1 3G VIRCELL IgG POZİTİF KONTROL : 500 µl pozitif kontrol serum IgG için, Prokilin içerir. HERPES SIMPLEX ELISA IgG/IgM (gg purified) G/M1013: İndirek immunoenzim testi, insan serumunda, herpes simplex type oluşan IgG ve /veya IgM antikorlarını test etmek için kullanılır. 96 test. GİRİŞ: Herpes virüs (HSV) insan enfeksiyonlarında düyada en yaygın olanıdır. İlk enfeksiyonlar çoğunlukla, subklinikaldir. HSV1 in en yaygın hali faranjit ve gingivostomatittir. Diğer tipik yaygın olanlar; konjuktivitler, keratitis, derinin vesikular patlaması, ve ensefalit. HSV- batı düntasında en çok görülen genital ülser ajanıdır ve aseptik ortamlarda menenjit ve neonatal herpes enfeksiyonu üretir. En çok kullanılan serolojik metotlar komplement sabitleme metodu, nötralizasyon ve enzim bağlı immunosorbent testi (ELISA) Bağışıklık yanıtı ilk enfeksiyondan daha fazladır ikinci yakalanma. İki HSV tipi,epitopları paylaşırlar, bu antijenlerle güçlğ bir çapraz reaksiyon yapar.böylece, serolojik ayırımı yapmak için ham maddeleri kullanmak zordur.saflaştırılmış viral proteinlerin kullanımı öel testlerin tipini belirlemede öncülük eder. Mevcut kit herpes 1 den gelen gg1 proteinleri kullanır ve teşhis koyar. TEST PRSİBİ: ELISA metodu numunelerdeki antikorla polstiren kuyucuklara kaplana antijenin reaksiyonuna dayanır.bağlanmayan immunglobulinler yıkanıp atılır.enzim bağlı etiketli anti insan globulin, ikinci basamakta kompleks oluşturur. Yeni bir yıkama adımından sonra konjugat bağlanır, substratın (TMB) yardımıyla mavi renk oluşturur.stop solüsyonu ile sarı renge dönüşür. Renkli Ürünt Coloured product 3M VIRCELL IgM POZİTİF KONTROL: 500 µl pozitif kontrol serum IgM için, Prokilin içerir. 4G VIRCELL IgG CUT OFF KONTROL: 500 µl cut off kontrol serum serum IgG için, Prokilin içerir. 4M VIRCELL IgM CUT OFF KONTROL: 500 µl cut off kontrol serum IgM için, Prokilin içerir. 5G VIRCELL IgG NEGATİF KONTROL: 500 µl negatif kontrol serum IgG, Proklin içerir. 5M VIRCELL IgM NEGATİF KONTROL: 500 µl negatif kontrol serum IgM için, Proklin içerir. 6G VIRCELL IgG KONJUGAT: 15 ml anti-insan IgG peroksidaz konjugat dilüsyonu, kırmızı renkte, Proklin içerir, kullanıma hazırdır. 6M VIRCELL IgM KONJUGAT: 15 ml anti-insan IgM peroksidaz konjugat dilüsyonu, kırmızı renkte,proklin içerir, kullanıma hazırdır. 7 VIRCELL TMB SUBSTRAT SOLÜSYONU : 15 ml substrat solüsyonu tetramethylbenzidine (TMB). Kullanıma hazırdır. 8 VIRCELL STOP REKTİF: 15 ml stop solüsyon: 0.5 M sülfirik asit. 9 VIRCELL YIKAMA BUFER: 50 ml 0x yıkama solüsyonu :fosfar buffer Tween R -0 ve Prokilin. -8ºC saklayınız ve miadını kontrol ediniz. Gerekli materyaller ama sağlanmayanlar: Presizyonlu mikro pipet 5 ve 100 µl. 8 kanallı 100 µl mikro pipet. ELİZA pleyt yıkayıcı. Termostatlı inkübatör/su banyosu. ELISA pleyt okuyucu spektrofotometre, 450 nm ve 60 nm filtreli. Alternatif olarak, ELISA otomatik analizörü. Distile su. IgM testi için, insan IgG sorbent (ref. Vircell S001). SAKLAMA GEREKLİLİKLERİ: Renksiz Substrat Colourless substate Anti-insan IgG/IgM globulin Anti-human IgG/IgM globulin Anti-herpes simplex type human IgG/IgM herpes simplex type antigen -8ºC de saklayınız. Miadı geçmiş kitleri kullanmayınız.bu kit -8ºC de ağzı kapalı olarak saklanırsa geçerli kalır. REAKTİF 1x yıkama