T.C. DOKTORA TEZİ. Gülden VURAL. Tez Danışmanı Prof.Dr. Nedim SULTAN

T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI SÜPERANTİJEN NİTELİĞİNDEKİ STAFİLOKOK TOKSİNLERİNİN VE PROTEİN A NIN KRONİK SİNÜZİT ETİYOLOJİSİNDEKİ ROLÜNÜN İNCELENMESİ DOKTORA TEZİ Gülden VURAL Tez Danışmanı Prof.Dr. Nedim SULTAN ANKARA TEMMUZ 2013

T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI SÜPERANTİJEN NİTELİĞİNDEKİ STAFİLOKOK TOKSİNLERİNİN VE PROTEİN A NIN KRONİK SİNÜZİT ETİYOLOJİSİNDEKİ ROLÜNÜN İNCELENMESİ DOKTORA TEZİ Gülden VURAL Tez Danışmanı Prof.Dr. Nedim SULTAN Bu tez Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından SBE-01/2010-75 proje numarası ile desteklenmiştir. ANKARA TEMMUZ 2013

İçindekiler Kabul ve Onay İçindekiler Şekiller ve Resimler Tablolar Semboller, Kısaltmalar i ii iv v vi 1 GİRİŞ 1 2 GENEL BİLGİLER 3 2.1 Sinüzit................................ 3 2.1.1 Kronik Sinüzit........................ 4 2.2 Stafilokoklar............................. 6 2.2.1 Morfoloji ve Boyanma Özellikleri.............. 7 2.2.2 Üreme ve Biyokimyasal Özellikleri............. 7 2.2.3 Stafilokokların Sınıflandırılması.............. 8 2.2.4 Doğal Ortamları ve Direnç................. 9 2.2.5 Stafilokok Enzimleri..................... 11 2.2.5.1 Katalaz (hidrojen peroksid oksidoredüktaz)... 11 2.2.5.2 Koagülaz..................... 11 2.2.5.3 Fibrinolizin.................... 12 2.2.5.4 Hiyaluronidaz................... 12 2.2.5.5 Lipaz....................... 12 2.2.5.6 Fosfatidilinositol-spesifik fosfolipaz C...... 13 2.2.5.7 Nükleaz...................... 13 2.2.5.8 Beta laktamaz.................. 13 2.3 S. aureus.............................. 14 2.3.1 S. aureus Toksinleri..................... 17 2.3.1.1 Sitolitik membran yıkıcı toksinler (a, b, s, g ve P-V) 17 2.3.1.2 Eksfoliatif toksin................. 19 2.3.1.3 Enterotoksinler.................. 20 2.3.1.4 Toksik Şok Sendromu Toksini-1......... 21 2.3.2 Protein-A.......................... 22 2.4 Süperantijenler........................... 23 3 MATERYAL METOD 27 3.1 Örneklerin Alınması ve Taşınması................. 27 3.2 Örneklerin İncelenmesi....................... 28 3.2.1 Bakteri Kültürü ve Tanımlama............... 28 3.2.2 Toksin Varlığının Tespiti.................. 29 ii

3.2.2.1 DNA izolasyonu................. 29 3.2.2.2 Toksinlerin Gerçek Zamanlı PZR Analizi ile Tespiti 30 3.2.2.3 Toksinlerin VIA Yöntemi Kullanılarak Tespiti.. 40 3.2.3 Bakterilerde Protein-A Miktarının EIA Yöntemi ile Tespiti. 40 3.3 İstatistik Değerlendirme....................... 43 4 BULGULAR 45 5 TARTIŞMA ve SONUÇ 52 6 ÖZET 60 7 SUMMARY 63 KAYNAKLAR 66 EK A Etik Kurul Kararı 75 TEŞEKKÜRLER 76 ÖZGEÇMİŞ 77 iii

Şekiller ve Resimler Şekil 1 Burun Çevresi Sinüsleri................... 3 Şekil 2 Koyun kanlı agarda üreyen S. aureus un koloni görünümleri 15 Şekil 3 Süperantijenler tarafından T hücre uyarılması....... 24 Şekil 4 Süperantijenlerin T lenfositlerine bağlanması........ 25 Şekil 5 DNA Saflaştırılmasından Sonra Ölçüm........... 31 Şekil 6 Gerçek Zamanlı PZR Cihazı................. 31 Şekil 7 Enteretoksin A için PZR grafikleri.............. 35 Şekil 8 Enteretoksin B için PZR grafikleri.............. 36 Şekil 9 Enteretoksin C için PZR grafikleri.............. 37 Şekil 10 Enteretoksin D için PZR grafikleri.............. 38 Şekil 11 TSST-1 için PZR grafikleri.................. 39 Şekil 12 Enterotoksin A, B, C ve D için VIA kit içeriği........ 41 Şekil 13 Enterotoksin A, B, C ve D nin VIA yöntemiyle değerlendirilmesi.............................. 41 Şekil 14 Yüzey Protein-A için Enzim Immunoassay (EIA) Kiti.... 42 Şekil 15 Enzim Immunoassay (Elisa) Cihazı............. 43 Şekil 16 Elisa Cihazında Okuma Öncesi............... 43 iv

Tablolar Tablo 1 Stafilokok türlerinden bazılarının temel ve biyokimyasal özellikleri............................. 8 Tablo 2 Toksinlere göre Tm dereceleri................ 34 Tablo 3 Kronik sinüzitli hasta grubu ile kontrol grubu biyopsi ve burun sürüntüsü örneklerinde S. aureus belirlenme düzeyleri 45 Tablo 4 Kronik sinüzitli hastalar ile kontrol grubundan elde edilen S. aureus suşlarında enterotoksin A geni bulunma sıklığı. 46 Tablo 5 Kronik sinüzitli hastalar ile kontrol grubundan elde edilen S. aureus suşlarında enterotoksin B geni bulunma sıklığı. 47 Tablo 6 Kronik sinüzitli hastalar ile kontrol grubundan elde edilen S. aureus suşlarında enterotoksin C geni bulunma sıklığı. 47 Tablo 7 Kronik sinüzitli hastalar ile kontrol grubundan elde edilen S. aureus suşlarında enterotoksin D geni bulunma sıklığı. 47 Tablo 8 Kronik sinüzitli hastalar ile kontrol grubundan elde edilen S. aureus suşlarında belirlenen TSST-1 gen değerleri... 48 Tablo 9 SpA nın değişik konsantrasyonları için okunan OD değerleri 49 Tablo 10 Protein A nın kantitatif değerleri............... 50 Tablo 11 Kronik sinüzitli hastalar ile kontrol grubundan elde edilen S. aureus suşlarında belirlenen SpA varlığı......... 51 Tablo 12 Hasta ve kontrol grublarından soyutlanan SpA pozitif S. aureus suşlarında EIA ile belirlenen SpA düzeyleri..... 51 v

Semboller, Kısaltmalar S. aureus Staphylococcus aureus a b alfa beta C derece santigrat d g delta gama µl mikrolitre Da DNA EIA ELİSA ETA ETB GÜTF Hlg IFN IgG IL ing. KBB kda mg ml mm mm dalton deoksiribonükleik asit enzim immünoassay (enzyme immunoassay) enzim bağlı immünolojik deney (enzyme linked immunosorbent assay) eksfoliyatif toksin A eksfoliyatif toksin B Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi hemolizin interferon immünglobulin G interlökin ingilizce kulak burun boğaz kilo dalton miligram mililitre milimolar milimetre vi

MRSA NaCl nm OD P-V PBP PCR pg PZR RNA rrna SEA SEB SEC SED SEs SpA SSSS TCR Th1 Tm TNase TNF metsiline dirençli Staphylococcus aureus sodyum klorür nanometre optik dansite panton valentine penisilin bağlayan protein polimerase chain reaction pikogram polimeraz zincir reaksiyonu ribonükleik asit ribozomal ribonükleik asit stafilokok enterotoksin A stafilokok enterotoksin B stafilokok enterotoksin C stafilokok enterotoksin D stafilokok enterotoksin ailesi stafilokok protein A haşlanmış deri sendromu (staphylococcal scalded skin syndrome) T hücre reseptörleri (T cell receptor) tip-1 T helper erime eğrisi (melting temprature) termonükleaz tümör nekroz faktör TSST-1 toksik şok sendromu toksini-1 (toxic shock syndrome toxin 1) VIA VISA visual enzim immunoassay (visual enzyme immunoassay) vankomisine orta düzeyde duyarlı Staphylococcus aureus vii

1. GİRİŞ Kronik sinüzit, hastaların yaşam kalitesini düşüren ve tüm dünyada yaygın görülen bir hastalıktır. En az dört hafta süren bu hastalık uzun süre antibiyotik kullanılmasına neden olmakta ve yüksek tedavi maliyetleri gerektirmektedir. Antibiyotik tedavisi çoğunlukla tam tedavi sağlayamamakta ve bu nedenle cerrahi tedavide gerektirebilmektedir. Daha etkili tedavi yöntemlerinin geliştirilebilmesi için kronik sinüzit patofizyolojisinin iyi bilinmesi gerekmektedir. Kronik sinüzit, bir çok faktörün birlikte etkileşmesiyle ortaya çıkmaktadır. Bu faktörler arasında bakteriler en önemli rolü oynamaktadır. Kronik sinüzit etiyolojisinden sorumlu olan bakteriler arasında S. aureus en önemli rolü oynayan bakterilerden birisidir. Stafilokoklar doğada yaygın olarak bulunan ve çevre koşullarına diğer bakterilere göre daha dayanıklı bakterilerdir. Kurumuş balgam ve irin içinde uzun süre canlılıklarını sürdürebilmektedirler. Bu bakteriler aynı zamanda insan ve hayvanların vücut floralarında da bulunabilmektedir. Bu nedenle fırsatçı patojen olabilme potansiyeline sahiptirler. İnsan ve hayvanlarda enfeksiyonları en sık görülen bakterilerdendir. Bakteri virülansına katkı veren ve hastalık tablosunun ağırlaşmasına neden olan çok sayıda enzim ve toksinleri bulunmaktadır. Tekrarlayan akut sinüzit tablosunun kronik faza geçmesinde allerji, üst solunum yolu enfeksiyonları, anatomik anormallikler, immün yetmezlikler ve bazı çevresel etkiler (sigara, hava kirliliği) gibi bir çok faktör rol oynayabilmektedir. Kronik sinüzit gelişiminde S. aureus un önemli bir rolü olduğu düşünülmektedir. Özellikle bu bakterinin süperantijen özelliği gösteren enterotoksinlerinin ve toksik şok sendromu toksini-1 (TSST-1) in sinüs mukozasında ileri derecede enflamasyon cevabına yol açmalar nedeniyle kronik sinüzit gelişimine neden olabi- 1

lecekleri iddia edilmektedir. Aynı şekilde S. aureus yapısında bulunan protein- A (SpA) nın insan bazofil ve mast hücrelerinden histamin salınımını arttırdığı gösterilmiştir. SpA nın bu özellikleri nedeniyle kronik sinüzit gelişimindeki allerjik temelde rol oynadığı iddia edilmektedir. Bu çalışmada, kronik sinüzit etiyolojisinde önemli bir rol oynadığı bilinen S. aureus un kronik sinüziti olan hastaların sinüs biyopsi örneklerinde bulunma sıklığının belirlenerek kontrol grubu değerleriyle karşılaştırılması amaçlanmıştır. Örneklerin endoskopi sinüs cerrahisi yapılacak hastalardan alınması planlanmıştır. Çalışmada izole edilen S. aureus suşlarının enterotoksin A, B, C, D ve TSST-1 oluşturma sıklığının incelenerek kontrol grubundan soyutlanan suşların toksin oluşturma sıklığı ile karşılaştırılması planlanmıştır. Aynı zamanda hasta grubu ve kontrol gruplarından soyutlanan S. aureus suşlarının SpA yapım sıklığı ve yapım düzeyleri değerlendirilecektir. Böylece çalışma sonunda elde edilen veriler değerlendirilerek kronik sinüzit etiyolojisinde S. aureus suşlarının etiyolojideki rolü, SpA yapımının bu hastalık gelişimindeki önemi, aynı zamanda süperantijen niteliğindeki enterotoksinlerin ve TSST-1 in kronik sinüzit gelişimindeki rollerinin ortaya çıkarılması amaçlanmıştır. 2

2. GENEL BİLGİLER 2.1 Sinüzit Sinüzit paranazal sinüs dokusunun semptomatik enflamasyonudur. Paranazal sinüsler her biri değişik boyutta ve dört çifttir. İçlerinde bulundukları kemiğin ismi ile maksiller, etmoid, frontal ve sfenoid sinüsler olarak adlandırılırlar. Sinüsler Şekil 1 de şematik olarak gösterilmiştir. Sinüsler hava dolu, simetrik kaviter boşluklardır. Silialı kolumnar epitelle kaplıdırlar. Tübüler açıklıklarla burun boşluğuna açılırlar. Solunum havasını nemlendirme, mukus salgılama, kafa kemiklerini hafifletme, sesin rezonansına katkı yapma, beyin içi ısısının izolasyonu gibi işlevleri vardır 1. Frontal Sinüs Maksiller Sinüs Etmoidal Sinüs Sfenoidal Sinüs Şekil 1: Burun Çevresi Sinüsleri 2 Sinüzitler klinik olarak dört gruba ayrılır: 1. Akut sinüzit: Sinüs enfeksiyonuna ait semptomların dört haftadan kısa sür- 3

düğü klinik tablodur. 2. Rekürren akut sinüzit: Bir yıl içinde dört yada daha fazla kez, en az yedi gün süren akut sinüzit atağının geçirildiği tablodur. 3. Subakut sinüzit: Dört ile oniki hafta arasında seyreden akut ve kronik arası klinik tablodur. Enflamasyon genellikle geri dönüşümlüdür. 4. Kronik sinüzit: Oniki haftadan uzun süren tablodur 3. 2.1.1 Kronik Sinüzit Burun ve paranazal sinüs mukozasının 12 haftadan uzun süren semptomatik enflamasyonudur. Kronik sinüzit genellikle yetersiz tedavi edilen veya tedavi edilemeyen akut sinüzit sonrası ortaya çıkar. Sadece medikal tedavi ile mukozal değişiklikler düzelmeyebilir ve cerrahi tedavi gerekliliği ortaya çıkabilir. Kronik sinüzit hastalarda yaşam kalitesini düşüren ve tedavi direnci nedeniyle yüksek maliyete neden olan bir hastalıktır 1. Kronik sinüzitin başlıca belirtileri mukopürülan akıntı, burun tıkanıklığı (nazal konjesyon), yüzde ağrı, basınç hissi, postnazal akıntı ve hiposmidir. Tanı için bu semptomlardan en az ikisinin varlığı ile beraber mukozal enflamasyonun radyolojik veya endoskopik olarak gösterilmesi gerekmektedir 4. Kronik sinüzitlerin patofizyolojisi tam olarak aydınlatılamamıştır. Birçok enflamatuvar, mikrobiyal ya da nonimmünolojik faktör tek başına ya da kombine olarak persistan enfeksiyonun gelişimine neden olabilir 1,4. Sinüs direnajının tam olarak sağlanamadığı anatomik bir obstrüksiyonun 4

varlığı ve bozulmuş mukosiliyer aktivite kronik sinüzit gelişiminin temel sebebidir ancak beraberinde bir çok faktörün de rol oynadığı düşünülmektedir 1,4. Allerji, nazal polipler, üst solunum yolu enfeksiyonları, anatomik anormallikler, kistik fibrozis, immotil silia sendromu, immün yetmezlik, granülomatöz hastalıklar ve bazı çevresel faktörler (sigara, hava kirliliği) kronik sinüzit gelişimi için hazırlayıcı faktörlerdir. Kronik sinüzit patogenezinin tam olarak anlaşılması etkili tedavi yöntemleri geliştirilmesi açısından önem taşımaktadır 5,6. Kronik sinüzitlerde gelişen enflamasyonun nedeni tam olarak aydınlatılamamakla birlikte major rolü bakterilerin oynadığı düşünülmektedir 5,6. Kronik sinüzit patogenezinde en sık rol oynayan bakteriyel ajanlar şunlardır: Staphylococcus aureus, Anaerob bakteriler, Pseudomonas aeruginosa, Gram negatif enterik basiller, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, 5

