S.B. İSTANBUL EĞİTİM VE ARAŞTIRMA HASTANESİ Şef Uz. Dr. A. Cüneyt MÜDERRİSOĞLU KRONİK HEPATİT B DE LAMİVUDİN DİRENCİ VE LAMİVUDİN DİRENCİ GELİŞİMİ ÜZERİNE ETKİLİ FAKTÖRLER Dr. Muharrem DOĞAN İÇ HASTALIKLARI UZMANLIK TEZİ İSTANBUL 2007 1
İÇİNDEKİLER Sayfa No İÇİNDEKİLER.. i TEŞEKKÜR.. iii TABLOLAR... v ŞEKİLLER... v KISALTMALAR... vi GİRİŞ ve AMAÇ 1 GENEL BİLGİLER 3 HEPATİT B VİRUSUNUN MOLEKÜLER VİROLOJİSİ... 3 Virion yapısı ve genomik organizasyonu... 3 HBV genotipleri ve serotipleri... 6 Viral replikasyon ve HBV yaşam döngüsü... 6 HBV MUTANTLARI VE MUTASYONLARIN KLİNİK ÖNEMİ... 9 Bazal kor premotor/ prekor ve kor bölgelerinde izlenen mutasyonlar... 9 X bölgesi mutasyonları... 10 Zarf bölgesi mutasyonları... 10 Polimeraz bölgesi mutasyonları... 11 1. Lamivudin direncine neden olan mutasyonlar... 11 2. Adefovir dipivoksil direncine neden olan mutasyonlar... 12 3. Entekavir direncine neden olan mutasyonlar... 12 KRONİK HEPATİT B DE KLİNİK BULGULAR... 12 HBV İNFEKSİYONUNUN MİKROBİYOLOJİK TANISI... 15 1-Serolojik tanı yöntemleri... 15 Akut infeksiyon... 15 Kronik infeksiyon... 18 2-Moleküler tanı yöntemleri... 19 Serolojik tanının yetersiz kaldığı ve moleküler yöntemlerle HBV-DNA sının araştırıldığı durumlar... 19 Tedavi etkinliğinin izlenmesi... 20 i
Mutant virusun tanısı... 20 Antiviral ilaç direncinin saptanması... 20 KRONİK HEPATİT B NİN GÜNCEL TEDAVİSİ... 20 KRONİK HEPATİT B TEDAVİSİNDE PEGİLE İNTERFERONLAR... 23 KRONİK HEPATİT B TEDAVİSİNDE NÜKLEOZİD ANALOGLARI... 24 1. Lamivudin... 25 2. Adefovir dipivoksil... 28 3. Entekavir... 30 4. Telbivudin ( L-deoksitimidin)..... 30 MATERYAL VE METOD... 32 Hastalar:... 32 Verilerin toplanması:... 32 İstatistiksel değerlendirme:... 33 BULGULAR... 34 TARTIŞMA... 40 SONUÇ... 43 ÖZET... 44 LAMIVUDINE RESISTANCE AND AFFECTING FACTORS FOR IMPROVING THE RESISTANCE IN CHRONIC HEPATITIS B PATIENTS... 45 KAYNAKLAR... 46 ii
TEŞEKKÜR Asistanlığım süresince bilgi birikimi ve tecrübesinden bizi mahrum etmeyen başta klinik şefim Uz. Dr. A. Cüneyt MÜDERRİSOĞLU olmak üzere saygı değer hocalarım, Şef Uz. Dr. Füsun ERDENEN, Şef Uz. Dr. Mecdi ERGÜNEY, Şef Uz. Dr. Burhan BEDİR ve Şef Uz. Dr. Esma G. ALTUNOĞLU na; Rotasyonlarımın birer klinik tecrübe ve bilimsel havuza dönüşmesi için çaba harcayan rotasyon hocalarım Şef Uz. Dr. Muzaffer FİNCANCI, Şef Uz. Dr. Güvenç GÜVENEN, Şef. Doç. Dr. Mehmet ÖZKAN ve Şef Doç. Dr. Güngör ÇAMSARI ya; Bilimsel kişilikleri ile bize örnek olan ve hiçbir konuda yardımını esirgemeyen başta 1. Dahiliye Klinik Şef Yrd. Uz. Dr. Hayri Polat olmak üzere sevgili uzmanlarım Uz. Dr. Sedat Işık, Uz. Dr. Mine Besler, Uz.Dr. Muharrem Coşkun, Uz. Dr. Bülent Çağlar, Uz. Dr. Gökçen Gökcan, Uz. Dr. Ömür Tabak, Uz. Dr. Hanife Usta ve Uz. Dr. Abdullah Yüksel e; Asistanlığımın başından itibaren örnek aldığım, desteği ile her zaman yanımda hissettiğim Uz.Dr. Ümmügül Üyetürk e; İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji rotasyonum sırasında her türlü yardımı esirgemeyen ve tezimin verilerinin toplanmasında emeği geçen İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji servisi uzmanları Dr. Gülhan Eren, Dr. Zeki Boztaş, Dr. Ferda Soysal, Dr. Aylin İzat ve Dr. Bahadır Ceylan a; Asistanlığımın uygun bilimsel ortamda geçmesi için yapmış olduğu katkılarından dolayı hastanemiz başhekimi Sn. Op. Dr. Özgür YİĞİT e; Asistanlığım süresince birlikte dayanışma içerisinde çalıştığım sevgili asistan arkadaşlarım Dr. Tamer Çeviker, Dr. Mehmet Uçucu, Dr. Yasin Kocaöz, Dr. Nurettin Tunç, Dr. Fahri Akgül, Dr. Gürhan Şişman, Dr. Zeynep Gürcan, Dr. Pınar Demir, Dr. Selçuk Ergen, Dr. Özlem Kar, Dr. R. Bilge Özdemir, Dr. Fatih Kuzu, Dr. Akif Acay, Dr. A. Suat Demir, Dr. Umut Özdamarlar, Dr. Mehmethan Alişan, Uz. Dr. Ahmet Uludağ, Uz. Dr. Şükran Türkeş, Uz.Dr. Öznur Ertaş, Dr. Cemal Yıldırım ve Dr. Gülşen Yörük e; 1-4 Dahiliye servisinin çalışkan hemşire ve personellerine; iii
Asistanlığım süresince benden desteğini esirgemeyen çok değerli eşime ve ailesine; Bugünlere gelmemde en büyük payı olan başta ablam olmak üzere tüm aileme; Sonsuz saygı ve teşekkürlerimi sunarım. Dr. Muharrem DOĞAN iv
TABLOLAR Tablo 1 : İnfeksiyonun farklı dönemleri boyunca hepatit B virusunun serolojik ve moleküler belirteçlerinin yorumları Tablo 2 : Kronik hepatit B nin önerilen tedavisi Tablo 3 : Antiviral dirençte kronik hepatit B nin izlenmesi Tablo 4 : Direnç gelişen hastaların özellikleri Tablo 5 : Tedavi süresine göre direnç gelişme sıklığının dağılımı Tablo 6: Direnç gelişmeyen ve gelişen hastaların yaş, tedavi öncesi beden-kitle indeksi, tedavi öncesi serum ALT, tedavi öncesi histolojik aktivite indeksi, tedavi öncesi serum HBV- DNA ve tedavi süreleri açısından kıyaslanması Tablo 7: Direnç gelişiminin cinsiyete göre dağılımı Tablo 8: HBeAg pozitif ve negatif hastalarda direnç gelişme dağılımı Tablo 9: Kombinasyon tedavisi alma durumuna göre direnç gelişiminin dağılımı Tablo 10: Kombinasyon tiplerine göre direnç gelişiminin dağılımı Tablo 11: Direnç gelişmeyen ve gelişen hastaların cinsiyet, alkol alışkanlığı, sigara alışkanlığı, HBeAg durumu ve aldıkları tedavi tipi açısından kıyaslanması ŞEKİLLER Şekil 1 : HBV nun genomik organizasyonu ve sentezlenen RNA lar Şekil 2 : HBV nun yaşam ve replikasyon döngüsü Şekil 3 : Akut HBV infeksiyonunda tanısal belirteçler Şekil 4 : Kronik HBV infeksiyonunda tanısal belirteçler Şekil 5 : İnterferonların yan etkileri Şekil 6 : Lamivudin ve sitidinin kimyasal yapısı Şekil 7 : Adefovir dipivoksil ve adenosin monofosfatın kimyasal yapısı Şekil 8 : Tedavi süresine göre HBeAg pozitif ve HBeAg negatif hastalar arasında direnç gelişme oranı grafiği v
KISALTMALAR ALT : Alanin aminotransferaz BKİ : Beden-kitle indeksi cccdna : Kovelent bağlı sirküler DNA dk : dakika ELİSA: Enzyme linked immunosorbent assay ER : Endoplazmik retikulum FDA : Food and Drug Administration HAİ : Histolojik aktivite indeksi HBsAg : Hepatit B yüzey antijeni HBV : Hepatit B virusu HBV-DNA : Hepatit B virusu DNA sı HCV : Hepatit C virusu HDV : Hepatit D virusu HIV : Human Immunodeficiency Virus IgM : İmmunoglobulin M IgG : İmmunoglobulin G INFα: İnterferon alfa IU : International Unit kb : Kilobaz LHBs Ag : Büyük hepatit B yüzey antijeni LMV : Lamivudin mg : Miligram MHBs Ag : Orta hepatit B yüzey antijeni miu : Mili International Unit ml : Mililitre NCSS : Number Cruncher Statistical System nm : Nanometre NÜS: Normalin üst sınırı vi
