NÖROBLASTOMALARDA PI3-K SAĞKALIM SİNYAL İLETİMİNİ DEĞİŞTİREREK OLUŞAN APOPTOZİS SENSİTİZASYONU

T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ İÇ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI TEMEL ONKOLOJİ PROGRAMI NÖROBLASTOMALARDA PI3-K SAĞKALIM SİNYAL İLETİMİNİ DEĞİŞTİREREK OLUŞAN APOPTOZİS SENSİTİZASYONU Biyolog Çağdaş KUŞ YÜKSEK LİSANS TEZİ TEZ DANIŞMANI Doç. Dr. İ. Oğuz KARA ADANA 2010

TEŞEKKÜR Lisans üstü eğitimim boyunca bana yol gösteren değerli hocam Doç. Dr. Oğuz Kara ya, Temel Onkoloji programında master yapma kararımı vermemi sağlayan değerli bölüm başkanımız Prof. Dr. Berksoy Şahin e, Bu çalışmanın gerçekleşmesinde katkıları olan Almanya Ulm Üniversitesi, Kanser ve Apoptozis laboratuvarı şefi Prof. Dr. Simone Fulda ya, Michelsberg kliniğinde çalıştığım 6 aylık süre içerisinde yardımlarını hiç bir zaman esirgemeyen E- 15 laboratuvarının güleryüzlü sevecen insanlarına, özellikle Ariyanne Bender, Dominic Stadel, Daniela Opel, Andrew Westhoff a, Manevi olarak her zaman yanımda olan desteklerini hiç bir zaman esirgemeyen canım annem ve ablama, Her zaman yanımda olan canım arkadaşlarım Şahin Serin, Didem Serin, Özge Özgen, Zeynep Çobandağ, Ahmet Yağız, Mert Akbay a teşekkürlerimi borç bilirim. II

İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR...II İÇİNDEKİLER.III RESİM ve GRAFİK LİSTESİ..IV KISALTMALAR LİSTESİ....VII ÖZET ve ANAHTAR SÖZCÜKLER..IX ABSTRACT and KEYWORDS.......X 1.GİRİŞ ve AMAÇ... XI 2. GENEL BİLGİLER.. 14 2.1. Nöroblastoma...14 2.2. Apoptozis...17 2.2.1. Tanım... 17 2.2.2.Apoptozis Yolakları..... 18 2.2.3.Apoptozis Direnç Mekanizmaları.... 21 2.3. Sinyal İletim Mekanizmaları ve Kanser...... 23 2.3.1. PI3-K/Akt Sinyal İletim Yolağı......... 23 2.3.2. Akt Yolağı............24 2.3.3. Akt Yolağının Rol Aldığı Süreçler..........25 2.3.3.1 Hücre Döngüsü Üzerine Etkisi..... 25 2.3.3.2 Apotozis İnhibisyonu Üzerine Etkisi......26 2.3.3.3 Transkripsiyonun Kontrolü.... 26 2.3.3.4 p53 Üzerine Etkisi... 26 2.3.3.5. mtor Yolağı Üzerine Etkisi......27 2.3.4 Karsinogenezde Etkili Olan PI3-K Sinyal Yolu Değişim Özeti...28 2.3.5 PI3-K Sinyallerinin Nöroblastomadaki Rolü...28 3. GEREÇ VE YÖNTEM...29 3.1. Hücre Kültürü........29 3.2. Nicoletti (DNA Fragmentasyonlarının Analizi).......31 3.3. Western blotting...... 35 3.3.1. Protein Determinasyonu....35 3.3.2. Protein Örneklerinin Ölçülmesi...36 3.3.3. Poliakrilamid jel elektroforezi...36 3.3.4. Western Blotting Aşamaları...37 3.4. PI3-K inhibitörleri ve ilişkili diğer mat..eryaller...38 3.5. Verilerin Değerlendirilmesi...39 4. BULGULAR.......40 5. TARTIŞMA.....62 6. SONUÇLAR ve ÖNERİLER......65 KAYNAKLAR........... 66 ÖZGEÇMİŞ...... 72 III