Moraxella catarrhalis, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes. Akut sinüzitlerin esas patojenleri olan S. pneumoniae, H. influenzae ve M. catarrhalis kronik sinüzitlerde daha az sıklıkla etken olup S. aureus, S. epidermidis ve anaerobik gram negatif basiller daha baskın olarak bulunmaktadır. Kronik sinüzitlerde polimikrobiyal etkenler daha yaygın görülmektedir 7,8. 2.2 Stafilokoklar İlk kez 1878 yılında Robert Koch tarafından tanımlanmış olan stafilokoklar, Bergey s Manual of Systematic Bacteriology nin 1986 baskısında Micrococcaceae ailesi içinde yer almış, daha sonra katalaz pozitif olmaları ve nükleik asit dizilimlerinde önemli farklar bulunması nedeniyle Bacillaceae familyası içine alınmıştır. Staphylococcus cinsinin DNA sının G-C (%mol) oranı %30-40 olarak saptanmıştır. Rosenbach 1884 yılında beyaz renkli kolonileri Staphylococcus albus, sarı-portakal renkli kolonileride Staphylococcus aureus olarak tanımlamıştır. Daha sonra 1900 lü yılların başlarında stafilokokların alfa, beta, gama ve delta toksinleri bulunmuştur. Todd ve arkadaşları da 1978 yılında stafilokokların neden olduğu Toksik şok sendromunu (TSS) tanımlamışlardır 9. Son yıllarda stafilokokların klinik önemi giderek artmaktadır. Özellikle koagülaz negatif stafilokokların hastane enfeksiyonlarında oldukça önemli bir oynadığı görülmektedir 10,11,12. 6

2.2.1 Morfoloji ve Boyanma Özellikleri Stafilokoklar 0.5-1.5 µm büyüklüğünde, yuvarlak, hareketsiz, spor oluşturmayan, gram pozitif koklar olup, bazik boyalarla kolay boyanmaktadırlar. Çoğunlukla üzüm salkımına benzer kümeler oluştururlar İsimlerini de bu salkım görünümünden almışlardır. Sıvı besiyerinde diplokoklar ve kısa zincirler oluştururlar nadiren tek tek, çiftler, tetratlar ve uzun zincirler oluştururlar. Tipik kapsül oluşturmazlar 10,11,12. 2.2.2 Üreme ve Biyokimyasal Özellikleri Stafilokoklar %7.5-10 NaCl içeren klasik besiyerinde geniş bir ısı aralığında (18-45 C) üreyebilmektedirler. Staphylococcus saccharolyticus ve S. aureus subsp. anaerobius dışında fakültatif anaerop mikroorganizmalardır. Bu iki tür başlangıçta anaerobik ürer fakat aerotolerandırlar. Optimal üreme ısıları 30-37 C ph ı 7-7.5 tir. Kanlı agarda 18-24 saatte yuvarlak düzgün kenarlı 1-4 mm çapında, hafif konveks, opak koloniler yaparlar. S. aureus, S. hominis ve S. haemolyticus pigmentlidirler. S. aureus altın sarısı pigment yapar, S. epidermidis ise tebeşir beyazı koloniler oluşturur 10,11,13. Stafilokokların streptekoklardan ayrımında temel olarak katalaz testi kullanılmaktadır. Stafilokok türlerini birbirinden ayırmada ise çeşitli biyokimyasal testler kullanılır. Stafilokokların ayrımında kullanılan biyokimyasal testler ve bazı temel özellikler Tablo 1 de özetlenmiştir 10,11,12. 7

Tablo 1: Stafilokok türlerinden bazılarının temel ve biyokimyasal özellikleri 10,11,12 S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus S. haemolyticus S. capitis S. warneri S. hominis S. saccharolyticus S. auiricularis S. xylosus S. simulans S. cohnii S. pasteuri S. caprea S. lugdunensis S. schleiferi Hemolizin + - - + - D - - - - D D D + + + Koagülaz + - - - - - - - - - - - - - - * DNAse + - - - - - - - - - - - - - - + D-Trehaloz + - + + - + + - * + + + + + + - Novobiocin Duyarlılığı Bacitracin Duyarlılığı Asetoin Oluşturma + + - + + + + + + - + - + + + + - - - - - - - - - + + + D D + D D D D - D D + + + D-Mannitol + - D D + D - - - D + - D D - - Maltoz + + + + - * + - * + - D D D + - D-Ksiloz - - - - - - - - - + - - - - - - Sükroz + + + + * + * - D + + - + - + - a-laktoz + D D D - D D - - D + - D + + - D-Sellobioz - - - - - - - - - - - - - - - - Oksidaz - - - - - - - - - - - - - - - - Nitrat Redüksiyonu + + + + + + D D D D + - D + + + Üreaz D + + - * + + - + + * + + D * Alkalen + * - - - - - D - D * * - + - + Fosfataz N-Asetil + - * + - - - - + + * - + glukozamin (+) Pozitif (*) Çoğunlukla Pozitif (D) Değişken (-) Negatif ( ) Bilinmeyen 2.2.3 Stafilokokların Sınıflandırılması Stafilokokların uluslararası taksonomi komisyonunca belirlenen tanımlanma kriterleri arasında, koloni morfolojisi, pigment oluşturma, hemolitik aktivite koa- 8

gülaz ve diğer enzimatik aktiviteler, aerobik koşullarda sükroz, trehaloz, mannitolden asit oluşturma, asetil metil karbinol (asetoin) olusturma, fosfataz duyarlılığı ve novobiosin duyarlılığı bulunmaktadır. Son yıllarda stafilokok türleri ile yapılan DNA sekanslama çalışmaları sonucunda stafilokoklar fenotipik özelliklerine göre çeşitli gruplar altında toplanmışlardır 14,15,16. Stafilokok cinsi içinde çok sayıda tür (40 tür ve 26 alttür) bulunmasına rağmen S. aureus, S. epidermidis, S. capitis, S. caprea, S. saccharolyticus, S. warneri, S. pasteuri, S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. schleiferi, S. auiricularis, S. saprophyticus, S. cohnii, S. xylosus ve S. simulans insan klinik örneklerinden izole edilebilen türlerdir 12,17,18. 2.2.4 Doğal Ortamları ve Direnç Stafilokoklar, doğada yaygın bulunmakla birlikte en çok memelilerin ve kuşların cildinde ve mükoz membranlarında bulunurlar. İnsanda ağız boşluğunda, intestinal sistemde, genitoüriner sistemin dış ortamla ilişkili florasında ve üst solunum yollarında bulunabilirler 17,19,20. Stafilokoklar, insan ve hayvanlar için fırsatçı patojendir. İnsan vücudunda çeşitli yerlerde kolonize olurlar. Aksilla, inguinal ve perineal bölgelerde, yüz ve ayak parmaklarının derisinde bulunurlar 20,21. S. aureus normal insanların, hastanelerde çalışanların ve tedavi altındaki hastaların burun mukozasına kolonize olur 17,22. S. hominis ve S. haemolyticus aksillerde, ingüinal ve perineal deride, S. capitis baş derisinde, S. auiricularis dış kulak yolu derisinde, S. saprophyticus ürogenital mukozada bulunur 17,23. Stafilokoklar dış ortama dayanıklı bakterilerdir. Kuruluğa, ısıya ve yüksek 9

tuz konsantrasyonlarına (%10-15) dirençlidirler. Kurumuş balgam ve irin gibi hasta örneklerinde uzun süre canlılıklarını sürdürürler 11,12. Fleming tarafından 1929 da bulunan penisilin, bakteri hücre duvarında bulunan penisilin bağlayan protein (PBP) lere bağlanarak peptidoglikan sentezini bozmaktadır. Bunun sonunda hücre duvarında lokalize olan peptidoglikan tabakasını tamamlayamayan bakteri iç ozmotik basınç etkisiyle parçalanarak ölmektedir. Bakteriler penisilin molekülünün beta laktam halkasını hidrolize eden beta laktamaz enzimleri sentezleyerek penisilini inaktive edebilmektedirler. S. aureus tarafından penisilinaz üretildiği ilk olarak 1945 yılında Spink ve Ferris tarafından bildirilmiştir 24. Penisilinaz üreten S. aureus suşları bütün dünyada yaygın bir biçimde görülmeye başlayınca, antibiyotik üreticileri ticari penisilin molekülünün yapısında S. aureus suşlarına etkili olacak değişiklikler yapmaya başlamışlardır. Bu çalışmalar sonucu geliştirilen metisilin, penisilinaz aktivitesine karşı dirençli olan ve kimyasal olarak modifiye edilmiş ilk antibiyotiktir 62. Ancak bir yıl içinde, 1961 yılında, metisiline dirençli S. aureus suşları (MRSA=Methicillin Resistant S. aureus) saptanmıştır. Metisiline dirençli bulunan S. aureus suşları tüm beta laktam grubu antibiyotiklere dirençli kabul edilmektedirler 25,26. Glikopeptid grubu bir antibiyotik olan vankomisin MRSA ve çoklu dirençli S. aureus suşlarına etkili bir tedavi seçeneği olarak geliştirilse de 1996 yılında vankomisine düşük düzeyde dirençli S. aureus (VISA) suşları ortaya çıkmıştır. Sonraki yıllarda Avrupa ve Japonya da da VISA suşları görülmeye başlanmıştır. VISA suşları, 2002 yılından sonra da Amerika da ortaya çıkmıştır 27,28. Stafilokoklar antibiyotiklere hızlı direnç geliştiren bakterilerdir. Günümüzde 10

penisilin, metisilin, makrolid, aminoglikozid, glikopeptid ve diğer antiyobiyotiklere direnç mekanizmaları bilinmektedir 11,12. 2.2.5 Stafilokok Enzimleri Stafilokokların salgıladıkları enzimler katalaz, koagülaz, fibrinolizinler, hiyaluronidaz, fosfatidilinositol-spesifik fosfolipaz C, nükleaz ve beta laktamaz dır. 2.2.5.1 Katalaz (hidrojen peroksid oksidoredüktaz) Bu enzim genellikle sitokrom ihtiva eden aerobik bakterilerde ve bazı fakültatif bakterilerde bulunur. Katalaz enzimi bütün stafilokoklar tarafından üretilir. Katalaz enzimi hidrojen peroksiti (H 2 O 2 ), oksijen (O 2 ) ve suya (H 2 O) ayrıştırır. Fagositik hücrelerde mikroorganizma sindirimi sırasında aktive olan myeloperoksidaz sistemince toksik hidrojen peroksid ve serbest radikaller üretilir. Hidrojen peroksid ve serbest radikaller katalaz enzimi tarafından inaktive edilir. Streptokoklar katalaz enzimi aktivetesine sahip değillerdir. Bu nedenle katalaz testi stafilokokları streptokoklardan ayırmada kullanılan önemli bir testtir 11,29,30. 2.2.5.2 Koagülaz Plazmayı pıhtılaştıran bir enzimdir. Koagülaz enzimi serbest ve bağlı koagülaz olmak üzere iki formda bulunabilmektedir. Serbest koagülaz, coagulase - reacting faktör ile etkileşerek aktif duruma geçer ve fibrinojenin fibrine dönüşümünü katalizler. Besiyerinde serbest halde ya da hücreye bağlı formda bulunabilir. Serbest koagülaz protein yapısında olduğundan proteolitik enzimlerle 11

kolayca inaktive edilebilir. Bu enzimatik aktivite bakteriyel hücreleri fibrinle kaplayarak onları fagositoz ve opsonizasyona daha dirençli hale getirir. Bağlı formda olan koagülaz enzimi ise S. aureus un hücre yüzeyinde bulunmaktadır. Hücreden ayrılmamaktadır. Bu nedenle plazma varlığında stafilokokların kümelenmesine neden olur. Koagülaz enzimi, S. aureus u diğer stafilokok türlerinden ayırmada kullanılan önemli bir tanımlama kriteridir 11,29,30. 2.2.5.3 Fibrinolizin Staphylokinase adını da alan bu enzim fibrin pıhtısını çözmektedir. Isıya dirençlidir. Neredeyse bütün stafilokoklar tarafından üretilen enzim streptekoklar tarafından da üretilir 11,29,30. 2.2.5.4 Hiyaluronidaz S. aureus suşlarının %90 ından fazlası bu enzim aktivitesine sahip bulunur. Bağ dokusunda bulunan hiyaluronik asidi parçalar. Böylece mikroorganizmanın dokuda komşu bölgelere yayılımında rol oynar 11,29,30. 2.2.5.5 Lipaz Lipazlar, S. aureus suşlarının tamamı ve koagülaz negatif suşların %30 undan fazlası tarafından üretilmektedir. Stafilokokların vücuttaki yağlı bölgelerde hayatta kalabilmesini sağlayan bu enzim lipidleri parçalayarak bakterinin kutanöz ve subkutanöz dokulara yayılmasına yardımcı olmaktadır. Böylece stafilokokların yağ dokusu bulunan bölgelerdeki enfeksiyonlarında önemli bir rol oyna- 12

maktadır 11,29,30. 2.2.5.6 Fosfatidilinositol-spesifik fosfolipaz C Bu enzim, erişkin respiratuar distres sendromu ve yaygın damar içi pıhtılaşması olan hastalardan elde edilen suşlarda gösterilmiştir. Bu enzimle etkilenmiş dokular kompleman aktivasyonu sırasında biyoaktif kompleman komponentleri ve ürünleri ile oluşacak olan hasar ve yıkıma karşı daha duyarlı hale gelmektedir 11,29,30. 2.2.5.7 Nükleaz DNA ve RNA yı hidrolize edebilen ısıya dayanıklı bir enzimdir. Termonükleaz (TNase) da denilen bu enzim birçok stafilokok suşu tarafından üretilir. DNAtoluidin blue agar gibi bir takım özel besiyerleri veya ticari hızlı tanımlama kitleri ile tespit edilmektedir 11,29,30. 2.2.5.8 Beta laktamaz Yapılan çalışmalarda S. aureus tarafından sentezlenen üç farklı tip betalaktamaz enzimi tesbit edilmiştir. Bu enzimler yapısal ya da indüklenebilir enzimlerdir. Yapısal enzimler sürekli sentezlenirken, indüklenebilen enzimler ise beta laktam antibiyotiklerle karşılaşılınca sentezlenmektedirler. Beta laktamazlar kendilerini sentezleyen mikroorganizmaları penisilin ve ampisilin gibi beta laktam antibiyotiklere dirençli hale getirirler. Bu enzimleri kodlayan genler genellikle plazmidler üzerindedir ve bu plazmidler tetrasiklin ve eritromisin gibi bazı 13

antibiyotiklere karşı direnç genlerini de taşımaktadırlar. Bu direnç genleri diğer bakterilere transformasyon ve transdüksiyon ile aktarılabilmektedir 11,29,30. 2.3 S. aureus Staphylococcus aureus; Alexander Ogston tarafından 1881 de insan patojeni olarak bildirilmiştir. Pürülan enfeksiyonların mikroskobik analizlerinde yuvarlak, üzüm salkımı dizilişi özelliğinde koklar görmüş, kültürde ise altın renginde pigment yaptığını belirlemiştir 31. S. aureus fakültatif anaerop bir bakteridir. Çoğunlukla aerop üreyen, katalaz ve koagülaz aktivitesi olan, mannitol, sükroz, maltoz ve trehalozdan asit yapabilen bir bakteridir. S. aureus mannitol ve trehalozdan asit oluşturarak S. epidermidis den, novabiocine duyarlı olması ile S. saprophyticus dan ayrılabilir. S. aureus %10 NaCl varlığında üreyebilmektedir. Kanlı agarda hemoliz yapmaktadır. Kanlı agar üzerindeki kolonileri ve beta hemolitik etkisi görüntüsü Şekil 2 de gösterilmiştir. Novobiocin e duyarlı olup sporsuz, hareketsiz ve kapsülsüzdür. Lizozim etkisine dirençlidir. Enterotoksinleri insan ve sıcak kanlı hayvanlarda gıda zehirlenmesine neden olur. Piyojenik enfeksiyonlara neden olabilmektedir. Doğada her yerde yaygın olarak bulunur 32,33. S. aureus stafilokok türleri arasında en önemli insan patojenidir. Dış ortamda yaygın olarak bulunur. Yetişkin insanların burun deliklerinde %20-40 oranlarında saptanmaktadır. Ayrıca deri, perine, aksilla ve vajende bulunabilirler 11,18. Genel taşıyıcılık oranı insanlarda sürekli taşıyıcılık, aralıklı taşıyılık ve taşıyıcı olmayan olarak üç şekilde tanımlanmıştır 63,64,65. Genellikle kabul gören tüm 14

popülasyonda S. aureus için sürekli taşıyıcılık oranı %20 dir. Popülasyonun %30 kadarı aralıklı taşıyıcıdır, %50 si ise S. aureus taşıyıcısı değildir 34,35,36. S. aureus toplum kökenli sepsisin en önemli nedenidir. En önemli hastane enfeksiyonu etkenlerindendir. S. aureus toksinleriyle yaptığı hastalıklar dışında deri, yumuşak doku, akciğer, eklem, kemik ve dolaşım sistemi enfeksiyonları yapabilirler 11,18. S. aureus subsp. aureus ve S. aureus subsp. anaerobicus olmak üzere iki alt türü vardır. S. aureus subsp. aureus 34-35 C de 3 gün, oda sıcaklığında 2 gün inkübe edilince 6 mm çapından büyük bir koloni oluşturur. Oda sıcaklığında sarı, sarı turuncu, portakal rengi karotenoit pigment yapar. Sığır kanlı agarda hemoliz yapar ve katalaz aktivitesine sahiptir. Anaerobik ve aerobik koşularda üreyebilir. İnsan ve tavşan plazması kullanılarak yapılan lam aglünitasyon testi ile kümelenme faktörü (clumping factor) pozitif bulunur. Tüpte yapılan koagülaz testi serbest koagülaz aktivitesi nedeniyle plazmayı pıhtılaştırır 11,18. (a) (b) Şekil 2: Koyun kanlı agarda üreyen S. aureus un koloni görünümleri: (a) S. aureus un pigment görünümü, (b) S. aureus un kanlı agarda beta hemoliz etkisi 13 15

