TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BALIK VE BALIK ÜRÜNLERİNDE HİSTAMİN DÜZEYLERİNİN TESPİTİ İÇİN O-FİTALDİALDEHİT VE BENZOİL KLORÜR TÜREVLENDİRMESİ KULLANILAN YÜKSEK PERFORMANS SIVI KROMATOGRAFİSİ METOTLARININ KARŞILAŞTIRILMASI Deniz DEMİRKIRAN BİYOKİMYA ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Ulvi Reha FİDANCI 2013- ANKARA

iii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay İçindekiler Önsöz Simgeler ve Kısaltmalar Şekiller Çizelgeler ii iii vii ix xii xiii 1.GİRİŞ 1 1.1. Su Ürünlerinde Bozulma 2 1.2. Biyojen Aminler 3 1.3. Biyojen Aminlerin Fonksiyonları ve Önemi 5 1.4. Biyojen Aminlerin Sınıflandırılması 6 1.5. Biyojen Aminlerin Oluşum Mekanizması 7 1.6. Gıdalarda Biyojen Amin Oluşumunu Etkileyen Faktörler 9 1.6.1. ph nın Etkisi 12 1.6.2. Sıcaklığın Etkisi 13 1.6.3. Tuz Yoğunluğunun Etkisi 13 1.7. Biyojen Aminlerin Detoksifikasyonu 14 1.8. Biyojen Aminlerin Toksikolojik Özellikleri 15 1.9. Biyojen Aminler İçin İzin Verilebilir Limitler 17

iv 1.10. Biyojen Aminlerin Analiz Yöntemleri 19 1.11. Histamin 22 1.12. Validasyon 28 1.12.1. Validasyon Parametreleri 30 1.12.1.1. Spesifiklik (Specifity), Hassasiyet ve Seçicilik (Sensitivity / Selectivity)30 1.12.1.2. Ölçüm Aralığı (Range) ve Linearite (Linearity) 31 1.12.1.3. Tespit Limiti (LOD) ve Ölçüm Limiti (LOQ) 33 1.12.1.4. Doğruluk (Accuracy) 34 1.12.1.4.1. Gerçeklik (Trueness) 34 1.12.1.4.2. Kesinlik (Presicion) 36 1.12.1.4.2.1. Tekrar edilebilirlik (Repeatability) 37 1.12.1.4.2.2. Tekrar üretilebilirlik (Reproducibility) 41 1.12.1.5. Geri Kazanım (Recovery) 46 2.GEREÇ VE YÖNTEM 47 2.1. Gereç 47 2.1.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler 47 2.1.1.1.O-fitaldialdehit Türevlendirmesi Kullanılan HPLC Yönteminde 48 Kullanılan Kimyasal Maddeler 2.1.1.2.Benzoil Klorür Türevlendirmesi Kullanılan HPLC Yönteminde 48 Kullanılan Kimyasal Maddeler 2.1.2. Kullanılan Sarf Malzemeler 49 2.1.3. Kullanılan Cihazlar 50

v 2.2. Yöntem 50 2.2.1. Benzoil Klorür Türevlendirmesi Kullanılan HPLC Yöntemi 50 2.2.1.1.HPLC Şartları 51 2.2.1.2.HPLC Gradienti 51 2.2.1.3.Mobil Fazların Hazırlanması 51 2.2.1.4.Standart Çalışma Çözeltisinin Hazırlanması 52 2.2.1.5.Numune Hazırlama 53 2.2.2. O-Fitaldialdehit (OPA) Türevlendirmesi Kullanılan HPLC Yöntemi 53 2.2.2.1. HPLC Şartları 54 2.2.2.2. HPLC Gradienti 54 2.2.2.3. Mobil Fazların Hazırlanması 54 2.2.2.4. Standart Çalışma Çözeltisinin Hazırlanması 55 2.2.2.5. Numune Hazırlama 56 2.2.3. Analiz Sonuçlarının Hesaplanması 56 2.2.4. İstatistik Analizler 58 3.BULGULAR 59 3.1. Histaminin Kromatografik Profili 59 3.1.1. O-fitaldialdehit Türevlendirmesi Kullanılan HPLC yöntemi 59 (FLD yöntemi) ile Tespit Edilen Histaminin Kromatografik Profili, Ölçüm Aralığı ve Linearite Sonuçları

vi 3.1.2. Benzoil Klorür Türevlendirmesi Kullanılan HPLC yöntemi 63 (DAD yöntemi) ile Tespit Edilen Histaminin Kromatografik Profili, Ölçüm Aralığıve Linearite Sonuçları 3.2. Tespit Limiti ve Ölçüm Limiti Sonuçları 67 3.3. Geri Kazanım Sonuçları 71 3.4. Doğruluk Sonuçları 72 3.5. Tekrar edilebilirlik ve Tekrar üretilebilirlik Sonuçları 76 4.TARTIŞMA 84 5.SONUÇ VE ÖNERİLER 89 ÖZET 91 SUMMARY 92 KAYNAKLAR 93 EKLER 109 ÖZGEÇMİŞ 113

vii ÖNSÖZ Üç tarafı denizlerle çevrili olan ülkemizin, deniz ve iç sularında su ürünleri avcılığı ve yetiştiriciliği potansiyeli oldukça yüksek olmakla birlikte, su ürünleri (avlanan deniz balıkları, diğer deniz ürünleri ve içsu ürünleri ile kültür balıkçılığı) üretimi yıllık yaklaşık olarak 550.000-650.000 ton civarındadır. Su ürünleri sağlıklı büyüme ve beslenme için gerekli olan protein ve esansiyel amino asitlerin en önemli kaynağıdır. Bu durum, su ürünlerini oldukça değerli bir gıda maddesi haline getirmektedir. Protein bakımından önemli bir besin kaynağı olan balık ve balık ürünleri, avlanma aşamasından tüketim noktasına kadar uygun koşullarda tutulmadığı takdirde insan sağlığı için tehlikeli bir gıda haline gelmektedir. Başta histamin olmak üzere putresin, kadaverin, tiramin, triptamin, β-feniletilamin, spermin, spermidin ve agmatin gibi biyojen aminler, aminoasitlerin mikrobiyolojik dekarboksilasyonu sonucu oluşmaktadır. Gıda güvenliği bakımından uygun olmayan koşullarda, geleneksel yöntemlerle işlenen balık ürünlerinin insan sağlığı bakımından içerdiği risklerin başında histamin gelmektedir. Balık ve su ürünlerinde tespit edilen histamin düzeylerinin kontrolüne ilişkin olarak oluşturulmuş uluslararası limitler nedeniyle bu tür ürünlerin pazarlanması kısıtlanmaktadır. Bu nedenle balık ve balık ürünleri başta olmak üzere su ürünlerindeki histamin düzeylerinin tespiti, ürün kalitesini etkilediğinden dolayı insan sağlığı açısından büyük önem taşımaktadır. Su ürünlerinin tüketiciye sağlıklı bir şekilde ulaştırılması ve gıda güvenliğinin tüketici lehine geliştirilmesi için kalite kontrolleri zamanında ve etkin bir şekilde yapılmalıdır. Bununla birlikte, kalite kontrollerinde seçilen analiz yöntemlerinin güvenilir, basit, ucuz ve hızlı olması gerekmektedir. Gerçekleştirilen bu çalışmada histaminin hassas ve güvenilir bir şekilde tespit edilmesi için, yüksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) cihazı kullanılarak iki farklı yöntem karşılaştırılmıştır. Yöntem olarak seçilen o-fitaldialdehit türevlendirmesi ve FLD (Floresans dedektör) dedektörü ile benzoil klorür

viii türevlendirmesi ve DAD (Diode array dedektör) dedektörü ile elde edilen sonuçlar validasyon parametreleri hesaplanarak karşılaştırılmıştır. Böylece balık ve balık ürünlerinde histaminin tespiti için hangi metodun en hassas, kolay uygulanabilir ve güvenilir olduğu tespit edilmeye çalışılmıştır. Doktora eğitimim ve tez çalışmalarım süresince ilgi ve desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen başta Anabilim Dalı başkanımız Prof. Dr. Hilal KARAGÜL ve danışman hocam Prof. Dr. Ulvi Reha FİDANCI olmak üzere Biyokimya Anabilim Dalı nın saygıdeğer öğretim üyelerine, katkılarını ve yardımlarını esirgemeyen tez izleme komitesi üyeleri Prof. Dr. Haluk ÇELİK ve Prof. Dr. Tevhide SEL e, tez çalışmalarım için bana laboratuvarının kapılarını içtenlikle açan İstanbul Gıda Kontrol Laboratuvar Müdür ü Dr. Yunus BAYRAK a, yöntem validasyonu konusunda içtenlikle bilgilerini benimle paylaşan ve çalışmalarım boyunca bana destek olan Dr. Didem Hilkat AKSAKAL a, laboratuvar çalışmalarım esnasında yardımlarını esirgemeyen Yük. Ziraat Müh. Selim SÜNNETCİ ye ve İstanbul Gıda Kontrol Laboratuvar Müdürlüğü Mikotoksin Laboratuvarı personellerine, doktora eğitimim boyunca desteklerini her daim hissettiğim Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı araştırma görevlileri, doktora ve yüksek lisans öğrencisi arkadaşlarıma, hayatımın her aşamasında olduğu gibi eğitim hayatım ve doktora tezim boyunca da desteklerini benden esirgemeyen annem Ayşe Cahide DEMİRKIRAN ve ablam Diyetisyen Duygu ÜNAL a sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

ix SİMGELER VE KISALTMALAR AOAC BAI C 5 H 9 N 3 DAD DAO DNA EURACHEM FDA FLD GDL HACCP Analitik Topluluklar Derneği Biyojen amin indeks Histamin Diode array dedektör Diamin oksidaz Deoksiribonükleik asit Avrupa Analitik Kimya Merkezi Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi Floresans dedektör Glikono-delta-lakton Hazard Analysis Critical Control Point (Kritik kontrol noktalarında risk analizi) HCl HMT HNMT Horrat HPLC H1 H2 H3 Hidroklorik asit Histamin metil transferaz Histamin N-metil transferaz Horwitz değeri Yüksek performans sıvı kromatografisi Histamin 1 reseptörü Histamin 2 reseptörü Histamin 3 reseptörü

x H4 ISO LC-MS LOD LOQ MAO MAOI MCE MeOH M Na 2 B 4 O 7 NaCl NaH 2 PO 4.2H 2 O NaOH NMKL N OPA ph RSD R RSD r TCA TLC Histamin 4 reseptörü Uluslararası Standardizasyon Kurumu Sıvı kromatografi kütle spektrometrisi Tespit limiti Ölçüm limiti Monoamin oksidaz Monoamin oksidaz inhibitör 2-merkaptoethanol Metanol Molar Disodyum tetraborat Sodyum klorür Sodyum dihidrojenfosfat dihidrat Sodyum hidroksit Kuzey Avrupa Ülkeleri Gıda Komitesi Normal O- fitaldialdehit Asitlik bazlık derecesi Tekrar üretilebilirlik relatif standart sapması Tekrar edilebilirlik relatif standart sapması Trikloroasetik asit İnce tabaka kromatografisi

xi TÜİK UV α β Türkiye İstatistik Kurumu Ultra viole Alfa Beta ± artı eksi C Santigrad derece dk g kg kob mg ml mm nm ppm μg μl μm Dakika Gram Kilogram Koloni oluşturan birim Milligram Millilitre Millimetre Nanometre Milyonda bir (mg/kg) Mikrogram Mikrolitre Milimikron

xii ŞEKİLLER Şekil 1.1. Biyojen aminlerin oluşumu 4 Şekil 1.2. Bazı amino asitlerin dekarboksilasyonu 4 Şekil 1.3. Biyojen aminlerin dekarboksilasyon yoluyla oluşumu 7 Şekil 1.4. Biyojen amin oluşumunun metabolik iz yolu 8 Şekil 1.5. Histidin amino asitinin dekarboksilasyon ile histamine 22 indirgenmesi Şekil 1.6. Histaminin enzimatik parçalanma yolları 24 Şekil 1.7. Ton balığı vücudunda histaminin yoğun olarak bulunduğu 27 bölgeler Şekil 3.1. O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi 59 ile tespit edilen histaminin kromatografik profili Şekil 3.2. O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi 61 ile belirlenen histamin standartının (1 ppm) kromatografik profili Şekil 3.3. O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi 61 ile tespit edilen histaminin kalibrasyon eğrisi Şekil 3.4. Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ile 63 tespit edilen histaminin kromatografik dağılımı Şekil 3.5. Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ile 65 tespit edilen histaminin kalibrasyon eğrisi Şekil 3.6. Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ile 65 belirlenen histamin standartının (83,3 ppm) kromatografik profili Şekil 3.7. Teşhis çalışmaları için Küçükçekmece sahilinden tutulan 68 canlı istavrit balığı

xiii ÇİZELGELER Çizelge 1.1. Biyojen aminlerin sınıflandırılması 6 Çizelge 1.2. Çeşitli gıdalardan izole edilen bakteriler ve biyojen aminler 10 Çizelge 2.1. O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan HPLC yönteminde 48 kullanılan kimyasal maddeler Çizelge 2.2. Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yönteminde 48 kullanılan kimyasal maddeler Çizelge 2.3. O-fitaldialdehit ve benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan 49 HPLC yöntemlerinde kullanılan sarf malzemeler Çizelge 2.4. O-fitaldialdehit ve benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan 50 HPLC yöntemlerinde kullanılan cihazlar Çizelge 3.1. O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi 62 kullanılarak tespit edilen histamin kalibrasyon eğrisinin yalın hatası Çizelge 3.2. O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan HPLCyöntemi 62 kullanılarak tespit edilen histamin kalibrasyon eğrisinin rezidüel standart sapması (ANOVA Regresyon hesabı fark çıkışı) Çizelge 3.3. O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi 63 kullanılarak tespit edilen histamin kalibrasyon eğrisinde F-testi Çizelge 3.4. Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi 66 kullanılarak tespit edilen histamin kalibrasyon eğrisinin yalın hatası Çizelge 3.5. Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi 66 kullanılarak tespit edilen histamin kalibrasyon eğrisinin rezidüel standart sapması (ANOVA Regresyon hesabı fark çıkışı)

xiv Çizelge 3.6. Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan yöntemi kullanılarak 67 tespit edilen histamin kalibrasyon eğrisinde F-testi Çizelge 3.7. O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılanhplc yönteminde 69 tespit (LOD) ve ölçüm (LOQ) limiti Çizelge 3.8. Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yönteminde 70 tespit (LOD) ve ölçüm (LOQ) limiti Çizelge 3.9. O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ile 71 FAPAS T2775QC numunesi geri kazanım çalışması Çizelge 3.10. Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ile 71 FAPAS T2775QC numunesi geri kazanım çalışması Çizelge 3.11. O-fitaldialdehit ve benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan 73 HPLC yöntemleri ile FAPAS T2775QC numunesi gerçeklik (Sistematik hata ve Grubbs testi) Çizelge 3.12. O-fitaldialdehit ve benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan 74 HPLC yöntemleri ile FAPAS T2775QC numunesi gerçeklik (T-testi) Çizelge 3.13. O-fitaldialdehit ve benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan 75 HPLC yöntemleri ile FAPAS T2775QC numunesi yöntemler arası karşılaştırma (T-testi) Çizelge 3.14. O-fitaldialdehit ve benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan 77 HPLC yöntemleri ile FAPAS T2775QC numunesi tekrar edilebilirlik çalışması Çizelge 3.15. O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ile 78 FAPAS T2775QC numunesi tekrar edilebilirlik limiti (F-testi) Çizelge 3.16. Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ile 79 FAPAS T2775QC numunesi tekrar edilebilirlik limiti (F-testi)

xv Çizelge 3.17. O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ile 80 FAPAS T2775QC numunesi tekrar edilebilirlik limiti uygunluk kontrolü Çizelge 3.18. Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ile 80 FAPAS T2775QC numunesi tekrar edilebilirlik limiti uygunluk kontrolü Çizelge 3.19. O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ile 81 FAPAS T2775QC numunesi kesinlik kontrolü (Horrat değeri) Çizelge 3.20. Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ile 82 FAPAS T2775QC numunesi kesinlik kontrolü (Horrat değeri) Çizelge 3.21. O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ve 83 benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yönteminin validasyon parametreleri yönünden karşılaştırılması