RESİM ve GRAFİK LİSTESİ Resim 1: PI3-K inhibitörlerinin etki mekanizması....xii Resim 2: Nöral krestten orijinlenen sempatik sinir sisteminde ortaya çıkan, sempatik ganglia, adrenal medullayı paragangliayı içeren nöroblastomanın oluşum resimi..14 Resim 3: Apotozisin içsel ve dışşal yol oluşum şekli...19 Resim 4: p85 ve p110 genlerinin PI3-K mekanizmasına etkisi..24 Resim 5: Protein kinaz B/Akt yolunun işlevleri..25 Resim 6: Eş zamanlı tedavi ve farklı zamanlı tedavi deneylerinin hazırlanması...31 Resim 7: BGT 226 nın tek ajan olarak kullanılan deneylerde kuyucukları hazırlama şekli...32 Resim 8: BEZ 235 in tek ajan olarak kullanılan deneylerde kuyucukların hazırlaması..32 Resim 9: BKM 120 nin tek ajan olarak kullanılan deneylerde kuyucukların hazırlaması...33 Resim 10: BGT 226 nın zvad (kaspaz inhibitörü) ile yapılan deneylerde hazırlanması...33 Resim 11: Kültür ortamına p53 ve BGT 226 eklerenek yapılan deneylerin hazırlanması...34 Resim 12: Kültür ortamına Bcl-2 ve BGT 226 eklenerek yapılan deneylerin hazırlanması 34 Resim 13: BEZ 235 in 0.6, 0.2, 0.06, 0.02 μm konsantrasyonlardaki western blotting sonuçları..41 Grafik 1: SH-EP hücre hattına 0.6 μm BEZ 235 ve 0.1, 0.2 μg/ml doksorubisin eklenerek oluşturulan eş zamanlı tedavi deneylerinin grafiği 41 Grafik 2: SH-EP hücre hattına 0.6 μm BEZ 235 ve 0.1, 0.2 μg/ml konsantrasyonlarda doksorubisin eklenerek oluşturulan farklı zamanlı tedavi deneylerinin grafiği..41 Resim 14: SH-EP hücrelerinde BGT 226 nın 0.2, 0.06, 0.02 μm konsantrasyonlardaki Western blotting sonuçları...42 Grafik 3: SH-EP hücre hattına 0.2 μm BGT 226 ve 0.1 ve 0.2 μg/ml konsantrasyonlardaki doksorubisin eklenerek oluşturulan eş zamanlı tedavi deneylerinin grafiği.....42 Grafik 4: SH-EP hücre hattına 0.2 μm BGT 226 ve 0.1 ve 0.2 μg/ml konsantrasyonlardaki doksorubisin eklenerek oluşturulan farklı zamanlı tedavi deneylerinin grafiği...42 Resim 15: BKM 120 nin 2.0, 1.0, 0.6 μm konsantrasyonlardaki western. blotting sonuçları....43 Grafik 5: SH-EP hücre hattına 0.6 μm BKM 120 ve 0.1 ve 0.2 μg/ml konsantrasyonlarda doksorubisin eklenerek oluşturulan eş zamanlı tedavi deneylerinin grafiği....43 Grafik 6: SH-EP hücre hattına 0.6 μm BKM 120 ve 0.1 ve 0.2 μg/ml konsantrasyonlarda doksorubisin eklenerek oluşturulan farklı zamanlı tedavi deneylerinin grafiği....43 IV