İkinci alt tür olan S. aureus subsp. anaerobicus un kolonileri büyük değildir. Pigment yapmazlar, anaerobik koşullarda üreyebilirken aerobik koşullarda üremeyebilirler. Bu alt türün koagülaz aktivitesi pozitif bulunurken, kümelenme faktörü negatif bulunur. Katalaz aktivitesi göstermezler 11,18. S. aureus un bazı suşları, hücre duvarının en dış tabakasını kaplayan ve bakterinin fagositer hücreler tarafından fagositozunu engelleyen bir kapsül maddesine sahiptir. Kapsülün serolojik olarak 11 serotipi belirlenmiştir. Bu kapsül tiplerinden 5 ve 7 nolu kapsül serotipleri insan enfeksiyonlarında en sık karşılaşılan serotiplerdir 11,18. S. aureus virülansı en yüksek olan stafilokok türüdür. Stafilokok enfeksiyonlarının patogenezi, bakterinin konak dokulara yapışmasını sağlayan yüzey proteinlerinin (kollajen bağlayan protein, fibronektin bağlayan protein, clumping faktör gibi) üretimine ve sonrasında spesifik toksin ve hidrolitik enzimler gibi ekstraselüler proteinlerin salınımına bağlıdır 11,18. S. aureus un nazal taşıyıcılık oranı kronik sinüzitli hastalarda %42.8, nazal poliple birlikte kronik sinüziti olan hastalarda %45.4, kontrol grubunda ise %13.3 olarak saptanmıştır. Ayrıca kronik sinüzitli hastalardan izole edilen S. aureus suşları tarafından üretilen Toksik şok sendromu toksini-1 (TSST-1) oranı anlamlı düzeyde yüksek bulunmuştur. Bu bulgular ışığında S. aureus un kronik sinüzit enfeksiyonunda önemli bir etken olduğu ve toksinlerinin de bu tablonun gelişiminde rol oynadığı düşünülebilir 37,38. Son zamanlarda kronik sinüzit gelişiminde öne sürülen bir hipotez, burun mukozasında kolonize olan S. aureus un ürettiği süperantijenlere bağlı enflamasyon oluştuğudur. İnflamasyonun lenfosit aktivasyonu sonucu sitokinlerin ve 16

diğer enflamatuar mediatörlerin salınımı ile geliştiği düşünülmektedir 39. 2.3.1 S. aureus Toksinleri Stafilokoklar, enfeksiyonlarında patogenezde etkili olan birçok virulans faktörlerinin yanı sıra çeşitli toksinler de üretmektedirler. Bu toksinler şunlardır: 1. Sitolitik membran yıkıcı toksinler (a, b, s, g ve P-V), 2. Eksfoliyatif toksin (A ve B), 3. Enterotoksin (A,B,C,D,E,G,H,I) ve 4. Toksik şok sendromu toksini-1. Toksik etkili ekzoprotein genlerinin ekspresyonu, primer olarak regülatör olan agr gen bölgesi tarafından kontrol edilmektedir. Bu proteinlerin salınım düzeylerini çevresel faktörler, hücre yoğunluğu ve enerji durumu etkilemektedir 11,40,41. 2.3.1.1 Sitolitik membran yıkıcı toksinler (a, b, s, g ve P-V) Sitolitik toksinler hemolizinler olarak tanımlanmaktadır ancak hemoliz yapabilen a, b, s ve g toksinler eritrositler dışındaki hücreleri de yıkabilmektedir. Bu gruptaki Pantone-Valentine (P-V) lökosidini ise eritrositleri etkilememektedir. Bu nedenle bu toksinlere hemolizin yerine sitolitik toksin denilmesi uygun görülmüştür. Sitotoksinlerin nötrofilleri yıkması sonucu lizozomal enzimler salınır ve sonrasında çevre dokularda hasar meydana gelir 11,42. 17

2.3.1.1.1 Alfa toksin (a): İnsanlarda enfeksiyonlara neden olan S. aureus suşlarının ana sitolitik toksinidir. 33 kda luk bir polipeptittir. Bu toksin kan damarlarındaki düz kas hücrelerine ve kandaki lökosit, eritrosit ve trombosit gibi hücre tiplerine toksik etki yapmaktadır. Hücre membranında 1-2 nm çapında porlar oluşmasına neden olur. Buna bağlı olarak hücre içine molekül akışı hızlanır hücrenin şişerek parçalanmasına sebep olur 11,13,29. 2.3.1.1.2 Beta toksin (b): 35 kda ağırlığındadır. Sfingomiyelinaz olarak da adlandırılan bu toksin ısıya duyarlıdır. İnsan ve hayvanlarda enfeksiyon yapan S. aureus suşlarının çoğu tarafından üretilmektedir. Sfingomiyelin ve fosfatidilkolin yapısına spesifik bir toksindir. Hücre yüzeyindeki sfingomyelin miktarına bağlı olarak hücre membranındaki fosfolipitler üzerindeki yıkıcı etkisi artmaktadır. Aktivasyonu için magnezyum ve kobalt iyonlarına ihtiyaç vardır 11,29. 2.3.1.1.3 Delta toksin (d): S. aureus suşlarının çoğu ve diğer bazı stafilokoklar tarafından yapılır. Molekül ağırlığı 103 kda olan bu toksin antijenik değildir ve bu özelliğiyle alfa ve beta toksinlerinden ayrılır. Bu toksin deterjan benzeri bir etkiyle hücre membranı üzerine etki yaparak membran yapısını bozmaktadır 11,29. 2.3.1.1.4 Gama toksin (g): S. aureus suşlarının çoğu tarafından yapılan bu polipeptide insan, tavşan, koyun eritrositleri duyarlıyken at ve kuş eritrositleri dirençlidir 11,29. 2.3.1.1.5 Panton-Valentine P-V lökosidin: Bikomponent bir toksindir. Yavaş ayrılan protein S (slow) ve hızlı ayrılan protein F (fast) olmak üzere iki polipeptid zincirinden oluşmaktadır. Ayrıca bu iki zincir kendi içinde üç S proteininden biri 18

(hemolizin gamma A (HlgA), hemolizin gamma C (HlgC), Luk S-PV) iki F proteininden biri (hemolizin gamma B (HlgB), Luk F-PV) bir arada olmak üzere altı farklı kombinasyonda bulunabilirler. Bu altı farklı toksinin tümü insan ve tavşan lökositleriyle makrofajlarını etkilemektedir. Eritrositleri parçalayamaması nedeniyle hemolitik olmayan lökosidin olarak isimlendirilmektedir. Antijeniktir ve formaldehitle toksoide dönüştürülebilir. Porların oluşumu sonrasında deformasyonu sonrasında permeabilite artışına bağlı olarak hücreleri parçalamaktadır. MRSA suşlarının en az %5 inde saptanmaktadır. Toplumdan kazanılmış enfeksiyon etkeni MRSA suşlarının tamamında bulunmaktadır. Bu özelliği ile epidemiyolojik bir değer taşımaktadır. S. aureus suşları için primer bir virülans faktörüdür 11,29. 2.3.1.2 Eksfoliatif toksin Stafilokoklara bağlı haşlanmış deri sendromuna (staphylococcal scalded skin syndrome: SSSS) sebep olur. Molekül ağırlığı 24 kda olan bu ekzotoksinin eksfoliyatif toksin A (ETA) ve eksfoliyatif toksin B (ETB) olmak üzere iki tipi saptanmıştır. İki tipi de hastalık oluşturabilmektedir. ETA ısıya dirençli, ETB ise ısıya duyarlıdır. Formaldehid ile toksoide dönüşebilirler. Bu toksinin S. aureus suşlarında bulunma sıklığı coğrafik bölgelere göre değişmektedir. Genellikle %5-10 arasında bir sıklıkta bulunmaktadır. Bu toksine karşı hastalarda nötralizan ve presipitan antikorlar meydana gelmektedir 11,29. 19

2.3.1.3 Enterotoksinler S. aureus tarafından yapılan ve enterotoksin ailesi (SEs) olarak tanımlanan toksinler saptanmıştır. Bu toksinler serolojik olarak farklılık göstermektedir. Alfabetik olarak isimlendirilen enterotoksinlerin bugün bilinen ve genom sekanslaması yapılmış birçok farklı tipi mevcuttur 42,43,44,45 Enterotoksinler S. aureus suşlarının %30-50 si tarafından yapılmaktadır. Sık olarak gıda kaynaklı zehirlenmelere neden olurlar. Bu toksinler stafiloklara bağlı gelişen besin zehirlenmelerinin klinik semptomlarından sorumludurlar. Besin zehirlenmesine en sık neden olan tip enterotoksin A dır. Enterotoksin C ve D kontamine süt ürünlerinde bulunmaktadır. Enterotoksin B ise stafilokoklara bağlı gelişen pseudomembranöz enterokolite neden olur. Enterotoksin B ve nadiren enterotoksin C adet dönemi ile ilişkili olmayan toksik şok sendromu (TŞS) vakalarının yaklaşık yarısından sorumludur. Diğer enterotoksinlere gıda zehirlenmelerinde daha az rastlanmaktadır 11,42,46. Enterotoksinler diğer ekzotoksinlerden farklı olarak ısıya dayanıklıdırlar. Enterotoksinler 100 C de 30 dakika ısıtılmaya ayrıca mide ve jejunal enzimlere dayanıklıdırlar. Bu yüzden bir yiyecek enterotoksin üreten stafilokoklarla kontamine olmuşsa ve toksin üretilmeye başlanmışsa ne yiyeceğin ısıtılması ne de gastrik asitlere maruz kalması koruyucu olmamaktadır. Pastörizasyon, S. aureus hücrelerini öldürse de ısıya dirençli enterotoksinler biyolojik aktivitelerini sürdürebilmektedirler. Bu toksinlerin toplum sağlığı ve gıda sektörü açısından önemi göz önüne alındığında enterotoksin suşların prevalansının saptanması değer kazanmaktadır. Bu toksinlerin nasıl etki ettiği tam olarak bilinmemektedir. Ancak intestinal peristaltizmi arttırdıkları gösterilmiştir. Enterotoksin üretmiş stafilokok- 20

ların bulunduğu hamur işleri, dondurma, patates salatası, krema gibi yiyeceklerin yenmesinden sonra, 2-8 saat içinde ishal ile birlikte görülebilen kusma gelişir. Bu toksik tablo kendini sınırlayarak 24-48 saatte sonlanır ve sadece destek tedavisine ihtiyaç gösterir. Gastrointestinal sistem boyunca enflamatuar değişiklikler görülebilir 11,47. Enterotoksinler, nonspesifik T hücre aktivasyonu ve sitokin salınımını uyaran süperantijenlerdir. Süperantijen olma özellikleriyle klinikte önem taşımaktadırlar 48,49,50. Enterotoksinlerin antijenik tipleri değişik yöntemlerle belirlenebilmektedir. Enterotoksinler için immunolojik tanımlama metotları ve nükleik asit probları geliştirilmiştir. İmmunolojik tanımlama metotları toksinin örneklerde gösterilmesini sağlarken, nükleik asit probları ise toksini kodlayan yapısal genleri saptamaktadır 42,44,48,51,52,53. 2.3.1.4 Toksik Şok Sendromu Toksini-1 Toksik Şok Sendromu Toksini-1 (TSST-1) 22 kda moleküler ağırlıkta, ısıya ve proteolize dirençli, kromozomal orjinli bir ekzotoksindir. TSST-1, eskiden pirojenik ekzotoksin C ve enterotoksin F olarak da bilinirdi. Adet dönemi ile ilişkili toksik şok sendromundan sorumlu S. aureus suşlarının %90 ı, TSST-1 salgılarken, toksik şok sendromunun diğer formlarından sorumlu S. aureus suşlarının ise %50 si TSST-1 salgılamaktadır. TSST-1 in invitro salınımı için yüksek oksijen konsantrasyonu ve nötral ph ya gereksinim vardır 17,18,19,20,21,22,23,42,54. 21

Toksik Şok Sendromu (TŞS), en çok adet döneminde yüksek emici tampon kullanımına bağlı olarak ortaya çıkmaktadır. Toksin üreten stafiloklar tampon üzerinde ürerken yaptıkları toksinin mukozalardan emilmesi sonucu tablo gelişmektedir. Bu tip tamponların kullanımının kısıtlanması ve daha hijyenik koşullarda üretilmesi nedeniyle bu tablonun görülme sıklığı önemli ölçüde azalmıştır. Bakterinin yarada çoğalmasıyla da bu tablo gelişebilmektedir. Ancak toksin yapımı için nötral ph ve oksijen gerekli olduğundan yara enfeksiyonlarına bağlı TŞS gelişme olasılığı fazla değildir. TŞS nda bakteri sadece vajinal tampon veya yarada bulunmaktadır. Ancak yapılan toksin mukozal bariyerlerden geçerek TŞS na neden olmaktadır. TŞS lu hastalarda ölüm çoklu organ yetmezliği ve hipovolemik şok nedeniyle olmaktadır 38,42,46,49. TŞS nun ilk salgını 1928 yılında Avustralya da görülmüştür. S. aureus ile kontamine aşı yapılmasının ardından 21 çocukta hastalık gelişmiş ve bunların 12 si ölmüştür. Elli yıl sonra 7 çocukta sistemik hastalık görülmüştür. 1980 yılında ise adet dönemindeki kadınlarda saptanmıştır. 2.3.2 Protein-A S. aureus duvarı Protein-A olarak adlandırılan bir protein içermektedir. Saflaştırılmış Protein-A 42 kda molekül ağırlığındadır. Bu protein peptidoglikana veya sitoplazmik membrana bağlıdır ve IgG 3 subgrubu hariç bütün IgG lerin Fc bölgesine bağlanma özelliğine sahiptir. Protein-A immunojeniktir. Ciddi S. aureus enfeksiyonu olan kişilerde bu proteine karşı antikorlar bulunmaktadır. S. aureus taki Protein-A nın varlığı birçok klinik laboratuarda mikroorganizma tanımlanması ve vücut sıvılarında bakteriyel 22