1 1.GİRİŞ Farklılaşan yaşam koşulları içerisinde sağlıklı bir yaşam sürdürmek için protein, vitamin ve mineral madde bakımından zengin gıdalarla dengeli ve sağlıklı beslenmek gerekmektedir. İnsan vücudu tarafından sentezlenemeyen eksojen amino asitleri içermesi, vitamin ve mineral madde içeriğince zengin olması bakımından hayvansal kaynaklı gıda maddelerinin içerisinde önemli bir yere sahip olan su ürünleri, insan beslenmesinde vazgeçilmez protein kaynaklarıdır (Huss ve ark.,2000; Türker, 1997; Metin ve Varlık, 1997; Uğur ve ark., 1996; Pala ve Karakuş, 1991). Su ürünleri hayvansal protein kaynaklarının oldukça büyük bir bölümünü oluşturmaktadır. Dünyada avlanan 100 milyon ton balığının 70 milyon tonu insan gıdası olarak kullanılmaktadır (Huss ve ark., 2000). Üç tarafı denizlerle çevrili bir yarımada konumundaki Türkiye, farklı ekolojik özellikteki 8333 km deniz kıyı şeridiyle, su ürünleri üretim alanı olarak kullanılabilecek 178.000 km uzunluğunda akarsuya, yüzey alanları 200 bin hektarın üzerinde olan yaklaşık 200 adet doğal göl ve 3442 km 2 genişliğinde baraj gölüne sahiptir. Bu bakımdan ülkemizin deniz ve iç sularında su ürünleri avcılığı ve yetiştiriciliği potansiyeli oldukça yüksek olmakla birlikte 2011 yılına ait TÜİK su ürünleri istatistiklerine göre su ürünleri üretimi bir önceki yıla göre artarak 703 bin ton olarak gerçekleşmiştir. Üretimin yaklaşık % 61,4 ü deniz balıklarından, % 6,5 i diğer deniz ürünlerinden, % 5,3 ü tatlı su ürünlerinden ve % 26,8 i kültür balıkçılığından elde edilmiştir. Türkiye, 2009 yılı dünyada ülkelere göre avlanan su ürünleri miktarına bakıldığında 32. sırada yer almaktadır. 2011 yılında ülkemize ithal edilen su ürünü miktarı 65,698 ton olup ihraç edilen su ürünü miktarı ise, 66,737 ton dur. Kişi başına düşen su ürünleri tüketim miktarı 2011 yılında 6,329 kg ve toplam tüketim ise 703,545 ton dur (TÜİK, 2011).

2 Beslenme fizyolojisi açısından önemli bir gıda maddesi olan sü ürünleri yapısal niteliklerine bağlı olarak fiziksel, mikrobiyolojik ve biyokimyasal bozunmaya uğramaktadır (Varlık, 1998; Yücel, 1993). Bu nedenle, su ürünlerinin, üreticiden tüketiciye kadar tazeliğini koruması şarttır (Varlık ve Gökoğlu, 1991). Çevresel faktörlerden çok kolay etkilenebilen su ürünlerinin tüketimini yaygınlaştırıp artırmak ve bu alandaki ticareti daha güvenli hale getirmek için su ürünlerinin avlandığı andan başlayarak işlenmesi ve tüketimine kadar her aşamada dikkatli olunması gerekmektedir. Bunun için hızlı, etkin ve güvenilir kalite kontrollerinin önemi büyüktür. Çünkü sağlıklı tüketimin ilk koşulu kaliteli üründür (Varlık ve ark., 1993). 1.1. Su Ürünlerinde Bozulma Balık dokusu karakteristik olarak protein ve protein olmayan azotlu maddelerce zengindir. Bağ doku yönünden fakir olması, doymamış yağ asitlerini fazla miktarda içermesi, ph ve nem miktarlarının yüksek olması, solungaçlardan mikroorganizma geçişinin çok kolay olması ve mide-bağırsak florasındaki patojen mikroorganizmaların ölüm sonrası ete geçiş süresinin çok hızlı olması gibi nedenlerle su ürünlerinde mikrobiyolojik, fiziksel ve kimyasal bozulma olayları, kasaplık hayvan etlerine göre daha hızlı olduğundan su ürünlerinin avlanmalarından itibaren işlenmesi ve tüketiciye ulaştırılıncaya kadar, soğuk zincir içinde tutulmaları büyük önem taşımaktadır (Varlık ve ark., 1993; Gün ve ark., 1992; Varlık ve Heperkan, 1990; Fraizer ve Westhoff,1978). Balık etinde meydana gelen bozulmanın başlıca belirtileri; hoş olmayan tat ve koku oluşumu, sümüksü yapı ve gaz oluşumu, renk ve tekstür değişimi olarak özetlenebilir (Huss, 1994).

3 Gıdalarda mikrobiyolojik değişimler sırasında proteinlerin önce ekzopeptidazlar vasıtasıyla yüksek molekül ağırlıklı peptitlere, daha sonra da endopeptidazlar aracılığıyla serbest amino asitlere kadar indirgendikleri ve bu amino asitlerin önemli bir kısmının yıkımlanarak amin yapısındaki toksik yapılara dönüştükleri bildirilmiştir (Lehane ve Olley, 2000; Halasz ve ark., 1994). Balık ve balık ürünlerinde mevcut olan amino asitler bozulma süresince dekarboksile olarak biyojen aminleri meydana getirirler (Huss, 1988). 1.2. Biyojen Aminler Biyojen aminler, gıdalarda mikrobiyolojik aktivite sonucu amino asitlerin dekarboksilasyonu veya aldehit ya da ketonların transaminasyonu ile oluşan organik bazlı düşük molekül ağırlıklı azotlu bileşiklerdir (Askar ve Treptow, 1986). Bu azotlu bileşikler canlı organizmaların aktivitesi sonucu oluştuklarından biyojen amin adını almaktadırlar (Silla Santos, 1996). Biyojen aminler balık ve balık ürünleri, et ürünleri, yumurta, peynir, fermente sebzeler, meyveler, soya ürünleri, bira, şarap, fındık ve çikolata gibi birçok gıda ürünü içerisinde oluşabilmektedir (Santos, 1996; Brink ve ark., 1990).

4 Şekil 1.1 Biyojen aminlerin oluşumu (Silla-Santos, 1996) Şekil 1.2. Bazı amino asitlerin dekarboksilasyonu ( Kılıç, 2008).

5 Balık ve su ürünleri avlandığı andan itibaren çevre sıcaklığı, hijyen gibi etkenlere ve zamana bağlı olarak, taşıma, depolama ve işleme aşamalarında mikrobiyolojik, fiziksel ve kimsayal aktiviteler sonucu oluşan biyojen aminler belirli bir düzeyi aştığında insan ve hayvanlar için toksik olabilmektedir. (Hungerford, 2010; Huss ve ark., 2003). 1.3. Biyojen Aminlerin Fonksiyonları ve Önemi Biyojen aminler canlı organizmada hormonların, alkoloidlerin, nükleik asitlerin ve proteinlerin sentezinde azot kaynağı olarak rol oynamalarının yanı sıra gıda maddelerinin aromasını oluşturmaları, mide hacminin ve ph sının ayarlanması, vücut ısısının kontrolü ve merkezi sinir sisteminin aktivitesi açısından son derece önemli maddelerdir (Allen, 2004; Ölmez, 2000). Putresin, spermidin ve spermin gibi poliaminler canlı hücrenin vazgeçilmez bileşenleridir ve DNA, RNA, protein sentezinin birçok basamağında yer alarak hücre nin çoğalma ve büyümesi için gereklidirler (Bardocz, 1995). Kateşolamin, indolamin, histamin gibi bazı aminler, sinir sistemi ve kan basıncının kontrolü olmak üzere çeşitli metabolik fonksiyonlarda önemli görevler almaktadırlar. β-feniletilamin ve tiramin kan basıncının yükselmesinde etkili olurken histamin kan basıncının düşürülmesinde etkili olmaktadır (Silla Santos, 1996). Spermin, spermidin, putresin gibi poliaminlerin, çoklu doymamış yağ asitlerinin oksidasyonunu önlediği ve bu antioksidan etkinin amin grubu sayısıyla korelasyon gösterdiği ifade edilmektedir (Silla Santos,1996). Ayrıca poliaminler bağırsakların ve bağışıklık sisteminin normal fonksiyonu için gereklidir (Erkan, 2004).

6 1.4.Biyojen Aminlerin Sınıflandırılması Biyojen aminler, uçucu olmayan, düşük molekül ağırlığına sahip alifatik (putresin, kadaverin, spermin, spermidin), aromatik (triamin, β-feniletilamin) ve heterosiklik (histamin, triptamin) organik bazlardır. Gıdalarda amino asitlerin mikrobiyolojik olarak dekarboksilasyonu ya da aldehit ve ketonların transaminasyonu ile oluşan biyolojik aktif biyojen aminlerden histamin başta olmak üzere kadaverin, putresin, tiramin, triptamin, β-feniletilamin, agmatin, spermidin ve spermin gıda kalitesi ve güvenliğinin izlenmesinde önemlidirler (Köse ve ark., 2011; Landete ve ark., 2007; Da Silva ve ark., 2002; Halasz ve ark., 1994; Ababouchve ark., 1991). Biyojen aminler kimyasal yapılarına ve içerdikleri azot sayılarına göre sınıflandırılabilirler. Çizelge 1.1 Biyojen aminlerin sınıflandırılması (Til ve ark., 1997; Silla Santos, 1996).

7 1.5.Biyojen Aminlerin Oluşum Mekanizması Amino asitler, yapılarında en az bir amino ve karboksil grubu bulunan, gıdalarda ve fizyolojik sıvılarda bulunan önemli bileşiklerdir. Amino asitlerin aminogrubu (- NH 2 ), karboksil grubu (- COOH), hidrojen atomu (H) ve yan zincir (R) grubu, α-c atomu olarak da adlandırılan C atomuna bağlıdır ve bu yapısal özellikteki amino asitler α- amino asitler olarak adlandırılmaktadır (Kelly, 1999). Biyojen aminlerin dekarboksilasyon yoluyla oluşumu Şekil 1.3 de verilmiştir. Şekil 1.3. Biyojen aminlerin dekarboksilasyon yoluyla oluşumu (Kelly, 1999). Amino asitlerden karbondioksitin ayrılması sonucunda söz konusu amino asidin amini oluşmaktadır. Dekarboksilasyondan sorumlu dekarboksilazlar, hem hayvansal ve bitkisel dokular hem de mikroorganizmalar tarafından oluşturulabilirler. Genellikle dekarboksilazlar ya özel olarak bir tek amino aside ya da bir dizi farklı amino aside etki ederler. Çeşitli bakteri türlerinin aminoasitleri dekarboksile etme kabiliyetleri farklıdır (Yerlikaya ve Gökoğlu, 2002). Kadaverin, putresin, histamin, tiramin, triptamin gibi biyojen aminler sırasıyla lizin, ornitin, histidin, tirozin ve triptofan amino asitlerinin dekarboksilasyonu sonucu oluşmaktadırlar (Moret ve Conte, 1996; Ten Brink ve ark., 1990). Biyojen aminlerden en fazla söz edileni et, balık ve su ürünleri için histamin, süt ürünleri için ise tiramindir (Üçüncü, 2004).

Şekil 1.4. Biyojen amin oluşumunun metabolik iz yolu (Halasz ve ark., 1994). 8

9 1.6.Gıdalarda Biyojen Amin Oluşumunu Etkileyen Faktörler Biyojen amin üretebilen bakterilerin en önemlilerinin, Enterobacteriacea familyasına ait türler, Clostridium spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp. ve Photobacterium spp., laktik asit bakterilerinden Lactobacillus spp, Streptococcus spp., Pediococcus spp. ve Carnobacterium spp. olduğu bildirilmiştir ( Santos, 1996; Shalaby, 1996; Brink ve ark., 1990). Scombroid zehirlenmesine (histamin zehirlenmesi) yol açan balıklarda histamin oluşturan ve ilk izole edilen bakterilerin; Morganella morganii, Klebsiella pneumoniae ve Hafnia alvei olduğu ve aynı zamanda Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Clostridium perfringens, Enterobacter aerogenes ve Vibrio alginolyties inde histamin ürettiği bildirilmiştir (Frank ve ark., 1985; Arnold ve ark,1980).

10 Çizelge 1.2. Çeşitli gıdalardan izole edilen bakteriler ve biyojen aminler (Shalaby, 1996). GIDA İZOLE EDİLEN BAKTERİ BİYOJEN AMİN Morganella morgoni Klebsiella pneumonia Histamin Hafnia alvei Kadaverin Proteus mirabilis Putresin Balık Clostridium perfringens Tiramin Enterobacter aerogenes Agmatin Vibrio alginolytiens Spermin Spermidin Bacillus spp. Staphylococcus xylosus Lactobacillus buchneri Lactobacillus 30a Peynir L. bulgaricus Histamin L. plantorum Kadaverin L. casei Putresin L. acidophilus Tiramin Β-feniletilamin Streptecoccus faecium Triptamin S. mitis Bacillus macerans Propioni bacterria Et ve et ürünleri Fermente sebzeler Pediococcus Enterobacteriaceae Lactobacillus Pseudomonas Streptococcus Micrococcus Lactobacillus plantarum Pediococci sp. Leuconostoc mesenteroides Histamin Kadaverin Putresin Tiramin Β-feniletilamin Triptamin Histamin Kadaverin Putresin Tiramin Triptamin Fermente soya ürünleri Rhizopus oligosporus Trichosporon beiglli Lactobacillus plantorum Histamin Kadaverin Tiramin Triptamin

11 Middlebrooks ve ark. (1988), bozulmuş balıktan dekarboksilaz aktiviteli Acitenobacter Iwoffi, Pseudomonas putrefaciens, Aeromonas hydrophila gibi üç bakteri türü izole etmesinin yanı sıra, Lopez-Sabater ve ark. (1994), Plesiomonas shigelloides gibi yeni bir histamin üreticisi tespit etmiştir. Yatsunumi ve Echigo (1993), fermente balıkta histamin üreten bakteri olarak Staphylococcus, Vibrio, ve Pseudomonas soylarını teşhis etmişlerdir. Histamin ile diğer aminleri üretmede yetenekli olan bakterilerin genellikle benzer türlerden oldukları bildirilmiştir (Rodriguez-Jerez ve ark., 1994). Tuza toleranslı bakteri sayısının yaklaşık 10 dan 104 kob/g a kadar değişiklik gösterdiği, %12 NaCl içeren sardalya ürünlerinin 30 C de depolanması süresince histamin, putresin ve kadaverin oluştuğu saptanmıştır (Yatsunami ve Echigo, 1993). Aynı zamanda Photobacterium un da histamin, agmatin ve kadaverin üretimine neden olduğu bildirilmiştir (Okuzumi ve ark., 1990; Rawles ve Flick, 1996). Tuzlanmış yarı konserve edilmiş hamsiden izole edilen ve 37ºC de 24 saatlik inkübasyondan sonra Morganella morganii, Bacillus spp in iki üyesi ve Staphylococcus xylosus un sırasıyla 212, 11 ve 110 ppm histamin ürettiği bildirilmiştir (Rodriguez-Jerez ve ark., 1994). Et ve et ürünlerinden, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Proteus morganii ve Edwardsiella spp. gibi biyojen amin üreten koliformlar, Pediokoklar, Streptekoklar ve Mikrokok türleri yanında, Lactobacillus brevis, L. divergens ve L. hilgardii gibi amin üreten obligat heterofermentatif laktik asit bakterileri ile fakültatif heterofermentatif L. carnis ve homofermentatif L. curvatus izole edildiği bildirilmiştir (Maijala,1994; Maijala ve ark., 1993). Gıdalarda biyojen aminlerin oluşumunda, amin üreten mikroorganizmaların dekarboksilaz aktivitesini etkileyen bazı faktörlerin sırasıyla ph, sıcaklık, tuz konsantrasyonu olduğu bildirilmiştir (Shalaby, 1996; Teodorovic ve ark., 1994; Maijala, 1994).

