve diğer prosedürler için kullanılmamalıdır veya diğer alanlara taşınmamalıdır. B) Amplifikasyon alanı: Bu alanda PCR gerçekleştirilir ve sadece PCR reaktifleri kullanılmalıdır. Amplifikasyon faaliyetleri için spesifik ekipmanlar belirlenmelidir (eldivenler, steril tüpler, bariyer uçlar, mikropipetler, mikrosantrifüj, thermocycler, katmanlı hava akış dolabı veya diğer gerekli ekipman) ve diğer prosedürler için kullanılmamalıdır veya diğer alanlara taşınmamalıdır. Amplifikasyon tamamlandıktan sonra, PCR tüpleri asla bu alanda açılmamalıdır. C) Amplifikasyon sonrası veya belirleme alanı: Belirleme bu alanda gerçekleştirilir. Isıtma bloğu, 1.5 ml lik mikrosantrifüj tüpleri mikropipet gereklidir. Amplifikasyon sonrası materyeller ve teçhizat her zaman amplifikasyon sonrası alanda durmalıdır. 9. Testin yüksek analitik duyarlılığından dolayı, kit reaktifleri veya amplifikasyon karışımlarının saflığını korumak için aşırı özen gösterilmelidir. Tüm reaktiflerin saflığı yakından takip edilmelidir. Şüpheli reaktifleri atın. 10. Bu ürün PCR testlerinin tekniklerinde eğitilmiş personel ile sınırlandırılmalıdır. 11. Kiti son kullanma tarihinden sonra kullanmayın. 12. Kullanılmamış reaktifleri ve atığı uygulanabilir yönetmeliklere göre atın. 13. Bu kitin reaktifleri genetik materyal veya hayvan ve/veya insan orjinli maddeler içerebilir. Her ne kadar bu materyal bulaşıcı olmasa da potansiyel olarak bulaşıcı gibi kullanılmalıdır. Tüm materyal potansiyel olarak bulaşıcı gibi kullanılmalı ve atılmalıdır. Klinik atıkların yok edilmesi için yerel yönetmeliklere uyun. 14. Edinilen stripler PCR kontaminasyon riskinden kaçınmak için amplifikasyon öncesi alandan uzak bir yerde saklanmalıdır. Daha iyi bir koruma için edinilen striplerin kenarlarının kesilmesi tavsiye edilir. ÖRNEK TOPLAMA VE KULLANMA: Tüm numuneleri bulaşıcı ajanları bulaştıracakmış gibi kullanın. Numune toplama Nazofarenks çubukları, burun ve yutak salgıları, balgam, uyarılmış balgam, bronşiyal lavaj, doku ve enfekte olmuş hücreler veya kültürler test materyali olarak kullanılabilir. Kalsiyum aljinat çubukları PCR inhibitörü etkisi gösterdiği için numune toplamak için kullanılamaz. Ticari olarak mevcut olan DNA ekstrasyon kitlerinin kullanımı tavsiye edilir. C. pneumoniae: Çubuklar 2SP taşıma ortamına yerleştirilmelidir (Vircell referans MTC). Bronşiyal lavaj, balgam ve plevral sıvı örnekleri numune ortam oranı 1:2 olarak 2SP de toplanmalıdır. Taşıma ortamı 18,000 g de 15 dk santrifüjlenmeli ve DNA ekstraksiyonu için pelet işleme tabi tutulmalıdır. M. pneumoniae, L. pneumophila: Çubuklar sıvı kültür taşıma ortamı ile karıştırılmalıdır (Vircell referansları MTC ve MTV). Numune taşınması C. pneumoniae: İnsan solunumun sistemine ait numuneler kültür taşıma ortamında (Vircell referans MTC) taşınmalıdır. M. pneumoniae, L. pneumophila: İnsan solunum sistemine ait numuneler kültür taşıma ortamında (Vircell referansları MTC ve MTV) taşınmalıdır. Test için laboratuvara yüksek kalitede numune teslimini garanti etmek için, örnekler laboratuvara pratik olarak en