ANTICORASE MB-96 (TMB) Kullanım manueli Dok.No.:W7.3IUB4 Yayım Tarihi:2008/11/18-3 Ürün Adı ANTICORASE MB-96 (TMB) Ürün Kodu 4CME3 Sınıflandırma Ek II, Liste A (98/79/EC) Kullanım İnsan serumu veya plazmasındaki hepatit b virüsü core antijenine Amacı (Anti-HBc IgM) karşı oluşan IgM antikorunun in vitro kalitatif tespiti içindir. Yasal Üretici GENERAL BIOLOGICALS CORPORATION Adres #6, INNOVATION FIRST ROAD, SCIENCE- PARK, HSIN CHU, TAIWAN, R.O.C. E mail Sales.group@gbc.com.tw Tel. 886-3-5779221 Faks 886-3-5779227 Avrupa Medical Technology Promedt Consulting GmbH Yetkili Temsilcisi Adres Altenhofstrasse 80, D-66386 St. Ingbert, Germany Tel. +49-6894-581020 Fax. +49-6894-581021 E mail info@mt-procons.com 0
No İçerik Sayfa 1) Kullanım Amacı 1 2) Özet ve Test Açıklamaları 1 3) Test Prensibi 1 4) Kit İçeriği 2 4.1) Kit ve İçeriğinin Saklama Koşulları 3 5) Kullanım Talimatı 4 5.1) Uyarılar 4 5.2) Örnek Toplama ve Hazırlama 4 5.3) Reaktifleri Saklama Koşulları 5 5.4) Plate Yıkama Prosedürü 5 5.5) Test Prosedürü 5 5.6) Sonuçların Değerlendirilmesi 6 5.7) Test Sonuçlarının Geçerliliği 7 5.8) Sonuç Yorumlama 7 5.9) Sorun Giderme 7 5.10) Sınırlamalar ve Engellemeler 7 5.11) Performans Özellikleri 7 5.11.1) Diagnostik Özgünlük 7 5.11.2) Analitik Özgünlük ve Doğrusallık 8 5.11.3) Diagnostik Duyarlılık 9 5.11.4) Kesinlik 10 5.11.5) İzlenebilirlik 10 5.11.6) Antikor Fazlalığı/Yüksek Doz Etkisi 10 5.12) Test Prosedürü İş Akış Şeması 10 6) Referanslar 11 1) Kullanım Amacı ANTICORASE MB-96 (TMB) insan serumu ve plazmasındaki (heparinli, sitratlı ya da EDTAlı) hepatit B virus core antijenine karşı oluşan IgM antikorlarının (Anti-HBc IgM) in-vitro kalitatif tespiti için bir Enzim İmmunotest Kiti 2) Özet ve Test Açıklamaları Hepatit B virusu (HBV); dış yüzeyinde (HBsAg) ve iç yüzeyinde (HBcAg) den oluşur. Akut HBV enfeksiyonunda, HBcAg IgM antikorları (Anti-HBc IgM) viral replikasyondan kısa bir süre sonra serum ve plazmada tespit edilebilir ve 7-17 hafta dolaşımda kalmaktadır. anti-hbc IgM antikorları belirlenmesi, enfeksiyonda indikatif markır olarak ve interferon tedavsi gören hastaların izlenmesi için HbsAg belirlenmesi ile birlikte kullanılır. Yüksek anti-hbc IgM titresi; akut HBV enfeksiyonunda ve kronik hepatit B ataklarında görülebilir. anti-hbc IgM seviyesi enfeksiyon boyunca azalacaktır. Ancak; bazı hastalarda düşük anti-hbc IgM seviyesi 1 yıldan uzun bir süre gözlenebilir ve bazen kronik taşıyıcılarda bulunabilir. *1-6 ANTICORASE MB-96 (TMB) serum ve plazma (heparinli, sitratlı ve EDTAlı) örneklerinde HBcAg IgM antikorlarını kalitatif olarak belirleyen hızlı bir testtir. Bu test,serum ve plazmadaki Anti-HBc IgM seviyesini belirlemek için solid fazda Anti- Human IgM kaplı mikrotiter plate ve likid fazda HBcAG ile peroxidase-konjugatlı Anti- HBc kullanan IgM capture prensibine dayanır. Absorbans değeri 0.9 x sinyal/cutoff oranı olan örnekler Anti-HBc IgM için NEGATİF olarak kabul edilir. Absorbans değeri 1.1 x sinyal/cutoff oranı olan örnekler Anti-HBc IgM için POZİTİF olarak kabul edilir. 1