12 1.6.1.pH nın Etkisi ph nın, dekarboksilaz aktivitesini ve dolayısıyla biyojen amin oluşumunu etkileyen en önemli faktörlerden biri olduğu ve biyojen amin oluşumunun, asidik ortamlarda bakteri için koruyucu bir mekanizma oluşturduğu bildirilmiştir (Masson ve ark.,1997; Teodorovic ve ark., 1994). Asidik ortamlarda amino asit dekarboksilaz aktivitesinin daha güçlü şekillendiği belirlenmiş ve amin oluşumunda ph 4.0-5.5 arasındaki koşulların optimum olduğu saptanmıştır (Santos, 1996). Lactobacillus bulgaricus un amino asit ilave edilerek kuvvetlendirilmiş MRS Broth (De Man, Rogosa and Sharpe) da ph 5.0 da daha fazla histamin, tiramin ve triptamin ürettiği tespit edilmiştir (Maijala, 1994). Glikoz gibi fermente olabilen karbonhidratlardan oluşan laktik asitin ortamın Ph sını düşürerek bakteri aktivitesini ve amino asit dekarboksilaz aktivitesini arttırdığı vurgulanmış, % 0.5 2 lik ortam glikoz konsantrasyonunun optimal koşulları oluşturduğu (Masson ve ark., 1997), konsantrasyonun % 3 ü aştığı durumlarda ise enzim oluşumunun inhibe olduğu bildirilmiştir (Santos, 1996). Beutling (1994), Enterococcus faecalis in L-tirozin ve glikoz ilave edilmiş broth ta ph 5.0-8.0 arasında yüksek miktarlarda tiramin ürettiğini Ph optimum 7.0 olarak belirlenmiştir. Maijala ve ark. (1993), kıyma örneklerine GDL (Glikono delta lakton) ilave edilerek sağlanan ph düşüşünün koliform, fekal streptekok ve toplam bakteri sayıları ile histamin ve putresin düzeylerinde de önemli bir azalmaya yol açtığını bulmuşlardır.

13 1.6.2.Sıcaklığın Etkisi Masson ve ark. (1997), ısının bakterinin biyojen amin düzeylerini önemli derecede etkilediğini, ancak optimal ısı derecelerinin bakteri türlerine göre farklılık gösterdiğini bildirmektedirler. Santos (1996) da biyojen amin düzeylerini ısı yanı sıra depolama süresinin de etkilediğini saptamış, Ababouch ve ark. (1991), 3 farklı Proteus türünün ph 5.0 te, ph 7.0 ye göre ve 25 C de, 4 C veya 35 C ye göre daha iyi bir aktivite gösterdiğini saptamışlardır. Bakar ve ark. (2010) tarafından levrek ailesine ait bir tür olan Barramundi balığının 0 C ve 4 C de 15 günlük depolanmasında en fazla histamin oluşumunun 15. günde 4 C de görüldüğünü tespit etmişlerdir. 1.6.3.Tuz Yoğunluğunun Etkisi Biyojen amin oluşumunda, ortamın tuz konsantrasyonu önemli bir faktördür. Ababouch ve ark. (1991), üç ayrı Proteus türü ile yaptıkları çalışmalarında, % 8 NaCl ilavesinin etkili bir şekilde histidin dekarboksilaz aktivitesini azalttığını belirtmişlerdir. Diğer taraftan, kuvvetli bir histamin oluşturma aktivitesine sahip olarak tanımlanan Staphylococcus capitis in % 10 luk NaCl bulunan ortamlarda yaklaşık 400 mg/ml histamin üretebildiği (Hernandez-Herrero ve ark., 1999). Carnobacterium divergens in % 10 luk NaCl ün tiramin oluşumunu inhibe ettiği, potasyum nitrat varlığının ise tiramin oluşumunu etkilemediği belirtilmiştir (Masson ve ark., 1997). Teodorovic ve ark. (1994), % 3.5 tuz veya % 0.02 oranında sodyum nitrit katılan gruplar ile, kontrol grubu olarak ilave yapılmamış brotlarda oluşan histamin değerlerinin oldukça benzer olduğunu bulmuşlardır.

14 1.7.Biyojen Aminlerin Detoksifikasyonu Memeli organizmaların bağırsakları monoaminoksidaz (MAO), diaminoksidaz (DAO) ve histamin N-metil transferaz (HNMT) dan oluşan ve çok iyi çalışan, gıda ile alınan biyojen aminleri yıkımlayan bir detoksifikasyon sistemine sahiptirler (Çolak ve Aksu, 2002; Ten Brink ve ark., 1990). Ancak bazı alerjik bireylerde yüksek miktarda biyojen amin alınması veya detoksifikasyon enzimlerin inhibitörlerinin kullanılması durumunda detoksifikasyon işlemi gerçekleştirilememekte ve biyojen aminlerin vücutta birikimi söz konusu olmaktadır (Silla Santos, 1996). Özellikle solunum ve kroner sistem problemleri, gastrointestinal rahatsızlıklar, yüksek tansiyon, B12 vitamini eksikliği gibi sorunları olan bireyler risk gruplarını teşkil etmektedir. Çünkü bu bireyler düşük dozlarda biyojen amin alımına bile hassasiyet göstermektedirler. (Bardocz, 1995). Yüksek miktarlarda biyojen amin alınması, stres, depresyon, Alzheimer ve Parkinson tedavilerinde kullanılan bazı farmakolojik ajanlarla detoksifikasyon metabolizmasındaki enzimlerin inhibe edilmesi, genetik olarak detoksifikasyon enzimlerinin eksikliği, gastrointestinal rahatsızlıklar, alkol alımı gibi nedenlerle detoksifikasyon yapılamamasını izleyen gıda zehirlenmeleri ortaya çıkabilmektedir (Çolak ve Aksu, 2002). Gıdalarda biyojen aminlerin bir arada bulunuşunun da toksik etkilerin ortaya çıkmasında önemi büyüktür (Çolak ve Aksu, 2002). Örneğin putresin ve kadaverin histamini detoksifiye eden enzimleri inhibe etmektedir. Tiramin MAO, triptamin DAO, β-feniletilamin ise DAO ve HNMT enzimlerini inhibe etmektedir (Silla Santos, 1996; Stratton ve ark, 1991). Spermin ve spermidin ise gastrointestinal duvardan histamin geçişini arttırmaktadır (Shalaby, 1996).

15 1.8.Biyojen Aminlerin Toksikolojik Özellikleri İnsan ve hayvanların biyolojik fonksiyonlarında önemli role sahip olan biyojen aminlerin, gıdalarla fazla miktarda alındıklarında toksik etkiler gösterebildikleri belirlenmiştir (Santos, 1996; Shalaby, 1996). Genel olarak biyojen aminlerin neden olduğu en sık görülen toksik etkiler; baş ağrıları, hipotansiyon veya hipertansiyon ve çeşitli alerjik reaksiyonlardır. Daha ciddi durumlarda ise intraserebral hemoraji ve ölüm olaylarının da meydana gelebildiği bildirilmiştir (Buatti ve ark., 1995). Biyojen aminlerin neden olduğu gıda kaynaklı intoksikasyonların çoğunda histamin yer almaktadır. Histamin zehirlenmesi çoğunlukla Scombroidae (uskumru, sardalya, ton balığı, palamut) familyasına dahil balıkların yenmesiyle geliştiğinden scombroid balık zehirlenmesi (scombroidozis) olarak adlandırılmaktadır (Gökoğlu ve Varlık, 1995; Halasz ve ark., 1994). Histamin biyolojik olarak aktif bir amin olup, insan vücudu içerisinde birçok tepkimelere yol açabildiği gözlenmiştir. Histaminin kalp-damar sistemi ve çeşitli salgı bezlerindeki hücre zarı reseptörlerine bağlanarak etkisini gösterdiği, böbrek üstü bezlerindeki etkisinin bir sonucu olarak kalbi etkileyip, uterus, bağırsak ve solunum bölgelerindeki düz kasları, duyu ve motor sistemini harekete geçirdiği ve mide asidini kontrol altına aldığı bildirilmiştir (Joosten, 1988). Bu nedenle histamin zehirlenmesinin genellikle çok geniş bir semptom çeşitliliğine sahip olduğu vurgulanmıştır. Yüksek miktarda histaminin vücuda alınması sonrasında görülen en yaygın semptomların solunum sistemi bozuklukları, ishal, mide bulantısı, kusma, deride kızarıklık ve ödem, kaşıntı, yüksek ya da düşük tansiyon, terleme, ateşlenme, kalp çarpıntısı ve baş ağrısı olduğu belirtilmiştir. Histamin balık zehirlenmesi ile ilgili semptomların toksik miktarların emiliminden birkaç dakika veya birkaç saat sonra görülmeye başlandığı belirlenmiştir. Tipik olarak intoksikasyonun birkaç saat sürdüğü ve bununla birlikte bu sürenin birkaç güne kadar da uzayabileceği bildirilmiştir (Özoğul, 2001; Bardocz, 1995; Taylor, 1986).

16 Bozulmuş veya fermente olmuş ürünlerdeki yüksek histamin varlığının, detoksifikasyon sistemi tarafından tolere edilemediği gösterilmiştir (Brink ve ark., 1990). Ayrıca, gıdalarda biyojen aminlerin bir arada bulunuşunun da toksik etkilerin ortaya çıkmasında önemli olduğu belirlenmiştir (Hornero-Mendez ve Garrido- Fernandez, 1997). Tiramin MAO, triptamin DAO, β-feniletilamin, DAO ve HNMT enzimlerini inhibe ederek vazoaktif etkiler oluşturmaktadır. Tiramin, temel olarak sempatik sinir sistemini etkileyerek, periferal vazokonstrüksiyon ile kan basıncını ve kan şekerini arttırmakta ve monoamin oksidaz inhibitör (MAOI) ilaçlar ile reaksiyona girerek alerjik etkilere neden olmaktadır. Ayrıca peynirlerde yüksek oranda tiraminin vücuda alınması sonucu baş ağrısı, beyin kanaması ve kalp-damar problemleri ile karakterize peynir zehirlenmesi meydana geldiği bildirilmiştir (Ornodez ve ark, 1997; Joosten, 1988; Smith, 1980; Marine-Font, 1978). Spermin ve spermidinin ise gastrointestinal duvardan histamin geçişini arttırdığı tespit edilmiştir. Bir öğünde, 40 mg ın üzerinde biyojen amin alınmasının, potansiyel toksik etkiyi başlatacağı (Shalaby, 1996) 1000 mg/kg oranında amin bulunmasının ise sağlık açısından tehlike oluşturduğu bildirilmiştir (Santos, 1996). Putresin, kadaverin gibi diaminlerin, nitritlerle reaksiyona girme yatkınlıkları ve ısıyla birlikte potansiyel kanserojen nitrozaminler oluşturma riskleriyle mutajenik öncül maddeler olduğu bildirilmiş ve serbest nitrozamin bulunan çiğ ürünlerde pişirme işleminin (kızartma) nitrozamin oluşumunu arttırabildiği vurgulanmıştır (Bover-Cid ve ark., 2000; Hernandez-Jover ve ark., 1997b; Ornodez ve ark., 1997; Shalaby, 1996). Balık, et ve sebze ürünlerinde putresin ve kadaverin yanı sıra agmatin, spermin ve spermidinin nitrozaminleri oluşturabildikleri, nitrozaminler ortaya çıktıktan sonra inaktivasyonlarının oldukça zor olduğu, yüksek sıcaklık uygulamalarının mevcut biyojen amin düzeylerinde önemli bir azalma sağlayamadığı öne sürülmüştür. (Shalaby, 1996; Santos, 1996).

17 1.9.Biyojen Aminler İçin İzin Verilebilir Limitler Toksik etkilerin ortaya çıkması bireysel farklılıklara ve diğer biyojen aminlerin ortamda bulunup bulunmamalarına göre değişiklik gösterdiğinden biyojen aminler için toksik düzeylerin belirlenmesi oldukça güçtür (Silla Santos, 1996). Biyojen aminlerin toksikolojik etkileri göz önününe alınırken; alınan gıdanın miktarı, toplam biyojen amin konsantrasyonu, vücuda alınan ilaçlar ve alkol de hesaba katılmalıdır (Lonvaud-Funel, 2001). Geleneksel yöntemlerle işlenen balık ürünlerinin içerdiği gıda güvenliği risklerinin başında histamin gelmektedir. Histamin, balık, peynir ve et ürünleri gibi gıdalarda tespit edilmiş en toksik amin olup, yüksek düzeylerde histamin içeren balık ve balık ürünlerini tüketen insanlarda ve hayvanlarda histamin zehirlenmesi ne yol açmaktadır. Bu bakımdan balık ve balık ürünleri başta olmak üzere su ürünlerindeki histamin konsantrasyonunun tespiti insan sağlığı için büyük önem taşımaktadır ( Köse ve ark., 2011). Malle ve Valle (1996), balık bozulmasının tespitinde kullanmak üzere biyojen aminlerle Biyojen Amin İndeks (BAI) adını verdikleri bir kalite indeksi oluşturmuşlar ve bir formül ortaya koymuşlardır. Biyojen aminlerin özellikle de histaminin et ve balık ürünlerinin hijyen ve kalitesinin belirlenmesinde çok önemli bir parametre olduğunu belirtmişlerdir.

18 Bu formülden yola çıkarak; Birinci kalite et veya balık için; BAI < 1 Orta kalite et veya balık için; 1 < BAI < 10 Bozulmuş et veya balık için; BAI > 10 yorumunu yapmışlardır. Biyojen aminler içerisinde sadece histamin için yasal kriterler mevcuttur. Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tüketilebilir balıklarda maksimum histamin düzeyinin 5 mg/100 gramı (50 ppm) geçmemesi gerektiğini bildirmiştir (FDA, 2001). Avrupa Birliği Scombridae, Clupeidae, Engraulidae, Coryfenidae (Coryphaenidae), Pomatomidae, Scombresosidae familyalarına ait balık türlerinden 9 örnekleme yapılmasını zorunlu kılar (European Union Directive, EC, 2007: Directive No: 1441/2007). Buna göre; ortalama histamin değeri 10 mg/ 100 g (100 ppm) ı aşmaması gerekir, ancak iki örnekte 10 mg/100 g ı aşmasına izin verilirse de bu değerin 20 mg/100 g ı (200 ppm) geçmemesi şartı vardır. Hiçbir örneğin histamin miktarının ise 20 mg/100 g ı geçmemesi gerekmektedir. Avrupa Birliği kuralları ülkemiz dahil birçok ülkede yasal olarak uygulanmaktadır (Köse, 2011; Veciana- Nogues ve ark., 1997; Shalaby, 1996). 29 Aralık 2011 tarihli Türk Gıda Kodeksi Mikrobiyolojik Kriterler Yönetmeliği nde Engraulidae, Scombridae, Clupeidae, Coryfenidae, Pomatomidae, Scombressosidae familyasındaki türlere ait taze soğutulmuş balıklar, dondurulmuş balıklar, işlenmiş balıklar, konserve balıkçılık ürünleri ve işlenmiş çift kabuklu yumuşakçalar (kara midye, kıllı midye, akivades, kidonya istiridye,kum midyesi vb.), kabuklular (kerevit, karides, ıstakoz, yengeç vb.), karından bacaklılar (deniz salyangozu vb.), kafadan bacaklılar (ahtapot, mürekkep balığı, kalamar vb.), için histamin limitlerine yer verilmiştir.