ORF : Open Reading Frame (Açık okuma çerçevesi) PCR : Polimerase Chain Reaction (Polimeraz zincir reaksiyonu) peg INFα: Pegile interferon alfa rcdna : Pozitif iplikli çembersel DNA RNaz : Ribo Nükleaz S. B. : Sağlık Bakanlığı SHBs Ag : Küçük hepatit B yüzey antijeni Std. IFN : Standart interferon TGA : Timin -Guanin -Adenin TGG : Timin -Guanin -Guanin YADD : Tirozin-Alanin-Aspartat-Aspartat YIDD : Tirozin-İzolösin-Aspartat-Aspartat YKDD : Tiozin-Lizin-Aspartat-Aspartat YLDD : Tirozin-Lösin-Aspartat-Aspartat YMDD : Tirozin-Metionin-Aspartat-Aspartat YRDD : Tirozin-Arjinin-Aspartat-Aspartat YTDD : Tirozin-Tireonin-Aspartat-Aspartat YVDD : Tirozin-Valin-Aspartat-Aspartat vii
GİRİŞ VE AMAÇ Kronik hepatit B, bu gün dünyada 400 milyon kişiyi ilgilendiren önemli bir sağlık problemi ve en yaygın infeksiyon hastalıklarından biridir. Dünya Sağlık Örgütü ne göre, dünya nüfusunun üçte biri hepatit B virusu ile enfektedir ve bunların % 5 i kronik hastadır. Bu kronik hastaların yaklaşık dörtte biri, ölümcül karaciğer hastalıkları olan karaciğer sirozu ve karaciğer kanserine ilerlemektedir. Nihayetinde yılda 1 milyon kişi hepatit B virüsü nedeniyle ölmektedir (1, 7). Hasta olmayı önleme amacıyla yapılan çalışmalar, önemli bir adım olarak virüse karşı çok etkin bir aşının geliştirilmesini başarmış ve % 95 koruma etkinliği olan bir aşı gündeme gelmiştir. Bu aşı çok güvenilirdir ve uygulanışından uzun dönem sonrasında da kullanılabilirliğini engelleyecek bir etkisi gösterilememiştir. Bu açıdan hepatit B virusunun eradike edilebilmesi için önemli bir adım atıldığı aşikardır. Doksandan fazla ülkede, yenidoğanların aşılanması kural olarak kabul edilmiştir. Hepatit B virüsü ile enfeksiyon neticesinde meydana gelen kronik hepatit hastalığı, yıllar içerisinde karaciğer yetersizliğine ve hepatoselüler kansere ilerlemektedir. Karaciğer kanseri olguları incelendiğinde; hastaların % 82 sinde viral etiyoloji görülmekte, bunların da üçte ikisini hepatit B oluşturmaktadır. Kronik hepatit B de, kronik hepatit C ye benzer şekilde parenteral yollardan insanlara bulaşmaktadır. Hepatit B virüsünde farklı olarak göze çarpan bir özellik, infeksiyonun edinilme yaşı arttıkça kronikleşme riskinin azalmasıdır. Şöyle ki; yenidoğan ve ilk 1 yaşta geçirilen infeksiyon % 90 kronikleşmekte, bu oran 1-5 yaş arasında % 30 a inmekte, daha erişkin yaşlar için % 2 civarında bulunmaktadır (1). 1
Tanımlanmış olan olası hepatit B virüsü bulaş yoları, anneden bebeğe doğum esnasında geçiş, seksüel temas, intravenöz ilaç kullanımı, akupunktur yöntemleri uygulaması ve kan transfüzyonları sırasında meydana gelen geçişlerdir. Aile içi temas ile de bulaşabildiği tahmin edilmektedir. Lamivudin (beta- L- 2,3 -dideoksy thiacytidine), kronik hepatit B tedavisinde lisans alan ilk nükleozid analoğudur. Hastalar tarafından iyi tolere edilir ve kullanımını kısıtlayacak önemli ve sık görülen yan etkileri de yoktur. Hepatit B virüs DNA sının replikasyonunu sağlayan revers transkriptaz enzimini bloke ederek virüsün replike olmasını önler. Lamivudin ile tedavi edilen kronik hepatit B li hastaların karaciğer enzim düzeyleri normalleşir, serumda HBV-DNA yükü azalır ve hepatitin nekroinflamatuar aktivitesi geriler. Ancak; tedavi kesildikten ortalama 3-6 ay sonra hastalığın relaps gösterebilmesi ve ilaca karşı direnç gelişimi, lamivudin tedavisinin olumsuz özellikleri olarak karşımıza çıkmaktadır (1). Bu çalışmada, S.B. İstanbul Eğitim ve Araştırma Hastanesi Kronik Hepatit polikliniği nde takip edilen hastalar alınarak Türkiye de lamivudin direnci ve direnç gelişimine etki eden faktörler hakkında bilgi edinilmesi amaçlanmış, ilacın daha başarılı kullanımı için neler yapılabileceği tartışılmıştır. 2
GENEL BİLGİLER HEPATİT B VİRUSUNUN MOLEKÜLER VİROLOJİSİ HBV ilk defa 1965 yılında Bulumberg ve arkadaşları tarafından Avusturalya Antijeni adı verilen bir serum proteini olarak rapor edilmiş, 1970 yılında tüm virionun elektron mikroskobi görüntüleri saptanarak, HBV nun esas infeksiyöz partikülü olan Dane Partikülleri adını almıştır. 42 nm büyüklüğündeki Dane partikülleri dışında 22 nm lik sferik ve 22 x 100-200 nm büyüklüğünde flamentöz partiküller de elektron mikroskobunda tarif edilmiş, izleyen yıllarda çeşitli çalışmalar ile virusun genomik yapısı ve proteinleri karakterize edilmiştir. HBV, Hepadnaviridae virus ailesinde sınıflandırılan, ancak diğer aile üyelerinden farklı olarak sadece insan ve şempanzelerin karaciğerlerinde enfeksiyon oluşturan, genom organizasyonu, doku tropizmi ve replikasyon stratejisi açısından ailenin prototip özelliklerine sahip bir virustur (2). Virion yapısı ve genomik organizasyonu HBV küçük, zarflı bir DNA virusudur. Viral genom yaklaşık 3200 nükleotidden oluşan, oldukça küçük ve aşağı yukarı % 70 çift, % 30 tek iplikli çembersel DNA dan oluşur. Bu genom ikozahedral bir kapsid içerisinde bulunur ve bu kapsid dışında 3 farklı yüzey antijenini taşıyan lipid yapılı zarf yer alır. Zarflı bir virus olmasına rağmen eter, düşük ph, ısı, dondurma ve çözmeye oldukça dirençlidir, bu özellikleri ile kişiden kişiye geçişteki etkinlik ve dezenfektan direnci sağlanır (2, 8). HBV, bir DNA virusu olmasına karşın revers transkriptaz enzimi kodlar ve bu enzim sayesinde RNA aracısı üzerinden replike olur. İnfekte hücre çekirdeğinde bir 3
minikromozom şeklinde bulunur. Kovalent bağlı çembersel DNA adı verilen, replikasyon ve transkripsiyon esnasında aracı molekül özelliği taşıyan bir DNA zinciri üzerinden meydana gelen, karmaşık bir replikasyon stratejisine sahiptir. HBV genomu dört açık okuma çerçevesi oluşturacak şekilde organize olmuştur (P, C, X ve S). Bunlardan en büyüğü olan P viral polimerazı kodlar. Zarf yapılarına ait kısım da P içerisinde bulunur. Özyapı (C;core) ve X açık okuma çerçeveleri de zarfı oluşturan kısım ile bazı bölgelerde üst üste binmiş şekilde bulunur. cccdna yapısı tüm viral transkriptler için kaynak oluşturur ve virusa ait 3.5, 2.4, 2.1 ve 0.7 kb lik mrna lar cccdna kalıp alınarak sentezlenir. Viral RNA ların ekspresyonu sırasıyla enhancer II / bazal kor, büyük yüzey antijeni (L) ve majör yüzey antijeni (S) ve enhancer I / X geni promotorları tarafından kontrol edilir (2,3). Şekil 1 de HBV genomunun organizasyonu ve sentezlenen RNA lar görülmektedir. Şekil 1: HBV nun genomik organizasyonu ve sentezlenen RNA lar ( 3 numaralı kaynaktan alınmıştır). 4