antijenlerin saptanması için kullanılan koaglütinasyon test prosedürleri için temel oluşturmaktadır. S. aureus tarafından yapılan Protein-A (SpA), özellikle IgG gibi bazı immunglobulinlerin Fc kısımlarına spesifik olarak bağlanma özelliği gösteren bir duvar elemanıdır. SpA nın IgG ye bağlanma özelliği, bazı suşlarda dört bazı suşlarda beş tane olabilen birbirinin benzeri globüler bölgeler aracılığıyla olmaktadır. SpA, insan ve çeşitli hayvanların IgG 1, IgG 2 ve IgG 4 moleküllerine bağlanmaktadır. SpA, IgG molekülünün Fc parçasının CH 2 ve CH 3 bölgeleriyle etkileşmektedir 39,55. SpA, çeşitli hastalıklarda plazmada bulunan istenmeyen IgG moleküllerinin uzaklaştırılmasında ayrıca çeşitli serolojik testlerde kullanılabilmektedir. SpA, diğer yüzey proteinleriyle birlikte Th1 cevabını indükleyerek IFNg, TNF-a, IL-1a, IL-1bve IL-2 gibi sitokinlerin salınmasına neden olur 55,66. SpA nın IgE nin FceRI reseptörleriyle etkileşerek bazofilleri aktive ettiği de düşünülmektedir. SpA nın insan bazofil ve mast hücrelerinden histamin salımınını arttırdığı gösterilmiştir. SpA nın bu özellikleri nedeniyle kronik sinüzit gelişimindeki allerjik temelde rol oynadığı iddia edilmektedir 55,56,57,58. 2.4 Süperantijenler Antijen özgüllüğü olmadan T hücrelerini uyaran moleküllere süperantijenler denir. Süperantijenler özel bir toksin grubudur. Eksfolyatif toksin A, enterotoksinler ve TSST-1 süperantijen olarak bilinen polipeptid grubu protein yapıda moleküllerdir. Normal koşullar altında antijen niteliğindeki peptidler işlene- 23

rek MHC sınıf-ii moleküllerine sunulmaktadır ve bu moleküller T lenfosit reseptörleri (TCR) tarafından tanınmaktadır. Bu moleküllerin tanınması için Va, Vb, Ja, Jbve Db segmentlerine bağlanmaları gerekmektedir. Süperantijenler ise Şekil 3 ve 4 te gösterildiği gibi işlenmeden direkt olarak MHC sınıf-ii moleküllerine ve T hücre reseptörlerinin Vb segmentlerine bağlanarak ve T hücrelerini uyarabilirler. Ani ve büyük miktardaki sitokin salınımına (sitokin fırtınası), şok ve ağır doku hasarına yol açabilmektedir. Süperantijenlerin fazla miktarda salınımına neden oldukları sitokinlerden IL-1, TNF ve IL-2 hayatı tehdit eden otoimmün benzeri bir yanıtın oluşmasına neden olur. Süperantijenlerin T hücrelerini bu şekilde uyarması, aktive T hücrelerinin ölümüne neden olarak özgül T hücre klonlarının kaybına yol açar 11,43,46,59,60,61. Şekil 3: Süperantijenler tarafından T hücre uyarılması 61 S. aureus kronik sinüzitli hastalarda en sık saptanan bakteridir. Yapılan 24

Şekil 4: Süperantijenlerin T lenfositlerine bağlanması 67 çalışmalarda kronik sinüzitli hastalarda stafilokok kolonizasyonunun arttığı, S. aureus tarafından üretilen ve süperantijen rolü oynayan enterotoksinlerin özellikle nazal polipi olan hastalarda görülen eozinofilik enflamasyonla ilişkili olduğu gösterilmiştir. Ekzotoksinlerin T hücre proliferasyonunu arttırdığı kanıtlanmıştır. Süperantijenlerin indüklediği immün cevap, eozinofilik enflamasyonun şiddetli olmasına yol açar ve solunum yolu polip hastalarında semptomların şiddetlenmesine neden olur 37,38,58,60. Son yıllarda kronik sinüzit gelişiminde öne sürülen bir hipotezle, burun mukozasında kolonize olan S. aureus un ürettiği süperantijenlerin indüklediği lokal enflamasyonun bu tablonun ortaya çıkmasında etkili olduğu savunulmaktadır. Ayrıca SpA, nazal dokuda histamin salınımını arttırmakta ve allerjik etkilere yol açmaktadır 6,58. Lenfosit aktivasyonu sonucu sitokinlerin ve diğer enflamatuar mediatörlerin salınımı ile bu enflamasyonun geliştiği düşünülmektedir. 25

Bu çalışmada, kronik sinüzit tanısı konmuş hastalardan alınan endoskopik sinüs biyopsi örneklerinde S. aureus varlığının incelenmesi ve izole edilen S. aureus suşlarında SpA ve süperantijen niteliğinde olan toksinlerin üretimi araştırılmıştır. Ayrıca kontrol amacıyla alınan örneklerden izole edilen S. aureus suşlarındaki benzer özelliklerin değerlendirilmesiyle S. aureus tarafından üretilen SpA ve bu toksinlerin kronik sinüzit gelişimindeki rollerinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. 26

3. MATERYAL METOD 3.1 Örneklerin Alınması ve Taşınması Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi (GÜTF) Hastanesi Kulak Burun Boğaz (KBB) polikliniğine burun tıkanıklığı, burun akıntısı, postnazal akıntı, baş ağrısı ve hapşırma gibi nazal şikayetlerle başvuran, rinoskopik ve endoskopik nazal muayeneleri yapılarak ve radyogramları çekilerek kronik tekrarlayan sinüzit tanısı alan osteomeatalkompleks ve paranazal sinüslerde patoloji tespit edilerek endoskopik sinüs cerrahisi uygulanan 30 hasta çalışmaya dahil edilmiştir. Kontrol grubu için sinüs enfeksiyonu bulunmayan ve nazal septum cerrahisi yapılan 30 hasta seçildi. Fonksiyonel Endoskopik Sinüs Cerrahisi işlemi Messerklinger tekniği ile yapıldı 68. Hastalara endoskopi eşliğinde sinüs biyopsisi yapılarak her hastadan birer biyopsi örneği alındı. Çalışmanın yapılacağı zaman diliminde yapılabilecek endoskopi sinüs cerrahisi girişim sayıları göz önüne alınarak 30 hasta ve 30 kontrol grubundan örnek alınması planlandı. Hastaların biyopsi öncesi en az iki hafta antibiyotik kullanmamış olmasına dikkat edildi. Bu çalışmada; KBB polikliniğine başvuran ve kronik sinüzit tanısı almış hastalardan ayrıca sinüzit bulguları taşımayan ve başka nedenlerle gelmiş kişilerden de burun sürüntüsü alındı. Örnek alımı, endoskopik biyopsi örnekleride dâhil olmak üzere, hasta ve kontrol gruplarından 50 şer adet S. aureus suşu izole edilinceye kadar sürdürüldü. Böylece endoskopik sinüs biyopsi örnekleri dışında kronik sinüzit tanısı almış 210 hasta ile sinüzit bulguları taşımayan ve başka nedenlerle gelmiş 442 kişiden daha burun sürüntüsü alındı. Hastalardan ve kontrol grubu için seçilen bireylerden örnekler KBB uzmanı tarafından alındı. Biyopsi örnekleri içinde steril %0.9 luk NaCl içeren tüplere alındı ve bekletilme- 27

den GÜTF Mikrobiyoloji laboratuarına getirildi. Kronik sinüzitli hastalardan izole edilen 50 S. aureus suşu ile birlikte kontrol grubundan temin edilen 50 S. aureus suşunda çeşitli toksinler ve Protein-A (SpA) üretim düzeyleri incelendi. Bu tez çalışması Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Araştırma ve Değerlendirme Komisyonunun 25 Haziran 2010 tarihli 095 nolu kararıyla etik kurul onayı alınarak yapılmıştır (EK-A). Hastalardan örnek alınmadan önce hastalar çalışma hakkında bilgilendirilmiş ve her hasta için onam form doldurulmuştur. 3.2 Örneklerin İncelenmesi 3.2.1 Bakteri Kültürü ve Tanımlama Mikrobiyoloji laboratuarında gelen biyopsi örnekleri steril cam boncuk bulunan bir tüpte 1 ml steril serum fizyolojik içerisinde steril cam baget yardımıyla iyice ezilerek homojenize edildi. Daha sonra 0.5 µl kalibreli öze ile üst sıvıdan örnek alınarak iki farklı kanlı agar plağına tek koloni ekim tekniği ile ekildi. Ekim yapılan kanlı agar plakları 37 C de 24-48 saat süre ile inkübe edildi. Süre bitiminde üreyen bakteriler koloni morfolojisi, gram boyanma özelliği, hemoliz özellikleri, katalaz ve oksidaz aktivitesi ayrıca diğer biyokimyasal özellikleri bakımından değerlendirildi. Stafilokok olduğu düşünülen bakterilerin saf kültürleri yapıldı. Üreyen stafilokokların koagülaz aktivitesi tüp koagülaz testi ile incelendi. Test edilecek bak- 28

teri 0.5 ml plazma içine ekildi ve 4 saat 37 C de bekletildi. Plazmanın pıhtılaşması ve akışkanlığını kaybetmesi durumunda koagülaz enzim yapımı bakımından pozitif olarak kabul edildi. Klasik yöntemlerle tanımlanması yapılan bakterilerin tanılarının doğrulanması ve tanımlanması yapılamayan suşların tanımlanması amacı ile gram pozitif bakteri tanı kiti (API Staph. Biomeriux) kullanıldı. Bakterinin ticari kit prospektüs önerileri doğrultusunda süspansiyonu hazırlandıktan sonra herbir biyokimyasal reaksiyonun gerçekleşeceği striplere 100 er µl olarak yüklendi. 18-24 saat inkübasyon sonucunda firma önerileri doğrultusunda bazı kuyucuklar üzerine reaktifler eklendi. Kuyucuklardaki renk değişikliklerine göre skorlanıp okuma yapıldı. Bilgisayar programında okutularak bakteri isimlendirildi. 3.2.2 Toksin Varlığının Tespiti İzole edilen S. aureus suşlarında TSST-1 ve enterotoksin A, B, C ve D varlığı gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (gerçek zamanlı PZR, ing.: real-time PCR) yöntemi kullanılarak incelenmiştir 20,37. 3.2.2.1 DNA izolasyonu Triptik soy broth kültür solüsyonunda üretilen bakteriler 4000 rpm de, 4 C de 5 dakika santrifüj edildi ve DEP-C içeren yıkama solüsyonu ile iki kez yıkandılar. Her S. aureus çöküntüsünden 100 µl alınarak ayrı bir ependorf tüpüne aktarıldılar. Üzerine 0.8 mg silika boncuk eklenerek 5 dakika kuvvetlice vortekslendiler. Ependorf tüpündeki örneklere 100 er µl parçalama tamponu (TRİS 10 mm, EDTA 10 mm, NaCl 50 mm, SDS %2) ve 20 µl proteinaz-k (100 mg/ml) eklene- 29

rek 2 saat 65 C de inkübasyona bırakıldılar. Daha sonra örnekler 5 dakika süre ile 95 C de ısı bloğunda tutularak proteinaz-k nın denatüre edilmesi sağlandı. Bundan sonra tüpler 10000 rpm de 5 dakika santrifüj edildi. DNA içeren üst sıvıdan 150 µl alınarak temiz ependorf tüplerine aktarıldı ve üzerlerine 150 µl fenolkloroform-izoamilalkol (25:24:1) karışımı eklendi. İyice karıştırılıp 14000 rpm de 5 dakika santrifüjlendikten sonra üst sıvıları bulanık çökeltiye dokunmadan temiz ependorf tüplerine alındı. Üzerlerine 200 µl kloroform-izoamilalkol (24:1) karışımı eklenerek hafif vortekslendiler. Daha sonra 14000 rpm de tekrar 5 dakika santrifüjlendiler. Tekrar üst sıvıları temiz ependorf tüplerine aktarıldı ve üzerlerine üst sıvının 1:2.5 i oranında %100 lük etanol eklenerek yıkandı. Hafif vorteks sonrası 14000 rpm de 20 dakika santrifüjlendiler. Üstte kalan alkol pipetle uzaklaştırıldı. Sonra üzerlerine 200 er µl %70 lik etanol eklenerek iki kez daha yıkandılar. Daha sonra kurutularak alkolün örneklerden uzaklaştırılması sağlandı ve son ürün DNA ya 50 µl DEP-C li su eklendi. Saflaştırılan DNA, spektrofotometre ile OD260 kanalından ve Şekil 5 de gösterilen Qubit florimetrik sistemle (Invitrogen) ölçüldü. 3.2.2.2 Toksinlerin Gerçek Zamanlı PZR Analizi ile Tespiti Gerçek zamanlı PZR analizi LightCycler 480 Multiwell Plate 96 cihazı kullanılarak yapıldı. Kullanılan cihaz Şekil 6 da gösterilmiştir. Bu çalışmada gen varlığı araştırılan Enterotoksin A, B, C ve D ile TSST- 1 toksin genlerinin örnekte belirlenebilmesi için her gene spesifik forward ve reverse primerler kullanıldı. Stafilokoklara ait 16S rrna gen dizisi iç kontrol geni ve girdi miktarını normalize etmek amaçlı kalibrasyon örneği olarak kullanıldı. Literatür bilgileri ışığında belirlenerek kullanılan primerler aşağıda gösterilmiştir. 30

Şekil 5: DNA Saflaştırılmasından Sonra Ölçüm Şekil 6: Gerçek Zamanlı PZR Cihazı 31

Enterotoksin A için: SEA Forward: 5 TTGGAAACGGTTAAAACGAA 3, SEA Reverse: 3 GAACCTTCCCATCAAAAACA 5, Enterotoksin B için: SEB Forward: 5 TCGCATCAAACTGACAAACG 3, SEB Reverse: 3 GCAGGTACTCTATAAGTGCC 5, Enterotoksin C için: SEC Forward: 5 GACATAAAAGCTAGGAATTT 3, SEC Reverse: 3 AAATCGGATTAACATTATCC 5, Enterotoksin D için: SED Forward: 5 CTAGTTTGGTAATATCTCCT 3, SED Reverse: 3 TAATGCTATATCTTATAGGG 5, Toksik Şok Sendromu Toksini-1 için: TST Forward: 5 TGTAGATCTACAAACGATAATATAAAGGAT 3, TST Reverse: 3 ATTAAGCTTAATTAATTTCTGCTTCTATAGTT 5, 16s rrna için: 16s Forward: CCGCCTGGGGAGTACG, 16s Reverse: AAGGGTTGCGCTCGTTGC primerleri kullanıldı 41,51. 32

Gerçek zamanlı PZR analizi için Light Cycler 480 SYBR Green I master kiti kullanıldı. Kit içeriğine uyularak, 10 µl master mix, 1 µl (5 ng) forward primer, 1 µl (5 ng) reverse primer, 3 µl su ve her bir DNA örneğinden 5 µl mikropleytin her bir çukuruna eklendi. PZR aşamaları şu şekilde gerçekleştirildi: 1. Denatürasyon aşaması: 5 dakika, 95 C. 2. Amplifikasyon: 1 dakika, 95 C. 3. Bağlanma: 1 dakika, 55 C. (Primere göre 51-58 C arasında değiştirilmek üzere) 4. Uzama: 1 dakika, 72 C uygulandı. 5. 2,3 ve 4. basamaklar 45 siklus tekrarlandı. 6. Sonlanma: 5 dakika, 72 C uygulandı. Floresan okumaları herbir extension (uzama) basamağından sonra yapıldı. Cihazda bağlanma sonrası erime eğrisi analizi (melting curve) saniyede 0.1 C arttırılarak 65-99 C arasında sürekli floresan okumalarına bağlı olarak gerçekleştirildi. Stafilokoklara ait enterotoksin genleri ekspresyonu kalibrasyon örneği ve örnek girdi miktarını normalize eden iç kontrolüne (16S rrna) bağlı olarak hesaplandı. Veriler bilgisayar ortamında değerlendirildi ve sonuçlar kaydedildi. Bağlanma derecesi her bir toksin için ayarlandı. Enterotoksin A için 55 C, enterotoksin B için 58 C ayrıca denatürasyon aşaması 10 dakika olarak, enterotoksin C için 51 C, enterotoksin D için 54 C ve TSST-1 için 53 C olarak 33