kısa sürede taşınmalıdır. Numune saklama Numuneler 24 saate kadar 2-8ºC de saklanmalıdır veya uzun bir zaman dönemi için -20ºC'nin altındaki sıcaklıkta dondurulmalıdır. Ekstrakt en az - 20ºC sıcaklıkta bir yıl saklanabilir. Tekrarlayan dondurup çözme işleminden kaçınılmalıdır. Numune kullanıldıktan sonra işleme tabi tutulan herbir örneğin kalan miktarı testin tekrarlanması gerektiği durumlarda 2-8ºC de saklanmalıdır. Tekrar yapılan test numune işleme tutulduktan sonraki 7 gün içinde gerçekleştirilmelidir. REAKTİFLERİN İLK HAZIRLIĞI VIRCELL PCR MIX ve VIRCELL POSITIVE CONTROL dışındaki tüm reaktifler kullanıma hazır olarak temin edilmiştir. 1 VIRCELL PCR MIX. Herbir PCR mix 8 PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için yeterli reaktifi içerir. Kullanıma hazırlamak için sonraki adımları takip edin: - Herbir tübe 150 µl VIRCELL PCR MIX RECONSTITUTION SOLUTION ekleyin. - 10 saniye vorteksleyerek karıştırın. PCR karışımının tamamen homojenize olduğundan emin olmalısınız. - Kullanıma hazırlamanın tamamlanması için oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin. 2 VIRCELL POSITIVE CONTROL. Kullanıma hazırlamak için sonraki adımları takip edin: - İlgili tüpü 5000 g de 5 saniye santrifüjleyin. - Herbir tübe 200 µl VIRCELL POSITIVE CONTROL RECONSTITUTION SOLUTION ekleyin. - 10 saniye vorteksleyerek karıştırın. - Tüpü 5000 g de 5 saniye santrifüjleyin. - Kullanıma hazırlamanın tamamlanması için oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin. Kullanıma hazırladıktan sonra VIRCELL PCR MIX 1 ve VIRCELL POSITIVE CONTROL 2 daha sonraki reaksiyonlarda kullanmak için - 20ºC nin altındaki sıcaklıkta saklanabilir. ANALİZ PROSEDÜRÜ: Her kitte işleme tabi tutulan örnek sayısı çalışılan strateji büyüklüğüne bağlı olarak değişkenlik gösterecektir. 8 STRİP/MİKROORGANİZMA TEST PROSEDÜRÜ: POZİTİF NEGATİF ÖRNEK ÇALIŞMA KONTROL KONTROL SAYISI SAYISI SAYISI TOPLAM 1 1 1 6 8 2 2 2 4 8 1.-DNA ekstraksiyonu: (Amplifikasyon öncesi alanda gerçekleştirilir). Ticari ekstraksiyon kitlerinin kullanımında DNA ekstraksiyonu için üretici talimatlarının izlenmesi tavsiye edilir. Bu PCR kiti aşağıdaki DNA ekstraksiyon kitleriyle test edilmiştir: Yüksek saflıkta PCR kalıbı hazırlama kiti (Roche), QIAamp DNA kan mini kiti (Qiagen) ve NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel). Diğer ticari kitler belki kullanılabilir. Teknik servise danışın. 2.-PCR (Amplifikasyonun gerçekleştirildiği alan): PCR karışımı 1 liyofilizedir. Herbir şişe 8 reaksiyon için gerekli bileşenleri içerir. Analizlenecek örnek sayısı ve çalışılacak kontrol sayısına bağlı olarak bir veya daha fazla PCR karışımı tüpleri kullanıma hazırlanmalıdır ( reaktiflerin ön hazırlığı"na bakın). rack ta gerekli tüp sayısını ayırın: her örnek için bir tüp artı pozitif kontrol için bir tüp ve negatif kontrol için bir tüp. Artan PCR karışımı daha sonraki reaksiyonlarda kullanmak için - 20ºC nin altındaki sıcaklıkta dondurulabilir. Negatif kontrol verilen test için hazırlanan son örnek olmalıdır. - Her tübe kullanıma hazırlanan PCR karışımının 15 µl sini pipetleyin. - Herbir tübe örnek veya kontrolün 10 µl sini ekleyin. Kitte temin edilen negatif kontrol sudur.