HBV zarf proteinleri, her biri birer tane protein ve glikoprotein yapısında yapı taşı içeren küçük, orta ve büyük yüzey antijenleri olarak adlandırılan proteinlerdir. Bunlardan küçük olanı SHBs Ag olarak gösterilir, p24 ve gp27 alt birimlerinden oluşur. Orta büyüklükte olanı MHBs Ag olarak gösterilir, p33 ve gp36 alt birimleri vardır. En büyük olanı LHBs Ag olarak gösterilir, p39 ve gp42 alt birimlerinden oluşmuştur. Her 3 zarf proteininin de karboksi terminalindeki 225 aminoasiti ortaktır ve üçü de S domaininde yer alan sistein grupları arasında oluşan disülfit bağlarıyla stabilize edilen glikozile tip 2 transmembran proteini özelliği gösterirler. Daha önce bahsettiğimiz 42 nm lik Dane partikülünde her 3 bileşen de yer alır. S bileşeni virion zarfındaki ana protein olup, L ve M bileşenleri virion zarfındaki proteinlerin % 30 kadarını oluşturmakta ve ikisi eşit miktarlarda bulunmaktadır. Bu yüzey antijenleri infekte olan hücrelerden infektif virionlarla birlikte ancak onlardan yaklaşık olarak 100 kat daha fazla salınan non-infektif flamentöz ve sferik yüzey antijeni partiküllerinin de yapısını oluştururlar. İnfekte kişi plazmalarında mililitrede birkaç yüz mikrogram düzeyinde bulunan bu flamentöz ve sferik partiküller, infekte kişinin serumunda bulunan kendilerine karşı gelişmiş antikorlar ile birleşerek immün kompleks reaksiyonları oluşturabilmektedirler (2). Genomda P ve C olarak gösterilen polimeraz ve viral özyapı gen ürünleri, sırasıyla viral DNA replikasyonunda ve viral kapsid proteinlerinden nükleokapsid oluşumunda görev alırlar. Polimerazın amino terminali, pre-genomik RNA ların paketlenmesi ve DNA sentezi için hazırlayıcı görevini üstlenmiş olup terminal protein adı da verilir. Karboksi terminali ise revers transkriptaz ve RNaz H aktivitesinden sorumludur. Diğer hepadnavirus polimerazları gibi HBV polimerazı da enzimatik aktiviteleri için bulunduğu hücrenin bazı hücresel faktörlerine ihtiyaç duyar. Pre-kor/kor bölgesinden sentezlenen ürünün proteolizi ile oluşan HBeAg nin ilk bölümü, tüm molekülün endoplazmik retikuluma salgılanmasında görev alır. Golgi aygıtında bu molekülün karboksi terminalinden 29 aminoasit ayrılması ile HBeAg olgunlaşır ve kana salınır. HBx proteini ise bazı özel indirek etkiler ile viral ve bazı hücresel genlerin transkripsiyonunu artırabilme özelliği taşır (2). 5
HBV genotipleri ve serotipleri S geninde % 4, diğer tüm genom dizisinde de % 8 oranında görülen varyantlar HBV nun genotipleri olarak tanımlanır. Bu genotipler sirası ile A dan H harfine kadar 8 farklı tip olarak isimlendirilmişlerdir. Genotiplerin tahmin edilen prevelansı genotip A için % 35; genotip B için % 22; genotip C için % 31; genotip D için % 10 ve geriye kalanlar için % 2 civarındadır. Hepatit B virusu, HBs antijeninin yapısal farklılıklarına göre ise serotiplere ayrılmıştır. Bu serotipler 9 adet olup her biri ortak a determinantı taşımaktadırlar. Virusun coğrafi dağılımı ile genotip arasında uyumluluk görülmektedir. Farklı genotipler ile ko-infeksiyonun mümküm olduğu bazı çalışmalarda gösterilmiştir. Genotipler arasında rekombinasyon olasılığı da mümkündür (1,2, 21). Türkiye de yapılan bir çalışmada akut hepatit B etkenlerinin tümünün genotip D olduğu tesbit edilmiştir (4). Viral replikasyon ve HBV yaşam döngüsü HBV nun insan karaciğer hücrelerine tutunma ve giriş için kulandığı yüzey proteinlerinin henüz bilinmemektedir. Ancak LHBs Ag nin amino terminalinde bulunan pre-s1 bölgesinin hedef hücreye tutunmada en önemli göreve sahip epitopları içerdiği saptanmıştır. Ayrıca HBV zarf proteinlerini bağlayan çeşitli hücresel ligandlar da tesbit edilmiştir. Viral alt tiplere göre 109 ya da 120 aminoasit büyüklüğünde olan pre-s1 bölgesinde tutunma aktivitesinden sorumlu kısım 21-47. aminoasitler olarak tanımlanmış, tutunma için bu bölgenin var olmasının yeterli ve gerekli olduğu anlaşılmıştır. Daha sonra yapılan mutagenez çalışmalarında LHBs antijeninin bu epitopu içerisinde yer alarak hücreye tutunmada kritik rol oynayan QLDPAF dizisi tanımlanmıştır. Bu dizi başka birçok virus, bakteri ve mikroorganizmanın yapısında olup aynı amaçla kullanılmaktadır. HBV nun doku organ özgüllüğünün belirlenmesinde ise geri kalan pre-s1 kısımlarının etkili olduğu bilinmektedir. X proteininde de pre-s1 e benzer bir epitopun bulunması ve bu bölgenin de benzer şekilde QLDPAR dizisi içermesi, X proteininin de tutunmada rol aldığını akla getirmektedir. Ancak in-vitro çalışmalarda virusun karaciğer hücresine tutunmasında tüm yüzey proteinlerinin aynı derecede aktivite gösterdiği de görülmüştür. Tutunma gerçekleştikten sonra virus zarfı ve hücre membranı arasında füzyon meydana 6
gelir ve nükleokapsid sitoplazmaya salınır. Sitoplazmada enzimatik yollarla kapsid parçalanır ve viral genomik DNA ve polimeraz çekirdeğe taşınır (2, 9). HBV virionları genellikle 2 tip DNA taşır. Bunlardan biri daha baskın olan negatif iplik, diğeri ise kısmen tamamlanmış olan pozitif iplikli çembersel DNA ( rcdna) genomudur. Kendi kendine hazırlık mekanizması ile oluşmuş az miktarda lineer DNA da virion içerisinde bulunabilir. Replikasyon döngüsünün başlaması ile bu 2 form DNA da cccdna ya dönüştürülür. Genom replikasyonunun ilk ve en önemli aşaması burasıdır. Karaciğer hücresinde bu olay, hepatosite virus inokülasyonundan sonraki ilk 24 saatte olmaktadır. Negatif DNA ipliğine kovalent olarak bağlanan revers transkriptaz yerinden ayrılarak pozitif iplikcik tamamlanmakta, daha sonra bu 2 zincirin ligasyon reaksiyonu ile birbirine bağlanması ile cccdna oluşmaktadır. Bu aşamalarda hücresel DNA tamir enzimleri ile viral revers transkriptaz enziminin birlikte rol aldığına, ayrıca virus özyapısının çekirdeğe taşınmasında, özyapı (kor) ve revers transkriptaz proteinlerinin etkili olduğuna işaret eden veriler bulunmaktadır. cccdna, HBV nun hepatositlerde kalışında etkili olan moleküldür ve antiviral tedavi sonrasında izlenen viral reaktivasyonlardan sorumludur. Nükleer membrandan viral DNA nın çekirdeğe ulaşması sonrasında virusa ait transkriptazlar ve hücresel RNA polimerazlar tarafından cccdna oluşumu başlatılmaktadır. Viral RNA lar olan 3,5 kb RNA dan nükleokapsid proteini ya da HBcAg, HBe antijeni ve viral polimeraz; 2,4 ve 2,1 RNA dan zarf proteinleri; 0,7 kb RNA dan da X proteini sentezlenir. Bu esnada hücresel transkripsiyon faktörleri de rol oynar. 3,5 kb RNA ek olarak viral genomik DNA için kalıp olan pre-genomik RNA olarak da işleme alınır (2, 9). Viral genomik DNA nın sentezi için revers transkriptaz pre-genomik RNA nın 5 ucuna bağlanır ve bu kompleks nükleokapsid içine paketlenir; böylece nükleokapsid içinde revers transkripsiyon ve ve viral DNA nın sentezi başlar. Burada DNA sentezini viral revers transkriptaz başlatır. Negatif iplikli DNA oluştuktan sonra revers transkriptaz enzimi RNaz H aktivitesi ile pre-genomik RNA yı parçalar ve pozitif ipliğin sentezine başlar. Nükleokapsid partikülleri, kısmi çift iplikli DNA molekülü oluştuğunda endoplazmik retikulum içerisinde tomurcuklanarak zarf yapılarını kazanmalarına imkan 7