Absorbans değeri yeniden test etme aralığında olan (Cutoff Değeri ± 10 %) örnekler yeniden test edilmelidir ve sonuçları yukarıdaki gibi değerlendirilmelidir. 3) Test Prensibi ANTICORASE MB-96 (TMB) Anti-HBc IgM prensibine dayanan solid fazlı bir ELISA kitidir. Mikrotiter pleytin solid fazı anti-human IgM kaplı polistren kuyucuklardır. Anti-human IgM kaplı kuyucuklara Anti-HBc IgM içeren örnekler konularak inkübe edildiğinde, örneğin içinde bulunan IgM antikorları kuyucuklardaki Anti-h IgM ler ile bağlanırlar. HBcAg içeren reaktif ve peroxidase-konjugatlı anti-hbc solusyonu eklendikten sonra inkübasyon sırasında kuyucuklarda (Anti-h IgM) (Anti-HBc IgM) (HBcAg) (Anti-HBc peroxidase) kompleksi oluşur. Bağlanmayan materyallerin uzaklaştırılması için pleytin yıkanmasından sonra, TMB substrat solusyonu eklenir ve inkübe edilir. Eğer örnekte Anti-HBc IgM var ise, yıkamadan sonra, kuyucuktaki peroxidase aktivitesi örnekteki Anti-HBc IgM içeriğini yansıtacaktır. Peroxidase-TMB reaksiyonnu sülfirik asit eklenmesi ile son bulur. Oluşan rengin optik densitesi, 450nm ile 620 ila 690nm dalga boyları arasında seçilen bir referans dalga boyunda fotometrede okunur *8. Test prensibi aşağıdaki figürde de gösterilmektedir: A. Örnek (insan IgM Anti-HBc içeren): 1. Plate (Anti-h IgM) + örnek (containing Anti-HBc IgM) - plate (Anti-h IgM) Anti-HBc IgM 2. Plate (Anti-h IgM) Anti-HBc IgM + HBcAg + Anti-HBc peroxidase plate (Anti-h IgM) Anti- HBc IgM HBcAg (Anti-HBc peroxidase) kompleksi 3. Bağlanmayan materyalleri uzaklaştırmak için yıkayınız. 4. Plate (Anti-h IgM) IgM Anti-HBc IgM HBcAg (Anti-HBc HRPO) kompleksi + TMB substrat solusyonu Açık maviden maviye 5. Açık maviden maviye + sülfirik asit açık sarıdan sarıya, 450nm de OD okunması (620-690 nm referans dalgaboyu ) *8. B. Örnek (IgM Anti-HBc içermeyen): 1. Plate (Anti-h IgM) + örnek (Anti-HBc IgM içermeyen) plate (Anti-h IgM) 2. Plate (Anti-h IgM) + HBcAg + Anti-HBc peroxidase plate (Anti-h IgM)------ kompleks oluşmaz. 3. Bağlanmayan materyalleri uzaklaştırmak için yıkayınız. 4. Plate (Anti-human IgM) + TMB substrat solusyonu (renksiz) renksiz 5. renksiz + sülfirik asit renksiz, 450nm de OD okunması (620-690 nm referans dalgaboyu ) *8. 4) Kit İçeriği Aşağıdaki tabloda 1-8 maddeleri 2-8 C de saklanmalıdır. Yıkama solusyonu D (20X) ve 2N H2SO4 2-30 C de saklanabilir. NO Materyal Kodu Ürünler Açıklama 96 test için (1) 3B040MPCM Anti-IgM Microtiter Plate Anti-human IgM kaplı Mikrotiter Plate. miktar 1 plate 2
(2) 3B071CONCME3 Anti-HBc Peroxidase Solusyonu (3) 3B090P3HCM3 Anti-HBc IgM Pozitif Kontrol 3 Anti-HBc (human) peroxidase (horseradish) konjugat, bufferda protein stabilizatörü ile seyreltilmiş.koruyucular: 0.003% Gentamycin ve 0.01% Thimerosal. Human Anti-HBc IgM bufferda protein stabilizatörü ile seyreltilmiş. Koruyucular: 0.003% Gentamycin ve 0.01% Thimerosal. (4) 3B115SPDLT3 Örnek Diluent bufferda protein stabilizatörü ile seyreltilmiş. Koruyucular: 0.003%Gentamycin ve 0.01% Thimerosal. (5) 3B118CAGRT3 HBcAg Reaktif HBcAg bufferda protein stabilizatörü ile seyreltilmiş. Koruyucular: 0.003% Gentamycin ve 0.01% Thimerosal. (6) 3B110N4HCM3 Anti-HBc IgM Negatif Kontrol (7) 3B135TMB-A TMB Substrat Solusyonu A Normal (Anti-HBc IgM negatif) insan serumu, protein stabilizatörü içeren. Koruyucular: 0.003% Gentamycin ve 0.01% Thimerosal. 0.6 mg/ml of 3,3',5,5'- tetramethylbenzidine (TMB), organik tabanlı 1şişe, 8ml 1 şişe, 2.5 ml 2 şişe 36 ml 1 şişe, 8 ml 1 şişe, 2.5 ml 1 şişe, 12 ml (8) 3B140TMB-B TMB Substrat Solusyonu B Sitrik asit buffer, 0.03% H2O2 içeren. 1 şişe, 12 ml (9) 3B112PBS3 Konsantre Yıkama Solusyonu D (20X) Tween-20 ile konsantre Fosfat buffer. 1 şişe 58 ml (10) 3B155SACID2N 2N H2SO4 2N H2SO4 (Sulfirik asit) 1 şişe 12 ml AKSESUARLAR: (ihtiyaç duyulduğunda) NO Materyal Kodu Ürünler (11) 2P951001 Yapışkan Slipler (12) 2P505001 Emici tamponlar (13) 2P403001 Siyah kapak KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER NO Ürünler (1) 5µl, 50µl ve 100 µl mikropipetler ve uçlar (2) +37 C ayarlanabilen su banyosu ya da inkübatör (3) Örnek dilusyonu için tüpler. (4) Plate yıkama ekipmanları