Grafik 7: SH-EP hücre hattına BEZ 235 in 0.6, 1, 2, 3, 5 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 24 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği...45 Grafik 8: SH-EP hücre hattına BEZ 235 in 0.6, 1, 2, 3, 5 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 48 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği...45 Grafik 9: SH-EP hücre hattına BEZ 235 in 0.6, 1, 2, 3, 5 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 24 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği...45 Grafik 10: lan-5 hücre hattına BEZ 235 in 0.6, 1, 2, 3, 5 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 24 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği...46 Grafik 11: lan5 hücre hattına BEZ 235 in 0.6, 1, 2, 3, 5 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 48 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği...46 Grafik 12: lan5 hücre hattına BEZ 235 in 0.6, 1, 2, 3, 5 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 72 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği.. 46 Grafik 13: kelly hücre hattına BEZ 235 in 0.6, 1, 2, 3, 5 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 24 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği...47 Grafik 14: kelly hücre hattına BEZ 235 in 0.6, 1, 2, 3, 5 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 48 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği...47 Grafik 15: kelly hücre hattına BEZ 235 in 0.6, 1, 2, 3, 5 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 72 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği.. 47 Grafik 16: SH-EP hücre hattına BGT 226 nın 0.2, 0.6, 1, 1.5, 2 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 24 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği... 49 Grafik 17: SH-EP hücre hattına BGT 226 nın 0.2, 0.6, 1, 1.5, 2 μm. konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 48 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği.49 Grafik 18: SH-EP hücre hattına BGT 226 nın 0.2, 0.6, 1, 1.5, 2 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 72 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği....49 Grafik 19: lan5 hücre hattına BGT 226 nın 0.2, 0.6, 1, 1.5, 2 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 24 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği.50 Grafik 20: lan5 hücre hattına BGT 226 nın 0.2, 0.6, 1, 1.5, 2 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 48 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği. 50 Grafik 21: lan5 hücre hattına BGT 226 nın 0.2, 0.6, 1, 1.5, 2 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 72 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği...50 Grafik 22: kelly hücre hattına BGT 226 nın 0.2, 0.6, 1, 1.5, 2 μm konsantrasyoları eklenerek oluşturulan 24 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği...51 Grafik 23: kelly hücre hattına BGT 226 nın 0.2, 0.6, 1, 1.5, 2 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 48 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği..51 Grafik 24: kelly hücre hattına BGT 226 nın 0.2, 0.6, 1, 1.5, 2 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 72 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği...51 Grafik 25: SH-EP hücre hattına BKM 120 nin 0.6, 1, 1.5, 2, 3 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 24 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği 53 Grafik 26: SH-EP hücre hattına BKM 120 nin 0.6, 1, 1.5, 2, 3 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 48 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği....53 V

Grafik 27: SH-EP hücre hattına BKM 120 nin 0.6, 1, 1.5, 2, 3 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 72 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği... 53 Grafik 28: lan5 hücre hattına BKM 120 nin 0.6, 1, 1.5, 2, 3 μm konsantrasyoları eklenerek oluşturulan 24 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği...54 Grafik 29: lan5 hücre hattına BKM 120 nin 0.6, 1, 1.5, 2, 3 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 48 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği...54 Grafik 30: lan5 hücre hattına BKM 120 nin 0.6, 1, 1.5, 2, 3 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 72 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği...54 Grafik 31: kelly hücre hattına BKM 120 nin 0.6, 1, 1.5, 2, 3 μm konsantrasyolar.ı eklenerek oluşturulan 24 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği...55 Grafik 32: kelly hücre hattına BKM 120 nin 0.6, 1, 1.5, 2, 3 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 48 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği...55 Grafik 33: kelly hücre hattına BKM 120 nin 0.6, 1, 1.5, 2, 3 μm konsantrasyonları eklenerek oluşturulan 72 saatlik apoptotik hücre yüzdesi grafiği...55 Grafik 34: SH-EP hücre hattına 2 μm BGT 226, BKM 120 ve BEZ 235 konsantrayonlarına 20 μm zvad eklenerek oluşturulan 24 saatlik apoptotic hücre yüzdesi grafiği..57 Grafik 35: SH-EP hücre hattına 2 μm BGT 226, BKM 120 ve BEZ 235 konsantrayonlarına 20 μm zvad eklenerek oluşturulan 48 saatlik apoptotic hücre yüzdesi grafiği..57 Grafik 36: SH-EP hücre hattına p53 geni eklenerek oluşturulan, 2 μm BGT 226 konsantrasyonunun 24 saatlik grafiği....58 Grafik 37: SH-EP hücre hattına p53 geni eklenerek oluşturulan, 2 μm BGT 226 konsantrasyonunun 48 saatlik grafiği 58 Grafik 38: SH-EP hücre hattına Bcl-2 geni eklenerek oluşturulan, 2 μm BGT 226 konsantrasyonunun 24 saatlik grafiği 59 Grafik 39: SH-EP hücre hattına Bcl-2 geni eklenerek oluşturulan, 2 μm BGT 226 konsantrasyonunun 48 saatlik grafiği....59. VI