sağlayacak olgunlaşma sürecine girerler. Oluşan nükleokapsidlerin bir kısmı hücre çekirdeğine geri dönerek cccdna kopya havuzunu artırmak için görev alırlar (2, 9). Özyapı(kor) proteinlerinin LHBs Ag amino terminali kısmına bağlanmaları partiküllerin endoplazmik retikulumdan tomurcuklanmasına neden olur, üç zarf proteinini de içeren virionlar endoplazmik retikulumdan golgi kompleksine taşınır. Bu esnada zarf proteinlerinin glikozilasyonu tamamlanır ve olgun virion kan dolaşımına salınır (2). Şekil 2 de HBV nun yaşam siklusu ve replikasyonu şematik olarak gösterilmektedir. Şekil 2: HBV nun yaşam ve replikasyon döngüsü (Mandell, Bennet & Dolin: Principles and Practice of İnfectious Disease, 6. edisyon dan alınmıştır). 8
HBV MUTANTLARI VE MUTASYONLARIN KLİNİK ÖNEMİ İnsan immün yetersizlik virusu ve hepatit C virusu gibi, HBV da yüksek düzeyde virion üretimi ve yıkımı ile karakterizedir. İlaçlar ya da immün sistem tarafından replikasyon baskılanmadığı takdirde günde yaklaşık 10¹¹ virion meydana geldiği tahmin edilmektedir. Revers transkriptaz enziminin düzeltici fonksiyonu olmaması, yüksek virion üretimi ile bir araya geldiğinde replikasyonda yüksek düzeyde hata oluşmasına neden olmaktadır. HBV polimerazının yıllık hata oranının nükleotd başına 1,4-5/10.000 olduğu hesaplanmıştır. Bu oran retroviruslarla eşit, ancak diğer DNA viruslarından 104 kat yüksek gibi görülmektedir. Mutasyon olduğu durumlarda infekte kişilerde genetik olarak birbirine yakın ancak birbirinden farklı olan ve farklı özellikler taşıyan varyantların bir kombinasyonu var olmaktadır. Konaktaki virustan daha avantajlı bir özellik oluşur ise mutant virus baskın hale gelmektedir (2). Bazal kor promoter/ prekor ve kor bölgelerinde izlenen mutasyonlar Düşük miktarda ya da hiç olmayan HBeAg ekspresyonu ile ilişkilendirilen 2 önemli mutasyon tanımlanmıştır. Bunlardan ilki, prekor bölgesinde 1896. nükleotidde triptofan kodlayan 28. kodon olan TGG kodonunda sondaki guaninin adenine değişimi ile TGA stop kodonunun oluşmasıdır. Bu stop kodonu HBeAg ekspresyonunu durdurmaktadır. Buna rağmen HBV kor antijen üretimi ve HBV replikasyonu devam etmektedir. 1896. nükleotidle aynı bölgede 1858. pozisyonda bulunan nükleotidin baz çifti oluşturdukları, bu yapının da virusun replikasyonunda görev aldığı bilinmektedir. HBV nun B, D, E, G ve bazı C genotiplerinde 1858. nükleotid timidin şeklindedir ve mutasyon sonucu oluşan stop kodonu A-T baz çifti oluşturarak fonksiyonel sekonder yapıyı stabilize etmektedir. A, F ve bazı C genotiplerinde ise bu pozisyonda timidin yerine sitozin bulunmakta bu nedenle prekor stop kodonu mutasyonu bu genotiplerde nadiren izlenmektedir (2, 5, 6, 13). Prekor mutant HBV en çok Akdeniz Avrupası ve Asya da bulunur. Prevelansı tam belirgin değildir. Ancak Asya ve Akdeniz Avrupası nda % 40-80 arasında tahmin edilmektedir. Genotip A bölgelerinden daha az rapor edilmektedir (6). Diğer bir mutasyon grubu da bazal kor promoter bölgesini etkilemekte ve prekor ve kor RNA larının transkripsiyonunda azalma şeklinde ortaya çıkmaktadır. A1762T ve 9
G1764A şeklinde oluşan bu mutasyonlar ikisi birlikte olduğunda HBe antijeni sentezinde azalmaya ve viral yükte artışa neden olmaktadır. Diğerinin aksine bu mutasyon tipi genotip A ile infekte kişilerde daha sık ortaya çıkmaktadır. Bazal kor promoter bölgesinde oluşan mutasyonlar karaciğere özgül transkripsiyon faktörlerinin bağlanmasının azalmasına dolayısıyla daha az prekor ve kor transkriptinin ve kor proteininin oluşmasına neden olurlar. Ancak pregenomik RNA transkripsiyonunu ya da polimeraz / kor proteinlerinin translasyonunu etkilemezler. Kor geninde izlenen mutasyonlar ve prekor stop kodonu mutasyonlarının varlığı, HBe antijeni sentezi ve karaciğer hastalığının aktivitesi ile ilişkilidir (2). X bölgesi mutasyonları Bazal kor promotor bölgesinin X geni ile çakışmasından dolayı A1762T ve G1764A kor promotor mutasyonları X geninde de değişikliklere sebep olur. Bazal kor promoter bölgesinde izlenen tüm delesyon ve insersiyonlar X geninde çerçeve kayması oluşturarak dallı ve kısa X proteinlerinin sentezlenmesine sebep olmaktadır. Oluşan mutant X proteinleri HBx antijeninin transaktivasyon aktivitesini göstermemektedirler (2). Zarf bölgesi mutasyonları HBV genomunun en yüksek düzeyde heterojenlik izlenen bölgesi pre-s bölgesidir. Pre-S2 proteinlerini sentezlemeyen viruslar özellikle asemptomatik taşıyıcılarda baskın popülasyonlar olarak karşımıza çıkmaktadır. Polimeraz proteininin bağlayıcı boşluk bırakıcı bölgesiyle çakışan pre-s2 bölgesi nedeniyle, bölgede oluşan mutasyonlar enzim aktivitesinde önemli değişikliklere neden olmaktadır. Günümüzde uygulanan birçok Hepatit B aşısı HBs antijenini taşımakta, proteinin 99-170. pozisyonlarında yerleşen majör hidrofobik bölgeye karşı oluşan immün yanıt bağışıklığı sağlamaktadır. Yüzey antijeninin 144. ve 145. pozisyonlarında meydana gelen mutasyonlar aşı başarısızlığı ile ilişkilendirilmektedir (2). 10