19 Buna göre taze soğutulmuş balıklar ve dondurulmuş balıklarda kabul edilebilir en yüksek değer 100 ppm (mg/kg) iken bu değer konserve balık ürünleri ve işlenmiş çift kabuklu yumuşakçalar (kara midye, kıllı midye, akivades, kidonya istiridye, kum midyesi vb.), kabuklular (kerevit, karides, ıstakoz, yengeç vb.), karından bacaklılar (deniz salyangozu vb.), kafadan bacaklılar (ahtapot, mürekkep balığı, kalamar vb.), için 200 ppm (mg/kg) dir. Yukarıda belirtilen balık ve balık ürünlerinden ( konserve balıkçılık ürünleri hariç) alınan 9 adet numunenin ortalaması 100 ü geçmemelidir, iki örnekte 100 ppm den fazla 200 ppm den az olabilir fakat hiçbir numunede 200 ppm i geçmemelidir. Konserve balıkçılık ürünleri ve işlenmiş çift kabuklu yumuşakçalar (kara midye, kıllı midye, akivades, kidonya istiridye,kum midyesi vb.), kabuklular (kerevit, karides, ıstakoz, yengeç vb.), karından bacaklılar (deniz salyangozu vb.), kafadan bacaklılar (ahtapot, mürekkep balığı, kalamar vb.) da alınan 9 adet numunenin ortalaması 200 ppm i geçmemelidir. İki örnekte 200 ppm den fazla 400 ppm den az olabilir fakat hiçbir numunede 400 ppm i geçmemelidir. Balık zehirlenmelerinin çoğunda histamin düzeylerinin 200 ppm in üzerinde ve sıkça 500 ppm dolaylarında olduğu gözlenmiş, Ancak daha düşükdüzeylerin de zehirlenmelere yol açacağı vurgulanmıştır (Huss ve ark., 2003; FDA, 2001; Lehane ve Olley, 2000). 1.10.Biyojen Aminlerin Analiz Yöntemleri Biyojen amin analizlerinde, dünya çapında faaliyet gösteren laboratuvarlarda yüksek hızlı taramalı analitik prosedürlerden, güvenilirliği ve hassasiyeti daha fazla olan sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi yöntemlerine kadar değişen çeşitli yöntemler yaygın olarak kullanılmaktadır (Muscarella ve ark., 2013).

20 Biyojen amin varlığının saptanmasında genelde histamin tespitine dayalı çalışan, kolorimetrik, enzimatik ve immunoassay lerle yapılan kalitatif ve yarıkantitatif tarama yöntemleri ile histamin yanı sıra diğer biyojen aminlerinde analizlerinin yapılabildiği kantitatif yöntemler kullanılmaktadır (Köse, 1993; Baranowski, 1985). Genellikle immunoassay yöntemlerden temel alan kitlerden oluşan tarama yöntemleri, geleneksel analitik tekniklerle karşılaştırıldığında basitlik ve hızlılık bakımından daha popülerdirler (Köse, 2011). Hızlı tarama yöntemleri, balıkların avlandıktan sonra fabrikaya veya satış noktalarına getirilme esnasındaki, zaman/sıcaklık koşullarının net olarak bilinmediği hallerde ürün kabulü sırasında, işlenmiş ürünlerin veya ham maddelerin depolamalarında ve satış öncesinde histamin varlığının veya miktarının izlenmesi için kısa sürede analiz yapılması gereken durumlarda kullanılırlar. Ancak histamin miktarındaki yasal limitlere yakın veya yasal limitler üzerindeki değerleri içeren örneklerin, validasyonu yapılarak kabul görmüş referans kantitatif yöntemlerle ileri analizlerinin yapılıp miktarların doğrulanması gereklidir (Etienne ve Nantes, 2006). İkinci grupta histamin yanında diğer biyojen aminlerin de analizlerinin yapılabildiği kantitatif yöntemler yer almaktadır. Resmi ve özel gıda kontrol laboratuvarlarında balık ve balık ürünleri, su ürünleri ve bazı gıda maddelerinde histamin ve diğer bazı biyojen aminlerin analizlerinde, araştırma laboratuvarlarında yöntemlerin geçerliliğinin onaylanması, kalitatif yöntemlerin kontrolünde referans bir yöntem olmak gibi pek çok amaç için kullanılabilirler. Bu yöntemlerden başlıcaları; florometrik yöntemler, gaz kromatografisi, kapillar elektroforez yöntemleri ve geniş linearitesi, hassasiyeti ve güvenilirliği sayesinde günümüzde en yaygın yöntem olarak sıklıkla kullanılan yüksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) dir (Duflos ve ark.,1999; Hwang ve ark., 1997; Köse, 1993; Eerola ve ark., 1993).

21 Balık ve balık ürünlerinde biyojen aminlerin tespiti için ülkeden ülkeye farklılık gösteren pek çok yüksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi geliştirilmiştir. Kore de balıkçılık ürünlerinde (Park ve ark., 2010), Brezilya da taze ve konserve ton balığında (Silva ve ark., 2011), İran da konserve ton balığında (Zarei ve ark., 2011), Güney Afrika da deniz ürünlerinde (Auerswald ve ark., 2006), dokuz Asya ülkesindeki deniz ürünlerinde (Tao ve ark., 2011), İtalya ve diğer Avrupa Birliği ülkelerinde balık ve balık ürünlerindeki histamin kontaminasyon düzeylerinin tespiti için yüksek performans sıvı kromatografisi yöntemleri bildirilmektedir (Vosikis ve ark., 2008). Ülkemizde de balık ve balık ürünlerinde benzer şekilde yüksek performans sıvı kromatografisi ile yapılan çalışmalar bulunmaktadır (Köse ve ark., 2011; Gökoğlu ve Varlık, 1995). 1999 yılında balık ve balık ürünlerinde biyojen amin düzeylerinin belirlenmesinde yüksek performans sıvı kromatografisi ile yapılan bir yöntem Almanya da referans yöntem olarak kabul edilmiştir. Bu yöntemde balık ve balık ürünlerinin perklorik asit ekstraksiyonundan sonra HPLC solüsyonunun enjeksiyonu ve ters faz kolonda analizi sırasında aminlerin o-fitaldialdehit (OPA) ile türevlendirmesi sağlanır ve sonra floresans dedektörle ölçümü yapılır. Ancak 2005 yılında Avrupa Birliği, Male ve ark.(1996) ve Duflos ve ark. (1999) tarafından yüksek performans sıvı kormatografisi ile yapılan ve Eerola ve ark. (1993) yöntemine dayanılarak geliştirilmiş olan histamin analizi yöntemini kullanmaya başlamıştır. Ülkemizde Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı na bağlı bazı gıda kontrol laboratuvar müdürlüklerinde ise histamin düzeylerinin saptanmasında Özdestan ve Üren (2009) tarafından Male ve ark.(1996) ve Duflos ve ark. (1999) nın geliştirdiği yöntemden modifiye edilen yüksek performans sıvı kromatografisi yöntemi kullanılmaktadır ( Mah ve Hwang, 2009; Senoz ve ark., 2000). Çoğu amin doğal UV absorbsiyonu veya floresansa reaksiyon göstermediği için biyojen aminlerle ilgili HPLC yöntemlerinde kolon öncesi veya kolon sonrası türevlendirmeye ihtiyaç duyulmaktadır (Lange ve ark., 2002). Türevlendirme işlemleri için farklı kimyasallar kullanılmaktadır. Bunlardan en yaygın olanı dansil klorür, benzoil klorür, o-fitaldialdehit (OPA) dır. Kullanılan türevlendirme ajanlarının avantajları ve dezavantajları üzerine pek çok görüş ve araştırma

22 yapılmıştır. Özoğul ve ark. (2002) benzoil klorürün kısa türevlendirme ve alıkonma zamanı meydana getirmesi, basit kullanımı ve ucuz olmasıyla diğer türevlendirme ajanlarına göre daha iyi olduğunu belirtmişlerdir. Antoine ve ark (1999) ise merkaptoethanol ile birlikte o-fitaldialdehit (OPA) kullanımının çok iyi bir floresans hassasiyeti ve kararlılığı oluşturduğunu ve böylece solventteki polarite değişimlerinin önleyerek amino asitlerce zengin balık örneklerinin analizlerinde üstünlüğünün bulunduğunu öne sürmüşlerdir. 1.11.Histamin Histamin, kimyasal olarak 2-(4-imidazol) etilamin olup, C 5 H 9 N 3 formülüyle gösterilmektedir. Biyojen aminler içerisinde yer alan, balık ve balık ürünleri, peynir, et ürünleri gibi gıdalarda tespit edilmiş en toksik amin olduğu belirtilen histamin, gıdalarda histidin dekarboksilaz enzimine sahip mikroorganizmaların serbest histidin amino asitini histamine çevirmesi sonucu oluşmaktadır (Anon., 2012; Rawles ve Flick, 1996; Gökoğlu ve Varlık, 1995). Şekil 1.5. Histidin amino asitinin dekarboksilasyon ile histamine indirgenmesi (Huss, 1994).

23 Histamin, insan vücudunda kendiliğinden olan doğal bir toksin olmayıp, iletici bir moleküldür. Aynı anda birden fazla yerde dağılım gösterir ve mast hücreleri, enterokoromaffin benzeri hücreler ve nöronlardan salınırlar. Histamin etkisini H1, H2, H3 ve H4 histamin reseptörleri üzerinden göstermektedir. Böylece çevresel sinir sisteminden, mide asit sekresyonunun kontrolüne kadar olan birçok hayati fonksiyonda görev almaktadır (Katzung, 2007; Maintz ve Novak, 2007). İnsan vücudu biyojen aminlerin neden olduğu çeşitli toksik etkilerin ortaya çıkmasını önleyen kuvvetli bir detoksifikasyon sistemine sahiptir. Histaminin toksisite derecesi vücudun detoksifikasyon sisteminin verimliliğine bağlı olarak değişebilir. Günlük diyette normal düzeyde alınan biyojen aminler monoamin oksidaz (MAO) ve diamin oksidaz (DAO) enzimleri ile yıkımlandıktan sonra asetillenerek Escherichia coli, Enterobacter aerogenes gibi bakteriler tarafından zararsız hale getirilirler ya da değişime uğramadan atılırlar. Çoğu bakteri amino asitleri dekarboksile eder ve aminlere çevirir (Köse ve ark.,2011; Bodmer ve ark, 1999; Stratton ve ark., 1991; Ayres ve ark., 1980). Histamin, diamin oksidaz (DAO) ve histamin metiltransferaz (HMT) olmak üzere iki enzimatik yolla parçalanmaktadır (Şekil 1.6). Parçalanma sonunda meydana gelen ürünlerin toksisitesi histaminden daha azdır. Sağlıklı insanlarda histaminaz tarafından metabolize edilen histamin dışkı ya da idrarla atılır. Oral yolla alınan histamin insanlarda bağırsaklarda yıkımlanır ve DAO tarafından metabolize kan düzeylerinin artması engellenir. Yıkılım özellikle kalın bağırsak mukozasında aminooksidazlarca gerçekleştirilmektedir. Ancak alınan histamin düzeyinin çok yüksek olması ya da histaminle birlikte histaminin metabolizmasını engelleyen veya histaminin toksisitesini yükselten DAO ve HMT inhibitörlerinin alınması durumunda, zehirlenme olayları görülebilmektedir. Kadaverin, putresin, tiramin ve β-feniletilamin gibi aminler de DAO ve HMT yi engelleyerek, histaminin sindirim kanalından emilme oranını yükseltmekte ve histamin zehirlenmesi büyük oranda diğer biyojen aminlerin varlığında ve miktarlarına bağlı olarak gerçekleşmektedir. Şüpheli gıdalarda yüksek miktarlarda histamin tespit edilmesi, zehirlenmenin gıdayı tüketen grubun hemen hemen tamamında gözlenmesi ve şüpheli gıdanın alerjik

24 reaksiyonlara sebep olmadığının bilinmesi histamin zehirlenmesinin gıda alerjisinden kolaylıkla ayrımını sağlamaktadır (Gürbüz ve Değirmencioğlu 2003). Şekil 1.6. Histaminin enzimatik parçalanma yolları (Stratton ve ark., 1991).

25 Biyojen aminler arasında histamin, en toksik olarak bilinen amin olup ilk kez ton ve uskumru balığı gibi Scombridae familyasına ait balıklarda gözlenmiştir. Belirtilen familyaya ait balıkların bu zehirlenmeye neden olmasından dolayı histamin zehirlenmesi, Scombroid balık zehirlenmesi olarak bilinmektedir. Ancak bu familyadan olmayan ve kaslarında yüksek düzeyde serbest amino asit bulunduran ringa, sardalya, tirsi, hamsi, mahi-mahi gibi pek çok balık türünün de histamin zehirlenmesine neden olduğu bildirilmiştir (Huss ve ark., 2003; Özoğul, 2001; Lehane ve Olley, 2000). Histamin, etkisini kardiyovasküler sistem ve çeşitli salgı bezlerinin selüler membranlarında bulunan reseptörlere bağlanmak suretiyle göstermektedir. Böbrek üstü bezlerindeki etkisinin bir sonucu olarak kalbi harekete geçirip, uterus, bağırsak ve solunum bölgelerindeki düz kasları, duyu ve motor sistemini harekete geçirmekte, gastrik asit salgısını kontrol altına almaktadır. Bu nedenle histamin zehirlenmesi genellikle geniş bir semptom çeşitliliğiyle ortaya çıkmaktadır. Histamin zehirlenmesinin en belirgin semptomları alerjik benzeri semptomlar olup, ürtiker, lokalize yanmalar, baş ağrısı, düşük kan basıncı, kalp ritim düzensizliği, ödem, mide bulantısı, kusma ve ishaldir (Shalaby, 1999; Rawles ve Flick, 1996). Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tüketilebilir balıklarda maksimum histamin düzeyinin 5 mg/100 g (50 ppm) ı geçmemesi gerektiğini bildirmiştir (FDA, 2001). Avrupa Birliği Scombridae, Clupeidae, Engraulidae, Coryfenidae (Coryphaenidae), Pomatomidae, Scombresosidae familyalarına ait balık türlerinden 9 örnekleme yapılmasını zorunlu kılarak ortalama histamin değerinin 10 mg/100 g (100 ppm) ı aşmaması gerektiğini belirtmiştir. Ancak iki örnekte 10 mg/100 g ı aşmasına izin verilirse de bu değerin 20 mg/100 g ı (200 ppm) geçmemesi şartı vardır. Hiçbir örneğin histamin miktarının ise 20 mg/100 g ı geçmemesi gerekmektedir (European Union Directive, EC, 2007: Directive No: 1441/2007). Ülkemizde ise 29 Aralık 2011 tarihli Türk Gıda Kodeksi Mikrobiyolojik Kriterler Yönetmeliği nde Engraulidae, Scombridae, Clupeidae, Coryfenidae, Pomatomidae, Scombressosidae familyasındaki türlere ait taze soğutulmuş balıklar, dondurulmuş balıklar, işlenmiş balıklar, konserve balıkçılık ürünleri, işlenmiş çift kabuklu yumuşakçalar (kara midye, kıllı midye, akivades, kidonya istiridye, kum midyesi

26 vb.), kabuklular (kerevit, karides, ıstakoz, yengeç vb.), karından bacaklılar (deniz salyangozu vb.) ve kafadan bacaklılar (ahtapot, mürekkep balığı, kalamar vb.) için histamin limitlerine yer verilmiştir. Buna göre taze soğutulmuş balıklar ve dondurulmuş balıklarda kabul edilebilir en yüksek değer 100 ppm (mg/kg) iken bu değer konserve balıkçılık ürünleri ve işlenmiş çift kabuklu yumuşakçalar (kara midye, kıllı midye, akivades, kidonya istiridye, kum midyesi vb.), kabuklular (kerevit, karides, ıstakoz, yengeç vb.), karından bacaklılar (deniz salyangozu vb.), kafadan bacaklılar (ahtapot, mürekkep balığı, kalamar vb.) için 200 ppm (mg/kg) dir. Yukarıda belirtilen balık ve balık ürünlerinden ( konserve balıkçılık ürünleri hariç) alınan 9 adet numunenin ortalaması 100 ppm i geçmemelidir. İki örnekte 100 ppm den fazla 200 ppm den az olabilir fakat hiçbir numunede 200 ppm i geçmemelidir. Konserve balıkçılık ürünleri, işlenmiş çift kabuklu yumuşakçalar (kara midye, kıllı midye, akivades, kidonya istiridye, kum midyesi vb.), kabuklular (kerevit, karides, ıstakoz, yengeç vb.), karından bacaklılar (deniz salyangozu vb.) ve kafadan bacaklılar (ahtapot, mürekkep balığı, kalamar vb.) da alınan 9 adet numunenin ortalaması 200 ppm i geçmemelidir. İki örnekte 200 ppm den fazla 400 ppm den az olabilir fakat hiçbir numunede 400 ppm i geçmemelidir. Histidin düzeyinin balıktan balığa değişebileceği bildirilmiştir. (Ijomah ve ark., 1992). Bu durum balık ürünlerinde histamin düzeyinin bozulma sonrası farklı seviyelerde olabileceğini göstermektedir. Bazı balıklarda serbest histidin içeriğinin mevsimsel olarak değişiklik gösterdiği bildirilmiştir. Ringa balığında histidin içeriği 260 ila 1600 mg/kg arasında değişmekte olup en fazla histidin yaz aylarında gözlenmiştir. Bu nedenle balıklardaki histamin varlığı mevsimsel olarak değişim gösterebilmektedir. Sardalya ve torik balıklarında kış aylarında diğer balıklara göre daha az histamine rastlandığı belirtilmiştir. Bu durum histamin oluşumunu etkileyen sıcaklık faktörü ile de açıklanabilir. Balıklarda histamin miktarı balığın farklı bölgelerine göre de değişmekle birlikte balıklarda en fazla histamin miktarının mikrobiyal yükün baskın olabileceği solungaç ve bağırsaklara yakın bölgelerde gözlendiği ifade edilmiştir (Lehane ve Olley, 2000).