solüsyonu Diğer reaktifler STABİLİTE VE SAKLAMA 4 ay -8ºC Paket insertünde yazan miad kadardır. ( -8ºC) STABİLİTE VE REAKTİFLERİN KULLANIMI: KİT ÖZELLİKLERİ: Yıkama solüsyonu hariç tüm reaktifler kullanıma hazırdır. Serum dilüsyon solüsyonu ve konjugat solüsyonu tekniğe yardım etmek için renklendirilmiştir. Numune ön dilüsyonu gerekli değildir. Kırılabilir kuyucuk sağlanır.test sayısı kadar kuyucuk ayrılır. KİT İÇERİKLERİ: 1 VIRCELL HERPES SIMPLEX PLATE: 1 96-wells pleyt herpes simpleks tip gg- antijenile kaplı, strain Lovelace. VIRCELL SERUM DILUT: 5 ml serum dilüsyon buffer solüsyonu: mavi renkli fosfat buffer, stabilizör ve proklin içerir. Kullanıma hazırdır. Reaktifleri aseptik durumlarda, mikrobiyolojik kontaminasyondan uzak bir şekilde saklayınız. Yıkama ve reaktif ekleme arasında pleyti kuru bırakmayınız. Substrat solüsyonu ışığa hassastır. Işıktan sakınarak koruyunuz, mavi renk oluşursa atınız.substrat solüsyonu oksitleyicilerle örneğin çamaşır suyu ya da metallerle temas etmemelidir. Gerektiği kadar yıkama, serum dilüent solüsyonu, konjugat ve TMB solüsyonu kullanın geri kalan solüsyonları reaktif şişelerine geri koymayınız. VIRCELL, S.L.yanlış kullanımdan olan hataların sorumluluğunu kabul etmez. TAVSİYELER VE ÖNLEMLER: 1. Sadece in vitro diyagnostik kullanım içindir.sadece profesyonel kullanım içindir.. Sadece kitin içindekileri kullanın.diğer üreticilerin kitleri ile karıştırmayınız.sadece serum Diluent, yıkama, stop ve substrat solüsyonları diğer VIRCELL ELISA kitlerinden kullanılabilir. 3. Her test basamağında pipet uçlarını temizleyiniz.sadece temiz, tercihen tek kullanımlık materyal kullanınız. 4. Hasar görmüş paketleri kullanmayınız. FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE
5. Asla ağız ile pipetlemeyiniz. 6. Serum dilüenti, pleyt, konjugat ve kontroller hayvan kaynaklıdır. Kontroller insan kaynaklıdır. Bu kitin kontrolleri Hepatit B yüzey antijeni (HBsAg), Hepatit C antikorları ve HIV antikorlarına karşı test edilip negatif bulunmasına rağmen enfeksiyon kapma riski varmış gibi davranılmalıdır. Hiçbir mevcut metot bu konularda kesin sonuç vermez. Kuyucuklar, inaktive edilmiş herpes simplex type antijen ile kaplıdır.yine de kullanılan tüm malzemeler potansiyel risk faktörü gibi davranılmalıdır. Atıklar konusunda da bölgesel kanunlara göre davranılmalıdır 7. Substrat solüsyonu deriyi ve mukus tabakayı irrite edebilir.bu solüsyon ile temas edilirse bol su ile yıkanıp medikal bir yardım alınmalıdır. Daha fazla bilgi, Material Safety Data Sheet mevcuttur. 8. Bu ürünü otomatik analizörde çalışmadan önce, öncelikle kitin performansını değerlendirmenizi öneririz. Bu amaç için VIRCELL de numune seti mevcuttur, manuel teknikle paralel olarak çalışmak için kullanılır.bu numune seti talep üzerine sağlanır. 9. İnkübasyon süresi boyunca, kuyucukları üzerini uygun bir bant ile kapatınız.kitin buharlaşmasını önleyip daha garanti bir sonuç verir. 