çalışıldı. Bu toksinlere ait gerçek zamanlı PZR tekniğiyle elde edilen Tm dereceleri Tablo 2 de, Tm amplifikasyon ve Tm eğrilerine ait grafikler ise Şekil 7,8,9,10 ve 11 de verilmiştir. Tablo 2: Toksinlere göre Tm dereceleri Toksin Tm Derecesi ( C) SEA 73 SEB 75 SEC 76 SED 72 TSST-1 77 16s rrna 84 34

Şekil 7: Enteretoksin A için PZR grafikleri 35

Şekil 8: Enteretoksin B için PZR grafikleri 36

Şekil 9: Enteretoksin C için PZR grafikleri 37

Şekil 10: Enteretoksin D için PZR grafikleri 38

Şekil 11: TSST-1 için PZR grafikleri 39

3.2.2.3 Toksinlerin VIA Yöntemi Kullanılarak Tespiti Gerçek zamanlı PZR yöntemiyle toksin genlerinin araştırılması dışında, S. aureus suşlarında, A, B, C ve D enterotoksinleri TECRA Staphylococcal enterotoxin VIA kit (TECRA, New South Wales, Australia) kullanılarak da araştırılmıştır. Yöntem visual immunoassay (VIA) temeline dayanmaktadır. S. aureus suşları triptik soy broth içinde 37 C de 18 saat aerop etüvde inkübe edildi. İnkübasyon sonrası 10000g (9800 rpm) de 5 dakika santrifüj edildiler. Süpernatantları başka tüplere transfer edildi. Süpernatantların ph ı 7 ye ayarlandı. Örneklerden 200 er µl alınarak kit kapsamında verilen ve işaretlenmiş kuyucuklara eklendi. Daha sonra 37 C de 2 saat inkübasyona bırakıldılar. Kuyucuklar 4 kez yıkandı. Üzerlerine konjugat eklendi. Oda sıcaklığında 1 saat inkübasyona bırakıldılar. Kuyucuklar 5 kez yıkandılar ve üzerine 200 er µl substratları eklendi. Oda sıcaklığında yarım saat inkübasyona bırakıldı. Sonuçlar kitle birlikte verilen renk skalasına göre pozitif veya negatif olarak değerlendirildi 69. Yöntemin uygulama kiti ve değerlendirilmesi Şekil 12 ve Şekil 13 de gösterilmiştir. 3.2.3 Bakterilerde Protein-A Miktarının EIA Yöntemi ile Tespiti İncelenen S. aureus suşlarının SpA yapıp yapmadığı, Şekil 14 de gösterilen Protein-A enzim immunoassay (EIA) kiti (Assay Designs, Stressgen, USA) kullanılarak değerlendirilmiştir. Çalışma, üretici firmanın önerileri doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. İncelenen S. aureus suşlarının 0.5 McFarland eşeline göre süspansiyonları hazırlanarak bakteri sayıları standart hale getirildi. Kontrol suşu olarak S. aureus Cowan 1 suşu kullanıldı. Hazırlanmış bakteri süspansiyonlarının 100 kat- 40

Şekil 12: Enterotoksin A, B, C ve D için VIA kit içeriği Şekil 13: Enterotoksin A, B, C ve D nin VIA yöntemiyle değerlendirilmesi lık sulandırımları yapıldı. Kit içinde verilen SpA standardından ilk tüpteki miktar 10000 pg/ml olacak şekilde iki kat azalan dilüsyonları hazırlandı. Daha sonra her bakterinin 1/100 sulandırılmış süspansiyonu 95 C de 5 dakika bekletildi. 4000 rpm de 3 dakika santrifüj edildikten sonra süpernatanları alındı. İlk kuyucuk kör 41

Şekil 14: Yüzey Protein-A için Enzim Immunoassay (EIA) Kiti olmak üzere standartlar ve örnekler 100 er µl olarak kuyucuklara dağıtıldı. Oda sıcaklığında 500 rpm de çalkalayıcı üzerinde 1 saat inkübasyona bırakıldı. Daha sonra Şekil 15 te gösterilen elisa cihazı yıkayıcısında 4 kez yıkandı. Kör kuyucuk haricinde her kuyucuğa antikor eklendi. Tekrar oda sıcaklığında 500 rpm de çalkalayıcı üzerinde 1 saat inkübasyona bırakıldı. Daha sonra kuyucuklar 4 kez yıkandı. Kör kuyucuk haricindeki tüm kuyucuklara mavi renkli konjugattan 100 er µl eklendi. Oda ısısında 500 rpm de çalkalayıcı üzerinde yarım saat inkübasyona bırakıldı. Bütün kuyucuklara 100 er µl substrat eklendi. Oda sıcaklığında 15 dakika yine çalkalayıcı üzerinde 500 rpm de inkübe edildi. Kuyucuklara 100 er µl durdurucu solüsyon eklendi. Daha sonra kuyucuklardaki renk değişiminin optik dansite (OD) değerleri 450 nm de okundu. Okuma işlemi yapılmadan önceki kuyucukların görüntüsü Şekil 16 da gösterilmiştir. OD sonuçları, standart SpA değerlerinden oluşturulan standart eğri üzerinden örnekteki SpA miktarı pg/ml olarak değerlendirildi. 42

Şekil 15: Enzim Immunoassay (Elisa) Cihazı Şekil 16: Elisa Cihazında Okuma Öncesi 3.3 İstatistik Değerlendirme Hasta ve kontrol grubu Enterotoksin A,B,C,D ve TSST-1 gen varlığı, SpA yapımı ve S. aureus taşıyıcılığı sonuçları istatistiksel olarak SPSS (versiyon 43

15.0) programı kullanılarak Pearson Ki-kare ve Mann Whitney U testleri ile değerlendirildi. 44

4. BULGULAR Kronik sinüzit tanısı almış 6 (%20) hastanın biyopsi örneklerinden S. aureus izole edilirken, kontrol grubundan alınan hiçbir biyopsi örneğinden S. aureus izole edilmedi. Kronik sinüzit tanısı almış ve burun sürüntüsü incelenen 210 hastanın 44 ünde (%21) S. aureus üretildi. Kronik sinüziti olmayan ve kontrol amacıyla alınan 442 bireyin burun sürüntüsünün 50 sinde (%11) S. aureus üretildi. Hem biyopsi örneklerinde hem de burun sürüntüsü örneklerinde kronik sinüzitli hastalardan kontrol grubuna göre daha çok S. aureus üretildi ve aradaki fark önemli bulundu. Hasta ve kontrol grubu örneklerinde üretilen S. aureus sayıları Tablo 3 de gösterilmiştir. Tablo 3: Kronik sinüzitli hasta grubu ile kontrol grubu biyopsi ve burun sürüntüsü örneklerinde S. aureus belirlenme düzeyleri (p<0.05) Biyopsi örnekleri Pozitif Negatif Hasta Grubu n:30 6 (%20) 24 (%80) Kontrol Grubu n:30 0 (%0) 30 (%100) Burun sürüntüsü Pozitif Negatif Hasta Grubu n:210 44 (%21) 166 (%79) Kontrol Grubu n:442 50 (%11) 392 (%89) Tüm Örnekler Pozitif Negatif Hasta Grubu n:240 50 (%21) 190 (%79) Kontrol Grubu n:472 50 (%11) 422 (%89) S. aureus suşlarında toksin genleri varlığı gerçek zamanlı PZR yöntemiyle araştırılmıştır. Bakterilerde bu yöntemle elde edilen enterotoksin A gen analizlerine ait amplifikasyon eğrileri Şekil 7 de, TSST-1 gen analizlerine ait amplifikas- 45

yon ve TM eğrileri Şekil 11 de gösterilmiştir. Kronik sinüzitli hastalardan izole edilen S. aureus suşlarının %54 ünde, kontrol grubundan elde edilen S. aureus suşlarının ise %46 sında enterotoksin A gen varlığı belirlenmiştir. Kronik sinüzitli hastalar ve kontrol grubundan izole edilen S. aureus suşlarında enterotoksin A gen varlığı bakımından istatistiksel anlamda bir fark bulunmamıştır (p>0.05). Gerçek zamanlı PZR yöntemiyle kronik sinüzitli hastalar ile kontrol grubundan elde edilen S. aureus suşlarında belirlenen enterotoksin A gen varlığı değerleri Tablo 4 te, enterotoksin B gen değerleri Tablo 5 te, enterotoksin C değerleri Tablo 6 da ve enterotoksin D değerleri ise Tablo 7 de gösterilmiştir. Tablolarda hasta ve kontrol gruplarında gen varlığı bakımından yapılan istatistiksel önemlilik test değerleri de verilmiş olup hasta ve kontrol gruplarından soyutlanan S. aureus suşlarında belirlenen dört farklı enterotoksin geninin bulunma sıklığında Pearson Ki-kare testi sonucuna göre istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmamıştır. Tablo 4: Kronik sinüzitli hastalar ile kontrol grubundan elde edilen S. aureus suşlarında enterotoksin A geni bulunma sıklığı (p>0.05) SeA Pozitif SeA Negatif Hasta Grubu n:50 27 (%54) 23 (%46) Kontrol Grubu n:50 23 (%46) 27 (%54) İncelenen S. aureus suşlarının enterotoksin A, B, C ve D yapma özellikleri visual immunoassay (VIA) yöntemiyle de incelenmiştir. Hastalardan soyutlanan S. aureus suşlarının %50 sinin enterotoksin A, %30 unun enterotoksin B, %16 sının enterotoksin C ve %16 sının enterotoksin D yaptığı görülmüştür. Kont- 46

Tablo 5: Kronik sinüzitli hastalar ile kontrol grubundan elde edilen S. aureus suşlarında enterotoksin B geni bulunma sıklığı (p>0.05) SeB Pozitif SeB Negatif Hasta Grubu n:50 16 (%32) 34 (%68) Kontrol Grubu n:50 12 (%24) 38 (%76) Tablo 6: Kronik sinüzitli hastalar ile kontrol grubundan elde edilen S. aureus suşlarında enterotoksin C geni bulunma sıklığı (p>0.05) SeC Pozitif SeC Negatif Hasta Grubu n:50 8 (%32) 42 (%68) Kontrol Grubu n:50 7 (%24) 43 (%76) Tablo 7: Kronik sinüzitli hastalar ile kontrol grubundan elde edilen S. aureus suşlarında enterotoksin D geni bulunma sıklığı (p>0.05) SeD Pozitif SeD Negatif Hasta Grubu n:50 8 (%16) 42 (%84) Kontrol Grubu n:50 7 (%14) 43 (%86) rol grubundan izole edilen bakterilerde bu oranlar sırasıyla %44, %22, %12 ve %14 olarak saptanmıştır. Hasta grubundan soyutlanan 50 S. aureus suşunun 10 unda (%20) TSST- 1 geni saptanırken, kontrol grubundan soyutlanan 50 S. aureus suşunun 23 ünde (%46) toksin geni belirlenmiştir. Kontrol grubundan soyutlanan bakterilerde daha fazla toksin geni varlığı belirlenmiş ve bu fark istatistiksel açıdan anlamlı bulunmuştur. Gerçek zamanlı PZR yöntemiyle hasta ve kontrol grubundan soyutlanan 47

S. aureus suşlarında belirlenen TSST-1 gen varlığı analiz sonuçları Tablo 8 de gösterilmiştir. Tablo 8: Kronik sinüzitli hastalar ile kontrol grubundan elde edilen S. aureus suşlarında belirlenen TSST-1 gen değerleri (p<0.05) TSST-1 Pozitif TSST-1 Negatif Hasta Grubu n:50 10 (%20) 40 (%80) Kontrol Grubu n:50 23 (%46) 27 (%54) Hasta ve kontrol gruplarından soyutlanan S. aureus suşlarında SpA düzeyleri EIA yöntemiyle kantitatif olarak incelenmiştir. Protein A nın kantitaif analizinin yapılabilmesi için kit içinde bulunan standart SpA nın seri sulandırımı yapılmış ve değişik konsantrasyonların optik dansite (OD) değeri okunmuştur. Bu değerlerden standart eğri oluşturulmuştur. Her bakteri suşundan hazırlanan örneğin okunan OD değeri bu standart eğri temel alınarak pg/ml cinsinden konsantrasyon değeri olarak belirlenmiştir. Ticari kit önerileri doğrultusunda OD si 0.2 nin altında okunan değerler negatif kabul edilmiştir. SpA nın değişik konsantrasyonlarında okunan OD değerleri Tablo 9 da gösterilmiştir. Hasta ve kontrol gruplarından izole edilen S. aureus suşlarında belirlenen SpA varlığı ve miktarları Tablo 10 da gösterilmiştir. Kontrol amacıyla kullanılan S. aureus Cowan suşuna ait değer, aynı tablonun 101 numaralı satırında verilmiştir. Hasta grubundan soyutlanan 50 S. aureus suşunun 44 ünde (% 88), kontrol grubundan elde edilen 50 S. aureus suşunun ise 45 inde (% 90) SpA varlığı saptanmıştır. Hasta ve kontrol grublarından soyutlanan S. aureus suşlarında SpA bulunma sıklığı bakımından istatistiksel anlamda bir fark bulunmamıştır. Hasta ve kontrol gruplarından soyutlanan bakterilerdeki SpA varlığı analiz so- 48

Tablo 9: SpA nın değişik konsantrasyonları için okunan OD değerleri Konsantrasyon (pg/ml) Mean Standart-1 1000 2.6330 Standart-2 500 1.6025 Standart-3 250 0.9455 Standart-4 125 0.5395 Standart-5 62.50 0.3335 Standart-6 31.25 0.2545 Standart-7 15.62 0.2360 Standart-8 0 0 nuçları Tablo 11 de gösterilmiştir. Hasta örneklerinden soyutlanan ve SpA yaptığı belirlenen S. aureus suşlarında ölçülen SpA düzeyleri ortalama olarak 1171 pg/ml olarak ölçülmüşken aynı değer kontrol grubundan elde edilen S. aureus suşları için 1248 pg/ml olarak belirlenmiştir. Kontrol grubundan elde edilen bakterilerde daha yüksek bir SpA yapım sıklığı ve SpA düzeyleri belirlenmiştir. Hasta ve kontrol gruplarından izole edilen SpA pozitif S. aureus suşlarında belirlenen SpA düzeyleri ve istatistiksel değerlendirme sonuçları Tablo 12 de gösterilmiştir. Hasta ve kontrol grubundaki SpA yapım düzeyleri arasındaki fark Mann Whitney U testi kullanılarak değerlendirilmiş ve önemsiz bulunmuştur (p>0.05). 49

Örnek Tablo 10: Protein A nın kantitatif değerleri Hasta Grubu OD Konsantrasyon (pg/ml) Örnek Kontrol Grubu OD Konsantrasyon (pg/ml) 1 3.411 1383.0 51 3.408 1381.8 2 3.460 1401.8 52 3.390 1374.9 3 3.460 1401.8 53 3.671 1483.0 4 3.400 1378.8 54 1.537 662.2 5 3.409 1382.2 55 3.665 1480.7 6 2.122 887.2 56 3.666 1481.1 7 3.423 1387.6 57 3.647 1473.8 8 0.591 298.4 58 3.687 1489.2 9 3.345 1357.6 59 3.719 1501.5 10 3.761 1517.6 60 3.700 1494.2 11 3.580 1448.0 61 0.176 138.8 12 0.169* 136.1 62 3.516 1423.4 13 3.714 1499.5 63 3.534 1430.3 14 3.795 1530.7 64 3.488 1412.6 15 0.187 143.0 65 3.526 1427.2 16 3.739 1509.2 66 2.629 1082.2 17 3.356 1361.8 67 3.554 1438.0 18 3.370 1367.2 68 3.591 1452.2 19 3.296 1338.8 69 3.455 1399.9 20 3.348 1358.8 70 3.507 1419.9 21 3.332 1352.6 71 3.474 1407.2 22 3.331 1352.2 72 0.180 140.3 23 3.355 1361.5 73 3.515 1423.0 24 0.161 133.0 74 3.500 1417.2 25 0.295 184.5 75 3.476 1408.0 26 3.409 1382.2 76 3.559 1439.9 27 3.396 1377.2 77 3.415 1384.5 28 3.351 1359.9 78 3.405 1380.7 29 3.367 1366.1 79 0.136 123.4 30 3.390 1374.9 80 3.421 1386.8 31 0.176 138.8 81 3.454 1399.5 32 3.405 1380.7 82 0.169 136.1 33 0.180 140.3 83 3.714 1499.5 34 3.405 1380.7 84 3.795 1530.7 35 0.136 123.4 85 0.187 143.0 36 3.408 1381.8 86 3.739 1509.2 37 3.390 1374.9 87 3.356 1361.8 38 3.671 1483.0 88 3.370 1367.2 39 1.537 662.2 89 3.296 1338.8 40 2.629 1082.2 90 3.460 1401.8 41 3.554 1438.0 91 3.400 1378.8 42 3.591 1452.2 92 3.409 1382.2 43 3.500 1417.2 93 2.122 887.2 44 3.476 1408.0 94 3.423 1387.6 45 3.559 1439.9 95 3.409 1382.2 46 3.415 1384.5 96 3.396 1377.2 47 3.739 1509.2 97 3.351 1359.9 48 3.356 1361.8 98 3.367 1366.1 49 3.370 1367.2 99 3.390 1374.9 50 3.296 1338.8 100 2.122 887.2 (Cowan**) 101 3.454 1399.5 * 0.2 nin altındaki değerler negatif olarak kabul edilmiştir. ** Kontrol Suşu 50