Polimeraz bölgesi mutasyonları Kronik hepatit B tedavisinde nükleotid/nükleozit analoglarının kullanılmaya başlamasından sonra polimeraz bölgesinin önemi anlaşılmıştır. Bu bölgede mutasyon olan viruslar, tedavi sonucunda diğerlerinin arasından seçilip, ilaç direncinin oluşmasına sebep olmuştur. Sonuç olarak; ilaç tedavisine direnç gösteren bu etkenlerde, polimeraz bölgesinde mutasyon olduğu ortaya koyulmuştur ( 2, 10-12 ). 1. Lamivudin direncine neden olan mutasyonlar HBV polimerazının primer katalitik bölgesi revers transkriptaz enzimidir. Bu enzim A, B, C ve D domainleri içerir. C domaininin rt203-rt206. kodonlarını oluşturan tirozin(y), metiyonin(m), aspartat(d), aspartat(d) motifinde oluşan mutasyonlar lamivudin direnci ile bağlantılı mutasyonlar olarak bilinmektedir. 204. pozisyondaki metionin aminoasitinin başka bir aminoasit ile değişimine sebep olan mutasyonlar ilacın da etkili olamamasına yol açmaktadırlar (2, 10, 12, 13). Yakın zamana kadar lamivudin direncine yol açan 2 mutasyon bildirilmişti. Bu mutasyonlara revers transkriptazın B domaininin 180. kodonundaki L180M mutasyonları da eşlik ettiği görülmüş ve 3 grup mutasyon tanımlanmıştı. a) 1. grup mutasyonlar : M204V ve L180M mutasyonlarının birlikteliği b) 2. grup mutasyonlar : M204I mutasyonu c) 3. grup mutasyonlar : M204I ve L180M mutasyonlarının birlikteliği Bu gruplardan 1. grup mutasyonların daha sık olduğu, 2. grup mutasyonların ise daha erken görülmekte olduğu çeşitli çalışmalarla gösterilmiştir (7, 14, 16, 17). Lamivudine direnç gelişimine sebep olan mutasyonları araştırmak amacıyla in vitro ortamda yapılan bir çalışmada YMDD nin 7 değişik motifte mutasyonu olduğu ve bunların özellikleri karakterize edilmiştir. Bu motifler YIDD, YVDD, YADD, YLDD, YKDD, YRDD ve YTDD olarak gösterilmiştir. Bu oluşan mutant tiplerden YADD, YKDD ve YTDD motiflerinin HBsAg sekresyonu yapamadıkları yani oluşan mutasyonun infektif olmayan bir virusa yol açtığı gösterilmiştir. Yine bu mutant tiplerden YKDD, YRDD ve YTDD motiflerine lamivudinin uygulanabilir olmadığı gösterilmiş, YADD ve YLDD ye 11
lamivudinin replikasyonu inhibe edici etki ettiği görülmüş, YIDD ve YVDD motiflerinin ise lamivudine dirençli olduğu tespit edilmiştir (15). 2. Adefovir dipivoksil direncine neden olan mutasyonlar Lamivudin direncine neden olan mutasyonlara oranla daha az görülen adefovir dipivoksil direncine neden olan mutasyonlar revers transkriptazın D domaininin 236. kodonundaki N236T ve 181. kodonundaki A181T mutasyonlarına bağlanmıştır. Bu mutasyonların lamivudin duyarlılığında da azalmaya sebep olduğu gösterilmiştir. Direnç mekanizması tam belli değildir. Ancak 236 ve 181. pozisyonlardaki aminoasitlerin yerine geçen treonin (T) aminoasitinin daha küçük ve daha hidrofilik olması bir fark oluşabileceğini düşündürtmektedir (2, 18). 3. Entekavir direncine neden olan mutasyonlar Entekavir, lamivudine dirençli suşları hızla baskılayabilir. Ancak; polimerazın revers transkriptaz bölgesinde meydana gelen bazı mutasyonlar, bu ilaca da dirence neden olabilmektedir. Entekavir direnci ile ilişkilendirilen mutasyonlar B domeinindeki T184G, C domeinindeki S202I ve D domeinindeki M250V mutasyonlarıdır (2). KRONİK HEPATİT B DE KLİNİK BULGULAR HBV ile infeksiyon sonrası, 6 aydan uzun süren HBsAg pozitifliği kronik hepatit B ye işaret eder. Bu durum, karaciğerde viral replikasyonun devam ettiği, hem karaciğer hem de kanda titreleri farklı olmak kaydı ile viremi olduğu anlamına gelmektedir. Karaciğerde hepatosit ölümüne eşlik eden inflamatuar infiltratların varlığı, kronik viral hepatit için karakteristiktir (19). HBV infeksiyonunun kronikleşme olasılığı, infeksiyonun bulaşma yolu ve bulaşma yaşına göre değişkenlik gösterir. Yüksek endemik alanlarda infekte anneden yenidoğana perinatal infeksiyon ve erken çocukluk döneminde HBsAg pozitif aile üyelerine temas sonucu horizontal infeksiyon HBV bulaşındaki ana yolları oluşturur (19) İnfeksiyon yenidoğan ve süt çocukluğu döneminde kazanıldığında % 95 civarında kronikleşme görülürken, bu dönemden itibaren ilk 6 yaş içerisinde kazanıldığında ise 12
kronikleşme oranı % 30 civarına inmektedir. Erişkin dönemde infekte olunması durumunda kronikleşme riski % 5-10 civarında görülmektedir (1, 19, 20). Kronik HBV infeksiyonu oluştuğunda 3 faz bulunmaktadır : 1) İmmun tolerans fazı 2) İmmun klirens fazı 3) İnaktif faz İmmun tolerans fazında virusla infekte hepatositlere karşı yeterli immun cevap oluşmadığından, virus yüksek miktarda çoğalmakta ancak hepatositlerde hasar oluşmadığından transaminaz yüksekliği saptanmamaktadır. Bu dönemde HBeAg pozitif olarak saptanır. HBeAg pozitif kronik hepatit B olarak adlandırılır (19, 20). İmmun klirens döneminde ise aktif hepatit bulunur. Serum transaminaz düzeyleri artmıştır hatta bir komplikasyon olarak hepatik dekompansasyon meydana gelebilir. Buradaki hepatit gelişimi konağın HBV ne karşı immun cevabının sonucudur. Transaminaz düzeyi ne kadar yüksek ise immun cevabın şiddeti ve hepatosit hasarı da o kadar yüksektir. Bu olayın devamında anti-hbe oluşumu ile HBeAg negatifleşmesi ve HBV-DNA negatifleşmesi görülebilir. Buna HBeAg serokonversiyonu denir. HBeAg serokonversiyonu olması % 85 klinik remisyon anlamına gelir. Burada inaktif faz oluşur(20). İmmun klirens döneminde prekor mutasyonu olur ise HBeAg üretilemez. Ancak virus replikasyonu devam eder ve HBV-DNA artar. Aminotransferaz düzeyleri de yükselir ise HBeAg negatif kronik hepatit B söz konusu olur (19). Kronik viral hepatitli hastaların büyük çoğunluğu asemptomatiktir, bu nedenle de hastalar genellikle infekte olduklarının farkında değildirler. Bazı hastalarda halsizlik, yorgunluk, bulantı, üst abdominal ağrı, kas ve eklem ağrıları gibi nonspesifik şikayetler oluşabilir. Bununla birlikte anksiyete başta olmak üzere bir takım psikiyatrik semptomlar, endişe hali, düşüncelerini yoğunlaştırmada güçlük, kas gerginliği, uyku bozuklukları ve depresyon görülebilir. Bu bulguların hastaların yaşam kalitesini olumsuz etkilediği, mental ve genel sağlık skorlarında normal insanlara göre daha düşüklüğe sebep olduğu gösterilmiştir (19). 13
Bazı faktörler kronik hepatit B kliniğinin ağırlığını tahmin etmek için ön belirleyici olarak kabul edilmiştir. İnfekte kişinin ileri yasta olması, HBV genotip C ile infekte olması, HBV-DNA düzeylerinin yüksek olması, alkol alışkanlığının olması ve HCV, HDV ya da HIV ile koinfeksiyon olması, siroza ilerleme riskinin yüksek olduğunun göstergeleridir. Hepatoselüler karsinoma ilerleyiş i için risk faktörleri ise; erkek cinsiyet, ailede hepatoselüler karsinom öyküsü, ileri yaş, anti-hbe nin HBeAg ye geri dönme öyküsü, siroz varlığı, HBV genotip C ile infeksiyon, kor promoter mutasyonu ve birlikte HCV infeksiyonunun varlığı şeklinde sıralanabilir. Bazı çevresel faktörler de kişiden bağımsız olarak siroza ya da hepatoselüler karsinoma ilerleme olasılığını artırabilir. Bu çevresel faktörler aşırı alkol alımı, sigara kullanımı ve aflatoksin gibi karsinojen maddeler ile maruziyet olarak sıralanabilir (21). Kronik hepatit B li olgularda transaminaz düzeyleri yüksek ve viral replikasyon göstergeleri pozitif saptanıyor ise hastalık ilerliyor anlamına gelir. Bu ilerlemenin en önemli komplikasyonları siroz, portal hipertansiyon, asit, özefagus varis kanaması, hepatorenal sendrom ve hepatoselüler karsinom olarak sıralanabilir. İlerlemekte olan hastaların % 15-20 sinde 5 yıl içerisinde siroz gelişimi, sirozlu hastaların da % 20 sinde hepatoselüler karsinoma saptanır (1, 19). Kronik hepatit B de diğer ileri evre karaciğer hastalıklarında görülen sarılık, örümcek nevüs, splenomegali ve asit gibi bulgular da saptanabilir. İmmun kompleksler nedeniyle, karaciğer dışı organların etkilenmesine bağlı olarak poliarteritis nodoza, vaskülitik raş, glomerulonefrit ve poliartralji bulunabilir (19). Kronik hepatit B hastalarının %1-10 kadarında yıllık spontan HBeAg / AntiHBe serokonversiyonu görülür ve genellikle karaciğer hastalığında alevlenme ile birliktedir. HBsAg kaybı görülme olasılığı ise yıllık % 1-2 civarındadır (19). 14