4 - Thermocycler a PCR tüplerini yerleştirin ve aşağıdaki programı uygulayın*. 1 döngü 92ºC 1 dakika 30 saniye 92ºC 20 saniye 35 döngü 55ºC 20 saniye 72ºC 20 saniye 1 döngü 72ºC 2 dakika 1 döngü 95ºC 1 dakika 4ºC *(thermocycler üreticisi tarafından verilen talimatları izleyin). Pozitif kontrol 2 liyofilizedir. Gerekliyse kullanmadan önce kullanıma hazırlayın ( reaktiflerin ön hazırlığı"na bakın). Kullanıma hazırladıktan sonra, pozitif kontrol daha sonraki reaksiyonlarda kullanmak için -20ºC nin altındaki sıcaklıkta dondurulabilir ("reaktiflerin ön hazırlığı"na bakın). Tekniğin yüksek duyarlılığından dolayı ve kontaminasyondan kaçınmak için pozitif kontrol, PCR karışımı ve örnekler dağıtıldığında, PCR hazırlamanın sonunda kullanılmalıdır. PCR a başlamadan önce Pozitif kontrol ve PCR karışım tüplerinin ayrılmış alanda, pozitif kontrolün pipetlendiği amplifikasyon sonrası alandan ayrı saklanması tavsiye edilir. PCR ürünlerinin belirlenmesi daldırma çubuğuyla yapılır. Eğer hibridizasyon hemen gerçekleştirilmezse PCR tüpleri -20ºC nin altındaki sıcaklıkta dondurulabilir. Daha sonra hibridizasyonu oluşturmak için PCR son denatürasyon adımının bir daha gerçekleştirilmesi gereklidir. Adım 1 95ºC 1 dakika Adım 2 4ºC 3.-Strip belirlemesi: (Amplifikasyon sonrası alanda gerçekleştirilir). Strip hibridizasyonu gerçekleştirmeden önce ısıtıcı bloğun 55ºC de ön ısıtması gereklidir. - 1.5 ml lik tübe 35 µl VIRCELL RUNNING SOLUTION ekleyin ve 55ºC de 2 dakika inkübe edin. - 4ºC ye soğutulmuş denatüre PCR ürününün 5 µl sini ekleyin. Eğer PCR ürünü amplifikasyon işleminden sonra hemen eklenmezse son PCR denatürasyon adımını birkez daha gerçekleştirmek gerekecektir. Adım 1 95ºC 1 dakika Adım 2 4ºC - - Hemen stribi doğru yönelimde (oklar örneğe doğru göstermektedir: plana bakın) yerleştirin ve 55ºC de 5 dakika inkübe edin. - Stribi çıkarın ve sonucu okuyun. *1.5 ml lik tüp ısıtıcı bloğu dolduracak şekilde uymalıdır. Sonuçların yorumu strip çıkarıldıktan sonra gerçekleştirilmelidir. Kurutma işaret yoğunluğundaki değişimlere neden olabilir ve negatif örneklerde bazı zeminler görülebilir. Edinilen stripler PCR kontaminasyon riskinden kaçınmak için amplifikasyon öncesi alandan uzak bir yerde saklanmalıdır. İÇ KALİTE KONTROL: İç kalite kontrol testine tabi olan herbir parti piyasaya çıkmadan önce, yüksek derecede kesin tanımlamalara uymaktadır. Herbir özel lot için son kalite kontrol sonuçları mevcuttur. KÜLTÜR NAKİL ORTAMININ VE NUMUNE TOPLAMA ÇUBUKLARININ GEÇERLİLİĞİ Çubuk numunelerinin test için laboratuvara nakilinde kullanılan Kültür Nakil Ortamının tüm yeni lotları testte kullanılabilecek nitelikte (ortam PCR'a karışan maddeleri içermemelidir) olduğunu garanti etmelidir (nitelik için protokol mevcuttur). Tüm Vircell kültür ortamları (Vircell referansları MTC ve MTV) test edilerek PCR a karışan maddelerin olmadığı kanıtlanmıştır.