27 Şekil 1.7.Ton balığı vücudunda histaminin yoğun olarak bulunduğu bölgeler (Craven ve ark., 1995). Histamin oluşumu, çeşitli gıdalarda varlığı, zehirlenme ve metodolojisi ile ilgili pek çok kaynakta detaylı bilgi yer almaktadır (Köse ve ark., 2011). Balık ve balık ürünlerinin alınması sonrasında oluşan bu tip biyojen amin zehirlenmelerinin dünyada en fazla rastlanan zehirlenme olduğu bilinmektedir. Histamin zehirlenmesi ile ilgili 1990-1998 yılları arasında Amerika da 759 vaka ve 1992-1999 yılları arasında İngiltere de 47 vaka bildirilmiştir (Ababouch ve ark., 1991; Köse, 1993; Shalaby, 1996). Balık ve balık ürünlerinin tüketilmesinden sonra meydana gelen histamin zehirlenmesine, avlanan balığın taşınmasından tüketim noktasına kadar uygunsuz koşullarda getirilmesi ve işlenmesi sonucu oluşan mikrobiyal kontaminasyon ve hammaddelerin bozuk olması sebep olmaktadır. Dolayısıyla su ürünlerindeki histaminin bulunuşu ile ilgili kalite kriterlerinin hem teknolojik hem de toksikolojik yönden tespit edilmesi büyük önem taşımaktadır. Gıdalarda fazla histaminin bulunuşunu organoleptik olarak belirlemek her zaman mümkün değildir. Çünkü herhangi bir besin maddesinin dış görünüşü, kokusu ve rengi değişmeden de yüksek miktarda histamin içerebilmektedir. Bu durumda doğruluğu kanıtlanmış, güvenilir ve hassas olan histamin analiz yöntemlerinin kullanımı büyük önem taşımaktadır.

28 Balık ve balık ürünlerinde histamin analizi üzerine etkili olan çok çeşitli yöntemler mevcuttur. Bu yöntemlerden çoğunun deniz toksinlerine yönelik olmasına karşın, balıklardaki yüksek histamin düzeylerini saptamak adına basit ve pahalı olmayan kolorimetrik yöntemlerden, LC-MS yöntemlerine kadar çeşitli yöntemler bulunmaktadır (Hungerford, 2010). Balık ve balık ürünlerinde histamin analizlerinde sıklıkla kullanılan ve en bilinen yöntem, güçlü kromoforlar ya da floresans ürünlerin üretilmesi esasına dayanan ön kolon türevlendirmesi veya kolon sonrası türevlendirme kullanılan yüksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) dir (Brillantes ve Samosorn, 2001; Gloria ve ark, 1999; Hwang ve ark., 1997; Malle ve ark., 1996; Veciana-Nouges ve ark., 1995; Petridis ve Steinhart, 1995; Hui ve Taylor, 1983; Meitz ve Karmas, 1978). 1.12.Validasyon Validasyon, bir sistemin, cihazın, yöntemin belirlenen koşullara uygunluğunun belirlenmesi amacıyla uygulanan işlemler ve bu işlemlerin yazılı dökümanlarla onaylanmasıdır. ISO 8402:1994 te ise yöntem validasyonu, analitik gereksinimi belirleme, kullanılan yöntemin, uygulamanın gerektiği şekilde yeterli ve istikrarlı olduğunu doğrulama olarak tanımlanmaktadır. EURACHEM rehberine göre yöntem performansının yeterli olup olmadığını belirlemek, yöntemin uygulanabilirliğine karar vermek ve performans parametrelerini belirlemek yöntem validasyonunun temelidir. Yöntem validasyonu, laboratuvarın, analistin, amaca uygun olan yöntemi kullandığını ispat etmesini sağlar. Yöntem validasyonu ile yöntemin performansı doğrulanarak belirli bir güven aralığında sonuçlar belirtilir. Yöntem performansının analize uygunluğunu belirlemek, dökümanlarla belgelemek için,

29 Standart yöntemlerin laboratuvar koşullarında uygunluğunu göstermek veya analiz sonucunda elde edilen verilerin standart yöntemdeki gereklilikleri karşılayıp karşılamadığını belirtmek için, Yeni yöntem geliştirildiğinde, Kalite kontrol çalışmaları sonucunda var olan yöntemde değişimler olduğu tespit edildiğinde, Bilinen bir yöntemin yeni bir matrikse uygulanmasında, İki yöntem arasındaki benzerlikleri ortaya koymak için, Var olan belirlenmiş yöntemler farklı laboratuvarlarda ya da farklı enstrümanlarda kullanılacağı zaman yöntem validasyonu yapılabilmektedir. Validasyona başlamadan önce; kullanılan alet, ekipman ve araçların uygunluğunun belirlenmesi gerekir. Validasyonu ile ilgili hiçbir bilgi yoksa ön çalışmalarla yöntemin uygulanabilirliği kontrol edilmeli ve yöntem validasyon parametreleri belirlenmelidir. Validasyon tam validasyon ve kısmi validasyon olmak üzere iki çeşittir. Tam validasyon, çoklu laboratuvarların katılımıyla tüm validasyon parametrelerinin yapıldığı bir validasyon çeşitidir. Kısmi validasyon ise standart yöntemler kullanılacağı zaman uygulanabilirliği olan validasyon çeşitidir (EURACHEM, 1998). Validasyon çalışmasına başlanmadan önce planlama yapılmalıdır. Planlama, çalışmada değerlendirilecek parametreleri, zaman planlamasını ve detaylarını içermelidir. Buna göre yöntem seçimi, validasyon planının yapılması, deneysel çalışma, belirsizliğin hesaplanması, kalite kontrol grafiklerinin oluşturulması ve yeterlilik testleri gibi kriterler validasyon planının içerisinde yer almalıdır (NMKL, 2009; EURACHEM, 1998).

30 1.12.1.Validasyon Parametreleri Validasyonu yapılacak yöntemin performans basamakları, yöntemin uygulama amacı ve kapsamına bağlı olarak belirlenmelidir. Ayrıca yöntem validasyonuna başlanmadan önce kullanılacak cihazın performansının test edilip, uygunluğunun belirlenmesi gereklidir. Yöntem performansı ile ilgili hiçbir bilgi yoksa ön çalışmalar yapılarak öncelikle yöntemin amaca uygunluğu tespit edilmeli sonrasında ilk analiz sonuçlarına göre yöntem performans kriterleri belirlenmelidir (EURACHEM, 1998). EURACHEM ve NMKL rehberlerinde yöntem validasyonu için incelenmesi önerilen performans kriterleri; spesifiklik (Specifity) / hassasiyet ve seçicilik (Sensitivity / Selectivity), ölçüm aralığı (Range) ve linearite (Linearity), tespit (belirleme) limiti (Limit of Detection - LOD), tayin (ölçüm) limiti (Limit of Quantification - LOQ), doğruluk (Accuracy), kesinlik (Presicion), geri kazanım (Recovery) parametrelerinden oluşmaktadır (NMKL, 2009; EURACHEM, 1998). 1.12.1.1.Spesifiklik (Specifity), Hassasiyet ve Seçicilik (Sensitivity / Selectivity) Spesifiklik; bir yöntemin, belirlenmiş analiz koşullarında örnek matriksinde aranandan başka komponentlerin bulunması durumunda sadece aranan maddeyi belirleme yeteneğidir. Yani bir metodun, sadece aranan maddeyi belirleme, ölçme yeteneğidir. Hassasiyet ve seçicilik ise belli bir yönteme göre analiz edilen maddenin (analit), başka maddelerle ne kadar etkileştiğinin göstergesidir. Yöntemin ve cihazın (dedektörün) aranan maddeyi matriksle beraber tespit edip etmediği belirlenmelidir. Aynı zamanda dedektörün analiti diğer bileşenlerden ayırt edip edemediğinin belirlenmesi de önemlidir. Kullanılan dedektör, ölçülen analit için spesifikse çoklu deneysel çalışmalara gerek yoktur. Eğer matrikste, aranan analitten başka bileşenlerin varlığı tespit edilmişse o bileşenlerin matrikse karşı interferens etkisi incelenmelidir.

31 Spesifitenin tespitinde, sertifikalı referans maddeler kullanılabilir. Sertifikalı referans madde, validasyonu yapılacak olan yöntemle çalışılarak elde edilen sonuçlar sertifika değeri ile karşılaştırılmalıdır. Sertifikalı referans maddenin bulunmadığı zamanlarda; matriks, validasyonu yapılacak olan yöntemle ve referans yöntemle analiz edilerek sonuçlar karşılaştırılmalıdır. Aranan madde, interferens yapan diğer bileşenler belirlenmeli ve madde standartın üzerine eklenerek matriksin aranan madde-interferens ilişkisi incelenmelidir (EURACHEM, 1998). 1.12.1.2.Ölçüm Aralığı (Range) ve Linearite (Linearity) Ölçüm aralığı, yöntemin uygulama aralığının belirlenmesi için yapılmaktadır. Kalibrasyon eğrisinde ölçülen madde miktarı (konsantrasyonu) ve dedektör yanıtının (response) doğru orantılı olarak görüldüğü aralıktır. Yöntem geçerli kılma çalışmalarında belirlenecek madde konsantrasyonları bu aralık dikkate alınarak planlanmalıdır (Yılmaz, 2012; EURACHEM, 1998). Standart eğri (kalibrasyon eğrisi), yönteme ve ürüne bağlı belirli sayıda ölçüm noktası ile belirlenmektedir. Eğrinin oluşturulması, içinde bilinen referans örnekle veya kör örnek içine eklenmiş analitin bilinen konsantrasyonu ile yapılmaktadır. Eurachem rehberinde en az 6 noktada, bir de kör eklenerek ve her bir noktada tekrar sayısı 3 olarak, ISO 11095 te en az 3 farklı seviyede referans örnek ve tekrar sayısı ise en az 2 olarak belirtilmiştir (Yılmaz, 2012; EURACHEM, 1998; ISO 11095, 1996;). Kalibrasyon grafiğinin, hedeflenen ölçüm aralığını kapsaması gerekmektedir. Kalibrasyon eğrisi oluşturulurken, kalibrasyon standartları hedeflenen ölçüm aralığını içine almalıdır. Uygulanılan yönteme göre madde konsantrasyonlarının belirlenmesi gereklidir. Analiz sonucunda elde edilen yanıtla, çizilen eğride üst ve alt sınırlar belirlenmelidir. Kalibrasyon eğrisinin en alt noktası uygulanan analiz yönteminin ölçüm limiti (LOQ) olmalıdır (EURACHEM, 1998).

32 Kalibrasyon eğrisinin doğrusallığı (linearite), NMKL No:4 rehberinin ek 2 sinde yer alan ANOVA Excel hesaplamalarına göre hesaplanabilmektedir. İlgili hesaplama örneklerine www.nmkl.org sayfasının download Excel spread sheet sayfasından ulaşılabilmektedir. Ayrıca linearite Tiley (1985) e göre şu şekilde hesaplanabilmektedir. Formülasyonlara göre elde edilen sonuçlardan F değeri hesaplanarak F tablosuna göre değerlendirme yapılmalıdır. Elde edilen F değeri, F tablosundaki değerden küçük ise eğri doğrusaldır (Yılmaz, 2012). s 1 n 2 2 1 ( y yˆ ) n 2 i 1 S 1 = Rezidüel Standart Sapma y = Ölçülen y değeri ŷ = Kalibrasyon eğrisinin formülünde x değerinin yerine konulduğu zaman elde edilen y değeri (varsayılan y değeri) n= Toplam ölçüm sayısı s 1 n 2 2 2 ( a b) nk i 1 F s s 2 1 2 2 S 2 = Yalın Hata a= İlgili konsantrasyondaki ilk paralel değeri b= İlgili konsantrasyondaki ikinci paralel değeri n= Toplam ölçüm sayısı k= Her bir noktada tekrar sayısı

33 1.12.1.3.Tespit Limiti (LOD) ve Ölçüm Limiti (LOQ) Tespit limiti (LOD); istatistiksel kesinlik içinde ölçülebilen kabul edilebilir en düşük miktardır. LOD, örnekte ölçülebilen fakat kesin olarak miktarı belirlenemeyen en düşük miktardır. Madde sinyalinin, cihazdaki arka plan gürültüden ayrılabilmesi için gereken en düşük konsantrasyondur. Örnek köründen (içerisinde aranan madde bulunmayan matriks) 10 bağımsız ölçüm yapılır. En yüksek hassasiyet seviyesindeki gürültü değerlerinin standart sapması hesaplanır. Gürültünün standart sapması 3 ile çarpılarak tespit limitinin sayısal değeri belirlenir. Sayısal değer belirlendikten sonra aynı düzeyde standart hazırlanarak analiz yapılır. Sonrasında örnek körüne belirlenen limit düzeyinde analit ilave edilerek 10 bağımsız ölçüm yapılır ve ölçümlerin standart sapması bulunur. Tespit (Belirleme) Limiti (LOD) = Ortalama + 3 Standart Sapma Analitin çok düşük seviyelerde veya çok az miktarda olduğu yerlerde, yöntem tarafından güvenli şekilde belirlenebilecek en düşük konsantrasyon değerini bilmek önem taşır. Tayin (ölçüm) limiti (LOQ) ise kabul edilebilir doğrulukta, kesinlikte ve tekrarlanabilirlikte ölçülebilen en düşük konsantrasyondur. Analitin güvenilir bir şekilde doğru ölçüm yapabilmesi için gerekli en düşük miktardır. Örnek köründen (içerisinde analit bulunmayan matriks) 10 bağımsız ölçüm yapılır. Ölçümlerin standart sapması hesaplanır. Standart sapma 10 ile çarpılarak LOQ nun sayısal değeri belirlenir (EURACHEM, 1998). Ölçüm (Tayin) Limiti (LOQ) = Ortalama + 10 Standart Sapma

34 1.12.1.4.Doğruluk (Accuracy) Doğruluk, ölçüm sonucunun gerçek değere yakınlığını ifade etmektedir. ISO-3534 e göre doğruluğun 2 ana bileşeni vardır. Bunlar gerçeklik ve kesinliktir (EURACHEM, 1998). 1.12.1.4.1. Gerçeklik (Trueness) Ölçüm sonuçlarının ortalamasının gerçek değere yakınlığının ölçüsüdür. Gerçeklik için sistematik hata (bias) hesabı yapılır. Sistematik hata bir ölçüm yönteminin gerçek sonucu verebilme kabiliyetini belirtir. Sistematik hatanın hesaplanabilmesi için doğru olduğu kabul edilen referans değer yani gerçek değer bilinmelidir. Gerçek değer; sertifikalı referans materyallerden, valide edilmiş yöntemle yapılan ölçüm sonucunda veya yeterlilik testleri sonucunda elde edilmiş değerdir. Bu üç yöntemde de ortak nokta gerçek değerin çoklu laboratuvar çalışmaları ile yapılmış ölçümlerin sonucunda elde edilmiş olmasıdır (Yılmaz, 2012; EURACHEM, 1998). Sertifikalı referans materyal kullanarak gerçekliğin tespitinde, sertifika değerine göre sistematik hata hesaplanır. Sistematik hatanın, gerçek değerle arasında önemli bir farkın bulunup bulunmadığı T-testi yapılarak kontrol edilebilmektedir (Yılmaz, 2012). Doğruluk çalışması için ISO 5725-2 de belirtildiği üzere analistin paralel çalışmaları da dahil olmak üzere tüm çalışmalarında normal dağılımda sapan verilerin tespit edilmesi için Grubbs testi kullanılabilmektedir.