KISALTMA LİSTESİ MYCN : Nöroblastoma miyelomatosis onkogeni Trk A : Tirozin kinaz A NGF : Nerwe growth factor Trk B : Tirozin kinaz B Bcl2 : B-cell CLL/ Lymphoma 2 geni p53 : Tümör protein 53 geni TNFα : Tümör nekrozis faktör AIF : Apoptozis indükleyici faktör Endo G : Endonükleaz G Apaf 1 : Apoptotik proteaz aktive eden faktör 1 IAP : Inhibitor of apoptosis PTEN : Phospatase and tensin homolog of chromosom 10 PI3-K : Fosfotidil inositol 3 kinaz RTK : Reseptör tirozin kinaz PIP2 : Fosfatidil inositol (4,5) bifosfat PIP3 : Fosfatidil inositil 3,4,5 trifosfat GTPaz : Guanozin trifosfataz SH2 : SRC homology 2 mtor : Mammalian target of rapamycin CDK2 : Siklin bağımlı kinaz 2 CDK4 : Siklin bağımlı kinaz 4 EGFR : Epidermal growth factor reseptor HER2 : Human epidermal growth factor receptor 2 NFKB : NF-kappaB proteinleri TRADD : Tumor necrosis factor receptor type Mdm2 : Murine double minute 2 gene S6 : S6 ribozomal protein 4E-BP : 5 -end of all eukaryotic cellular mrnas BDNF : Beyin kaynaklı nörotrofik faktör μg / ml : Mikrogram/ mililitre μmol : Mikromolar c flip : Cellular FLICE-inhibitory protein VII

ÖZET Nöroblastomalarda PI3-K Aracılı Sağkalım Sinyal İletimini Değiştirerek Oluşan Apoptozis Sensizitasyonu Nöroblastomalar, genellikle bebeklerde, çocuklarda, genç yetişkinlerde rastlanan malign tümörlerdir. Bu tümörlerin sinir sistemi gelişmeden kalan primitif (farklılaşmamış) sinir hücreleri olduğu düşünülmektedir. Nöroblastomanın düzenleyici hücre ölüm yolaklarını daha iyi anlamak, moleküler hedefli tedavilerin tasarımı için yeni fırsatlar sağlayacaktır. En önemli hücre ölüm yolağı apoptozistir. Bu çalışmadaki amaç, PI3-K sinyallerinin apoptozis mekanizmaları üzerindeki etkisini araştırmaktır. PI3-K mekanizmaları, apoptozis mekanizmasıyla ilişkili sağkalım sinyal iletimi yolağı ailesidir. PI3-K sinyalleri, tümör formasyonu ve tümör progresyonunda merkezi bir rol oynamaktadır. PI3-K sinyallerinin iletim yolaklarının araştırılması nörolastoma hastalarının klinik gelişiminde umut verici bir hedef olacaktır. Elde edilecek sonuçlar özellikle hücre siklusunda tanımlanan noktalara yönelik yeni hedeflenmiş tedavi yöntemleri geliştirilebilmesi için olanak sağlayacaktır. Bu çalışmada apoptozisin düzenlenmesinde PI3-K sinyallerinin rolü SH-EP, lan 5, kelly nöroblastoma hücre hatlarında in vitro olarak araştırılmıştır. İnhibitör olarak spesifik sinyal moleküllerini içeren BGT 226, BEZ 235 ve BKM 120 kullanılmıştır. Kombine tedavi deneylerinde sitotoksik ajan olarak doksorubisin kullanılmıştır. Spesifik proteinleri bulmak için western blotting, apoptotik hücrelerin nicel yüzdesini ölçmek için nicoletti prosedürü uygulanmıştır. Veriler excel programında ortalamaları ve standart sapmaları alınarak grafiklere aktarılmış, MANN WHİTNEY U testi ile değerlendirilmiştir. Çalışmanın sonucunda farklı zamanlı tedavi (12 saat fark) deneylerinin sonucunda 3 farklı PI3-K inhibitöründe de kontrol grubuyla olan fark anlamlı olduğu bulunmuştur (p<0.05). Genetik özellikleri farklı olan nöroblastoma hücrelerinin PI3- K inhibitörlerine tepkisi farklı bulunmuştur. Lan 5 hücreleri bu inhibitörlere en duyarlı hücreler, SH-EP hücreleri PI3-K inhibitörlerine en az duyarlı hücreler olarak bulunmuştur. SH-EP hücrelerinin PI3-K inhibitörlerinin temel hedefi olduğu bulunmuştur. PI3-K inhibitörlerinin farklı konsantrasyonlarının tek ajan olarak denendiği değerlerde hücrelerin tepkisi farklı bulunmuştur. 24 saat, 48 saat, 72 saat zaman aralıklarında lan 5 hücreleri haricinde anlamlı fark bulunmamıştır. Nöroblastoma hücrelerinde gerçekleşen apoptozisin kaspaz bağımlı olarak gerçekleştiği ispat edilmiştir. PI3-K inhibitörleri etkilerine göre BGT 226>BKM 120>BEZ 235 şeklindedir. p53 ve Bcl-2 geninin bu döngülerdeki etkileri incelenmiştir. Bu çalışma için unutulmaması gereken şudur ki; toksik maddelerin yüksek konsantrasyonları apoptozis haricinde nekroza da yol açmaktadır. Bu çalışmada nicoletti yöntemiyle facs analizleri yapılarak nicel apoptozis yüzdelerine bakılmıştır. Çalışmanın ilerleyen aşamalarında propidium iodide boyasıyla apoptotik veya nekrotik hücreler saptanabilir. Ayrıca dapi yöntemi, Anneksin 5 metoduyla apoptotik, nekrotik ve canlı hücreler ayırt edilebilir. Bu çalışmanın benzeri kanser olmayan insan hücrelerinde in vitro ortamda denenmeli sonuçlar karşılaştırılmalıdır. Anahtar sözcükler: Nöroblastoma, Apoptozis, PI3-K sinyalleri, nicoletti, hücre kültürü VIII