5 NUMUNE İŞLEME KONTROLÜ Örnek işlemenin geçerlilik testi için, bir miktar mikroorganizma veya saflaştırılmış DNA kontrolü C. pneumoniae (ref. VIRCELL MBC011), M. pneumoniae (ref. VIRCELL MBC035), L. pneumophila (ref. VIRCELL MBC031) onaylanmış Kültür Nakil Ortamı tübüne eklenmelidir ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edilmelidir. Ani olarak artan numune işlenmeli ve test edilmelidir. PCR ürün kontaminasyonunun kontrolü için Nükleik Asit İzolasyonu adımından başlayarak kitin herbir çalışmasında negatif kontrol kullanın. KULLANICILAR İÇİN SONUÇLARIN YORUMU VE GEÇERLİLİK PROTOKOLÜ: Gerçekleştirilen herbir test çalışmasına bir negatif kontrol her zaman dahil edilmelidir. Gerçekleştirilen herbir test çalışmasına bir pozitif kontrol dahil edilmelidir. Yeni bir kit açıldığında en az bir kez pozitif kontrol çalışılmalıdır. Pozitif kontrol reaktif hataları ve zorunlu prosedürün doğru çalışılmasının izlenmesi içindir. Negatif kontrol reaktiflerin veya çevresel kontaminasyonun izlenmesi içindir. Sonucu okumak için okuma kartında S ile gösterilen pozisyona stribi yerleştirin. Test 3 okuma alanı içerir: - Ürün kontrol çizgisi: Eğer test doğru olarak gerçekleştirildiyse her zaman pozitif ve okunaklı olmalıdır. Bu çizgi kolloidal altının doğru olarak çalıştığını gösterir, prob uygulanabilirliği yeterli ve çalışma tamponu uygun bir şekilde akmıştır. - PCR amplifikasyon kontrol çizgisi: Kırmızı şeritin olmaması durumu örnekte amplifikasyon reaksiyonu ile girişim yapabilecek inhibitörlerin bulunduğunu gösterir. O takdirde numuneden alınan ikinci bir örnek veya yeni numune tekrar test edilmelidir. Şiddetli pozitif örneklerde örnekteki spesifik hedefin yüksek içeriğinden dolayı çizgi zayıf veya negatif olabilir ama son sonucu geçersiz kılmaz. - Test çizgisi: Bu pozisyondaki kırmızı şerit örnekte C. pneumoniae, M. pneumoniae ve L. pneumophila genetik materyali bulunduğunu gösterir. şekilde bağlı kalınması gereklidir. Özellikle doğru örnek ve reaktif pipetleme, dikkatli kullanımla birlikte inkübasyon adımlarının zamanlama ve sıcaklıkları doğru sonuçlar için zorunludur. Bu özellikle test protokolünde tanımlanan atanmış alanlarda herbir test adımını gerçekleştirmek için önemlidir. 3.-Bu test enfeksiyonun yerini göstermez. Bu izolasyon yenilemesini kastetmemektedir. 4.- Mikroorganizmanın belirlenmesi numunede bulunan organizma sayısına bağlıdır ve numune toplama metodlarından, hasta faktörlerinden, enfeksiyon aşaması ve/veya türünden etkilenebilir. 5.-Herhangi bir tanı testinde, sonuçlar tüm klinik ve laboratuvar bulgular göz önüne alınarak yorumlanmalıdır. Kit sonuçları klinik değerlendirme ve diğer tanı prosedürleri ile birlikte kullanılabilir. 6.-Bu ürünün kullanımı sadece PCR tekniklerinde eğitilmiş personel ile sınırlandırılmalıdır. 7.-Test kalitatif sonuçlar sağlar. Pozitif sonuç büyüklüğü ve örnekteki mikroorganizma sayısı arasında bir korelasyon oluşturulamaz. 8.-Bu test insan solunum sistemi örnekleriyle kullanım için doğrulanmıştır. Bu test diğer örnek tipleriyle doğrulanmamıştır. 9.-Güvenilir sonuçlar yeterli numune toplanması, nakil, saklama ve prosedürlerin uygulanmasına bağlıdır. 