35 Bias x bulunan x CRM xbulunan = Tekrar edilebilirlik veya tekrar üretilebilirlik koşulları altında yapılan ölçümlerin ortalaması xcrm = Sertifikalı referans materyalin sertifika değeri ( xcrm xbulunan) t S n = Tekrar edilebilirlik veya tekrar üretilebilirlik koşulları altında yapılan xbulunan ölçümlerin ortalaması xcrm = Sertifikalı referans materyalin sertifika değeri n = Tekrar edilebilirlik veya tekrar üretilebilirlik koşulları altında yapılan ölçümlerin tekrar sayısı S = Tekrar edilebilirlik veya tekrar üretilebilirlik koşulları altında yapılan ölçümlerin standart sapması Ayrıca iki farklı yöntem karşılaştırılarak gerçekliğin tespit edilmesinde de T- testi kullanılmaktadır. Bu şekilde kullanılan yöntemlerde gerçeklik tespit edilirken aynı analist tarafından her iki yöntemde de aynı örneklerin analizi yapılmalıdır. Elde edilen sonuçlar T-testi ile karşılaştırılmalıdır. T-testi ile karşılaştırma yapmak için şu formül kullanılmaktadır (Yılmaz, 2012).

36 t s x 1 1 n x 1 2 1 n 2 s 2 ( n 1 2 1) s1 ( n2 1) s n n 2 1 2 2 2 t = İki yöntemin karşılaştırılması için bulunan t değeri x 1= İlk yöntemin ortalaması x 2 = İkinci yöntemin ortalaması n 1 = İlk yöntemin analiz sayısı n 2 = İkinci yöntemin analiz sayısı s = standart sapma s 1 = İlk yöntemin standart sapması s 2 = İkinci yöntemin standart sapması 1.12.1.4.2. Kesinlik (Presicion) Kesinlik, ölçüm sonuçlarının birbirine yakınlığının ifadesidir. Bağımsız analiz sonuçları arasındaki tutarlılığı göstermektedir. Kesinlik doğruluğun gerçeklik dışındaki diğer bir bileşeni olup çalışanlar ve ekipmanlar tarafından meydana gelen rastgele hataların dağılımını göstermektedir (Yılmaz, 2012; EURACHEM, 1998). Kesinlik ölçümünü 4 faktör etkilemektedir. Bunlar;

37 -kısa zaman (aynı gün) ve uzun zaman (farklı günlerde) aralığı, -kalibrasyon (aynı ekipmanda dahi ölçümler arasında yeniden kalibrasyon yapılıp yapılmadığı), -operatör (aynı veya değişik operatörler), -ekipman (ölçümlerde aynı veya farklı ekipmanların kullanılıp kullanılmadığı) olup bu faktörlerin değişkenliğine göre kesinlik değişmektedir (Yılmaz, 2012). Kesinlik, tekrar edilebilirlik ve tekrar üretilebilirlik olmak üzere iki bileşenden meydana gelmektedir (Yılmaz, 2012; EURACHEM, 1998). 1.12.1.4.2.1. Tekrar edilebilirlik Tekrar edilebilirlik, r harfi ile ifade edilmektedir. Tekrar edilebilirlik koşulları ISO 5725-1 de aynı yönten ile eşdeğer örneklerde aynı laboratuvarda, aynı ekipman ve aynı analist tarafından kısa zaman aralığında elde edilen bağımsız test sonuçları elde edilmesi olarak tanımlanmıştır. EURACHEM (1998) rehberinde kesinlik çalışmaları için 10 tekrardan bahsederken, ISO 5725-3 standardında en az 15 tekrar öngörülmüştür. Kesinlik, kantitatif analizlerde standart sapma (s) ve analiz ölçümlerinin ortalamalarının standart sapmaya bölünmesiyle elde edilen relatif standart sapma (RSD) ile ifade edilmektedir. NMKL No:4 (2009) ve EURACHEM (1998) rehberlerine göre tekrar edilebilirlik standart sapması şu formülle hesaplanabilmektedir.

38 sr n i 1 ( x i n 1 x) 2 S r = Tekrar edilebilirlik standart sapması x i = Analiz sonucu x = Analiz sonuçlarının ortalaması n = Yapılan analizlerdeki tekrar sayısı Tekrar edilebilirlik limiti, Tekrar edilebilirlik şartları altında elde edilen iki analiz sonucu arasında %95 güven aralığında olması beklenen maksimum farktır. Tekrar edilebilirlik limiti r harfi ile ifade edilmektedir ve tekrar edilebilirlik standart sapmasının 2,83 (1,96 x 2) ile çarpılmasından elde edilmektedir (Yılmaz, 2012). r 2, 83xS r r = Tekrar edilebilirlik limiti S r = Tekrar edilebilirlik standart sapması

39 F-Testi: Kesinlik parametreleri içerisinde, kısa zaman aralığında bir personelin bir analizinin paralel çalışmaları arasındaki farkın önemli olup olmadığı F testi yapılarak belirlenmektedir (NMKL, 2009). SSA c j 1 n( x x) 2 SSA = Gruplar arası hataların kareler toplamı c = Çalışılan gün sayısı n = Çalışma Sayısı x = Farklı günlerdeki çalışmaların ortalaması x = Genel Ortalama df1 p 1 df 1 = Serbestlik derecesi p = Grup sayısı MSA SSA df 1 MSA = Gruplar arası kareler ortalaması /serbestlik derecesi df 1 = Serbestlik derecesi

40 SSW c j 1 nj i 1 ( x x) 2 SSW = Grup içi kareler toplamı c = Çalışılan gün sayısı n = Çalışma sayısı x = Farklı günlerdeki çalışma sonuçları (1. ve 2. çalışma sonuçları) x = Farklı günlerdeki çalışmaların ortalaması df 2 n toplam p df 2 = Serbestlik derecesi n toplam = Grupların örnek sayıları p = Grup sayısı SSW MSW df 2 MSW = Grup içi hataların kareler ortalaması / serbestlik derecesi df 2 = Serbestlik derecesi (Grup içi kareler ortalaması için df= c(çalışılan gün sayısı) dir.)

41 F MSA MSW MSA = Gruplar arası kareler ortalaması /serbestlik derecesi MSW = Grup içi kareler ortalaması / serbestlik derecesi Bu formüllere göre hesaplanan F değeri tablodaki F değeri ile karşılaştırılır. Bulunan F değeri F tablosunda (N-2; NK-N)'e göre bulunan değerden küçük olmalıdır. (N= Toplam ölçüm sayısı, K= Tekrar sayısı) Fbulunan F tablo 1.12.1.4.2.2. Tekrar üretilebilirlik Tekrar üretilebilirlik R harfi ile ifade edilmektedir ve ISO 5725 standartının birinci bölümünde aynı yöntem ile eşdeğer örneklerde farklı laboratuarlarda, farklı ekipman ve farklı analist tarafından uzun zaman aralığında elde edilen bağımsız analiz sonuçlarını ifade edilmektedir. NMKL No:4 (2009) rehberlerine göre tekrar üretilebilirlik standart sapması şu formülle hesaplanabilmektedir.

42 n ( xi yi ) i 1 s R 2n 2 S R = Tekrar üretilebilirlik standart sapması x i = 1. Analiz sonucu ( farklı cihaz, farklı personeller arası) y i = 2. Analiz sonucu ( farklı cihaz, farklı personeller arası) n = Yapılan analizlerdeki tekrar sayısı Tekrar üretilebilirlik limiti, tekrar üretilebilirlik şartları altında elde edilen iki analiz sonucu arasında %95 güven aralığında olması beklenen maksimum farktır. Tekrar üretilebilirlik limiti R harfi ile ifade edilmektedir ve tekrar üretilebilirlik standart sapmasının 2,8 (1,96 x 2) ile çarpılmasından elde edilmektedir (Yılmaz, 2012). R 2, 83xS R R = Tekrar üretilebilirlik limiti S R = Tekrar üretilebilirlik standart sapması EURACHEM (1998) rehberine göre tekrar üretilebilirlik limiti için farklı analistlerin veya farklı cihazlarla yapılan analizlerin çalışma sonuçları arasındaki mutlak farkın tekrar üretilebilirlik standart sapmasından küçük veya küçük eşit olması gerektiği belirtilmektedir. Bu durumun gerçekleşmediği durumlarda analist tüm analizi tekrar etmelidir.

43 Horwitz Oranı (Horrat) Horwitz oranı/ değeri (Horrat) basit bir performans parametresi olup kimyasal yöntemlerin kesinliğinin kabul edilebilirliği konusunda bilgi vermektedir. Her ne kadar laboratuvarlar arası relatif standart sapma (RSD R ) ile ilgili olarak geliştirilmiş olsa da laboratuvar içi relatif standart sapma (RSD r ) için de uygulanabilmektedir. Horrat değeri 2 den küçük olmalıdır (Yılmaz, 2012). - Horrat 0,5 ise yöntem tekrar üretilebilirliği/tekrar edilebilirliği çok düşüktür ve çalışmanın bağımsızlığında sorun vardır. - 0,5 < Horrat 1,5 ise yöntem tekrar üretilebilirliği/ tekrar edilebilirliği beklenen şekildedir. Normaldir. - Horrat > 1,5 ise yöntem tekrar üretilebilirliği / tekrar edilebilirliği beklenenden daha yüksektir. Çalışmada gözden geçirme yapılması faydalı olacaktır. - Horrat > 2 ise yöntem tekrar üretilebilirliği/ tekrar edilebilirliğinde sorun vardır (Yılmaz, 2012). Horrat hesabı için şu formül kullanılmaktadır. RSD Horrat RSD eldeedilen öngörülen

44 RSD öngörülen 2 (1 0,5 LogC) RSD eldeedilen = Tekrar üretilebilirlik/tekrar edilebilirlikten gelen relatif standart sapma C = Konsantrasyon (100g /100g için 1, 1000 mg /kg için 0,001 ve 1 mg/kg için 0,000001) Grubbs Testi: Bir analistin paralel çalışmaları da dahil olmak üzere tüm çalışmalarının kendi içindeki normal dağılımını gösteren hesaplamalardır. ISO 5725-2 de Grubbs testinin normal dağılımda sapan verilerin tespit edilmesi için kullanılması önerilmektedir. Sapma şüphesi olan en yüksek ve en düşük değerler formüllere göre hesaplanarak değerlendirilmelidir. G max x max x s G min x x s min G max = Grubbs testinde en yüksek sapma gösteren verinin bulunan değeri G min = Grubbs testinde en düşük sapma gösteren verinin bulunan değeri x max = Normal dağılımda sapma gösteren en yüksek analiz sonucu x min = Normal dağılımda sapma gösteren en düşük analiz sonucu x = Analiz sonuçlarının ortalaması s = Standart sapma

45 s n i 1 ( x i x) n 1 2 s = Tekrar edilebilirlik standart sapması x i = Analiz sonucu x = Analiz sonuçlarının ortalaması n = Yapılan analizlerdeki tekrar sayısı x n i 1 n x i x = Analiz sonuçlarının ortalaması x i = Analiz sonucu n = Yapılan analizlerdeki tekrar sayısı Grubbs testinde değerlendirme yapmak için formüllerle bulunan değerler Grubbs testi değerlendirme tablosundaki değerle karşılaştırılır. -Sonuç kendi kritik değerinin % 5 ine eşit veya bu değerden daha az ise, denenen madde doğru olarak kabul edilir. -Sonuç kendi kritik değerinin % 5 inden büyük ve kendi kritik değerinin %1 inden küçük veya buna eşit ise, denenen madde uzakta kalan olarak adlandırılır.

46 -Deney istatistiği kendi kritik değerinin %1 inden büyük ise, madde istatistiki açıdan değerlendirme dışı olarak bırakılan olarak adlandırılır. 1.12.1.5. Geri Kazanım (Recovery) Analiz yöntemi kullanılarak, sertifikalı referans materyalde var olan veya yöntemde kullanılacak matrikse eklenmiş analit ile ölçüm sonucunda elde edilen miktarın yüzde oranı geri kazanım olarak ifade edilmektedir. Uygulanan yöntemlere göre geri kazanım oranları farklılık göstermektedir. Güvenilir bir yöntem ile sertifikalı referans madde kullanılarak veya içinde analit olmadığından emin olduğumuz matrikse standart eklenmesi şeklinde geri kazanım iki yolla hesaplanabilmektedir (EURACHEM, 1998). ( GeriKazanm G G G3 100 G 1 = Örnek + Standart Konsantrasyonu G 2 = Örnek Konsantrasyonu G 3 = Standart (Analit) Konsantrasyonu ) 1 2 x Yapılan tez çalışmasında, histaminin hassas ve güvenilir bir şekilde tespit edilmesi için, birinde Özdestan ve Üren (2009) tarafından yapılmış DAD dedektör ve türevlendirme ajanı olarak benzoil klorürün kullanıldığı modifiye yöntemi, diğerinde ise Antoine ve ark. (1999) tarafından yapılmış FLD dedektör ve o-fitaldialdehit türevlendirme ajanı ile ön kolon türevlendirmesinin kullanıldığı HPLC yöntemi ile validasyon parametreleri hesaplanmış ve bu iki yöntem istatistiki olarak karşılaştırılarak balık ve balık ürünlerinde histamin düzeylerinin tespiti için en hassas, güvenilirliği ve uygulanabilirliği en iyi olan HPLC yönteminin belirlenmesi amaçlanmıştır.

47 2. GEREÇ VE YÖNTEM Tez çalışmaları Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı na bağlı olarak hizmet veren İstanbul Gıda Kontrol Laboratuvar Müdürlüğü nde bulunan yüksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) cihazları ile yapılmıştır. Yöntemlerde kullanılan cihazlar ve modelleri Çizelge 2.4 de yer almaktadır. Materyal olarak teşhis ve ölçüm limitlerini belirleme çalışmalarında İstanbul Küçükçekmece sahilinden tutulan istavrit balığı; doğruluk, kesinlik, geri kazanım ve yöntemler arası karşılaştırma gibi parametrelerin belirlenmesinde ise içerisinde bilinen düzeyde histamin içeren sertifikalı referans materyal (FAPAS T2775QC) kullanılmıştır. Histamin düzeylerinin tespiti ve validasyon çalışmalarında benzoil klorür türevlendirilmesi ile DAD dedektörün kullanıldığı yüksek performans sıvı kromatografisi yöntemi ve o-fitaldialdehit türevlendirmesi ile FLD dedektörün kullanıldığı yüksek performans sıvı kromatografisi yöntemi kullanılmıştır. 2.1 Gereç 2.1.1.Kullanılan Kimyasal Maddeler Çalışmada kullanılan kimyasal maddeler o-fitaldialdehit yöntemi ve benzoil klorür yöntemine göre farklılık göstermektedir. Yöntemlere göre kullanılan kimyasal maddeler Çizelge 2.1 ve 2.2. de yer almaktadır.