HBV İNFEKSİYONUNUN MİKROBİYOLOJİK TANISI 1. Serolojik tanı yöntemleri HBV nun serolojik tanısı, virus tarafından kodlanan antijen ve bu antijenlere karşı konak savunma mekanizması tarafından oluşturulmuş antikorların saptanmasına dayanır. HBsAg ye karşı anti-hbs, HBeAg ye karşı anti-hbe ve serumda serbestçe dolaşmayan HBcAg ye karşı anti-hbc saptayabildiğimiz belirteçlerdir (22). Tablo 1 de hastalığın dönemlerine göre saptanabilen antijen ve antikorlar belirtilmektedir. Tablo 1 : İnfeksiyonun farklı dönemleri boyunca hepatit B virusunun serolojik ve moleküler belirteçlerinin yorumları (22 nolu kaynaktan uyarlanmıştır). Ayrıntılı bilgi için metne bakınız. Hepatit B infeksiyonunun evresi Erken dönem Akut Pencere infeksiyon dönemi Düzelme dönemi Replikatif dönem Nonreplikatif/ inaktif taşıyıcılık Kronik dönemi infeksiyon HBsAg Anti-HBs HBeAg Anti-HBe Anti-HBc HBV-DNA + + IgM + IgM +/ + + IgG +/ + + IgG, IgM >100.000 kopya/ml + + IgG <100.000 kopya/ml Reaktivasyon + +/ IgM >100.000 kopya/ml HBeAg (-) kronik infeksiyon (prekor veya kor mutant) + + IgG >100.000 kopya/ml Akut infeksiyon Akut HBV infeksiyonu sırasında virusa ait ilk saptanan antijen HBsAg dir. Hastalık semptomları ortaya çıkmadan 3-5 hafta önce serumda HBsAg saptanır düzeye ulaşmakta, seviyesi giderek yükselerek akut infeksiyon sırasında en üst seviyeye çıkmaktadır. İyileşme ile sonlanan olgularda 2-6 ay içinde azalarak ortadan kaybolmaktadır. Kaybolduktan bir müddet sonra serumda HBsAg ye karşı oluşan koruyucu anti-hbs 15
antikorları ortaya çıkmakta ve genellikle hayat boyu saptanabilir bir düzeyde kalmaktadırlar. Akut dönemde anti-hbs antikorlarının daha erken oluştuğu ancak çok fazla miktarda HBsAg bulunması dolayısıyla oluşan immun komplekslerin bunları maskelediği düşünülmektedir. HBsAg nin ortadan kaybolduğu ve henüz anti-hbs antikorlarının saptanamadığı bu döneme pencere dönemi ismi verilmektedir. Bu dönemde hem HBsAg hem de anti-hbs antikoru negatif olarak bulunmaktadır. Akut HBV infeksiyonundan sonra anti-hbs antikorlarının oluşması, hastalığın iyileşme ile sonlandığını ve bağışıklık oluştuğunu göstermektedir. Kronik HBV infeksiyonlarında ise genellikle anti-hbs antikorları saptanmamaktadır. Akut HBV infeksiyonu dışında hepatit B aşılanması sonrasında da anti-hbs serumda tespit edilebilir. Hepatit B imunglobülin verilmesi, kan transfüzyonu ve anneden bebeğe pasif olarak geçiş sonrasında da serumda anti-hbs saptanabilmektedir. Pasif olarak alınan bu antikorlar birkaç ay içinde ortadan kaybolmaktadırlar. Serumda anti-hbs seviyesinin 10 miu/ml nin üzerinde olması bağışıklık seviyesinin üzerinde bir antikor titresinin var olduğunu ve kişinin bağışık olduğunu gösterir. Akut HBV infeksiyonundan sonra 6 aydan daha uzun süre serumda HBsAg pozitif olarak kalıyor ise hastalığın kronikleştiği düşünülmektedir (22). Şekil 3 : Akut HBV infeksiyonunda tanısal belirteçler (Piccini & Nilsson: The Osler Medical Handbook, 2. edisyon dan alınmıştır ). 16
Akut infeksiyon sırasında HBsAg nin ortaya çıkmasından kısa bir süre sonra serumda HBeAg ortaya çıkmakta, HBsAg ortadan kaybolmadan önce ortadan kaybolmaktadır. Serumda HBeAg nin varlığı bulaşıcılık, infektivite ve aktif viral replikasyon ile ilişkilidir. HBeAg nin kaybından kısa bir süre sonra anti-hbe antikorları ortaya çıkmaktadır. Anti-HBe antikorlarının serumda tespit edilmesi viral replikasyonun azaldığı ve hastalığın iyileşmeye doğru gittiği anlamına gelmektedir. Ancak prekor bölgesinde mutasyon sonucu oluşan mutant suşların meydana getirdiği infeksiyon sırasında hasta serumunda anti-hbe pozitif olmasına rağmen aktif viral replikasyon ve infeksiyon tablosu devam etmektedir. Bunun dışında oluşan bir diğer farklı durum ise serumda HBeAg pozitif olmasına rağmen viral replikasyonun göstergesi olan HBV-DNA nın saptanamamasıdır. HBeAg nin serumdaki varlığının 3-4 aydan uzun sürmesi kronik infeksiyona gidişi göstermektedir. Kronik infeksiyonda HBeAg nin pozitifliğinin sürmesi ise ağır karaciğer hastalığı gelişme riskini artırmaktadır (22). Serolojik tanıda kor bölgesi ile ilgili kullanabileceğimiz gösterge anti-hbc antikorlarıdır. Anti-HBc antikorları serumda HBsAg tespit edildikten kısa süre sonra ve anti-hbs ortaya çıkmadan önce görülmektedirler. İlk başta anti-hbc, immunoglobülin M sınıfındandır. Anti-HBc IgM infeksiyon başladıktan birkaç hafta sonra en üst seviyelere ulaşır, daha sonra titresi azalmaya başlar ve ortalama 6-8 ay sonra tespit edilemez hale gelir. Buna göre HBsAg pozitif olan bir olguda, anti-hbc IgM negatif bulunuyor ise o kişide akut infeksiyon olasılığı söz konusu değildir. Anti-HBc IgM sınıfı antikorların görülmesinden kısa bir süre sonra IgG sınıfı antikorlar da ortaya çıkar ve bunlar genellikle hayat boyu tespit edilebilir düzeyde kalır. Anti-HBc IgM antikorunun en önemli özelliği, infeksiyonun pencere döneminde tek ölçülebilir belirteç olmasıdır. Diğer önemli özelliği ise kronik infeksiyonun akut alevlenmeleri sırasında, çok düşük bir titrede de olsa pozitifleşebilmesidir (22). Bütün serolojik göstergeler negatif olmasına karşılık, tek başına anti-hbc IgG pozitifliği şu durumlarda saptanabilir : a) Hepatit B infeksiyonu iyileşmiş ancak serum anti-hbs düzeyi saptanamayacak kadar azalmış olan kişiler. b) HBsAg düzeyi saptanamayacak kadar düşük olan kronik infeksiyonlu kişiler. 17