(5) Temiz su: distile ya da deionize (6) ELISA Mikro Plate Okuyucu: İkili dalgaboyu 450nm ile referans dalgaboyu olarak 620-690nm, bant genişliği 10nm *8. (7) Opsiyonel olarak tam otomatik EIA mikroplate analizör. Kullanıcı otomatik EIA mikro-plate analizörün kit ile validasyonlarını yapmalıdır. 4.1) Kit ve İçeriğinin Saklama Koşulları Kit/İçerik Saklama Sıcaklığı Durum Saklanabilirlik ANTICORASE MB- +2~+8 C Orjinal 15 ay 96 (TMB) KIT Anti-HBc IgM +2~+8 C Orjinal 15 ay Pozitif Kontrol Anti-HBc IgM Negatif +2~+8 C Orjinal 15 ay Kontrol HBcAg Reaktif +2~+8 C Orjinal 15 ay Örnek Diluent +2~+8 C Orjinal 16 ay Anti-human IgM Plate +2~+8 C Orjinal 15 ay 2 ay Anti-HBc Peroxidase +2~+8 C Orjinal 15 ay Konjugat Solusyonu Konsantre Yıkama Oda sıcaklığı Orjinal 24 ay Solusyonu D (20X) 20X Seyreltilmiş Oda sıcaklığı. Seyreltilmiş 2 gün Yıkama Solusyonu +2~+8 C Seyreltilmiş 1 hafta TMB substrat +2~+8 C Orjinal 24 ay Solusyonu A TMB substrat +2~+8 C Orjinal 24 ay Solusyonu B 2N Sülfirik Asit Oda sıcaklığı Orjinal 24 ay 5) Kullanım Talimatı 5.1) Uyarılar: 5.1.1) Bu kit sadece profesyonel kullanım içindir. 5.1.2) Bu kit sadece in-vitro teşhis içindir. 5.1.3) Kullanmadan önce bütün reaktifleri ve numuneleri oda ısısına çıkarın (20-30ºC) ve dikkatlice karıştırın. 5.1.4) Reaktifleri son kullanma tarihinden sonra kullanmayınız. 5.1.5) Farklı lottaki reaktifleri karıştırmayınız. 5.1.6) Ağızla pipetleme yapmayınız. 4
5.1.7) Örneklerin veya reaktiflerin kullanıldığı bölgede yemek yemeyiniz ya da sigara içmeyiniz. 5.1.8) Tüm kit içeriğinin ve örneklerin potansiyel sağlık riski taşıdığını göz önünde bulundurunuz. Kullanımları ve atılımları laboratuvarınızın güvenlik prensiplerine gore yapılmalıdır. Bazı güvenli ürünler koruyucu eldiven giyilmesini ve aerosol kullanımından kaçınılmasını gerektirebilir. 5.1.9) Enfeksiyonlu numuneler ve asit ihtiva etmeyen maddeler döküldüğünde %5 sodyum hipoklorid ile temizlenmelidir ya da sizin daha önceden biyo-zararlı ürünler için uygulamakta olduğunuz uygulamalar ile temizlenmelidir. 5.1.10) Bütün atık materyalleri atılmadan önce uygun olarak dezenfekte edilmelidir. Hem sıvı hem de katı faz en az 1 saat 121ºC de otoklavlanmalıdır. Katı faz aynı zamanda yakılabilir. Asitsiz likit atık %1 son konsantrasyona karşı seyreltilmiş sodium hipoklorid ile kullanılabilir. Asit içeren likit atıklar yukarıda belirtilen şekilde kullanılmadan önce nötralize edilmeli ve etkili dezenfeksiyon elde etmek için 30 dakika beklenmelidir. 5.1.11) 2N Sülfürik Asit; deri, gözler, solunum yolu ve mukoz membranlar için tahriş edicidir. 2N Sülfirik asitin deri ve mukoz membranlar ile temasından kaçınınız. Temas etmesi halinde bol miktarda su ile yıkayınız. İnhalasyonu olması halinde temiz hava alınız ve ağrı hissetmeniz durumunda mutlaka doktora başvurunuz. 5.1.12) TMB substrat solusyonu A yanıcı organik çözücüler içermektedir. TMB substrat solusyonu A deri ve mukoz membranlar için tahriş dimetil sülfoksit içerir. 5.1.13) Tüm insan kaynaklı materyallerin Anti-HCV ve Anti-HIV aktivitelerinin olmadığı test edilmesine ve 1 saat içinde +56 C de inaktive edilmesine rağmen, reaktifler potansiyel enfeksiyon ajanı olarak değerlendirilmelidir. *7 5.2) Örnek Toplama ve Hazırlama 5.2.1) Kan alımından önce hastalarda özel bir hazırlık yapılması gerekmemektedir. Kan, geçerli olan medikal yöntemler ile alınmalıdır. 