ABSTRACT Apoptosis Sensitization of neuroblastoma by altering PI3K- mediated survival signalling Neuroblastomas are malignant tumors of the central nervous system that usually are found in infants, children, and young adults. These tumors are thought to arise from primitive (undifferentiated) nerve cells left over from the development of the nervous system. Better understanding of the regulatory cell death pathways in neuroectodermal tumors is anticipated to provide new opportunities for design of innovative, molecular targeted therapies. The most important pathway is apoptosis. The aim of this study; to investigate PI3-K signal the impact of mechanism to apoptosis. Beside of them PI3-K is one of the apoptosis related survival transduction pathway proteins. Deregulated PI3-K/Akt signaling often play central role in tumor formation and progression and frequently observed in a variety of human cancer. Thus PI3-K signaling appears to be promising target in the clinical management neuroblastoma patients. Results to be obtained will be allowed especially for cell cycle defined point for developing new targeting therapies. In this study, role of PI3-K/Akt signalling in apoptosis regulation were investigated in neuroblastoma cell lines; SH-EP, lan 5, Kelly. Inhibitors are specific signalling molecules including BGT 226, BEZ 235, BKM 120. As Cytototoxic agent doxorubicin has been used for combine treatment. To find specific proteins; western blotting, to measure the percentage of quantitavie apoptotoic cells nicoletti procedures were applied. As a result of study, differences post treatment between 3 different PI3-K inhibitors, with control group were found significant differences (p<0.05). The neuroblastoma cell lines, have different genetic properties, different responses to inhibitors which were used. Lan 5 cells most sensitive, SH-EP cells were found to be least sensitive cells to this PI3-K inhibitors. SH-EP cells were found to be main target of PI3-K inhibitors. Different concentrations of PI3-K inhibitors as a single agent have been tried in this experiments, it was different response in these cells. There is unsignificant difference between 24 hour, 48 hour and 72 hour other than lan 5 cell line. The apoptosis which occurred in this neuroblastoma cell lines is proved to be caspase dependent apoptosis. Effects of PI3-K inhibitors : BGT 226>BKM 120>BEZ 235. p53 and Bcl-2 genes were investigated in this cycle. For this study should not forget the fact that high concentrations of toxic agents which lead to necrosis other than apoptosis. In this study with nicoletti procedurses, quantitative apoptosis percentage can be performed with the facs analysis. In later stages in this study apoptotic or necrotic cells can be detected with propidium iodide. Method of annexin 5 or with dapi method, apoptotic cells, necrotic cells, live cells can be distinguished. Similar to this study should be try cells of human but not cancer and to compare with this results. Keywords: Neuroblastoma, Apoptosis, PI3-K signalling, Nicoletti, Cell culture IX