10.-Performans özellikleri tüm genotipler için belirlenmemiştir. 11.-Test sadece seçilen probun genomik bölgelerinin limitleri içerisinde çalışır. Bakteriyel genomların yüksek değişkenliğinden dolayı bazı alt tiplerin belirlenememesi olasıdır. PCR oligolarında veya mikroorganizma DNA dizi problarındaki değişiklikler yanlış negatif sonuçlara neden olabilir. 12.-Negatif test sonucu hedef organizma düzeyinin testin belirleme limitinin altında olduğu durumda dışlanamaz. 13.-Pozitif test diğer patojenlerin bulunma olasılığını bertaraf etmez. 14.-Testin içerdiği iç kontrol tüm yanlış negatif test sonuçlarını ortadan kaldırmayacaktır. 15.-Solunum sistemine ait örneklerde C. pneumoniae, M. pneumoniae and L. pneumophila nın belirlenmesi verilen pnömoni olayındaki patojenin nedensel rolünü muhakkak gösteren değildir. Ancak pnömoni nin klinik kanıtlarının tümü ve pozitif PCR sonuç mikroorganizmanın belirlenmesiyle kökeni gösterir. 16.-Test ticari izolasyon kitleriyle kullanım için onaylanmıştır. PERFORMANS DUYARLILIK VE SPESİFİKLİK: SINIRLAMALAR: 1.-Kit insan solunum sistemine ait örneklerle kullanılmak için tasarlanmıştır. 2.-Kit kullanıcısına paket insert ünü dikkatle okuması ve anlaması tavsiye edilmiştir. Güvenilir test sonuçları elde etmek için protokole katı bir Analitik Duyarlılık: C. pneumoniae nın saflaştırılmış DNA sının seri dilüsyonları işleme tabi tutulmuş ve test edilmiştir. Kit her reaksiyonda DNA nın 50 kopyasına kadar belirleyebilmiştir. M. pneumoniae nın saflaştırılmış DNA sının seri dilüsyonları işleme tabi tutulmuş ve test edilmiştir. Kit her reaksiyonda DNA nın 20 kopyasına kadar belirleyebilmiştir. L. pneumophila nın saflaştırılmış DNA sının seri dilüsyonları işleme tabi tutulmuş ve test edilmiştir. Kit her reaksiyonda DNA nın 5 kopyasına kadar belirleyebilmiştir. Tanısal duyarlılık: Dış testte REAL TIME PCR a karşı 60 örnek test edilmiştir. M. pneumoniae için sonuçlar aşağıdaki gibidir: Tanısal duyarlılık=%100 Spesifiklik: C. pneumoniae, M. pneumoniae, L. pneumophila: Sağlıklı donörlerden alınan 50 örnek işleme tabi tutulmuş ve test edilmiştir. Pozitif reaksiyon belirlenmemiştir. M. pneumoniae: Dış testte REAL TIME PCR a karşı 60 örnek test edilmiştir. Sonuçlar aşağıdaki gibidir: Spesifiklik=%98
6 TEST İÇİ KESİNLİK: 2 örnek (belirleme limitine yakın bir pozitif ve bir negatif) aynı operatör ile değiştirilmemiş koşullarda tekli testte 5 kez çoğaltılması gerçekleştirilmiştir. Tüm testlerde aynı sonuçlar gözlenmiştir. TESTLER ARASI KESİNLİK: İki örnek (belirleme limitine yakın bir pozitif ve bir negatif) 2 farklı operatör tarafından ardışık 3 günde ayrı ayrı çoğaltılmıştır. Tüm testlerde aynı sonuçlar gözlenmiştir. ÇAPRAZ REAKTİVİTE VE GİRİŞİMLER: Test aşağıdaki mikroorganizmaların ani artış gösteren örnekleriyle kontrol edilmiştir (Aspergillus fumigatus, Bacillus cereus, Bordetella pertussis, Brucella abortus, Candida albicans, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci, Coxiella burnetii, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria meningitidis serogroups A, B ve C, Rickettsia conorii, Salmonella typhi, Streptococcus pneumoniae, Toxoplasma gondii) bunlardan bazıları solunum sistemine ait örneklerde birlikte bulunur. Yanlış pozitif sonuç gözlenmemiştir. Sadece C. pneumoniae türü pozitif sonuç vermiştir. Test aşağıdaki mikroorganizmaların ani artış gösteren örnekleriyle kontrol edilmiştir (Aspergillus fumigatus, Bacillus cereus, Bordetella pertussis, Brucella abortus, Candida albicans, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Coxiella burnetii, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, HSV1, HSV2, Legionella pneumophila, Neisseria meningitidis serogroups A, B ve C, Rickettsia conorii, Salmonella typhi, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Toxoplasma gondii) bunlardan bazıları solunum sistemine ait örneklerde birlikte bulunur. Yanlış pozitif sonuç gözlenmemiştir. Sadece M. pneumoniae türü pozitif sonuç vermiştir. Test aşağıdaki mikroorganizmaların ani artış gösteren örnekleriyle kontrol edilmiştir (Aspergillus fumigatus, Bacillus cereus, Bordetella pertussis, Brucella abortus, Candida albicans, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Coxiella burnetii, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria meningitidis serogroups A, B ve C, Rickettsia conorii, Salmonella typhi, Streptococcus pneumoniae, Toxoplasma gondii) bunlardan bazıları solunum sistemine ait örneklerde birlikte bulunur. Yanlış pozitif sonuç gözlenmemiştir. Sadece L. pneumophila türü pozitif sonuç vermiştir. ETİKETLERDE KULLANILAN SEMBOLLER: 8ºC 2ºC x Laboratuvar içi tanı medikal aygıt Son kullanım tarihi 2-8ºC de saklayın. <X> teste yeterli içerik Parti kodu Katalog numarası KAYNAKÇA: <X> µl de kullanıma hazırlayın Monoline test için okuma kartı Yorumlama kartı Ürün Kontrol Çizgisi PCR Amplifikasyon Kontrol Çizgisi Test Çizgisi Örnek Pozitif Örnek Negatif Örnek Geçersiz Test C. pneumoniae: 1. Campbell, LA; Kuo, C.; Gaydos, CA. 2006. Chlamydial infections. In Manual of Molecular and Clinical Laboratory Immunology (Dertrick, B; Hamilton, RG; Folds, JD eds.). ASM Press, Washington DC. 2. Jantos, CA; Roggendorf, R; Wuppermann, FN; Hegemann, JH. 1998. Rapid detection of Chlamydia pneumoniae by PCR-Enzyme Immunoassay. Journal of Clinical Microbiology 36: 1890-1894. 3. Khanna, M; Fan, J; Pehler-Harrington, K; Waters, C; Douglas, P; Stallock, J; Kehl, S; Henrickson, KJ. 2005.The pneumoplex assays, a multiplex PCR-enzyme hybridization assay that allows simultaneous detection of five organisms, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, Legionella micdadei, and Bordetella pertussis, and its real-time counterpart. J. Clin. Microbiol. 43: 565-571. 4. Kumar, S; Hammerschlag, MR. 2007. Acute respiratory infection due to Chlamydia pneumoniae: current status of diagnostic methods. Clinical Infectious Diseases 44: 568-576. 5. Stralin, K; Bäckman, A. Holmberg, H; Fredlund, H; Olcén, P. 2005. Design of a multiplex PCR for Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae and Chlamydophila pneumoniae to be used on sputum samples. APMIS 113: 99-111. 