5.2.2) Bu kit ile serum ve plazma kullanılabilir. Tam kan örnekleri hemolizi önelemek için hemen ayrılmalıdır. Pıhtılar (fibrin ağı, eritrositler, ) kullanımdan önce uzaklaştırılmalıdır. 5.2.3) Örnekler kullanılmadan önce 2-8 Cde saklanmalı ve bozulmaları önlemek için ısı inaktivasyonundan kaçınılmalıdır. Uzun süreli saklamalar için -20 C nin altında dondurulmalıdır. Kendi kendine buz çözücü özelliği olan soğutucular kullanılması önerilmez. 5.2.4) Dondurulmuş örnekler çalışılmadan önce tamamen çözdürülmeli ve homojen olarak karıştırılmalıdır. 5.2.5) Arka arkaya dondurup çözdürmekten kaçınınız. 5.2.6) UYARI 1. Örnekler peroksidaz aktivitesini önleyici bir AZIDE içeriği ihtiva etmemelidir. 5
2. Tam olarak koagüle olmamış serumlar ve mikrobiyal içeriği olan örnekler kullanılmamalıdır. 5.3) Reaktiflerin Saklama Koşulları 5.3.1) Kit 2-8 C de saklanmalıdır. Dondurmayınız. 5.3.2) Plate stripleri orjinal aliminyum folyosu açıldıkan sonra içinde kullanılmalıdır. Kullanılmayan stripler aliminyum folyo içinde saklanmalı ve ağzı sıkıca bantlanmalıdır. 5.3.3) Kullanımdan hemen sonra reaktifleri 2-8 C de saklayınız. 5.3.4) Yıkama solusyonu D (20X) konsantre, kristalleşmeyi önlemek için oda ısısında saklanmalıdır. Eğer kullanımdan önce kristal çökelme yaparsa kristallenme çözülünceye kadar 37 C su banyosu içinde bekletilmelidir. 5.4) Plate Yıkama Prosedürü 5.4.1) Yıkama Solusyonu Hazırlanması: Yıkama Solusyonu D (20X) Konsantreyi distile veya deiyonize su ile 1:20 oranında seyreltiniz. Musluk suyu kullanmayınız. 5.4.2) Plate Yıkanması: (a) Aspire/dağıtım fonksiyonlu cihazlar ile plate yıkanması: Herbir siklusta herbir kuyucuk en az 0.5ml yıkama solusyonu ile 6 kez yıkanmalıdır. ya da (b) Aspire/dağıtım fonksiyonlu cihazlar kullanılmadan plate yıkanması: Herbir siklusta herbir kuyucuk en az 0.35ml yıkama solusyonu ile 8 kez yıkanmalıdır. 5.4.3) Pleyti tersyüz ederek sıvılarını akıtınız ve absorbent kağıt üzerinde kurutunuz. Çok fazla atık yıkama solusyonu kalması test sonuçlarınızı olumsuz etkileyecektir. UYARI Uygun olmayan yıkamalar hatalı sonuçlara neden olacaktır. 5.5) Test Prosedürü 5.5.1) Kullanmadan önce tüm reaktifleri ve örnekleri oda ısısına (20-30 C) getiriniz. Su banyosu ya da inkübatörü +37±1 C ye ayarlayın. 5.5.2) Her bir örnek 1+100 dilusyon yapınız: Kontroller hariç herbir örnek dilusyonu yapabilmek için bir tüp hazırlayınız. Herbir tüpe 500 μl örnek diluent ve 5 μl örnek ekleyiniz ve çalkalayarak karıştırınız. NOT: a) Kontrolleri seyreltmeyiniz. b) Çapraz kontaminasyonu önlemek için herbir örneği yüklerken yeni ve temiz pipet ucu kullanınız. 5.5.3) Bir kuyucuk blank için ayırın. Üç tane kuyucuğa 100 μl Negatif Kontrol, iki tane kuyucuğa 100 μl Pozitif Kontrol, geri kalan kuyucuklara 100 μl Örnek Diluent ekleyiniz. 5.5.4) Sadece örnek diluent içeren kuyucuklara 5 μl seyreltilmiş örnek ekleyiniz. 5.5.5) Pleyti yavaşça sallayınız. 6