Tablo 11: Kronik sinüzitli hastalar ile kontrol grubundan elde edilen S. aureus suşlarında belirlenen SpA varlığı (p>0.05) SpA Pozitif SpA Negatif Hasta Grubu n:50 44 (%88) 6 (%12) Kontrol Grubu n:50 45 (%90) 5 (%10) Tablo 12: Hasta ve kontrol grublarından soyutlanan SpA pozitif S. aureus suşlarında EIA ile belirlenen SpA düzeyleri (pg/ml) Ortalama Minimum Maksimum Std. Hata Std. Sapma Hasta Grubu n:44 1171* 1039 1304 66 467 Kontrol Grubu n:45 1248 1132 1364 57 407 * Hasta ve kontrol grubu bakteri suşlarında SpA düzeyleri arasındaki fark anlamsız bulunmuştur (p>0.05). 51

5. TARTIŞMA ve SONUÇ Kronik sinüzit, ülkemizde ve bütün dünyada sık görülen enfeksiyonlardan birisidir. Etiyolojisinde birden fazla mikroorganizma birlikte rol oynamaktadır. Ancak bazı insanlarda görülmesi, kronik sinüzitin ortaya çıkmasında sadece mikroorganizmaların değil değişik faktörlerinde rol oynayabileceğini göstermektedir. Çünkü etken olan mikroorganizmalar ağız ve burun florasında kalıcı ya da geçici olarak yer alabilmektedirler. Bu nedenle genetik yatkınlıkta dahil bir çok olayın bu tablonun ortaya çıkmasında etkili olabileceği düşünülmektedir. Kronik sinüzit yaşam kalitesini düşüren, tedaviye direnç gösteren ve yüksek tedavi maliyetleri gerektiren bir hastalıktır. Etiyolojide çeşitli mikroorganizmaların etkili olduğu bilinmektedir. Ancak bu etkenlerin dağılımı hastadan hastaya değişiklik gösterebilmektedir 6,70. S. aureus kronik sinüzit etiyolojisinde en çok suçlanan bakterilerden birisidir. Kronik sinüzit tablosunun ortaya çıkmasında S. aureus un süperantijen niteliğindeki bazı ekzotoksinlerinin rolü olabileceği iddia edilmiştir. Özellikle TSST- 1 ve enterotoksinlerin bu tablonun ortaya çıkmasında muhtemel etkileri çeşitli araştırma bulgularıyla desteklenmiştir. Süperantijenlerin kronik sinüzitin gelişiminde ve şiddetlenmesinde nasıl bir rol oynadıklarının belirlenmesi bu hastalık patogenezinin anlaşılmasına büyük katkı sağlayacaktır. Belki de kronik sinüzit patogenezinin tamamen anlaşılmasını sağlayacaktır 53,70. Bu konuda yapılan çalışmaların bir kısmı bu hipotezi desteklerken bir kısmı da bu konuda belirli bir sonuca ulaşılamadığını göstermektedir 49,71,72. S. aureus un duvar yapısında bulunan ve bakteriden salınabilen protein-a (SpA) adı verilen bir proteinin de değişik mekanizmalarla kronik sinüzit gelişiminde rol oynayabileceği iddia edilmiştir. SpA, diğer yüzey proteinleriyle birlikte 52

Th1 hücrelerini indükleyerek IFNg, TNF-a, IL-1a, IL-1bve IL-2 gibi sitokinlerin salınmasına neden olmaktadır 55,66. SpA nın FceRI lere bağlı IgE ile etkileşime geçerek bazofilleri aktive ettiği ayrıca insan bazofil ve mast hücrelerinden histamin salımınını arttırdığı gösterilmiştir. SpA nın bu özellikleri nedeniyle kronik sinüzit gelişimindeki allerjik mekanizmalarda rol oynayabildiği iddia edilmektedir 37,55,56,57,66. Bu çalışmada kronik sinüziti olan hastalardan belirli sayıda endoskopik sinus biyopsisi örneği alınmış ve bu örneklerde S. aureus varlığı incelenmiştir. Ancak kısıtlı sayıda örnekle fazla sayıda bakteri elde edilemeyeceği düşünülerek kronik sinüzit tanısı konmuş hastalardan burun sürüntüsü alınarak S. aureus sayısının 50 ye çıkarılması amaçlanmıştır. Aynı şekilde nazal septum cerrahisi için gelen ve kronik sinüzit yakınması olmayan benzer sayıdaki kişilerden endoskopik sinus biyopsi örneği alınmıştır. Kontrol grubundaki bireylerden izole edilen S. aureus sayısının 50 ye çıkarılması amacıyla kronik sinüziti olmayan ve başka şikayetlerle KBB polikliniğine başvuran hastalardan burun sürüntüleri alınmış ve S. aureus varlığı açısından incelenmiştir. Hasta ve kontrol gruplarından soyutlanan 50 şer S. aureus suşunda SpA varlığı ve yapım miktarı incelenmiştir. Aynı bakterilerden VIA yöntemiyle enterotoksin A, B, C ve D varlığı incelenmiştir. Yine aynı bakterilerde gerçek zamanlı PZR yöntemiyle TSST-1, enterotoksin A, B, C ve D gen varlığı incelenmiştir. Hasta ve kontrol gruplarından soyutlanan S. aureus suşlarında SpA bulunma sıklığı ve yapım düzeyleri ile süperantijen niteliğindeki toksin gen varlığı oranları karşılaştırılmıştır. Hasta grubundan alınan 30 biyopsi örneğinin 6 sında (%20) S. aureus üretilmişken, kontrol grubundan alınan biyopsi örneklerinin hiç birinde bu bakteri üretilememiştir. Kronik sinüziti olan 210 hastanın burun sürüntü örneğinin 53

44 ünde (%20.9) S. aureus üretilmişken, kontrol grubundan alınan 442 burun sürüntüsünün 50 sinde (% 11.3) S. aureus üretilmiştir. Hasta grubundan elde izole edilen S. aureus sayısı kontrol grubundan elde edilen sayılardan istatistiksel olarak anlamlı düzeylerde yüksek bulunmuştur. Ancak her iki gruptan soyutlanan S. aureus sayılarının değişik çalışmalarda hasta ve kontrol gruplarından izole edilen sayılardan düşük olduğu dikkat çekmiştir. Sağlıklı insanlarda nazofarinks taşıyıcılığının %30 a kadar görülebildiği belirtilmektedir 11. Değişik çalışmalarda kronik sinüzitli hasta ve kontrol grublarından farklı oranlarda S. aureus üretildiği belirtilmektedir. Örneğin el-fiky ve arkadaşları nazal polipli kronik sinüzitli hastalarda %45, kontrol grubunda ise %13 oranında S. aureus üretmişlerdir 38. Çalışmamızda kontrol grubunda belirlenen oran ile araştırıcıların bulguları benzerdir. Ancak hasta grubundan soyutladıkları S. aureus oranı, çalışmamızda soyutlanan S. aureus oranından daha yüksektir. Laudien ve arkadaşları kronik sinüzitli hastalarda %28, Niederfuhr ve arkadaşları ise %39 oranında S. aureus saptamışlardır 73,74. Ancak kontrol grubuna göre anlamlı bir fark bulmamışlardır. Genel olarak S. aureus kronik sinüzitli hastalarda daha sık bulunmaktadır. Ancak bütün hastalarda olmaması bu bakterinin çok sayıdaki etken mikroorganizmadan sadece biri olduğunu kanıtlamaktadır. Hasta grubundan elde edilen 50 S. aureus suşunun 44 ünde (% 88), kontrol grubundan elde edilen 50 S. aureus suşunun ise 45 inde (% 90) SpA varlığı saptanmıştır. Hasta ve kontrol grubu stafilokok suşlarının SpA üretim sıklığı benzer bulunmuştur. Genel olarak S. aureus suşlarının çoğunun SpA yaptığı ve bu faktörün S. aureus tanımlanmasında kullanıldığı bilinmektedir 11. Bu nedenle burun ya da lezyonda bulunan bakterinin SpA yapmasının kronik sinüzitin ortaya çıkmasında rol oynayabileceği iddia edilemez. Hasta ve kontrol gruplarından soyutlanan S. aureus suşlarının SpA yapım düzeyleri de incelenmiştir. 54

Hasta suşlarından SpA yaptığı belirlenen 44 bakteri suşunun üst sıvısında ortalama 1172 pg/ml SpA varlığı saptanırken, kontrol grubundan elde edilen ve SpA yaptığı belirlenen 45 bakterinin üst sıvısında ortalama 1248 pg/ml düzeyinde SpA belirlenmiştir. Kontrol grubundan soyutlanan S. aureus suşlarında ölçülen SpA düzeyi daha yüksek elde edilmiş ancak bu fark istatistiksel açıdan önemli bulunmamıştır. Bu nedenle SpA varlığı ve yapım düzeyinin kronik sinüzitin gelişiminde bir rol oynadığına dair bir bulguya varılamamıştır. Ancak ortamda SpA bulunmasının allerjik bir temele yol açtığı ve neden olduğu inflamasyonla kronik sinüzit tablosunu alevlendireceği yapılmış çalışmalarla kanıtlanmıştır. SpA, kronik sinüzit gelişiminde etkili birçok faktörden biridir. Ancak bulgularımıza göre kronik sinüzit gelişimi için SpA nın ortamda bulunması koşul değildir. Gerçek zamanlı PZR yöntemiyle hasta ve kontrol gruplarından soyutlanan stafilokoklarda enterotoksin A, B, C ve D gen varlığı incelenmiştir. Hastalardan elde edilen bakterilerden 27 sinde (%54), kontrol grubundan izole edilen bakterilerin ise 23 ünde (%46) enterotoksin A gen varlığı saptanmıştır. Hasta grubundaki bakterilerde daha yüksek sıklıkta toksin geni bulunmuşsa da aradaki fark önemli olarak değerlendirilmemiştir. Hasta grubu stafilokoklarında %32, kontrol grubu bakterilerinde ise %24 oranında enterotoksin B varlığı saptanmıştır. Hasta grubundan elde edilen S. aureus suşlarından 8 inde (%16) enterotoksin C ve yine 8 inde (%16) enterotoksin D geni bulunurken kontrol grubundan soyutlanan S. aureus suşlarının 7 sinde (%14) enterotoksin C ve yine 7 sinde (%14) enterotoksin D gen varlığı saptanmıştır. Dört farklı enterotoksine ait gen varlığı hasta grubu bakterilerinde kontrol grubu bakterilerine göre yüksek bulunmuştur. Ancak hiçbir enterotoksin tipi için aradaki fark istatitiksel değerde bulunmamıştır. Bu bulgulara göre enterotoksin yapımının kronik sinüzit etiyolojisinde rol oynadığına dair bir sonuca ulaşılamamıştır. 55

İncelenen bakterilerin enterotoksin ekspresyonu kalitatif olarak visual immunoassay (VIA) yöntemiyle de değerlendirilmiştir. Bu yöntemle hasta grubundan elde edilen stafilokoklarda %50 oranında enterotoksin A, %30 oranında enterotoksin B, %16 oranlarında enterotoksin C ve D varlığı gösterilmiştir. Aynı değerler kontrol grubu stafilokoklarında sırasıyla %44, %22, %12 ve %14 olarak belirlenmiştir. VIA sonuçları ile PZR sonuçları ile genel olarak benzer bulunmuştur. Ancak VIA ile önemsiz düzeyde daha düşük pozitif değerler elde edilmiştir. Bu fark, gen varlığına rağmen toksinin eksprese edilmemesi ya da VIA yönteminin moleküler yönteme göre daha az duyarlı olmasıyla izah edilebilir. Bu sonuçlara göre hasta grubu bakterileri ile kontrol grubu bakterilerinin enterotoksin yapma sıklığı değerlendirildiğinde enterotoksinlerin tek başına kronik sinüzit gelişiminden sorumlu tutulamayacağı ancak bu hastalığın gelişiminde rol oynayan çok sayıdaki faktörden biri olabileceği değerlendirilmiştir. Yapılan bir çalışmada, kronik sinüzitli hastaların mukus ve doku örnekleri incelenmiş. Nazal polipli kronik sinüzitli hastaların %33 ünde toksin varlığı gösterilmiş ancak kontrol grubu örneklerinde toksin bulunmamıştır 49. Yine başka bir çalışmada da 22 nazal polipli kronik sinüzitli hastanın %54 ünün nazal mukoza ve dokularında en az bir stafilokok ekzotoksini saptanmışken, nazal polibi olmayan kronik sinüzitli hasta ve kontrol grubu dokularında toksin varlığı gösterilememiştir 53. Bu sonuçlar, toksinlerin kronik sinüzit gelişiminde rol oynayabileceğini ancak hastalık için mutlak gerekli olmadığını kanıtlamaktadır. Ancak hasta ve kontrol grubu örneklerinde çalışmamız sonuçlarına benzer toksin sıklığı belirlenen ve bu çalışma sonuçlarıyla örtüşen sonuçların alındığı farklı çalışmalarda yayınlanmıştır 41,71. Hasta ve kontrol gruplarından soyutlanan S. aureus suşlarında TSST-1 toksin gen varlığı gerçek zamanlı PZR yöntemiyle incelenmiştir. Beklenenin aksine kontrol grubundan elde edilen S. aureus suşlarında daha yüksek TSST-1 56

gen varlığı belirlenmiştir. Kontrol grubu bakterilerinde %23 oranında gen varlığı bulunurken, hasta grubu bakterilerinde bu oran %10 oranında belirlenmiştir. el- Fiky ve arkadaşları yaptıkları çalışmada kronik sinüzitli hastalardaki bakterilerde TSST-1 bulunuş sıklığını kontrol grubuna göre fazla bulmuşlardır 38. Bu konuda en ayrıntılı çalışmayı gerçekleştiren Heymans ve arkadaşları ise kronik sinüzitli hastalardan soyutlanan S. aureus suşlarında %13, nazal polipli kronik sinüzitli hasta bakterilerinde %19 oranında TSST-1 saptamışken, kontrol grubu bakterilerinde bu oranı %32 bulmuşlardır 71. Bu çalışmada elde ettiğimiz sonuçlar bu araştırıcıların sonuçlarıyla uyumludur. Sonuçlarımız ve diğer araştırıcı çalışma sonuçları TSST-1 in kronik sinüzit gelişimi için tek başına yeterli olmadığını göstermektedir. TSST-1 in, bir süperantijen olarak diğer toksinler gibi kronik sinüzit gelişiminde rol oynadığı düşünülmektedir. Ancak bu bulgular ışığında TSST-1 in çok sayıda etkili faktörden sadece biri olabileceği sonucuna varılmıştır. S. aureus un bazı insanlarda nazofarinkste taşınması bu bakteri ile ilişkili enfeksiyonların ortaya çıkması ve bakterinin kişiler arasında yayılmasında önemli rol oynamaktadır. Taşıyıcılığın gelişmesi ve sürekliliği için konak ve mikroorganizma arasında bir denge oluşmalıdır. Bakteri bir takım yüzey proteinlerinin salınmasını ve ekzotoksin salınımını azalmaktadır 75. Bu nedenle kültür ortamından alınan bakteriler ile lezyonlardan alınan bakteriler arasında bu tip proteinlerin araştırılmasında farklı sonuçlar alınabilmektedir. 57