10. IgM test için, bu ürün VIRCELL insan IgG sorbent (Vircell ref. S001 ile birlikte tek kullanım için üretilmiştir) NUMUNE TOPLAMA VE SAKLAMA : Kan mikrobiyolojik kontaminasyon dikkate alınarak eğitimli bir personel tarafından, venipunktür tekniği ile eğitimli bir personel tarafından alınmalıdır. Steril ve aseptik teknik kullanımı numunenin yapısını da koruyacaktır. Serum numuneleri (-8ºC) buzdolabında ya da 7 gün içinde çalışılmayacaksa (-0ºC) de saklanır.numuneler tekrar tekrar dondurulup çözülmemeli.hiperlipemik, hemolizli ya da kontamine olmuş numune kullanmayınız. Partikül içeren numuneler, santrifüj edilerek berrak hale getirilmelidir. Plazma kullanmayınız. 1-Hemen 100 µl substrat solüsyonunu 7 her kuyucuğa ekleyiniz. 13.-Işıktan korunarak 0 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir. 14.-Her kuyucuğa,50 µl stop solüsyonu 8 ekleyiniz. 15.- 450/60 nm de 1 saat içinde okuyunuz İNTERNAL KALİTE KONTROL: Her üretim lotu pazara sürülmeden önce internal (Q.C.) testi yapılır.bu validasyon prosedüründen daha önemlidir. Lotlara göre,son QC testleri mevcuttur. QC materyalleri referans numune panellerine karşı valide olmuş, ispat edilmiştir. KULLANICILAR İÇİN VALİDASYON PROTOKOLÜ: Pozitif, negatif ve cut off kontroller her teste çalışılmalıdır.bu kitin ve testin validasyonunu sağlar. (O.D.) aşağıdaki aralıklarda olmalıdır.değilse, test geçersiz olup tekrar edilmelidir. KONTROL O.D. POZİTİF KONTROL >0.9 NEGATİF KONTROL <0.55 CUT OFF KONTROL SONUÇLARIN YORUMLANMASI: Cut off un ortalama O.D. sini hesaplayın. <0.7 x(o.d. POZİTİF CONTROL) >1.5 x(o.d. NEGATİF CONTROL) Antikor indeks=(numune O.D./ cut off serum ortalama O.D.) x 10 REAKTİFLERİN ÖN HAZIRLIĞI: Sadece yıkama solüsyonu hazırlanmalıdır. 50 ml 0x yıkama solüsyonu 1 litre distile su ile karıştırılır.eğer yıkama solüsyonu saklama sırasında kristalleşebilir, hazırlanmadan önce 37ºC ye getirilmelidir.dilüe edilen solüsyonlar -8ºC de saklanmalıdır TEST PROSEDÜRÜ: 1.-İnkübatörü veya su banyosunu 37±1ºC ye getiriniz..-tüm reaktifleri çalışmaya başlamadan 1 saat önce dolaptan çıkarınız.pleyti paketinden çıkarmayınız. 3.-Tüm reaktifleri karıştırınız. 4.-Pleyti 1 paketten çıkarın.kaç kuyucuk kullanacağınızı tespit ediniz: : 4 tane kontrol için ayırınız. cut off serum, 1 pozitif kontrol ve 1 negatif kontrol içindir.: Gerekli olmayan kuyucuklar paketin içine konup ağzı kapatılmalıdır. 5.-.IgG testi için, tüm kuyucuklara 100 µl serum diluent ekleyiniz.5 µl serum, 5 µl pozitif kontrol 3G, 5 µl cut off kontrol 4G (çift olarak) ve 5 µl negatif kontrol 5G ilgili kuyucuklara pipetlenir. Eğer test manuel yapılıyorsa, homojenizasyonu sağlamak için, dk elle çalkalanır. Bazı sebeplerden dolayı doğru karıştırmak mümkün değilse, iki kat hacimlerde bir tüpte karışım yapınız.homojen bir şekilde karıştırıp, her kuyucuklara 105 µl dilüe edilmiş numuneden koyulur. 1 6.-IgM testi için, 5 µl VIRCELL IgG sorbent (ref. S001) tüm kuyucuklara ekleyiniz, kontrol kuyucukları hariç. 5 µl Numune ve 75 µl serum diluent eklenir.her kuyucuğa 100 µl serum diluent ekleyin ve sonra 5 µl pozitif kontrol 3M, 5 µl cut off kontrol 4M (çift çalışma) ve 5 µl negatif kontrol 5M ilgili kuyucuğa eklenir. Eğer test manuel yapılıyorsa, homojenizasyonu sağlamak için, dk elle çalkalanır. Bazı sebeplerden dolayı doğru karıştırmak mümkün değilse, iki kat hacimlerde bir tüpte karışım yapınız.homojen bir şekilde karıştırıp, her kuyucuklara 105 µl dilüe edilmiş numuneden koyulur. 1 7.-.- Üzerini kapatıp 37±1ºC de 45 dk inkübasyona bırakınız. 8.- Üzerinden yapışkanı alıp tüm kuyucuklardan sıvıyı çekiniz ve 0.3 ml yıkama solüsyonu 9 ile her kuyucuğu 5 defa yıkayınız.kuyucuklardan tüm solüsyonu çekiniz. 