5.5.6) Yapışkan slipten arka kısmını ayırın ve sıkıca reaksiyon pleytin üzerini kaplayacak şekilde bastırınız. 5.5.7) Reaksiyon pleytini +37±1 C deki su banyosunda ya da inkübatörde 1 saat inkübe ediniz. 5.5.8) İnkübasyon periyodunun sonunda yapışkan slipi çıkarıp atın ve 5.4)de belirtilen pleyt yıkama prosedürüne göre pleyti yıkayınız. 5.5.9) Blank kuyucuğu hariç tüm kuyucuklara önce 50 µl Anti-HBc-Peroxidase solusyonu, sonra 50 µl HBcAg reaktif ekleyiniz. Yeni yapışkan slip ile kapatınız. 5.5.10) Reaksiyon pleytini +37±1 C deki su banyosunda ya da inkübatörde 1 saat inkübe ediniz. 5.5.11) İnkübasyon periyodunun sonunda yapışkan slipi çıkarıp atın ve 5.4)de belirtilen pleyt yıkama prosedürüne göre pleyti yıkayınız. 5.5.12) Renk gelişimi için aşağıdaki iki yöntemden birini seçiniz: A. Kullanmadan önce temiz bir kapta TMB Substrat Solusyonu A ve B yi eşit miktarlarda karıştırınız. İki blank kuyucuğu da dahil olmak üzere herbir kuyucuğa 100 l karıştırdığınız mix solusyondan ekleyiniz. A. B. Blank kuyucuğu da dahil olmak üzere herbir kuyucuğa önce 50 l TMB Substrat Solusyonu A, sonra 50 l TMB Substrat Solusyonu B ekleyiniz. Dikkatlice pleyti çalkalayınız. NOT: TMB Substrat Solusyon A renksiz veya açık mavi olmalıdır aksi takdirde dökülmelidir. TMB Substrat Solusyonu A ve B nin karışımı hazırlandıktan sonraki 30 dakika içinde uygulanmalıdır. Miks solusyon yoğun ışıktan uzak tutulmalıdır. 5.5.13) Pleytin üzerini siyah kapak ile kapatıp oda sısında 30 dakika bekletiniz. 5.5.14) Reaksiyonu durdurmak için blank de dahil herbir kuyucuğa 100 µl 2N H2SO4 eklenmelidir. 5.5.15) Hassas bir spektrofotometre ile 30 dakika içinde kontrollerin ve test örneklerinin 450/620-690nm de absorbanslarını ölçünüz *1. İlk blank kuyucuğu için blank spektrometre uygulayınız. NOT: Blankin rengi renksizden açık sarıya dönmelidir; aksi takdirde test sonuçları geçersizdir. 5.6) Sonuçların Değerlendirilmesi 1) NCx Hesaplanması (Negatif Kontrol Absorbansı). Örnek: Örnek No. Absorbans 1 0.068 2 0.072 3 0.070 NCx = (0.068+0.072 + 0.070) / 3 = 0.070 NOT: NCx 0.1 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir. 5.6.2) PCx Hesaplanması (Pozitif Kontrol Absorbansı) Örnek: Örnek No. Absorbans 1 1.612 7
2 1.613 PCx = (1.612 + 1.613) /2 = 1.613 NOT: PCx 0.4 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir. 5.6.3) P-N Değeri Hesaplanması P-N = PCx - NCx Örnek: P - N = 1.613 0.070 = 1.543 NOT: P - N Değeri 0.3 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir. 5.6.4) Kesim Noktası (Cutoff) Değeri Hesaplanması Cutoff Değeri = NCx + (PCx)/4 Örnek: Cutoff Değeri = 0.070 + (1.613)/4 = 0.473 5.6.5) Yeniden Test Aralığı Hesaplanması Yeniden Test = Cutoff Değeri ±10% Örnek: Cutoff Değeri = 0.473 Yeniden Test Aralığı = (0.473-0.047) dan (0.473 +0.047) = 0.426-0.520 5.7) Test Sonuçlarının Geçerliliği 5.7.1) NCx 0.1 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir. 5.7.2) PCx 0.4 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir. 5.7.3) P-N Değeri 0.3 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir. 5.8) Sonuç Yorumlama Sinyal/cut-off oranı 0.9 ise örnek Anti-HBc IgM için reaktif değildir sonucuna varılır. Sinyal/cut-off oranı 1.1 ise örnek Anti-HBc IgM için reaktiftir sonucuna varılır. Eğer Sinyal/cut-off oranı yeniden test aralığı (0.9-1.1) içinde ise test tekrar edilmelidir ve yukarıdaki gibi değerlendirilmelidir. Eğer her iki sonuçta reaktif olmayan ise test sonucu reaktif olmayan dır; ya da her iki sonuç reaktif ise test sonucu reaktif dir. Diğer kombinasyonlarda olan test sonuçları bilinmeyen sonuç olarak verilmelidir. Bilinmeyen örnekler için hasta takip testleri ve diğer hepatit B serolojik markırları ile testler yapılmalıdır. NOT: Sonuç Değerlendirmesi: Anti-HBc IgM test sonuçları mutlaka diğer Hepatit B serolojik ve NAT markırları ile test edilerek doğrulanmalıdır. 5.9) Sorun Giderme Eğer sonuç alınamazsa, aşağıdaki sorun giderme maddelerini kontrol ediniz: 5.9.1) Yanlış yıkama prosedürü uygulanması. 5.9.2) Pozitif örnekler ile kontaminasyon. 5.9.3) Örnek, konjugat ya da substrattan yanlış miktarlarda uygulama. 5.9.4) Kuyucuk kenarının konjugat ile kontamine olması. 5.9.5) Örneğin; sediment içeren örnek, hemolize olmuş serum ya da plazma gibi yanlış örneklerin kullanılması ya da kullanımdan önce örneklerin iyi karıştırılmaması. 5.9.6) Yanlış inkübasyon zamanı ya da sıcaklığı uygulanması. 8