c) Uzamış pencere dönemi. d) Yalancı pozitiflik. e) Pasif olarak anti-hbc IgG kazanılması. Kronik infeksiyon Kronik infeksiyonlu hastalarda, HBV replikasyonunun seviyesini ve infektivite potansiyelini saptamak için serumda HBeAg ve anti-hbe düzeyleri incelenmektedir. HBeAg pozitif olan kronik hasta serumları, anti-hbe pozitif serumlara göre belirgin olarak daha fazla konsantrasyonlarda virus içermektedirler. Yani, HBeAg pozitif hastaların cinsel ilişki yoluyla, aile içi temas yoluyla ve perinatal olarak HBV nu bulaştırma ihtimalleri çok daha fazladır. İnterferon gibi antiviral bir ajanla tedaviden sonra HBeAg nin kaybolması ve anti-hbe antikorlarının oluşması arzu edilmektedir (22). Şekil 4 : Kronik HBV infeksiyonunda tanısal belirteçler (Piccini & Nilsson: The Osler Medical Handbook, 2. edisyon dan alınmıştır ). 18
2. Moleküler tanı yöntemleri HBV infeksiyonunun tanısında moleküler tanı yöntemleri HBV-DNA düzeyi, HBV genotipi, tedavi etkinliğinin izlenmesi, HBV mutasyonlarının saptanması ve serolojik yöntemlerle tanı koymakta zorlandığımız bazı durumların aydınlatılmasında bize yardımcı olan yöntemlerdir. Geçmişten günümüze bu konuda çeşitli araştırma yöntemleri kullanılmıştır. Bu yöntemler başlangıçta kalitatif veriler elde etmemizi sağlamakta iken, teknolojinin gelişmesi ile birlikte kantitatif veriler de elde etmemize olanak vermektedirler. Moleküler tanı konusundaki en önemli gelişme HBV-DNA testlerinin sensitivitesini arttıran real time PCR tekniğinin ortaya çıkması ve gelişmesidir. Bu yöntem sayesinde sonuçlar kantitatif olarak daha kısa zamanda verilmekte ve farklı HBV genotiplerini saptamak mümkün olmaktadır. Ancak çeşitli kantitatif test sonuçları arasında standardizasyon sorunu bulunmaktadır. Moleküler yöntemlerin en çok kullanım alanları şunlardır : a) Serolojik tanının yetersiz kaldığı ve moleküler yöntemlerle HBV-DNA sının araştırıldığı durumlar. b) Tedavi etkinliğinin izlenmesi. c) Mutant virusun tanısı. d) Antiviral ilaç direncinin saptanması (22, 23). Serolojik tanının yetersiz kaldığı ve moleküler yöntemlerle HBV-DNA sının araştırıldığı durumlar - HBsAg negatif HBV infeksiyonunun tanısı - HBeAg negatif / anti-hbe pozitif HBV infeksiyonunun tanısı : Normalde bu durum HBeAg serokonversiyonunu düşündürmektedir. Ancak HBV nin prekor bölgesindeki mutasyonlar sonucu oluşan mutant suşlarla meydana gelen infeksiyon sırasında HBeAg üretimi kesintiye uğramaktadır. Anti-HBe varlığına rağmen HBV-DNA pozitif tespit edilmektedir. - Anti-HBs pozitif HBV infeksiyonunun tanısı 19
Tedavi etkinliğinin izlenmesi HBV-DNA miktarının kantitatif olarak ölçülmesi, kullanılan tedavi şemasının etkili olup olmadığını anlamamıza, tedavi süresini ve dozunu belirlememize ve gerektiği durumlarda tedavi protokolünü değiştirmemize yardımcı olmaktadır. Mutant virusun tanısı HBV-DNA nın sekans analizi ile, ilgili gen bölgelerindeki mutasyonlar saptanabilmektedir. Antiviral ilaç direncinin saptanması HBV ilaç dirençlilik testleri; tek veya çoklu mutasyonları saptayan genotipik testler veya viral genomun ilgili vektörlerle hücre içerisine konulması ve ilaç varlığında HBV nun replikasyonunu direkt olarak ölçen fenotipik testlerdir. Duyarlı testler kullanılarak yapılan HBV direnç tayininin, HBV-DNA miktarının ve transaminaz düzeylerinin yükselmesinden daha önce belirlenebileceği çeşitli çalışmalarla gösterilmiştir. İlaç direnci geliştiğinde hastalığın aktivitesinde artış kaydedildiğinden, ilaç direncinin bu aktivite görülmeden saptanması önem arz etmektedir (22, 23). KRONİK HEPATİT B NİN GÜNCEL TEDAVİSİ Kronik HBV infeksiyonlu hastanın ilk değerlendirilmesinde kapsamlı bir fizik muayene yapılmalı ve hastalık öyküsü irdelenmelidir. Özellikle koinfeksiyon açısından risk faktörleri, alkol kullanımı, ailesel HBV infeksiyonu ve karaciğer kanseri hikayesi sorgulanmalıdır. Karaciğer hastalığının değerlendirilmesi için karaciğer fonksiyon testleri, HBV replikasyon belirteçleri ve risk tarif edenlerde HIV, HDV ve HCV koinfeksiyonu araştırılması için gerekli testler gibi laboratuvar testleri istenmelidir. Eğer geçirilmemiş ise hepatit A için aşı yapılmalıdır (20, 21). İlk değerlendirmeden sonra bazı hasta gruplarında tedaviye başlamadan izlemek gerekebilir. Bu hastalar; HBeAg pozitif, HBV-DNA sı 20.000 IU/mL den fazla ve ALT düzeyi normal olan grup ve inaktif HBsAg taşıyıcıları grubu olarak iki şekilde sınıflandırılabilir. Her iki gruptaki hastalarda da hepatoselüler karsinom için tarama yapılması gereklidir (20, 21). 20
Birinci gruptaki hastalar her 3-6 ayda bir ALT düzeyleri bakılarak izlenirler. Eğer ardışık 2 ALT seviyesi normalin üst limitinden 1-2 kat yüksek, yaşı da 40 ın üzerinde ise karaciğer biyopsisi yapılır. Biyopside orta / şiddetli inflamasyon ve belirgin fibroz gösteriyor ise tedavi başlanması için değerlendirilir. Ardışık 2 ALT düzeyi normalin üst limitinin 2 katından daha yüksek olan hastalara ise direkt biyopsi yapılarak tedavi başlanır(20, 21). İnaktif HBsAg taşıyıcıları ise ilk yıl her üç ayda bir ALT düzeyleri bakılarak takip edilir. İlk yıl ALT normal seviyelerde seyretti ise takip aralıkları 6-12 aya çıkarılabilir. Eğer ALT düzeyi normalin üst sınırından 1-2 kat fazla görülür ise diğer karaciğer hastalığı nedenleri araştırılır ve HBV-DNA düzeyi tekrar bakılır. HBV-DNA düzeyi 20.000 IU/mL nin üzerinde ve ALT düzeyleri aynı seviyelerde devam eder ise karaciğer biyopsisi için değerlendirilir. Biyopside belirgin fibroz veya orta / şiddetli inflamasyon görülür ise tedavi başlanması için değerlendirilir (20, 21). Kronik hepatit B tedavisinin hedefleri; HBV replikasyonunu durdurmak veya belirgin oranda azaltmak, siroz, karaciğer yetersizliği ve hepatoselüler karsinoma gelişimini önlemektir. HBV-DNA nın azalması ya da negatifleşmesi birincil hedef olarak görülmektedir. Bunun yanı sıra ALT seviyesinin normale dönmesi ve histolojik iyileşme sağlanması diğer hedefler arasındadır. Eğer HBeAg pozitif ise HBeAg nin negatifleşmesi ve anti-hbe serokonversiyonu diğer bir hedef olarak sayılabilir. Özellikle interferon dışı antiviral tedavilerin sonlandırılma kararında HBeAg nin negatifleşmesi önemli bir noktadır. HBsAg negatifleşmesi son derece nadirdir ve bir hedef olarak gösterilemez (20). Kronik hepatit B nin tedavisi planlanırken tedavi öncesi bazı laboratuvar verilerine dikkat etmek gerekir. Çünkü tedavi öncesi hastalığın klinik dönemine göre kişinin ne şekilde tedavi edileceği planlanmaktadır. Tablo 2 de kronik hepatit B infeksiyonunun önerilen güncel tedavisi özetlenmektedir. 21