Sonuç olarak; 1. Kronik sinüziti olan kişilerde S. aureus burun taşıyıcılık oranı, kronik sinüziti olmayan hastalara göre daha yüksek saptanmıştır. Ancak hastaların sadece %20 sinde taşıyıcılık saptanmış olması bu bakterinin kronik sinüzit gelişimindeki önemini azaltmaktadır. Çünkü S. aureus eğer kronik sinüzitin mutlak etkeni olsaydı bu bakterinin genellikle hasta nazal dokularında ya da burun sürüntüsünde bulunması gerekirdi. 2. Hasta ve kontrol grubundan soyutlanan S. aureus suşlarında benzer oranlarda SpA saptanmıştır. SpA ekspresyon düzeylerinde de hasta ve kontrol gruplarında önemli bir fark bulunmamıştır. Bu sonuca göre SpA varlığı ya da yapım miktarı kronik sinüzitin gelişimi için mutlaka gerekli bir faktör olarak bulunmamıştır. Ancak bilinen bir takım fizyolojik etkileri göz önüne alındığında bu proteinin ortamda bulunmasının hastalık tablosunun gelişimini kolaylaştıracağı ve var olan hastalık bulgularını şiddetlendirebileceği söylenebilir. 3. Hasta ve kontrol gruplarından soyutlanan S. aureus suşlarında enterotoksin A, B, C ve D gen varlığı ve visual immunoassay yöntemiyle enterotoksin varlığı inceleme sonuçlarına göre her iki grupta bulunan bakterilerin enterotoksin yapma oranları arasında önemli bir fark bulunmamıştır. Enterotoksinlerin, süperantijen özellikleri nedeniyle neden oldukları sitokin fırtınası, bulundukları ortamda bir inflamasyon oluşturmaları yada var olan yangı reaksiyonunu şiddetlendirmeleri beklenmektedir. Bu çalışma sonuçlarına göre enterotoksinlerin kronik sinüzit gelişimi için mutlaka ortamda bulunmalarının gerekmediği anlaşılmaktadır. 4. Hasta ve kontrol gruplarından soyutlanan S. aureus suşlarında TSST-1 58

gen analizi sonuçlarına göre bu toksinin kronik sinüzit gelişimi için gerekli olmadığı, ancak tablonun ortaya çıkmasını hızlandırabileceği ya da bulguların şiddetlendirebileceği düşünülebilir. 5. Kronik sinüzit bir çok mikroorganizmanın birlikte etkisi, tekrarlayan akut enfeksiyonların sonucunda konağın anatomik, allerjik, genetik ve immun statüsünün uygun olması koşullarında ortaya çıkan tek nedene bağlanamayacak bir tablodur. Etkili bütün faktörlerin bilinmesi ve bu faktörlerin etkilerinin ortadan kaldırılması tedavi başarısını arttıracaktır. 59

6. ÖZET Süperantijen niteliğindeki stafilokok toksinlerinin ve protein-a nın kronik sinüzit etyolojisindeki rolünün incelenmesi. Kronik sinüzit, 12 haftadan uzun süren nazal ve paranazal mukozanın semptomatik inflamasyonudur. Kronik sinüzit, hastanın yaşam kalitesini düşüren ve tedaviye direnci nedeniyle yüksek maliyetlere yol açan bir hastalıktır. Kronik sinüzitin oluş mekanizması tam bilinmemekle beraber bakterilerin bu olayda en önemli rolü oynadıkları düşünülmektedir. Son yıllarda nazal mukozaya kolonize olmuş S. aureus tarafından oluşturulan süperantijen özelliği gösteren toksinlerin sinüzit ile ilişkili inflamasyonun gelişiminde rol oynadığı konusunda hipotezler ileri sürülmüştür. Ayrıca S. aureus ta bulunan protein-a (SpA) nın nazal dokuda histamin salınımına yol açması lokal allerjik reaksiyonlara neden olmaktadır. Bu etkileri nedeniyle S. aurues un kronik sinüzit gelişiminde en önemli rolü oynadığı düşünülmektedir. Bu çalışmada, kronik sinüzitli hastalardan ve kontrol grubundan alınan endoskopik sinüs biyopsi örnekleri ile burun sürüntüsü örneklerinde S. aureus bulunma sıklığı, izole edilen bakterilerde süperantijen niteliği gösteren toksin genlerinin varlığı, ayrıca bu bakterilerde SpA bulunma sıklığı ve düzeylerinin incelenmesi ve bu parametrelerin kronik sinüzit gelişimindeki rollerinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Kronik sinüzitli hastalardan alınan 30 biyopsi örneğinden 6 sında (%20) S. aureus üretilmişken, kontrol grubu örneklerinin hiçbirinde S. aureus üretilememiştir. Kronik sinüzitli 210 hastanın burun sürüntü örneğinin 44 ünde (%21), 60

kronik sinüziti olmayan 442 hasta örneğinin ise 50 sinde (%11) S. aureus üretilmiştir. Hasta grubunda kontrol grubuna göre daha yüksek sayıda bakteri izole edilmiş ve aradaki fark önemli bulunmuştur. Real-time PCR yöntemiyle kronik sinüzitli hastalardan soyutlanan 50 S. aureus suşunun 27 sinde (%54) enterotoksin A, 16 sında (%32) enterotoksin B, 8 inde (%16) enterotoksin C ve 8 inde (%16) enterotoksin D geni saptanmışken, kontrol grubundan soyutlanan 50 S. aureus suşunun 23 ünde (%46) enterotoksin A, 12 sinde (%24) enterotoksin B, 7 sinde (%14) enterotoksin C ve 7 sinde (%14) enterotoksin D geni bulunmuştur. Hasta grubunda dört enterotoksin tipide daha fazla bulunmuş ancak kontrol grubu değerlerine göre bu fark istatistiksel anlamda önemli bulunmamıştır. Hasta grubundan izole edilen bakterilerde TSST-1 gen varlığı %20 oranında bulunurken bu oran kontrol grubu bakterilerinde %46 oranında bulunmuş ve bu fark önemli görülmüştür. Enzim immuno assay yöntemiyle hasta grubundan soyutlanan S. aureus suşlarının %88 inin, kontrol grubundan soyutlanan S. aureus suşlarının ise %90 ının SpA yaptığı saptanmış ve aradaki farkın önemsiz olduğu bulunmuştur. Hasta grubu stafilokoklarının üst sıvılarında ortalama 1171 pg/ml SpA bulunmuşken, kontrol grubu bakterilerinde bu değer 1248 pg/ml olarak belirlenmiş ve aradaki farkın önemli olmadığı görülmüştür. Sonuç olarak; kronik sinüziti olan hastaların endoskopik sinüs biyopsisi ve burun sürüntüsü örneklerinden kontrol grubuna göre daha yüksek sayılarda S. aureus üretilmiş ancak hastaların çoğundan bu bakteri soyutlanmadığı için bu bakterinin çok sayıdaki etken mikroorganizmadan sadece biri olduğu sonucuna varılmıştır. Hasta ve kontrol grubundan izole edilen stafilokoklarda saptanan enterotoksin ve TSST-1 genleri bulunuş sıklığına göre bu ekzotoksinlerin de kronik 61

sinüzit gelişimi için mutlaka gerekli olmadıkları anlaşılmıştır. Aynı şekilde bu bakterilerde belirlenen SpA bulunma oranları ve düzeylerine göre, SpA nın kronik sinüzit gelişimi için mutlak bir şart olmadığı görülmüştür. Süperantijen niteliğindeki ekzotoksinlerin ve SpA nın ortamda bulunması durumunda fizyolojik etkileri ile hastalık tablosunun alevlenmesine ve tablonun ağırlaşmasına neden olabilecekleri düşünülmüştür. Anahtar Kelimeler: Staphylococcus aureus, Kronik sinüzit, Toksik şok sendromu toksini-1, Enterotoksin, Protein A, Süperantijen. 62

7. SUMMARY Investigation of the role of protein A and staphylococcal toxins acting as superantigens in the etiology of chronic sinusitis. Chronic sinusitis is a symptomatic inflammation of the nasal and paranasal mucosa which lasts more than 12 weeks. Chronic sinusitis is a disease associated with significant reduction of patients quality of life and high costs due to treatment resistance. Despite the real cause of the inflammation developed by chronic sinusitis is not clear it is thought the bacteria plays the major role. In recent years the hypothesis that has been put forward is the development of chronic sinusitis is related with the inflammation resulting from the superantigens produced by the S. aureus colonized in the nasal mucosa. In addition, the protein-a (SpA) increases the release of the histamine in the nasal tissue that results in allergic reactions. Because of its effects, S. aureus is thought to play a major role in the formation of chronic sinusitis. The aim of this study was to investigate the presence of S. aureus and to analyse the presence of staphylococcal exotoxins acting as superantigens and SpA in the strains isolated from the patients with chronic sinusitis and control patients without sinusitis in endoscopic sinus biopsy and nasal swabs samples and to elucidate the role of these parameters in the development of chronic sinusitis. 30 patients diagnosed with chronic sinusitis applied to GÜTF hospital Oto Rhino Laryngology (ORL) polyclinic or hospitalized in the ORL service were chosen. Endoscopic surgery were done to these patients and sinus tissue bi- 63

opsy samples were taken. Nasal septum surgery were performed and tissue biopsy samples were taken from 30 healthy individuals as the control group. Additionally, nasal swabs were also taken from 210 patients diagnosed with chronic sinusitis, and 442 patients without chronic sinusitis who had other diseases and the prevalence of S. aureus in these patients groups were investigated. Presence of Toxic-Shock Syndrome Toxin-1 (TSST-1) and enterotoxins A, B, C, and D genes were investigated from isolated S. aureus strains by performing realtime PCR. In addition, the toxin production were screened with TECRA Staphylococcal Enterotoxin VIA kit (TECRA, New South Wales, Australia) and the SpA were determined with commercial kit Protein-A EIA (Assay Designs-Stressgen, Hines Drive Ann Arbor, Michigan, USA). While S. aureus strains were isolated in 6 of 30 (20%) biopsy specimens taken from the chronic sinusitis patients, no growth were detected in the samples taken from the control group. For the chronic sinusitis patients, S. aureus was detected in 44 of 210 (21%) nasal swab specimens. On the other hand, 50 of 442 (11%) nasal swab specimen cultures obtained from the patients without chronic sinusitis yielded S. aureus. The patient group yielded much more S. aureus than the control group, and this finding was found to be statistically significant. Out of the 50 S. aureus isolates from the chronic sinusitis patients, enterotoxin A gene was found in 27 (54%), enterotoxin B gene was found in 16 (32%), enterotoxin C gene was found in 8 (16%), enterotoxin D gene was found in 8 (16%) of the isolates by real-time PCR method. On the other hand, for the control patients, we found enterotoxin A gene in 23 (46%), enterotoxin B gene in 12 (24%), enterotoxin C gene in 7 (14%), enterotoxin D gene in 7 (14%) of the 50 S. aureus strains. Although the number of the isolates that produce en- 64

terotoxin were higher in the patient group than those in the control group, the difference between them was not found to be statistically significant. While 20% of the isolates in the patient group were positive for the TSST-1 toxin gene, 46% were positive in the control group, and this finding was found to be statistically significant. Although 90% of the S. aureus strains in the control group and 88% in the patient group were found to be positive for SpA by enzyme immunoassay method, this was not statistically significant. We found that the supernatants of the S. aureus strains in the patient group yielded an average of 1171 pg/ml SpA, while it was 1248 pg/ml in those of the control group, and this was not statistically significant. In conclusion, we found higher numbers of S. aureus in the endoscopic sinus biopsy samples and nasal swab specimens of the patient group with chronic sinusitis than those of the control group. However, since S. aureus was not isolated in most of the patients, it was thought that this bacterium was only one of the multiple causative agents. It was concluded that the presence of these exotoxins is not an absolute requirement for the development of chronic sinusitis based on the rate of the enterotoxin and TSST-1 genes found in the strains isolated from patient and control group. Similarly, it was determined that the levels and rates of the presence of the SpA in the isolates were not so necessary for the development of chronic sinusitis. It was thought that in the presence of SpA and exotoxins as superantigens, they may lead to exacerbations of the clinical picture with their physiological effects. Keywords: Staphylococcus aureus, Chronic sinusitis, Toxic shock syndrome toxin 1, Enterotoxin, Protein A, Superantigen. 65

KAYNAKLAR [1] Pearlman AN, Conley DB. Review of current guidelines related to the diagnosis and treatment of rinosinusitis. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg 2009;16:226 30. [2] Arıkan O, (Ed.)Koç C. Kulak Burun Boğaz Hastalıkları ve Baş-Boyun Cerrahisi. Güneş Yayınevi; 2004. Bölüm:Paranazal Sinüslerin Anatomisi ve Fizyolojisi. [3] Yvonne C, Frederick AK. An update on the classifications, diagnosis and treatment of rinosinusitis. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg 2009;17:204 8. [4] Soler ZM, Sauer DA, Mace J. Relationship between clinical measures and histopathologic findings in chronic rhinosinusitis. Otolaryngology Head and Neck Surgery 2009;(141):454 61. [5] Schleimer RP, Kato A, Peters A, Conley DB. Epithelium, inflammation, and immunity in the upper airways of humans ; studies in chronic rhinosinusitis. In: Proc Am Thorac Soc; vol. 6. 2009, p. 288 94. [6] Slavin RG. Sinusitis: Viral, bacterial, or fungal and what is the role of staph? In: Allergy Asthma Proc; vol. 27. 2006, p. 447 50. [7] Brook I, Frazier EH. Bacteriology of chronic maxillary sinusitis associated with nasal polyposis. J Med Microbiol 2005;54(595-597). [8] Brook I. Bacteriology of chronic sinusitis and acute exacerbation of chronic sinusitis. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2006;132:1099 101. [9] Todd J, Fishaut M, Kapral F, Welch T. Toxic-shock syndrome associated with phage-group-i Staphylococci. Lancet 1978;2(8100):1116 8. [10] Schleifer KH. Bergey s Manual of Systematic Bacteriology; vol. 2; chap. Gram-positive cocci. Baltimore, Md: The Williams and Wilkins Co.; 1986, p. 999 1002. [11] Murray PR. Klinik Mikrobiyoloji. Ankara: Atlas Kitapçılık Tic.Ltd.Şti.; 2009. 9th. 66

[12] Cengiz TA. Tıp ve Diş Hekimliğinde Genel ve Özel Mikrobiyoloji. Ankara: Güneş Kitabevi Ltd.Şti.; 2004. [13] Winn CW, Allen DS, Janda WM, Koneman WE, et al. Koneman s Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 6th ed.; Lippincott Williams and Wilkins; 2006. [14] Stackebrandt E, Koch C, Gvozdiak O, Schumann P. Taxonomic dissection of the genus micrococcus: Kocuria, gen. nov., nesterenkonia gen. nov. kytococcus gen. nov. micrococcus cohn 1972 gen. emend. Int J Syst Bacteriol 1995;45:682 92. [15] Rosypal S, Rosypalora M, Horejs J. The classification of micrococci and staphilococci based on their dna base composition and adansonian analysis. J Gen Microbiol 1966;44:281 02. [16] List of prokaryotic names with standing in nomenclature - genus Staphylococcus [online]. [cited 09 Mar 2013]; 2013. Avaliable from: URL: http://www.bacterio.cict.fr/s/staphylococcus.html. [17] Peacock SJ. Topley and Wilson s Microbiology and Microbial. Infections; chap. Staphylococcus. 10th ed.; London UK: Hodder Arnold Ltd.; 2005, p. 771 832. [18] Proctor RA, Langevelde van P, Kristjansson M, Maslow JM, et al. Persistent and relapsing infections associated with small-colony variants of Staphylococcus aureus. Clin Infect Dis 1995;20:95 102. [19] Kloos WE, Mardh AE, Schleifre (ed.) KH. Coagulase-Negative Staphylococci; chap. Ecology of Human Skin. Stockholm, Sweden: Almqvist and Wiksell International; 1986, p. 37 50. [20] Kloos WE. Natural populations of the genus Staphyloccus. Annu Rev Microbiol 1980;34:559 92. [21] Devriese LA. A simplified scheme for biotyping Staphylococcus aureus strains isolated from different animal species. J Appl Bacterial 1984;56:215 20. 67