48 2.1.1.1. O-fitaldialdehit HPLC Yönteminde Kullanılan Kimyasal Maddeler Çizelge 2.1. O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan HPLC yönteminde kullanılan kimyasal maddeler Kimyasal Madde Adı Üretici Firma Katalog Numarası Histamin dihidroklorür, %99 saflıkta Sigma-Aldrich H7250 Sodyum Hidroksit Merck 106462 Sodyum dihidrojen fosfat dihidrat Merck 106342 O-fitaldialdehit(OPA) Merck 111452 2-Merkaptoetanol Merck 805740 Sodyum tetraborat dekahidrat Riedel de Haen 11627 Metanol (HPLC dereceli) Merck 106007 Tetrahidrofuran Sigma-Aldrich 34865 2.1.1.2.Benzoil Klorür HPLC Yönteminde Kullanılan Kimyasal Maddeler Çizelge 2.2. Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yönteminde kullanılan kimyasal maddeler Kimyasal Madde Adı Üretici Firma Katalog Numarası Histamin dihidroklorür, %99 saflıkta Sigma-Aldrich H7250 1,7-diaminoheptan Sigma-Aldrich D17408 Sodyum Hidroksit Merck 106462 Benzoil Klorür Sigma-Aldrich 259950 Sodyum Sülfat(Susuz) Merck 106639 Sodyum Klorür Merck 106400 Hidroklorik Asit Merck 100317 Trikloroasetik asit (TCA) Sigma-Aldrich 27242 Dietil eter (% 99,5 saflıkta) Honeywell 65756 Asetonitril (HPLC dereceli) Merck 100030 Metanol (HPLC dereceli) Merck 106007 Sodyum Asetat trihidrat Sigma-Aldrich 25022

49 2.1.2. Kullanılan Sarf Malzemeler Çizelge 2.3. O-fitaldialdehit ve Benzoil Klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemlerinde kullanılan sarf malzemeler Sarf Malzeme Adı Üretici Firma Katalog Numarası Pipet uçları 100 µl Eppendorf 0030073.061 Pipet uçları1000 µl Eppendorf 0030073.100 Santrifüj tüpü (BD Falcon) 50 ml Poliproplen Biosciences 743-0453 Santrifüj tüpü (BD Falcon) 15 ml Poliproplen Biosciences 743-0450 Tek kullanımlık şırınga filtresi Sartorius 17765 (0,45 µm por büyüklüğüne sahip) Blendır kabı (çelik, 1L) Waring 431-9123 Cam balon joje (2000 ml) Isolab 013.01.902 Cam balon joje (1000 ml) Isolab 013.01.901 Cam balon joje (100 ml) Isolab 013.01.100 Poliproplen balon joje (250 ml) Isolab 014.03.250 Poliproplen balon joje (100 ml) Isolab 014.03.100 Poliproplen balon joje (250 ml) Isolab 0.26.03.500 Parafilm Isolab 0.58.01.002 Cam pipet (5 ml) Isolab 021.01.005 Cam pipet (10 ml) Isolab 021.01.010 Cam pipet (25 ml) Isolab 021.01.025 Tek kullanımlık steril şırınga(20 ml) Hayat 12214 Vakum filtrasyon ünitesi(1000 ml) Schott Duran PM-996 Membran filtre, porafil Macherey-Nagel 081115 (0,45 µm por büyüklüğüne sahip) Laboratuvar standı Kartell 241-3216 Puar Isolab 011.02.001 Ayırma hunisi (250 ml)poliproplen Nalgene 527-0006 Amber Vial(vidalı kapaklı) Supelco 27003 Amber Vial (32 x 11,6 mm) VWR 548-0448 Septalı kapak Agilent 5182-C717 Mezür (1000 ml) Isolab 015.01.901 Mezür (100 ml) Isolab 015.01.100 Mobil faz şişesi(dar ağızlı, cam, 2000 ml) Isolab 061.01.902 Mobil faz şişesi(dar ağızlı, cam, 1000 ml) Isolab 061.01.901 Spatül (210 mm) Isolab 047.01.210 Kaşık spatula VWR 231-0184 Kaba filtre kağıdı Munktell A524938

50 2.1.3.Kullanılan Cihazlar Çizelge 2.4. O-fitaldialdehit ve Benzoil Klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemlerinde kullanılan cihazlar Cihaz Adı Üretici Firma Katalog Numarası HPLC(1100 serisi), FLD Dedektörlü Agilent DE40525967 HPLC(1100 serisi), FLD Dedektörlü Agilent DE91609941 HPLC(1100 serisi), DAD Dedektörlü Agilent DE33224774 HPLC(1100 serisi), DAD Dedektörlü Agilent DE40926081 Analitik terazi (XB 220A) Precisa 2407-844 Hassas terazi (XT 10200 D) Precisa 2424-249 Buzdolabı Bosch SSH 210923 Ultra saf su cihazı(young Ling) Aquamax Ultra 3500054 Tüp karıştırıcı(vorteks, MN 110) Nüve 02-1178 Blender(32 BL 79 (8010)) Waring 20123 Derin Dondurucu(- 20 ⁰C) Arçelik MZ 001714 Santrifüj(Soğutmalı, 3K 152) Sigma 79445 Ph-Metre (3520) Jenway 35433 Çeker ocak (Faster) Chem free SN 201 Su banyosu ve azot gazı uçurma düzeneği Bilge Otomatik pipet (100 µl) Eppendorf 3484596 Otomatik pipet (1000 µl) Eppendorf 182843Z Vakum manifoldu ve pompası Agilent 26598617 2.2.Yöntem 2.2.1.Benzoil Klorür Türevlendirmesi Kullanılan HPLC Yöntemi Bu yöntem örnek ekstraksiyonu, türevlendirme ve HPLC ye enjeksiyon aşamalarından oluşmaktadır.

51 2.2.1.1.HPLC Şartları Akış: 1 ml/dk Otomatik Enjeksiyon Sistemi: 10µl enjeksiyon yapabilen Analitik Kolon: 300 mm C18 125A 10µm Dedektör:DAD dedektör, 254 nm dalga boyu Sıcaklık: 23 ºC 2.2.1.2.HPLC Gradienti Zaman(dakika) %C %D 0,00 90,00 10,00 4,00 70,00 30,00 10,00 70,00 30,00 12,00 60,00 40,00 16,00 40,00 60,00 19,00 30,00 70,00 22,00 0,00 100,00 24,00 0,00 100,00 30,00 90,00 10,00 32,00 90,00 10,00 2.2.1.3.Mobil fazların hazırlanması Mobil Faz A: 0,05 M Asetat Tamponu (Sodyum Asetat trihidrat) + Metanol (6v+4v) (ph 8 e ayarlanarak, membran filtreden süzülür) Mobil Faz B: Metanol

52 2.2.1.4.Standart Çalışma Çözeltisinin hazırlanması 50 mg histamin ve 50 mg iç standart ayrı ayrı balon jojelerde 0,1 M HCl ile 25 ml ye tamamlanarak 5 kat ultra saf su (125 ml) ile seyreltirir ve ana stok çözeltisi hazırlanır. Hazırlanan histamin ana stok çözeltisinden 5 ml alınarak 20 ml ultra saf su ile seyreltilir ve ara düzey standartı hazırlanır. Hazırlanan ara düzey standartından 4 farklı konsantrasyonda kalibrasyon tablosu standartları hazırlanır. *Standart 1 (STD 1)= 1v / 1v oranında ara düzey standart ından alınarak, ultra saf su ile seyreltilir.(166,65 ppm) * Standart 2 (STD 2) = STD 1 v / 1v oranında Standart 1 den alınarak, ultra saf su ile seyreltilir.(83,3 ppm) * Standart 3 (STD 3) = 1v / 9v oranında ara düzey standart ından alınarak, ultra saf su ile seyreltilir. (16,65 ppm) * Standart 4 (STD 4) = STD 2 v / 8v oranında Standart 1 den alınarak, ultra saf su ile seyreltilir. (8,33 ppm) Histamin standart çözeltisinden ağzı kapaklı bir tüpe 0,5 ml alınarak içerisine 0,1 ml iç standart (1,7 Diaminoheptan) ve 2ml saf su ilave edilir, 2 ml 2 M NaOH eklenerek ortam bazik yapılır ve 30 µl benzoil klorür (türevlendirme reaktifi) ilave edilir. Tüpün ağzı kapatılarak vorteks karıştırıcıda 5 dk 2200 devir/dk karıştırıldıktan sonra 1,5 ml asetonitril ilave edilir ve 30 sn 2200 devir/dk karıştırılır. Karışım 10 dk 25⁰C de türevlendirmeye bırakılır. Süre sonunda 1,5 g NaCl ilave edildikten sonra vorteks karıştırıcıda 1 dk 2200 devir/dk karıştırılır. Sonra türevlenen kısım 3 kez 4 ml dietileter ile ayırma hunisinde 1 dakika çalkalanarak dietileter içeren fazlar toplanır. 1 g susuz sodyum sülfat eklenerek 5 dk bekletilir. Sıvı kısım temiz tüpe aktarılarak azot gazı altında eter fazı uzaklaştırılır. Tüpteki kalıntı 1 ml metanolle çözüldükten sonra 0.45µm filtreden geçirilerek viale alınır ve HPLC cihazına enjeksiyonu yapılmak üzere verilir.

53 2.2.1.5.Numune Hazırlama 25g örnek %5 TCA ile 250 ml ye tamamlanarak blendır yardımı ile 2 dk homojenize edilir. Numune yağlı ise 4⁰C de 5dk/3500-4000 devirde santrifüj edilerek yağ fazı alınır. Sonrasında numune kaba filtre kağıdından süzülerek numune ekstraktından 2 ml ağzı kapaklı tüpe alınır. 0,1 ml iç standart (seyreltilmiş), 0,5 ml saf su, 2,5 ml NaOH ilave edilerek ortam bazik yapılır ve 0,1 ml benzoil klorür (türevlendirme reaktifi) eklenir. Tüpün ağzı kapatılarak vorteks karıştırıcıda 5 dk 2200 devir/dk karıştırıldıktan sonra 1,5 ml asetonitril ilave edilir ve 30 sn 2200 devir/dk karıştırılır. Karışım 10 dk 25⁰C de türevlendirmeye bırakılır. Süre sonunda 1,5 g NaCl ilave edildikten sonra vorteks karıştırıcıda 1 dk 2200 devir/dk karıştırılır. Sonra türevlenen kısım 3 kez 4 ml dietileter ile ayırma hunisinde 1 dakika çalkalanarak dietileter içeren fazlar toplanır. 1 g susuz sodyum sülfat eklenerek 5 dk bekletilir. Sıvı kısım temiz tüpe aktarılarak azot gazı altında eter fazı uzaklaştırılır. Tüpteki kalıntı 1 ml metanolle çözüldükten sonra 0.45µm filtreden geçirilerek viale alınır ve HPLC cihazına enjeksiyonu yapılmak üzere verilir. 2.2.2. O-Fitaldialdehit (OPA) Türevlendirmesi Kullanılan HPLC Yöntemi Bu yöntemde analiz örneği ilk olarak metanol su ile ekstrakte edilir. Ekstraksiyon sonrasında santrifüj edildilerek 0,45 µm por büyüklüğüne sahip şırınga filtresi ile filtre edilir. Vialde OPA çözeltisi kullanılarak türevlendirilir ve histamin miktarı HPLC de analitik kolondan geçtikten sonra fluorometrik olarak tayin edilir.

54 2.2.2.1.HPLC Şartları Akış: 1 ml/dk Otomatik Enjeksiyon Sistemi: 20µl enjeksiyon yapabilen Analitik Kolon: C18 ODS 5 µm 4,6 mm x 15 cm Dedektör: FLD dedektör, 330 nm eksitasyon, 418 emisyon dalga boyu Sıcaklık: 25 ºC 2.2.2.2.HPLC Gradienti Zaman(dakika) %C %D 5,00 85,00 15,00 10,00 50,00 50,00 22,00 50,00 50,00 25,00 0,00 100,00 34,00 0,00 100,00 2.2.2.3.Mobil Fazların Hazırlanması Mobil Faz A: 0,05 M NaH 2 PO 4.2H 2 O (ph 5,5 1 N NaOH ile ayarlanır) + Metanol + Tetrahidrofuran (80v+19v+1v) Mobil Faz B: Metanol + 0,05 M NaH 2 PO 4.2H 2 O (ph 5,5 1 N NaOH ile ayarlanır) (80v+20v) OPA Çözeltisi: 27 mg OPA 0,5 ml metanol ile çözündürülür. 5 ml 0,1 M Na 2 B 4 O 7 ile seyreltilir, 50 µl 2-Merkaptoetanol ilave edilir ve vortekslenir.

55 2.2.2.4.Standart Çalışma Çözeltisinin hazırlanması Standartlar 0,05 M NaH 2 PO 4.2H 2 O (ph 5,5 olarak 1 N NaOH ile ayarlanır) ile hazırlanır. 20 mg kristal haldeki saf histamin standardından alınır. 100ml ye 0,05 M NaH 2 PO 4.2H 2 O (ph 5,5 olarak 1 N NaOH ile ayarlanır) ile seyreltilerek ana stok standartı hazırlanır. Bu standart çözeltiden 5 farklı konsantrasyonda standart hazırlanır. *Standart 5 (STD 5) = Ana stok standartıdır. 20 mg kristal haldeki saf histamin standardından alınır. 100 ml ye 0,05 M NaH 2 PO 4.2H 2 O (ph 5,5 1 N NaOH ile ayarlanır) ile seyreltilerek hazırlanır.(200 ppm) *Standart 4 (STD 4 ) = 1 v / 1 v oranında STD 5 ten alınarak 0,05 M NaH 2 PO 4.2H 2 O (ph 5,5 1 N NaOH ile ayarlanır) ile seyreltilerek hazırlanır.(100 ppm) *Standart 3 (STD 3 ) = 1 v / 9 v oranında STD 4 ten alınarak 0,05 M NaH 2 PO 4.2H 2 O (ph 5,5 1 N NaOH ile ayarlanır) ile seyreltilerek hazırlanır.(10 ppm) *Standart 2 (STD 2 ) = 1 v / 9 v oranında STD 3 ten alınarak 0,05 M NaH 2 PO 4.2H 2 O (ph 5,5 1 N NaOH ile ayarlanır) ile seyreltilerek hazırlanır. (1 ppm) *Standart 1 (STD 1 ) = 3 v / 7 v oranında STD 2 ten alınarak 0,05 M NaH 2 PO 4.2H 2 O (ph 5,5 1 N NaOH ile ayarlanır) ile seyreltilerek hazırlanır. (0,3 ppm) Hazırlanan standartlar kalibrasyon tablosunun oluşturulmasında kullanılır. Hazırlanan bu enjeksiyon standartları OPA çözeltisi ile 100 µl standart + 400 µl OPA çözeltisi olacak şekilde bir vial içerisine pipetlenerek 30 saniye süreyle vortekslenir. Böylece türevlendirme işlemi yapılmış olur. Her türevlendirme işlemini takip eden 3 dakika içerisinde standartlar HPLC ye sırası ile enjeksiyon yapılmak üzere verilir.

56 2.2.2.5.Numune Hazırlama Numuneler homojen hale getirilerek analiz edilecek numune ayrılır ve 10 g numune blendır kabına alınarak üzerine 40 ml ekstraksiyon çözeltisi (%75 metanol) ilave edilir. 2 dakika blendırla karıştırılır. Üzerine 45 ml ekstraksiyon çözeltisi (%75 metanol) ilave edilir ve 2 dakika blendırla karıştırılır. Çamur kıvamına gelen numune poliproplen bir beherde 60 dk 4⁰C de bekletilir. 10000 devirde 4⁰C de 40 dk santrifüj edilir. Üstteki yağlı kısım atılarak yağsız sıvı kısım 0,45 µm lik filtreden geçirilir. Bu karışımdan 100 µl viale alınır ve üzerine 400 µl OPA çözeltisi ilave edilir. 30 saniye süre ile vortekslenir ve 20 µl türevlendirilmiş elüat HPLC ye enjeksiyon yapılmak üzere verilir. 2.2.3. Analiz sonuçlarının hesaplanması HPLC analizlerinde sonuçlar belirlenirken dilüsyon faktörü de hesaba katılmalıdır. Dilüsyon faktörü hesaplamak için; Ekstraksiyon sonucunda viale alınan miktarlar göz önünde bulundurularak (OPA türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi =0,1 ml; benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi =1 ml) HPLC ye enjekte edilen miktara göre (OPA türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi=0,02ml; benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi=0,1 ml) hesaplama yapılır. Örneğin; OPA türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi için ekstraksiyon sonucunda viale alınan miktar 0,1 ml dir. Mevcut yöntemde 10 g numune tartılıp 85 ml %75 lik metanol ile blendırla karıştırılır buna göre, 10 g numune 85ml %75 lik MeOH da varsa X 0,1 ml de X=0,011764999 g numune 0,1 ml de bulunur.