1-GİRİŞ ve AMAÇ Nöroblastoma sinir sisteminin genellikle bebeklerde, çocuklarda ve genç yetişkinlerde en sık görülen ekstrakraniyal tümördür. Bu tümörlerin sinir sistemi gelişmeden kalan primitif (farklılaşmamış) sinir hücreleri olduğu düşünülmektedir 1,3,5. Nöroblastoma tüm çocukluk malignensilerinin % 8-10 unu oluşturur 3,4. Nöroblastoma tedavisinde esas tedavi cerrahi işlemdir. Kemoterapi ve radyoterapi kullanılan yardımcı tedavi yöntemleridir. Fakat kemoterapi diğer tümörlerdeki kadar yüz güldürücü değildir 4,11. Nöroblastomanın, tümör biyolojisini anlamak, daha etkili ve daha az toksik tedavilerin gelişimini sağlayacaktır. Bilindiği gibi diğer solid tümörlerde olduğu gibi nöroblastomada da en önemli hücre ölüm yolağı apoptozisdir. Apoptozis, programlanmış hücre ölümüdür. Apoptozisin gerçekleşmeyişi, hızlanmış apoptozis veya yavaşlamış apoptozis organizma için tehlikelidir. Apoptozisin yavaşladığı veya inhibe olduğu hastalıklardan en önemlisi kanserdir 52,58. Nöroblastomada apoptozis mekanizmasında oluşan hasarlar ile ilgili oldukça fazla bulgu mevcuttur. Örneğin MYCN onkojeninin amplifikasyonu tüm agresif nöroblastomalarda bulunmuştur 2. MYCN transkripsiyon faktörü, hücre siklusunun düzenlenmesinde, farklılaşmada ve apoptozisde kritik roller üstlenmiştir 2,15,16. Ayrıca Kaspaz 8 in nöroblastomalarda tümör süpresör geni olarak işlev gördüğü bulunmuştur 49,50. Bunun yanında PI3-K sinyallerinin aktivasyonunun nöroblastomayla ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu sinyal yolaklarının aktivasyonunu, nöroblastomalarda MYCN amplifikasyonunu arttırır 2. Kanser hücrelerinde sağkalım p53 mutasyonu, bazı genlerin amplifikasyonu, demetilasyon, exonların artması, PI3-K/Akt ve MAP sinyallerinin artmasıyla olur 2,21. Son yıllarda yapılan çalışmalarda PI3-K sinyallerinin aktivasyonu pro ve anti apoptotik proteinlerin direk hedefi olduğu gösterilmiştir. Fosfotidil inositol 3 kinaz (PI3-K) ailesi büyüme ve yaşama sinyallerinin iletiminden sorumludur. PI3-K sinyallerinin ve Akt nin inhibisyonu nöroblastoma hücrelerinde apoptozisi arttırır 23,24. PI3-K/Akt sinyalleri tümörlü hastaların tedavisi için önemli bir hedeftir. Çünkü tümör hücreleri PI3-K sinyallerinin hiperaktivitesine bağlıdır. Bu sinyalleri normal seviyelerine düşürmek tümör büyümesini yavaşlatır. PI3K/Akt sinyallerinin inhibisyonu; apoptozisi arttırır, hücre proliferasyonunu azaltır, hücre büyümesini ve sağkalımı azaltır 47. X

Klinik çalışmalarda yapılan deneylerde yeni stratejiler geliştirmek için genellikle deney hayvanları kullanılmaktadır, ancak tür özgünlüğü nedeniyle bu çalışmalardan elde edilen veriler tartışılmaktadır. Bu açıdan temel bilim ve hastalıklarda çoğu karmaşık sorunun en iyi adresi insan hücreleridir. Hücre kültürü metoduyla yapılan çalışmalar başta kanser olmak üzere bir çok hastalığın araştırılması ve yeni ajanların geliştirilmesi için ipucu sağlayacaktır. Bu gerçeklik içinde kliniğe uygulanabilir deney modelleri sunmak önemli bir adımdır 71. Bu çalışmada PI3-K/Akt sinyallerinin nöroblastoma kanser hücreleri üzerindeki etkilerini in vitro ortamda araştırılmıştır. Bu çalışma in vitro ortamda gerçekleştirilmiştir. Hücre kültürü metodu üzerinde çalışılmıştır. SH-EP, lan 5 ve kelly olmak üzere 3 farklı tip nörolastoma hücresi üzerinde çalışılmıştır. PI3-K/Akt inhibitörleri olarak BGT 226, BEZ 235, BKM 120 kullanıldı. BGT 226 ve BEZ 235 PI3-K ve mtor ihbitörü, BKM 120 yalnızca PI3-K inhibitörü olarak kullanılmıştır. BGT 226 ve BEZ 235 in solid tümörlü ve metastatik meme kanserli hastalarda faz I/II çalışmaları sürmektedir. BKM 120 nin ise solid tümörlü ve metastatik meme kanserli hastalarda faz I çalışmaları devam etmektedir. XI