5.9.7) Aspiratör/dağıtıcı cihazların başlıklarının ya da iğnelerinin tıkanması. 5.9.8) Yetersiz aspirasyon. 5.10) Sınırlamalar ve Engellemeler 5.10.1) Bu reaktif kiti sadece insan serumu ve plazması için kullanılır. 5.10.2) Bu reaktif kiti kadavra örnekleri için kullanıma uygun değildir. 5.10.3) Teknisyenden ya da bozuk cihazlardan kaynaklanan büyük teknik hatalardan ötürü her enzim immunotest kiti ile tekrar edilemez yanlış pozitif sonuçlar alınabilir. 5.10.4) Anti-HBc IgM test sonuçları akut ve akut olmayan HBV enfeksiyonunu ayrımlamak için kullanıldığında, hastanın klinik geçmişi ve diğer markırlar ile alınan sonuçlar da göz önünde bulundurulmalıdır. 5.10.5) Negatif Anti-HBc IgM sonuçları daha önceden HBV enfeksiyonu geçirdiğine dair bir kanıt olarak sunulamaz. 5.10.6) Çeşitli Karışımlar: Hiperlipemi, hemoliz, hiperbiliburinemi ve monoclonal immunglobulin içeren örnekler, yüksek seviyede otoimmun antikor (rheumatoid factor-rf, antinuclear antibodies-ana, or anti-mitochondrial antibodies-ana) içeren örnekler test sonuçlarını etkilememektedir. 5.10.7)Antikoagülant olarak heparin, EDTA ve sodium sitrat testin duyarlılığını etkilememektedir. 5.11) Performans Özellikleri 5.11.1) Diagnostik Özgünlük Örneklerin Özellikleri Klinik/Hastaneye yatırılan hastalar (HBV negatif klinik olarak ) Kan donorleri (HBV/Anti-HBc negatif donorler ) Çeşitli Karışımlar Örnek Sayısı Referans kiti Negatif Sonuçlar ANTICORAS E MB Testi 200 200 200 200 198 200 50 50 50 içeren örnekler Toplam 450 448 450 Diagnostik Özgünlük ------- 99.5% 100% 5.11.1.1) Çeşitli Karışımlar Potansiyel karışımlar ANTICORASE B-96 (TMB testi ile incelenmiştir. Çeşitli karışımları içeren en az iki serum örneği ile hiç karışım içermeyen Anti-HBc seviyesi yüksek serum örnekleri 10 + 0; 7 + 3; 5 + 5; 3 + 7; 0 + 10 oranlarında karşılaştırılmıştır. Karışımı olan örnekler olmayanlar kadar iyi sonuçlar vermiştir. Çalışmada kullanılan örnekler: lipemik (turbid) örnekler (hiperlipidemi) yüksek santrifüjden önce ve sonra hemolitik örnekler ya da hemolizat ikterik örnekler (=hiperbilirubinemi) monoklonal immunoglobulin içeren örnekler (hiperimmunoglobulinemi) yüksek otoimmun antikor seviyesine sahip örnekler (rheumatoid factor - RF, antinuclear antibodies ANA, or antimitochondrial antibodies-ama) 9
5.11.2) Analitik Duyarlılık ve Doğrusallık: 5.11.2.1) Seyreltilmiş Anti-HBc IgM Referans Materyallerini kullanarak limit belirlenmesi: ANTICORASE MB-96 (TMB) kiti analitik duyarlılığının belirlenmesinde Anti-HBc IgM (100 PEI U/ml) için bir seri dilusyondan geçirilmiş Paul Ehrlich Institute (PEI) (Langen, Germany) Standart Materyali kullanılmıştır. Analitik duyarlılık belirlenebilen en düşük konsantrasyonda tanımlanmıştır. Yapılan çalışmalar sonucunda, ANTICORASE MB-96 (TMB) kitinin referans kitlerden daha duyarlı olduğu saptanmıştır. Lot #B44333PT Analitik Duyarlılığı Lot #B44334PT Analitik Duyarlılığı S/C Konsantrasyonu S/C Konsantrasyonu PEI U/ml PEI U/ml 5.11.2.2) Kan Örnekleri Kullanılarak Doğrusallık Ölçüm aralığı boyunca seyreltilmiş ve dar dilusyon aralığındaki cutoff seviyesine sahip yüksek Anti-HBc-IgM içeren pozitif serum örnekleri kullanılarak ANTICORASE MB-96 (TMB) kiti doğrusallığı ölçülmüştür. Linear Range: OD from 1.714 to 0.290 Linearity (semilog chart): R = 0.983 10