57 Bu çözeltiden HPLC ye 0,02 ml enjekte edilir. 0,1 ml de 0,011764999 g numune temsil ediliyorsa 0,02 ml de X X=0,00235299986 g numune temsil edilir. Sonucun 1 g numuneyi temsil etmesi için gerekli olan dilüsyon faktörü, 1 / 0,00235299986= 424,9894 tür. Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yönteminde aynı yolla hesaplanan dilüsyon faktörü (çarpan faktörü) ise 500 dür. Teşhis limiti ve diğer parametrelerdeki sonuçların elde edilmesi için HPLC de okunan sonuçlar dilüsyon faktörleri ile çarpılırsa numunedeki histamin miktarı ppm olarak bulunur. W Histamin =MxD W Histamin = Numunedeki histamin miktarı (ppm) M = HPLC de okunan sonuç D = Dilüsyon faktörü (OPA yöntemi için=424,9894; Benzoil Klorür yöntemi için=500)

58 2.2.4. İstatistik Analizler İstatistiksel analizler Excel 2007 programında ANOVA hesaplamalarına göre yapılmıştır. Yöntem validasyon parametrelerinden linearite için ANOVA regresyon hesaplamaları kullanılmıştır. Yöntemler arası karşılaştırma için EURACHEM (1998) ve NMKL No. 4 (2009) rehberlerinde belirtildiği gibi T-testi yapılmıştır. Doğruluk parametresi için her yöntemde sapan verilerin kontrolü ISO 5725-2 de ve Grubbs ve Beck (1972) de belirtildiği gibi Grubbs Testi kullanılarak yapılmış ve Winer (1962) e göre yöntemlerin analiz sonucu değerlerinin sertifikalı referans maddenin sertifika değeriyle arasında önemli bir fark bulunup bulunmadığını belirlemek için T- testi yapılmıştır. Kesinlik parametresi içerisinde yer alan tekrar edilebilirlik için her yöntemde sapan verilerin kontrolü ISO 5725-2 de belirtildiği gibi Grubbs Testi kullanılarak yapılmış ve analizin paralel çalışmaları arasındaki farkın önemli olup olmadığı her yöntem için ANOVA F-testi kullanılarak yapılmıştır. Yılmaz (2012) ve Horwitz ve Abert (2006) ya göre kesinlik parametreleri içerisinde yöntemlerin kabul edilebilirliğini saptamak için Horrat değeri hesaplaması yapılmıştır.

59 3.BULGULAR 3.1. Histaminin Kromatografik Profili Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan (DAD yöntemi) ve O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan (FLD yöntemi) HPLC yöntemleri için sertifikalı saf kristalize histamin standartı kullanılarak farklı düzeylerde çalışma standartları hazırlanmıştır. Hazırlanan standartlardan HPLC de yapılan enjeksiyonlar sonucu standartın çıkış zamanı belirlenmiş ve kromatografik profil ortaya konmuştur. 3.1.1. O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi (FLD yöntemi) ile tespit edilen histaminin kromatografik profili, ölçüm aralığı ve linearite sonuçları Şekil 3.1. O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ile tespit edilen histamin biyojen amininin kromatografik dağılımı

60 O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemine göre hazırlanan histamin standartının HPLC ye enjeksiyonu sonrasında 18-19 dakika içerisinde pik verdiği ve iyi bir dağılım gösterdiği belirlenmiştir. Yöntem iki mobil fazla kullanım gerektirdiği için cihazda gradient mod kullanılmıştır ve cihaz kolonun 300 mm uzunluğunda olması her bir enjeksiyonun 40 dakikada sonlanmasına neden olmuştur. Bu yöntemde kalibrasyon eğrisi çizmek için, yöntemde belirtilen düzeyde sertifikalı saf kristalize histamin standartı ile hazırlanan ana stok çözeltisi dilüe edilerek ara düzey çözeltisi hazırlanarak, ara düzey çözeltiden 0,3 ppm, 1 ppm, 10 ppm, 100 ppm, 200 ppm düzeylerinde 5 farklı düzeyde histamin çalışma standartı hazırlanmıştır. 5 farklı düzeyde hazırlanan çalışma standartlarının türevlendirme sonrasında HPLC ye 2 tekrarlı olarak enjeksiyonu ile belirlenen analiz sonuçları, Microsoft Excel (2007) programından yararlanılarak kalibrasyon eğrisi grafiği çizdirilmiş ve korelasyon katsayısı hesaplanmıştır. Linearitenin belirlenmesi için ANOVA regresyon analizi kullanılmış ve F testi yapılmıştır. Kalibrasyon eğrisi ve korelasyon katsayısı Şekil 3.3 de verilmiştir. Kalibrasyon eğrisinin linear (doğrusal) olup olmadığına ilişkin hesaplamalar Çizelge 3.1 ve 3.2 de verilmiştir. Bu sonuçlar doğrultusunda dedektör cevabıyla histamin çalışma standartları arasında linear bir ilişki olduğu tespit edilmiştir. Değerlendirme Çizelge 3.3 de yer almaktadır.

Alan (LU) 61 Şekil 3.2. O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ile belirlenen histamin standartının (1 ppm) kromatografik profili Histamin FLD Kalibrasyon Eğrisi 5000,00 4500,00 4000,00 y = 5711,3x + 5,3739 R² = 0,9997 3500,00 3000,00 2500,00 2000,00 1500,00 1000,00 500,00 0,00 0,0000 0,2000 0,4000 0,6000 0,8000 1,0000 Konsantrasyon (ppm) Şekil 3.3. O-fitaldialdehit türevlendiresi kullanılan HPLC yöntemi ile tespit edilen histaminin kalibrasyon eğrisi

62 Çizelge 3.1. O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ile tespit edilen histamin kalibrasyon eğrisinin yalın hatası Tekrar Sayısı Konsantrasyon mg/l( ppm) Alan Konsantrasyon Alanların farkları Farkların karesi 1 0,0012 5,39 0,4986 0,248642 1 0,0012 4,89 2 0,0040 16,51 0,45 0,19897 2 0,0040 16,07 3 0,0400 215,48-81,28 6605,702 3 0,0400 296,76 4 0,4000 2312,29 53,69 2882,437 4 0,4000 2258,60 5 0,8000 4658,79 166,31 27659,36 5 0,8000 4492,48 Toplam 37147,95 2 S 2 3714,795 S 2 : Yalın hatadır. Çizelge 3.2. O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ile tespit edilen histamin kalibrasyon eğrisinin rezidüel standart sapması (ANOVA Regresyon Hesabı Fark Çıkışı) Gözlem Öngörülen Farklar Standart Farklar Farkların Karesi 1 12,22745982-6,837709824-0,145065273 0,021043933 2 12,22745982-7,336349824-0,155644158 0,024225104 3 28,21921242-11,70591242-0,248346511 0,06167599 4 28,21921242-12,15197242-0,257809887 0,066465938 5 233,8274601-18,34449006-0,3891871 0,151466598 6 233,8274601 62,93097994 1,335110733 1,782520668 7 2289,909936 22,37839358 0,474768285 0,225404925 8 2289,909936-31,30993642-0,664255224 0,441235002 9 4574,446021 84,34401872 1,789398556 3,201947191 10 4574,446021-81,96702128-1,738969422 3,024014651 Toplam 9 2 S 1 1,125 S 1 =Rezidüel standart sapma

63 Çizelge 3.3. O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ile tespit edilen histamin kalibrasyon eğrisinde F-testi F bulunan F tablo(8,10)* DEĞERLENDİRME 1,125 3714,795 0,000302843 3,35 F bulunan <F tablo S 1 2 S 2 2 LİNEAR(DOĞRUSAL) dır. *F tablo = F tablosunda (N-2,NK-N ( 8, 10)) bulunur. N = Toplam ölçüm sayısı (o-fitaldialdehit yöntemi için10), K = Tekrar sayısı(2) dır. S 1 = Rezidüel standart sapma, S 2 = Yalın hata dır. 3.1.2. Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi (DAD yöntemi) ile tespit edilen histaminin kromatografik profili, ölçüm aralığı ve linearite sonuçları Şekil 3.4. Benzoil klorür yöntemi ile tespit edilen histaminin kromatografik dağılımı

64 Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemine göre hazırlanan histamin standartının HPLC ye enjeksiyonu sonrasında 20 dakika içerisinde pik verdiği ve iyi bir dağılım gösterdiği belirlenmiştir. Türevlendirme kontrolü için bu yöntemde iç standart (1,7 diaminoheptan) kullanılmıştır. Yöntem iki mobil fazla kullanım gerektirdiği için cihazda gradient mod kullanılmıştır ve cihaz kolonun 300 mm uzunluğunda olması her bir enjeksiyonun 35 dakikada sonlanmasına neden olmuştur. Kullanılan yöntemde kalibrasyon eğrisi çizmek için, sertifikalı saf kristalize histamin standartı ile hazırlanan ana stok çözeltisi dilüe edilerek ara düzey standartı hazırlanmıştır. Hazırlanan ara düzey standartını dilüe edilerek 8,33 ppm, 16,65 ppm, 83,3 ppm, 166,65 ppm düzeylerinde 4 farklı histamin çalışma standartı hazırlanmıştır. Türevlendirme kontrolü için yöntemde belirtildiği gibi iç standart (1,7 diaminoheptan) hazırlanmıştır. 4 farklı düzeyde hazırlanan çalışma standartlarının türevlendirme sonrası HPLC ye 2 tekrarlı olarak enjeksiyonu ile belirlenen analiz sonuçları, Microsoft Excel (2007) programından yararlanılarak kalibrasyon eğrisi grafiği çizdirilmiş ve korelasyon katsayısı hesaplanmıştır. Linearitenin belirlenmesi için ANOVA regresyon analizi kullanılmış ve F testi yapılmıştır. Kalibrasyon eğrisi ve korelasyon katsayısı Şekil 3.5 de verilmiştir. Kalibrasyon eğrisinin linear (doğrusal) olup olmadığına ilişkin hesaplamalar Çizelge 3.4 ve 3.5 de verilmiştir. Bu sonuçlar doğrultusunda dedektör cevabıyla histamin çalışma standartları arasında linear bir ilişki olduğu tespit edilmiştir. Değerlendirme Çizelge 3.6 da yer almaktadır.

Alan (LU) 65 Histamin DAD Kalibrasyon Eğrisi 450,00 400,00 350,00 y = 1213,5x + 0,1799 R² = 0,9744 300,00 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00 0,00 0,0000 0,0500 0,1000 0,1500 0,2000 0,2500 0,3000 0,3500 Konsantrasyon (ppm) Şekil 3.5. Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ile tespit edilen histaminin kalibrasyon eğrisi Şekil 3.6. Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ile belirlenen histamin standartının (83,3 ppm) kromatografik profili

66 Çizelge 3.4. Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ile tespit edilen histamin kalibrasyon eğrisinin yalın hatası Standartlar Konsantrasyon mg/l( ppm) Alan Konsantrasyon Alanların farkları Farkların karesi 1 0,0167 29,84 6,7089 45,00867 1 0,0167 23,13 2 0,0333 46,72 4,39 19,2377 2 0,0333 42,33 3 0,1666 248,82 130,05 16911,83 3 0,1666 118,77 4 0,3333 431,80 37,10 1376,462 4 0,3333 394,70 5 0,0167 29,84 6,7089 45,00867 5 0,0167 23,13 Toplam 18352,54 S 2 2 2294,068 S 2 : Yalın hatadır. Çizelge 3.5. Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ile tespit edilen histamin kalibrasyon eğrisinin rezidüel standart sapması (ANOVA Regresyon Hesabı Fark Çıkışı) Gözlem Öngörülen Farklar Standart Farklar Farkların Karesi 1 20,39811147 9,439548532 0,248288629 0,061647243 2 20,39811147 2,730698532 0,071825617 0,005158919 3 40,62843571 6,089024292 0,160159725 0,025651137 4 40,62843571 1,702944292 0,044792577 0,002006375 5 202,3618077 46,45363228 1,221870797 1,492968244 6 202,3618077-83,59186772-2,198718528 4,834363166 7 404,6650501 27,13835989 0,71382081 0,509540149 8 404,6650501-9,962340108-0,262039626 0,068664766 9 20,39811147 9,439548532 0,248288629 0,061647243 10 20,39811147 2,730698532 0,071825617 0,005158919 Toplam 7 2 S 1 1,166666667 S 1 =Rezidüel standart sapma

67 Çizelge 3.6. Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan HPLC yöntemi ile tespit edilen histamin kalibrasyon eğrisinde F-testi F bulunan F tablo(6,8)* DEĞERLENDİRME 1,166666667 2294,068 0,000508558 4,15 F bulunan <F tablo S 1 2 S 2 2 LİNEAR(doğrusal) dır. *F tablo = F tablosunda (N-2,NK-N ( 6, 8)) bulunur. N = Toplam ölçüm sayısı (Benzoil klorür yöntemi için 8), K = Tekrar sayısı(2) dır. S 1 = -Rezidüel standart sapma, S 2 = Yalın hata dır. 3.2. Tespit Limiti (Limit of Detection - LOD) ve Ölçüm Limiti (Limit of Quantification LOQ) Sonuçları Tespit ve ölçüm limiti çalışmaları için her iki yöntemde de İstanbul Küçükçekmece sahilinden tutulan canlı istavrit balığı numuneleri kullanılmıştır (Şekil 3.7). Tutulan canlı balık numuneleri iç organları temizlenerek soğuk zincirde laboratuvara getirilmiştir. Teşhis çalışmaları için örnek numune dilue edilmiş standartın görülebildiği son değerde 10 kez, iki paralelli olarak HPLC ye enjeksiyon yapılmış ve dilüsyon faktörleri göz önünde bulundurularak mevcut olan LOD ve LOQ değerleri hesaplanmıştır. LOQ ve LOD hesaplamaları aşağıdaki şu formüller kullanılmıştır. Ortalama ve Standart sapma Microsoft Excel (2007) programından yararlanılarak hesaplanmıştır. Tespit (Belirleme) Limiti (LOD) = Ortalama + 3 Standart Sapma Ölçüm (Tayin) Limiti (LOQ) = Ortalama + 10 Standart Sapma

68 Şekil 3.7. Teşhis çalışmaları için Küçükçekmece sahilinden tutulan canlı istavrit balığı O-fitaldialdehit türevlendirmesi kullanılan yöntemde tespit ve ölçüm limiti çalışmaları için ölçüm sonucu 1 ppm olacak şekilde konsantrasyonu 10 ppm olan (kalibrasyon eğrisi çizdirmek için kullanılan) histamin standartından 10 g temiz balık numunesi üzerine 1 ml standart pipetlenmiş ve iki paralelli olmak üzere 10 kez, toplamda 20 enjeksiyon yapılmıştır. Benzoil klorür türevlendirmesi kullanılan yöntemde ise ölçüm sonucu 10 ppm olacak şekilde konsantrasyonu 166,65 ppm olan histamin standartından 25 g temiz balık numunesi üzerine 1,5 ml standart pipetlenmiş ve iki paralelli olmak üzere 10 kez, toplamda 20 enjeksiyon yapılmıştır. Analiz sonuçları Çizelge 3.7 ve 3.8 de yer almaktadır.