Tablo 2: Kronik hepatit B nin önerilen tedavisi (21 numaralı kaynaktan uyarlanmıştır). HBeAg HBV-DNA ALT Önerilen tedavi yaklaşımı (PCR) + >20.000 IU/mL 2 x NÜS Güncel tedavi etkisi düşüktür. İzle, ALT düzeyi yükseldiğinde tedavi için değerlendir. Karaciğer hastalığının aile öyküsü var veya kişi 40 yaşın üstünde ve kalıcı 1-2 kat yüksek ALT düzeyleri var ise karaciğer biyopsisi için değerlendir. Biyopsi belirgin fibroz veya orta/şiddetli inflamasyon gösteriyor ise tedavi için değerlendir. + >20.000 IU/mL > 2 x NÜS 3-6 ay izle, spontan HBeAg kaybı yok ise tedavi başla. Kompanse ise tedaviden önce karaciğer biyopsisi için değerlendir. Klinik dekompansasyon veya sarılık var ise acil tedavi başla. Başlangıç tedavisi için IFNα/peg IFNα, lamivudin, adefovir, entekavir veya telbivudin kullanılabilir (İlaç rezistans oranının yüksekliği nedeniyle lamivudin ve telbivudin tercih edilmez). Tedavinin son noktası HBeAg serokonversiyonudur. Tedavi süresi IFNα için 16 hafta,peg IFNα için 48 hafta, lamivudin, adefovir,entekavir ve telbivudin için en az 1 yıl önerilmektedir (HBeAg serokonversiyonundan sonra 6 ay devam edilmelidir). IFNα ya cevapsız veya kontrendike ise adefovir veya entekavir ile IFNα değiştirilebilir. - >20.000 IU/mL > 2 x NÜS Başlangıç tedavisi için IFNα/peg IFNα, lamivudin, adefovir, entekavir veya telbivudin kullanılabilir (İlaç rezistans oranının yüksekliği nedeniyle lamivudin ve telbivudin tercih edilmez). Tedavi son noktası belirsizdir. Tedavi süresi IFNα/peg IFNα için 1 yıl, lamivudin, adefovir,entekavir ve telbivudin için 1 yıldan fazla önerilmektedir. IFNα ya cevapsız veya kontrendike ise adefovir veya entekavir ile IFNα değiştirilebilir. - >2.000 IU/mL > 1-2 x NÜS Karaciğer biyopsisi için değerlendir, biyopsi belirgin fibroz veya orta/şiddetli inflamasyon gösteriyor ise tedavi için değerlendir. - 2.000 IU/mL NÜS İzle, HBV-DNA veya ALT yükselirse tedavi et. +/- saptanabilir siroz Kompanse: HBV-DNA > 2.000 IU/mL ise lamivudin, adefovir, entekavir veya telbivudin ile tedaviye başlanabilir (İlaç rezistans oranının yüksekliği nedeniyle lamivudin ve telbivudin tercih edilmez). HBV-DNA < 2.000 IU/mL ise ALT yükselince tedavi için değerlendir. Dekompanse: Lamivudin + adefovir veya entekavir önerilir. Karaciğer transplantasyonu için değerlendirilmelidir. +/- saptanamaz siroz Kompanse ise izle. Dekompanse ise karaciğer transplantasyonu için sevk et. ALT: alanin aminotransferaz, INFα: interferon alfa, peg INFα:pegile interferon alfa, NÜS: normalin üst sınırı 22
KRONİK HEPATİT B TEDAVİSİNDE PEGİLE İNTERFERONLAR İnterferon molekülüne bir polietilen glikol polimerinin bağlanması esasına dayanan pegilasyon teknolojisi, uzamış plazma ömrüne sahip interferonların oluşturulmasını sağlamıştır. Pegile interferonun terapötik etkinliği öncelikle kronik hepatit C tedavisinde gösterilmiştir. Kronik hepatit C tedavisinde standart interferonlardan çok daha etkili olduğunun anlaşılması, kronik hepatit B tedavisinde de klinik çalışma yapılması gerekliliğini doğurmuştur (23, 24). Pegile interferonlarla ilgili yapılan çalışmaların sonuçları incelendiğinde, tedavi sonunda pegile interferonların; HBeAg serokonversiyonu, transaminaz normalizasyonu, kalıcı viral yanıt ve HBV-DNA negatifleşmesi açısından standart interferonlara göre daha avantajlı oldukları görülmüştür (23-25). 307 HBeAg pozitif hasta içeriği ile yapılan bir çalışmada, lamivudin + pegile interferon alfa-2b kombinasyonu ile pegile interferon alfa-2b monoterapisi karşılaştırılmıştır. Tedavi sonunda HBeAg serokonversiyonu, HBV-DNA düzeyi azalması ve transaminaz normalizasyonu açısından kombine tedavinin anlamlı olarak daha üstün olduğu ancak tedavi sonrası takip edildiklerinde bu farklılığın ortadan kalktığı görülmüştür. Bu çalışmada pegile interferon alfa-2b nin HBV genotiplerine göre farklı HBeAg serokonversiyon oranları olduğu gösterilmiştir. Buna göre genotip A ve B hastaları, genotip C ve D hastalarına göre pegile interferon alfa-2b den daha fazla yarar görmektedirler (23). Pegile interferon alfa-2b ve lamivudin kombinasyon tedavisi ile lamivudin monoterapisinin karşılaştırıldığı her iki grupta da 50 şer kişinin yer aldığı bir çalışmanın sonunda kombinasyon tedavisinin, HBV-DNA düzey azalması, biyokimyasal ve histolojik cevap açısından lamivudin monoterapisine göre daha üstün olduğu gösterilmiştir (24). Yapılan çalışmalarda pegile interferonların güvenilirliği de araştırılmış ve yan etki profili açısından standart interferonlardan farklı bir özelliklerinin olmadığı görülmüştür. Pegile interferonların en sık yan etkileri üst solonum sistemi semptomları, ateş, saç dökülmesi, abdominal rahatsızlık, yorgunluk, eklem ağrısı, iştah azalması ve lokal 23
eritamatöz reaksiyonlardır. % 10 kadar hastada kilo kaybı görülebilir. En sık görülen laboratuvar bulgusu transaminaz yükselmesidir (Şekil 5) (23-25). Şekil 5 : İnterferonların yan etkileri (Cohen & Powderly : İnfectious Diseases, 2. edisyondan alınmıştır). KRONİK HEPATİT B TEDAVİSİNDE NÜKLEOZİD ANALOGLARI Nükleozid analogları selüler DNA polimerazlara bağlanmak için doğal substratlar ile yarışan, bu yolla yeni yapılmakta olan DNA ya bağlanma sonucunda DNA zincir sentezini durdurup viral replikasyonu önleyen bileşiklerdir. Nükleozid analoglarının çoğu sitoplazmada bulunan enzimler tarafından nükleozid 5 -trifosfatlara fosforillenir ; ardından 24
viral polimerazlar ile etkileşir. Kronik hepatit B tedavisinde ilk denenen DNA polimeraz inhibitörleri adenin arabinosid ve aköz monofosfat türevidir. Her ikisi de sınırlı etkileri ve nöromüsküler toksisiteleri nedeniyle tedavide fazla kullanılmamışlardır. FDA tarafından kronik hepatit B tedavisinde onay verilen nükleozid analogları 1998 de lamivudin, 2002 de adefovir dipivoksil ve Mart 2005 te entekavir olmak üzere 3 tanedir. Bu ajanlar güvenilirlik ve oral kullanılabilme avantajına sahiptirler. Ancak tedavi kesildikten sonra hastaların az bir kısmında kalıcı cevap oluşur. Bu nedenle hastaların büyük bir bölümünde uzun süre kullanılmaktadırlar. Uzun süreli kullanım ise ilaca dirençli HBV mutantlarının sıklığında artışa ve ilacın etkinliğinin sınırlanmasına sebep olmaktadır (26, 27). 1. Lamivudin Lamivudin, 2-3 dideoksi 3 -tiyasitidin in negatif enantiomeri olan bir nükleozid analoğudur. Enzimatik yolla hücre içerisinde kendisine eklenen aktif trifosfat sayesinde DNA zinciri içerisine girmesi sonucunda, olgunlaşmamış zincir sonlanmasına sebep olması suretiyle HBV-DNA sentezini inhibe eder (8, 9, 11, 21, 28). Lamivudin Sitidin Şekil 6 : Lamivudin ve sitidinin kimyasal yapısı (Mandell, Bennett & Dolin: Principles and Practice of Infectious Diseases, 6. edisyondan alınmıştır). 25