[22] Klutymans J, van Belkum A, Verbrugh H. Nasal carriage of Staphylococcus aureus: epidemiology, underlying mechanisms and associated risks. Clin Microbiol Rev 1997;10(3):505 20. [23] Reuther J, Noble C. An ecological niche for Staphylococcus saprophyticus. Microbial Ecol Health Dis 1993;6:209 12. [24] Spink WW, Ferris V. Quantitative action of penicilin inhibitor from penicilinresistant strains of staphylococci. Science 1945;102:221 3. [25] Jevons MP. Celbenin -resistant staphylococci. Br Med J 1961;1:124 5. [26] Hartman BJ, Tomasz A. Low-affinity penicillin-binding protein associated with beta-lactam resistance in S. aureus. J Bacteriol 1984;158:513 316. [27] Hiramatsu K. Vancomycin-resistant S. aureus: anew model of antibiotic resistance. Lancet Infect Dis 2001;1(147-155). [28] Cui L, Murakami H, Kuwahara-Arai K, Hanaki K, et al. Contribution of a thickened cell wall and its glutamine nonamidated component to the vankomycin resistance expressed by Staphylococcus aureus Mu50. Antimicrob Agents Chemother 2000;44:2276 85. [29] Ustaçelebi Ş. Temel ve Klinik Mikrobiyoloji. Ankara: Güneş Kitabevi; 1999. [30] Bilgehan H. Klinik Mikrobiyolojik Tanı. 4. ed.; Fakülteler Kitabevi; 2004. [31] Ogston A. Report upon micro-organisms in surgical dieseases. Br Med J 1881;1(1054):369 75. [32] Allegre G, Nuitta R, Guiffrida G. Studies on synthesis of carotene and on the role of carotenoids in Staphylococcus aureus. i. effect of glucose on chromogenesis of Staphylococcus aureus (Oxford strain). Riv Ist Sieroter Ital 1954;29(3):263 9. [33] Madigan M, Martingo J, Parker J. Prokaryote diversity: Bacteria Biology of Microorganisims. 9th ed.; New Jersey Prentice-Hall, Inc; 2000. [34] Eriksen NH, Espersen F, Rosdahl VT, Jensen K. Carriage of Staphylococcus aureus among 104 healthy persons during a 19-month period. Epidermiol Infect 1995;115(1):51 60. 68

[35] Kluytmans J, van Belkum A, Verbrugh H. Nasal carriage of S.aureus: epidemiology, underlying mechanisms and associated risks. Clin Microbiol Rev 1997;10(3):505 20. [36] Kluytmans JA, F. WH. Nasal carriage of Staphylococcus aureus and prevention of nosocomial infections. Infection 2005;33(1):3 8. [37] Patou J, Gevaert P, van Zele T, Holtappels G, et al. Staphylococcus aureus enterotoxin b, protein a and lipoteichoic acid stimulations in nasal polyps. J Allergy Clin Immunol 2008;121:110 5. [38] el Fiky LM, Khamis N, Mostafa Bel D, Adly AM. Staphylococcal infection and toxin production in chronic rhinosinusitis. Am J Rhinol Allergy 2009;23(3):264 7. [39] Patel AH, Nowlan P, Weavers ED, Foster T. Virulence of protein A-deficient and alpha-toxin-deficient mutants of Staphylococcus aureus isolated by allele replacement. Infect Immun 1987;55(12):3103 10. [40] Da Cunha Mde L, Calsolari RA, Júnior JP. Detection of enterotoxin and toxic shock syndrome toxin 1 genes in staphylococcus, with emphasis on coagulase-negative staphylococci. Microbiol Immunol 2007;51(4):381 90. [41] Nagao M, Okamoto A, Yamada K, Hasegawa T, et al. Variations in amount of TSST-1 produced by clinical methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) isolates and allelic variation in accessory gene regulator (agr) locus. BMC Microbiol 2009;9:52. [42] Martin MD, Paul MO, Patrick MS. Exotoxins of Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Rev 2000;13(1):16 34. [43] Balaban N, Rasooly A. Staphylococcal enterotoxins. Int J Food Microbiol 2000;61(1):1 10. [44] Chiang YC, Liao WW, Fan CM, Pai WY, et al. PCR detection of Staphylococcal enterotoxins (SEs) N, O, P, Q, R, U, and survey of SE types in Staphylococcus aureus isolates from food-poisoning cases in Taiwan. Int J Food Microbiol 2008;121(1):66 73. 69

[45] Orwin PM, Leung DY, Donahue HL, Novick RP, et al. Biochemical and biological properties of Staphylococcal enterotoxin K. Infect Immun 2001;69(1):360 6. [46] Thomas D, Chou S, Dauwalder O, Lina G. Diversity in Staphylococcus aureus enterotoxins. Chem Immunol Allergy 2007;93:24 41. [47] Argudín M, Mendoza MC, Rodicio MR. Food poisoning and Staphylococcus aureus enterotoxins. Toxins 2010;2(7):1751 73. [48] Marrack P, Kappler J. The staphylococcal enterotoxins and their relatives. Science 1990;248(4956):705 11. [49] Seiberling KA, Conley DB, Tripathi A, Grammer LC, et al. Superantigens and chronic rhinosinusitis: detection of staphylococcal exotoxins in nasal polyps. Laryngoscope 2005;115(9):1580 5. [50] Bachert C, Zhang N, Patou J, van Zele T, et al. Role of staphylococcal superantigens in upper airway disease. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2008;8(1):34 8. [51] Lee Y, Moon B, Park J, Chang H, et al. Expression of enterotoxin genes in Staphylococcus aureus isolates based on mrna analysis. Microbiol Biotechnol 2007;17(3):461 7. [52] Becker K, Roth R, Peter G. Rapid and specific detection oftoxigenic S. aureus: use of two multiplex PCR enzyme immunoassays for amplification and hybridization of staphylococcal enterotoxin genes, exfoliative toxin genes and toxic shock syndrome toxin 1 gene. J Clin Microbiol 1998;36:2548 53. [53] Wang M, Shi P, Chen B, Zhang H, et al. The role of superantigens in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec 2008;70(2):97 103. [54] Yarwood JM, Schlieveert PM. Oxygen and carbon dioxide regulation of toxic shock syndrome toxin 1 production by Staphylococcus aureus MN8. J Clin Microbiol 2000;38(5):1797 803. [55] Sinha P, Ghosh AK, Das T, Sa G, et al. Protein A of Staphylococcus aureus evokes Th1 type response in mice. Immunol Lett 1999;67(3):157 65. 70

[56] Genovese A, Bouvet JP, Florio G, Lamparter-Schummert B, et al. Bacterial immunoglobulin superantigen proteins A and L activate human heart mast cells by interacting with immunoglobulin E. Infect Immun 2000;68(10):5517 24. [57] Palmqvist N, Silverman GJ, Josefsson E, Tarkowski A. Bacterial cell wallexpressed protein A triggers supraclonal B-cell responses upon in vivo infection with Staphylococcus aureus. Microbes Infect 2005;7(15):1501 11. [58] Chana Y, Kuhn FA. An update on the classifications, diagnosis, and treatment of rhinosinusitis. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg 2009;17(3):204 8. [59] Kotb M. Bacterial pyrogenic exotoxins as superantigens. Clin Microbiol Rev 1995;8:411 26. [60] Zhang N, Gevaert P, van Zele T, Perez NC, et al. An update on the impact of Staphylococcus aureus enterotoxins in chronic sinusitis with nasal polyposis. Rhinology 2005;43(3):162 8. [61] Male D, Brostoff J, Roth BD, Roitt I. İmmünoloji. Ankara: Palme Yayıncılık; 2008. İmir T. (Çev) 7. Baskı. [62] Rolinson GN, Stevens S, Batchelor FR, Wood JC, et al. Bacteriological studies on a new penicilin-brl.1241. Lancet 1960;2(7150):564 7. [63] VandenBergh MF, Yzerman EP, van Belkum A, Boelens HA, et al. Followup of Staphylococcus aureus nasal carriage after 8 years: redefining the persistent carrier state. J Clin Microbiol 1999;37(10):3133 40. [64] Williams RE. Healthy carriage of Staphylococcus aureus: its prevalence and importance. Bacteriol Rev 1963;27:56 71. [65] Armstrong-Esther CA. Carriage patterns of Staphylococcus aureus in a healthy non-hospital population of adults and children. Ann Hum Biol 1976;3(3):221 7. [66] Marone G, Poto S, Petracca R, Triggiani M, et al. Activation of human basophils by staphylococcal protein A. I. The role of cyclic AMP, arachidonic acid metabolites, microtubules and microfilaments. Clin Exp Immunol 1982;50(3):661 8. 71

[67] Xu SX, McCormick KJ. Staphylococcal superantijens in colonization and disease. Front Cell Infect Microbiol 2012;2:52. [68] Yarıktaş M, Demirci M, Döner F, Tuz M, et al. Microbiologic findings of sinusitis by a novel method for obtaining culture. Diagn Microbiol Infect Dis 2007;58(1):49 52. [69] Bennett RW, McClure F. Visual screening with enzyme immunoassay for staphylococcal enterotoxins in foods: collaborative study. Int J AOAC 1994;77(2):357 64. [70] Raymond G, Slavin R, Spector SL, Bernstein IL. The diagnosis and management of sinusitis: A practice parameter update. J Allergy Clin Immunol 2005;116:13 47. [71] Heymans F, Fischer A, Stow NW, Girard M, et al. Screening for staphylococcal superantigen genes shows no correlation with the presence or the severity of chronic rhinosinusitis and nasal polyposis. PLoS One 2005;5(3):e9525. [72] Van Zele T, Vaneechoutte M, Holtappels G, Gevaert P, et al. Detection of enterotoxin DNA in Staphylococcus aureus strains obtained from the middle meatus in controls and nasal polyp patients. Am J Rhinol 2008;22(3):223 7. [73] Laudien M, Gadola SD, Podschun R, Hedderich J, et al. Nasal carriage of Staphylococcus aureus and endonasal activity in Wegener s granulomatosis as compared to rheumatoid arthritis and chronic Rhinosinusitis with nasal polyps. Clin Exp Rheumatol 2010;28(1 Suppl 57):51 5. [74] Niederfuhr A, Kirsche H, Deutschle T, Poppert S, et al. Staphylococcus aureus in nasal lavage and biopsy of patients with chronic rhinosinusitis. Allergy 2008;63(10):1359 67. [75] Burian M, Wolz C, Goerke C. Regulatory adaptation of Staphylococcus aureus during nasal colonization of humans. PLoS One 2010;5(4):e10040. [76] Dingens M, Orwin MR, Schlievert RM. Exotoxins of Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Rev 2000;13:16 34. 72

[77] Mehtora M, Wang G, Johnson M. Multiplex PCR for detection of genes for S. aureus enterotoxins, exfoliative toxins, toxic shock syndrome toxin 1 and methicillin resistance. J Clin Microbiol 2000;38:1032 5. [78] Miwa K, Fukuyama M, Sakai R, Shimizu S, et al. Sensitive enzyme-linked immunosorbent assays for the detection of bacterial superantigens and antibodies against them in human plasma. Microbiol Immunol 2000;44:519 23. [79] Monday SR, Bohach AG. Use of multiplex PCR to detect classical and newly described pyrogenic toxin genes in staphylococcal isolates. J Clin Microbiol 1999;37:3481 9. [80] Schmitz FJ, Steiert M, Hoffmann B, Verhoef J, et al. Development of a multiplex PCR for direct detection of the genes for enterotoxin B and C and toxic shock syndrome toxin 1 in S. aureus isolates. J Med Microbiol 1998;47:335 40. [81] Kloos WE, Bannerman TL. Update on clinical significance of coagulasenegative staphylococci. Clin Microbiol Rev 1994;7:117 40. [82] Rupp ME, Archer GL. Coagulase-negative staphylococci: Pathogens associated with medical progress. Clin Infect Dis 1994;19:231 45. [83] Perry JD, Davies A, Butterworth AL, Hopley AL, et al. Development and evaluation of of a chromogenic agar medium for methcillin-resistant S. aureus. J Clin Microbiol Rev 2004;42:4519 23. [84] Pfaller MA, Herwaldt LA. Laboratory, clinical and epidemiological aspects of coagulase-negative staphylococci. Clin Microbiol Rev 1988;1:281 99. [85] Huang CR, Lu CH, Wu JJ, Chang HW, et al. Coagulase negative staphylococcal meningitis in adults: Clinical characteristics and therapeutic outcomes. Infection 2005;33:56 60. [86] Lina G, Bohach GA, Nair SP, Hiramatsu K, et al. Standard nomenclature for the superantigens expressed by Staphylococcus. J Infect Dis 2004;189:2334 6. 73

[87] Ortega E, Hikmate A, Lucas R, Galvez A. Multiple roles of Staphylococcus aureus enterotoxins: Pathogenicity, superantigenic activity and correlation to antibiotic resistance. Toxins 2010;2:1751 73. [88] Arad G, Levy R, Nasie I, Hillman D, et al. Binding of superantigen toxins into the CD28 homodimer interface is assential for induction of cytokine genes that mediate lethal shock. PLoS Biol 2011;9(9):e100114. [89] Ahn S. K.and Jeon SY, Khalmuratov R, Kim DJ, Kim JP, et al. Rat model of staphylococcal enterotoxin B-induced rhinosinusitis. Clin Exp Otorhinolaryngol 2008;1(1):24 8. [90] Yang P, Liu T, Kong W, Wang B. The possible association of staphylococcus enterotoxin B as a cause of asthma in the presence of sinusitis. Int J Otorhinolaryngol 2006;4(2). [91] Tomassen P, Van Zele T, Zhang N, Perez-Novo C, et al. Pathophysiology of chronic rhinosinusitis. Proc Am Thorac Soc 2011;8(1):115 20. 74

EK- A Etik Kurul Kararı 75

TEŞEKKÜRLER Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalında aldığım doktora eğitimim süresinde ve tez çalışmamda her türlü desteğini esirgemeyen değerli hocam Prof.Dr. Nedim SULTAN a, Eğitim süresince kıymetli bilgilerinden faydalandığım değerli bölüm hocalarım Prof.Dr. Turgut İMİR, Prof.Dr. Semra KUSTİMUR, Prof.Dr. Meltem YALI- NAY ÇIRAK ve Prof.Dr. Kayhan ÇAĞLAR a, Tez çalışmamdaki yönlendirmelerinden dolayı yine bölüm hocalarımızdan Prof.Dr. Ayşe KALKANCI ve İmmünoloji Bölümü hocalarından Doç.Dr. Resul KARAKUŞ a, Çalışmalarımda laboratuvarından faydalandığım ve her türlü desteği sağlayan çok sevgili hocam Prof.Dr. Münci YAĞCI ya, Bilimsel desteğini ve yardımlarını benden esirgemeyen değerli arkadaşlarım Dr. Handan KAYHAN, Bio. Nesrin UYSAL, Tek. Nevruz KURŞUNOĞLU ve Tek. Zeynep YILMAZ a, Verdiği mali destekten dolayı Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimine ve çalışanlarına, Ayrıca çok sevgili annem Güler VURAL a, kardeşim Dr. Aydın VURAL a ve eşi Elit AYDIN VURAL a çok teşekkür ederim. 76

ÖZGEÇMİŞ KİŞİSEL BİLGİLER Adı : Gülden Soyadı : VURAL Doğum Yeri ve Tarihi : Konya - 01 Ekim 1976 EĞİTİM BİLGİLERİ Doktora : Gazi Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tıbbi Mikrobiyoloji (2006-2013) Y.Lisans : Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Bölümü (2003-2005) Lisans : Niğde Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü (1993-1997) Lise : Niğde Lisesi (1990-1993) Ortaokul : Niğde Meslek Lisesi (1987-1990) İlkokul : Yamanegeli İlkokulu/Bandırma (1982-1987) YABANCI DİLLER İngilizce : İyi Almanca : Orta ÇALIŞTIĞI KURUMLAR 2010-Halen : Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Erişkin Hematoloji Lab. 2003-2010 : Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Lab. 1998-2002 : Abdi İbrahim İlaç Sanayi ve Ticaret AŞ İLETİŞİM BİLGİLERİ Telefon : 0 532 6353118 e-posta : guldenvural@hotmail.com 77