Linear Range: OD from 0.95 to 0.118 Linearity (semilog chart): R = 0.980 5.11.3) Diagnostik Duyarlılık HBV enfeksiyonlu hastalarda diagnostik duyarlılık değerlendirmesi için Pozitif örnek/örnek kullanılmıştır: ANTICORASE MB Referans Test pozitif 199 188 negatif 1 13 bilinmeyen 7 6 toplam 207 207 çözülmüş diagnostic duyarlılık 96.1% 90.8% 11 5.11.3.1) HBV enfeksiyonlu kişiler 207 Anti-HBc-IgM pozitif örnek GB ANTICORASE MB-96 (TMB) kiti ile test edilmiştir, 199 pozitif, 1 negatif ve 7 bilinmeyen sonuç bulunmuştur. GB ANTICORASE MB-96 (TMB) kiti için çözülmüş diagnostic duyarlılık 96.1 % (199/207) bulunurken; CE markalı referans kitlerde 90.8 % (188/207), 188 pozitif, 13 negatif, 6 bilinmeyen olarak bulunmuştur. Örnekler ANTICORASE MB Referans Testi pozitif 199 188 negatif 1 13 bilinmeyen 7 6 toplam 207 207 çözülmüş diagnostic duyarlılık 96.1% 90.8% 5.11.3.2) Ticari serokonversiyon paneli Sekiz ticari serokonversiyon paneli akut hepatit B hastalarından aylık ya da haftalık periyotlarla örnek alınmasının takibini yapmaktadırlar. Paneller Boston Biomedica Inc., BBI, West Bridgewater, MA USA (PHM 933, PHM 934 ve PHM 935A); Pyramid-Profile Diagnostics, Sherman Oaks, CA, USA (RP 009, RP 016 ve RP 017) ve NABI, Boca Roton, FL, USA (SB 411 ve SB 413) dan oluşmaktadır.. Tüm paneller HBV spesifik serolojik markırları (anti-hbs, anti-hbc IgM, anti-hbc-total, and HBsAg) için tanımlanmıştır. Serokonversiyon panellerinin GB ANTICORASE B-96 (TMB) ile test edilmesi sonucu NABI panel RP-009 de bir tane erken kanamalı Anti-HBc total tespit edilmesine karşı referans testlerde BBI Panel 935A da iki tane, NABI panel RP-017 de bir tane erken kanamalı Anti-HBc total tespit edilmiştir. Özetle; referans testler ile GBC ANTICORASE B-96 (TMB) testi arasında önemli bir fark bulunamamıştır. 5.11.4) Kesinlik 5.11.4.1) Çalışma içi tekrar edebilirlik Çalışma içi kesinlik belirlenmesi için, test kiti ile sağlanan pozitif kontrol ve farklı Anti-HBc IgM titresine sahip iki hasta serum örneği 3 gün içinde 20 replikasyonda tek bir çalışma ile test edilmiştir. Pozitif kontrol ve hasta örneklerinin anlamları ve varyasyon katsayıları ölçülmüştür. Test edilmiş örnek örnek boyutu kesinlik Pozitif Kontrol N = 20 CV 17.31% Hasta Serumu #1 N = 20 CV 20.11% Hasta Serumu #2 N = 20 CV 13.53%
5.11.4.2) Çalışmalar arası tekrar edilebilirlik Test edilmiş örnek örnek boyutu kesinlik Pozitif Kontrol N = 60 CV 12.83% Hasta Serumu #1 N = 60 CV 12.00% Hasta Serumu #2 N = 60 CV 8.24% 5.11.5) İzelenebilirlik ANTICORASE MB-96 (TMB) Pozitif Kontrol konsantrasyonu = 640 PEI U/ml ±30% 5.11.6) Antikor Fazlalığı/Yüksek Doz Etkisi Antijen fazlalığı/yüksek doz etkisini ölçmek için ANTICORASE MB-96 (TMB) kiti ile bir seri seyreltide oldukça yüksek Anti-HBc IgM titresine sahip (OD 1.5) iki serum örneği test edilmiştir. Yapılan testler sonucunda Antijen fazlalığı/yüksek doz etkisi olmadığı görülmüştür. 