6. Tong, CYW; Donnelly, C; Harvey, G; Sillis, M. 1999. Multiplex polymerase chain reaction for the simultaneous detection of Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, and Chlamydia psittaci in respiratory samples. J. Clin. Pathol 52: 257-263. M. pneumoniae: 1. Daxboeck, F; Krause, R; Wenisch, C. 2003. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. Clinical Microbiology and Infection 9: 263 273. 2. Loens, K; Ursi, D; Goossens, H; Ieven, M. 2003. Molecular diagnosis of Mycoplasma pneumoniae respiratory tract infections. J. Clin. Microbiol. 41: 4915-4923. 3. Pitcher, D; Chalker, VJ; Sheppard, C; George, RC; Harrison, TG. 2006. Real-time detection of Mycoplasma pneumoniae in respiratory samples with and internal processing control. J Med Microbiol 55: 149-155. 4. Stralin, K; Bäckman, A. Holmberg, H; Fredlund, H; Olcén, P. 2005. Design of a multiplex PCR for Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae and Chlamydophila pneumoniae to be used on sputum samples. APMIS 113: 99-111. L. pneumophila: 1. Ballard, AL; Fry, NK; Chan, L; Surman, SB; Lee, JV; Harrison, TG; Towner, KJ. 2000. Detection of Legionella pneumophila using a real-time PCR hybridization assay. Journal of Clinical Microbiology 38: 4215-4218. Kullanım talimatlarına başvurun
7 2. Edelstein, PH. 2007. Legionella. In Manual of Clinical Microbiology (Murray, PR; Baron, EJ; Jorgensen, JH; Landry ML; Pfaller, MA, eds.). ASM Press, Washington DC. 3, Fields, BS; Benson, RF; Besser, RE. 2002. Legionella and Legionnaires' Disease: 25 Years of Investigation. Clinical Microbiology Reviews 15: 506-526. 4. Hayden, RT; Uhl, JR; Qian, W; Hopkins, MK; Aubry, MC; Limper, AH; Lloyd, RV; Cockerill, FR. 2001. Direct detection of Legionella species from bronchoalveolar lavage and open lung biopsy specimens: comparison of LightCycler PCR, in situ hybridization, direct fluorescence antigen detection, and culture. J. Clin. Microbiol. 39: 2618-2626. 5. Khanna, M; Fan, J; Pehler-Harrington, K; Waters, C; Douglas, P; Stallock, J; Kehl, S; Henrickson, KJ. 2005.The pneumoplex assays, a multiplex PCR-enzyme hybridization assay that allows simultaneous detection of five organisms, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, Legionella micdadei, and Bordetella pertussis, and its real-time counterpart. J. Clin. Microbiol. 43: 565-571. 6. Lindsay, DS; Abraham, WH; Findlay, W; Christie, P; Johnston, F; Edwards, GF. 2004. Laboratory diagnosis of legionnaires disease due to Legionella pneumophila serogroup 1: comparison of phenotypic and genotypic methods. Journal Medical Microbiology 53: 183-187. 7. Templeton, KE; Acheltinga SA, Sillekens, P; Crielaard, JW ; van Dam, AP ; Goossens, H ; Claas, ECJ. 2003. Development and clinical evaluation of an internally controlled single-tube multiplex real-time PCR assay for detection of Legionella pneumophila and other Legionella species. J. Clin. Microbiol. 41: 4016-4021. Sorularınız için lütfen temasa geçin: customerservice@vircell.com REVİZYON TARİHİ: Eylül-08