Resim 1 : PI3-K inhibitörlerinin etki mekanizması Çalışmadaki amaçlarımız; kemoterapi ajanı doksorubisin ile PI3-K inhibitörlerinin kombine tedavi deneylerinde eş zamanlı tedavi ile farklı zamanlı tedavi arasındaki farkı göstermek, PI3-K inhibitörlerinin tek ajan olarak kullanıldığında nöroblastomanın farklı hücre çeşitlerinde, farklı zaman aralıkları ve farklı konsantrasyonlarında nicel apoptozis yüzdesini belirlemek, gerçekleşen apoptozisin kaspaz bağımlı olup olmadığını, Bcl2 nin ve p53 ün bu inbibitörler üzerinde olan etkisini incelemektir. Nöral krestten kaynaklanan nöroblastomalar biyolojik ve klinik olarak farklı özellikler göstermektedir. İn vitro ortamda yapılan bu tarz çalışmalar, daha az toksik ve daha etkili ajanların geliştirilmesi için ipuçları verecektir. Elde edilecek sonuçlar özellikle hücre siklusunda tanımlanan noktalara yönelik yeni hedeflenmiş tedavi yöntemleri geliştirilebilmesi için olanak sağlayacaktır. XII

2. GENEL BİLGİLER 2.1. NÖROBLASTOMA Nöroblastoma, adrenal medulla ve sempatik ganglionlarda görülen ve ilkel nöral krest hücrelerinden orijin alan bir tümördür. Sinir sisteminin en sık görülen ekstrakraniyal solid tümörüdür 1,2. Tüm çocukluk malignitelerinin %8-10 kadarını oluşturur. Nöroblastoma insidansı bazı merkezlerde yapılan çalışmalarda 1/8000 canlı doğum olarak ifade edilir 3,4. Spontan regresyonlar, benign hastalığa farklılaşma, ileri yaştaki çocuklarda oldukça malign seyretmesi, nöroblastomanın farklı davranışlarına örnek olarak verilebilir. Nöroblastomanın etyolojisi çok bilinmemektedir 5. Nöroblastoma sempatik sinirlerin öncül hücrelerinden kaynaklanan bir embriyonik tümördür. Doğumdan sonra geçen zaman içerisinde sempatik sinir sistemi yeniden düzenlenir. Bu geçen zamanın nöroblastomanın başlangıç zamanı ile örtüşmesi bu tümörlerin gelişiminde sempatik farklılaşmada rol alan temel mekanizmalarda bir bozukluk olduğunu düşündürmektedir 8. Çevresel faktörlerin etyolojide majör rolü gösterilmemiştir. Hamilelikte ilaç kullanımı, kimyasallar, virüsler ve radyasyonla güçlü ilişkisi yoktur. Daha çok embriyolojik olarak nöral krest gelişim bozukluğuna bağlı geliştiği düşünülmektedir 11,12. Tüm nöroblastomaların % 22 sinde germinal mutasyon olduğu düşünülmektedir 5. 14

Resim 2: Nöral krestten orijinlenen sempatik sinir sisteminde ortaya çıkan, sempatik ganglia, adrenal medulla, paragangliayı içeren nöroblastomanın oluşum resimi İn vitro ortamda yapılan çalışmalarda I tip kök hücre, N tip nöroblastik hücreler ve S tip Schwannian/melanoblastik öncül olmak üzere 3 farklı tip nöroblastoma hücresi bulunmuştur. Bu hücrelerin moleküler özellikleri ve davranışlarının farklı oldukları bulunmuştur. Hücre kültürü çalışmalarında tümör dışından gelen dokuyu schwann hücrelerinin istila ettiği gösterilmiştir 9. Nöroblastoma sempatik sinir sisteminin bir tümörüdür ve sempatik nöral yol boyunca, herhangi bir yerde görülebilir. Çoğunlukla primer tümör abdomende görülür. Yaklaşık % 1 hastada primer tümör saptanmayabilir. Tanı anında olguların % 75 kadarında metastaz mevcuttur. Metastaz lenfatik ve hematojen yollarla oluşur. Lokalize tümörlü hastaların % 35 in de bölgesel lenf nodu metastazı görülür. Diğer bölgelere metastaz olmaksızın bu durumun görülmesi iyi prognozdur. Hematojen yayılım; sıklıkla kemik iliği, kemik, karaciğer ve deri nadiren akciğer ve beyin parenkimine olur. Akciğer ve beyin parenkimine metastaz genellikle relaps ve son dönem hastalıkta görülür 11,12,13. Kromozomal delesyonlara nöroblastomaların % 50 sinde rastlanmıştır. Kromozom 1p deki delesyon yüksek olarak MYCN onkojeninin overekspresyon ve 15