9.- Hemen, her kuyucuğa,100 µl IgG konjugat solüsyonu 6 ekleyiniz ya da IgM konjugat 6M solüsyonu ekleyiniz. 10.- Bir bant ile yüzeyini kapatınız ve 37±1ºC de 30 dk inkübe ediniz. 11.-Bantı çıkarınız, sıvıyı tüm kuyucuklardan çekiniz ve 5 defa 0.3 ml yıkama solüsyonu 9 ile yıkayınız. Kalan tüm sıvıyı dışarı atınız. INDEKS YORUM < 9 Negatif 9-11 Şüpheli >11 Pozitif Şüpheli serumlar mutlaka yeniden test edilmeli ve/veya yeni numune alınarak çalışılmalı. 9 dan küçük indeks sonucu, herpes simplex type karşı IgG ya da IgM antikoru oluşmadığını gösterir. 11 den büyük indeks sonucu, herpes simplex type IgG ya da IgM antikoru oluşturduğunu gösterir. LİMİTLER: 1.-Bu kit sadece insan serumunda kullanmak içindir..- Kitin kullanıcısına, kitin içeriğini iyice okuyarak, anlayıp çalışması önerilir. Güvenilir sonuç elde etmek için, protokole tamamen uymak gerekir. Özellikle, doğru numune ve doğru reaktif pipetleme ve inkübasyon zamanı adımlarına tamamen uymak gereklidir. 3.- Numunelerin sonuçları klinik değerlendirme ve diğer teşhislerle birlikte yorumlanmalıdır. Kesin teşhis ayırma tekniği ile konulmalıdır. 4.- Bu test enfeksiyonun yerini belirtmeyecektir. Ayırım yapma amacı ile kullanılmaz. 5.- Antikor seviyesinin eksikliğinin tespiti enfeksiyon olasılığını içermemesi söz konusu değildir 6.-Erken alınan numunelerde IgG seviyesi tespit edilmeyebilir.bu durumlarda IgM testi yapılmalıdır.ikinci serum 14-1 gün sonra alınmalıdır, serokonversiyonun tespiti için ilk alınan numuneyle paralel çalışılmalıdır. 7.-Neonatallarda IgG tespiti değerlendirilmesi dikkale yorumlanmalıdır, çünkü IgG anneden pasif bir şekilde doğumdan önce tfansfer edilir.igm testi 6 ayın altındaki çocuklarda bakmak daha faydalı olur. 8.-Tek bir numuneye antikor bakmak teşhis koymakta tek başına yardımcı olmak için kullanılmamalıdır.çitf numune(akut ya da nekahat zamanı numunesi) alınmalı, serokonversiyon için test edilmeli yada yükselen antikor seviyesi izlenmelidir. 9.-IgM test çalışması için, insane IgG sorbent kullanılmalı. Yoksa, RF nin varlığından dolayı yanlış pozitiflik ya da IgG antikor fazlalığından dolayı yanlış negatiflik görülür.
3 PERFORMANS HASSASİYET VE ÖZGÜLLÜK: 88 adet serum numunesi HERPES SIMPLEX ELISA IgG/IgM (gg1 recombinant) testi, diğer bir ELISA kiti ile kıyaslanarak çalışılmıştır. 68 adet serum numunesi HERPES SIMPLEX ELISA IgG/IgM (gg1 recombinant)diğer bir ELISA kiti ile IgM için karşılıklı çalışılmıştır. Sonuçlar aşağıdadır: NUMU NR HASSASİYET ÖZGÜLLÜK IgG 88 91% 100% IgM 68 83% 100% Bulunamayan değerler son hesaplamadan çıkarıldı. INTRA-TEST PRESİZYONU: IgG TESTİ İÇİN 3 serum 10 defa aynı operatör tarafından aynı koşullarda çalışıldı.sonuçlar aşağıdadır: SERUM N %C.V. PC 10 1.67 NC 10 3.4 CO 10.76 IgM için, önerilen sorbent test edildi ve IgG antikorların fazlalığından kaynaklanan yanlış negatifliğin engellendiği görüldü. ETİKETTE KULANILAN SEMBOLLER: ºC x 8ºC In vitro diyagnostik medikal alet Miadı kadar kullanın (miadı) -8ºC de saklayınız Yeteri kadar r <X> test içerir. Lot Katalog No Inserte bakınız <X>kuyucuklar IgM TESTİ İÇİN 3 serum 10 defa aynı operatör tarafından aynı koşullarda çalışıldı.sonuçlar aşağıdadır: SERUM N %C.V. PC 10 