5.12) Test Prosedürü İş Akış Şeması 5 μl herbir örnekten, 500 μl Örnek Diluent ile seyreltiniz. Kontrolleri seyreltmeyiniz. Blank için bir kuyucuk bırakınız. Uygun kuyucuklara100 μl kontrollerden (3x NC, 2x PC) ve100 μl Örnek Diluent ekleyiniz. Örnek diuent içeren kuyucuklara 5μl seyreltilmiş örnek ekleyiniz. Yapışkan slip ile kaplayınız. Pleyti +37 ±1 C de 1 saat inkübe ediniz. Pleyti yıkayınız. Blank hariç tüm kuyucuklara 50 μl HBcAg Reaktif ve 50 μl Anti-HBc Peroxidase Solusyonu ekleyiniz. Pleyti +37 ±1 C de 1 saat inkübe ediniz Pleyti yıkayınız. (Renk gelişimi için iki enzimatik reaksiyondan birini seçiniz) TMB Substrat solusyonu A ve B den eşit miktarlarda karıştırınız. Bu karışımdan herbir kuyucuğa 100 µl ekleyiniz. Herbir kuyucuğa önce 50 µl TMB substrat solusyonu A, sonra 50 µl TMB substrat solusyonu B ekleyiniz. Pleyti dikkatlice sallayınız. Pleyti oda sıcaklığında 30 dakika inkübe 12
ediniz. Herbir kuyucuğa 100 µl 2N H2SO4 ekleyiniz. 450 nm de ve referasn dalga boyu olarak 620-690 nmde absorbanslarını ölçün. *8 6) Referanslar: 1. Hoofnagle JH, Gerety RJ, Barker LF, Antibody to hepatitis B virus core in man. Lancet. 1973: 2(7834): 869-873. 2. Barker LF, Almeida JD, Hoofnagle JH, et al. Hepatitis B core antigen: immunology and electron microscopy. J Virol. 1974 Dec;14:1552-1558. 3. Hoofnagle. JH., Gerety, RJ.. Ni, LY.. Barker, LF. Antibody 10 Hepatitis B core antigen: A sensitive lndicator of hepatitis B virus replication. New Engl J Med. 1974;290:1336-1340. 4. Niermeijer, P., Gips, C. H., Huizenga, J. R. et al. IgM Anti-HBc as a marker of persistent and IgG anti-hbc as a marker of past hepatitis B infection. A longitudinal study over 5 years. Acta Hepato-Gastroenterol 1978;25: 360 364. 5. Kryger P: Significance of anti-hbc IgM in the differential diagnosis of viral hepatitis. J Virol Meth. 1985; 10: 283-289. 6. Hadziyannis SJ, Hadziyannis AS, Dourakis S, et al. Clinical significance of quantitative anti-hbc IgM assay in acute and chronic HBV Infection. Hepatogastroenterology 1993;40:588 592. 7. Shikata T, Karasawa T, Abe K, et al. Incomplete inactivation of hepatitis B virus after heat treatment at +60 C for 10 hours, J. Infect. Dis. 1978;138:242-244. Spektrometre in referans dalga boyu 620nm ile 690nm olmalıdır. Böylece, kullanıcı kullanım öncesi bu kit ile spektrometre ile valide edilmelidir. Symbols Key / Symbolschlussel / Explication des Symboles / Interpretazione simboli /Clave dos Simbolos / İşaret Açıklamaları Manufacturer / Hersteller / Fabricante / Fabbricante / Fabricant / Fabricante / Üretici In Vitro Diagnostic Medical Device / In-Vitro-Diagnostikum / Producto sanitario para diagnóstico in vitro / Dispositivo medico-diagnostico in vitro / Dispositif médical de diagnostic in vitro / Dispositivo médico para diagnóstico in vitro / İn-vitro Diagnostik Tıbbi Bakım Batch code / Chargenbezeichnung / Código de lote / Codice del lotto / Code du lot / Código do lote / Parti Kodu Use By / Verwendbar bis / Fecha de caducidad / Utilizzare entro / Utiliser jusque / Prazo de validade / İle kullanım Temperature limitation / Temperaturbegrenzung / Límite de temperatura / Limiti di temperatura /Limites de température / Limites de temperatura / Sıcaklık Limitleri CE Mark / CE-Zeichen / Marquage CE / Marchio CE / CE Marca / Marca CE / CE İşareti Catalogue number / Bestellnummer / Número de catálogo / Numero di catalogo / Référence du catalogue / Referência de catálogo / Katalog Numarası Consult Instructions for Use- / Gebrauchsanweisung beachten / Consulte las instrucciones de uso / Consultare le istruzioni per l'uso / Consulter les instructions d'utilisation / Consulte as instruções de utilização / Kullanım için Danışma Bilgileri 13