1.6 NC 10 8.75 CO 10 1.44 INTER-TEST PRESİZYONU: IgG TESTİ İÇİN 3 serum 5 günde farklı operatör tarafından çalışıldı.sonuçlar aşağıdadır: SERUM N % C.V. PC 10 1.95 NC 10 19.17 CO 10.97 IgM TESTi İÇİN 3 serum 5 günde farklı operatör tarafından çalışıldı.sonuçlar aşağıdadır: SERUM N % C.V. PC 10.06 NC 10 8.75 CO 10.90 ÇAPRAZ REAKSİYONLAR VE ETKİLEŞİMLER: Sendromik gruplardan pozitif (herpes simplex tip varicella-zoster, Epstein-Barr virus ve cytomegalovirus) pozitif 9numune IgG ve IgM için için test edildi. ANA testi için pozitif olduğu bilinen 3 numune IgG için test edildi.ayrıca RF pozitif 3 numune daha IgM için test edildi. Çapraz bir reaksiyon veya etkileşim görülmedi. DİĞER TESTLER İLE ETKİLEŞİMLER: Daha önce ANA pozitif olan15 numune ve RF pozitif olan 5 numune IgG ve IgM için 4 farklı ELISA kiti kullanılarak test edildi.(3 viral ve 1 bakterial)igm için numuneler IgG sorbenti ile kullanıldı. Sonuçlar gösterdi ki Ana pozitif olan numunelerin % 96 sında, RF pozitif olan numuneleri %100ünde etkileşim görülmedi.
4 TEST PROSEDÜRÜNÜN ÖZETİ IgG İÇİN DİLÜSYON 100 μl serum diluent 5 μl serum ve kontroller 3G 4G 5G IgM İÇİN DİLÜSYON 5 μl sorbent 5 μl serum 75 μl serum diluent KONTROLLER 100 μl serum diluent 5 μl kontroller 3M 4M 5M 8. Whitley, R. J., L. Corey, A. Arvin, F. D. Lakeman, C. V. Sumaya, P. F. Wright, L. M. Dunkle, R. W. Steele, S. J. Soong, A. J. Nahmias, and a. l. et. 1988. Changing presentation of herpes simplex virus infection in neonates. J Infect Dis 158:109-16. 45 dk 37ºC Yıkama 5x (yıkama solüsyonu) 9 6G 100 μl konjugat 6M 30 dk 37ºC Yıkama 5x (yıkama solüsyonu) 9 100 μl substrat 7 0 dk oda sıcaklığı 50 μl stop solüsyonu 8 Okuma 450/60 nm LİTERATÜR: 1. Arvaja, M., M. Lehtinen, P. Koskela, M. Lappalainen, J. Paavonen, and T. Vesikari. 1999. Serological evaluation of herpes simplex virus type 1 and type infections in pregnancy. Sex Transm Infect 75:168-71.. Ashley, R. L., J. Militoni, F. Lee, A. Nahmias, and L. Corey. 1988. Comparison of Western blot (immunoblot) and glycoprotein G-specific immunodot enzyme assay for detecting antibodies to herpes simplex virus types 1 and in human sera. J Clin Microbiol 6:66-7. 3. Brown, Z. A. 1998. Genital herpes complicating pregnancy. Dermatol Clin 16:805-10, xiv. 4. Eing, B. R., L. Lippelt, E. U. Lorentzen, W. Hafezi, W. Schlumberger, K. Steinhagen, and J. E. Kuhn. 00. Evaluation of Confirmatory Strategies for Detection of Type-Specific Antibodies against Herpes Simplex Virus Type. J Clin Microbiol 40:407-13. 5. Eis-Hubinger, A. M., M. Daumer, B. Matz, and K. E. Schneweis. 1999. Evaluation of three glycoprotein G-based enzyme immunoassays for detection of antibodies to herpes simplex virus type in human sera. J Clin Microbiol 37:14-6. 6. Enders, G., B. Risse, M. Zauke, I. Bolley, and F. Knotek. 1998. Seroprevalence study of herpes simplex virus type among pregnant women in Germany using a type-specific enzyme immunoassay. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 17:870-. 7. Prober CG, A. A. 1995. Perinatal herpes current status and obstetric management strategies: the pediatric perspective. Pediatr Infect Dis J 14:83-5. Sorularınız için lütfen aşağıdaki adres ile temasa geçiniz: technicalservice@vircell.com REVİZE EDİL TARİH: Ekim-06
5