amplifikasyonuyla ilişkilidir. MYCN sinir sisteminde ve seçilmiş organlarda eksprese edilen bir protoonkogendir. MYCN amplifikasyonu nöroblastomada hızlı tümör büyümesi, kötü prognoz, ileri evre hastalıkla ilişkilidir. Büyüme faktörlerinin nöroblastomanın malignent transformasyonunda çok önemli bir rol oynadığı belirlenmiştir 17. Nöroblastomadaki genetik çalışmalarla onaltıncı kromozomun kısa kolunda 16p kalıtsal yatkınlık bölgesi tespit edilmiştir. Hastalığın düşük evresindeki hastalıklarda ve bebeklerde MYCN amplifikasyonu varsa bu hastalarda tümör hızlı progresyon gösterir ve prognoz kötüdür 14. Onyedinci kromozomun uzun kolundaki (17q) anomaliler nöroblastomalı hastalarda tespit edilmiş diğer bir genomik değişikliktir. 17q anomalisi olan hastalarda nöroblastomun oldukça agresif seyrettiği bilinmektedir. Birinci kromozomun kısa kolundaki (1p) delesyon; %25-30 hastalarda saptanabilir. 1p delesyonu daha çok ileri evre hastalarda ve MYCN amplifikasyonu ile birlikte gösterilir, kötü prognozla ilişkilidir 15. Onbirinci kromozumun uzun kolundaki (11q) kayıplar % 35-45 hastada görülebilir. İlginç olan bu durumun MYCN ile birlikte görülmemesidir. MYCN amplifikasyonu olmamasına rağmen onbirinci kromozomdaki kayıplarda ileri evre, olumsuz patoloji gibi yüksek risk özellikleri görülür. 16. Sempatik sinir sistemi hücrelerinin nöroblastoma hücrelerine dönüşümü günümüzde çok iyi anlaşılamamış, hücrelerin farklılaşmasında muhtemelen nörotrofin reseptör yolunun kullanıldığı düşünülmektedir. Bu yolda Tirozin kinaz (Trk) A, B ve C reseptörleri ve bunlara bağlanan nerve growth factor (NGF), brain-derivered neurotrophic factor (BDNF), nörotrofin-3 (NT-3) gibi faktörler mevcuttur. Trk A nın aktivasyonu hücrenin yaşamını ve farklılaşmasını arttırmakta, inhibisyonu ise programlanmış hücre ölümüne neden olmaktadır. Böylece NGF nin varlığı veya yokluğu Trk-A bulunan hücrelerin davranışına etki etmektedir. Trk-A nın yüksek seviyeleri erken yaş, düşük evre, MYCN amplifikasyonunun olmaması ve olumlu sonuçlarla ilişkilidir. Trk-B ise agresif tümör davranışı MYCN amplifikasyonu ile güçlü ilişkilidir 18. 16

Bcl-2 proteini çoğu nöroblastomada, primer tümörlerde aşırı olarak ifade edilir. Bcl2 geninin karsinogenez ile ilişkisi olabilir. Bcl2 proteininin yüksek düzeyleri tümörün ilaca direnmesinde önemli bir rol oynar 11. Cerrahi işlem, radyasyon, kemoterapi tüm nöroblastomalarda uygulanabilen alternatif tedavi yaklaşımlarıdır. Nöroblastoma tek olarak cerrahi işlem veya cerrahi işleme kemoterapi, radyasyon eklenerek tedavi edilebilmektedir. Ancak metastatik nöroblastomanın prognozu çok kötüdür. Nöroblastomanın tümör biyolojisini daha iyi anlamak daha etkili ve daha az toksik tedavilerin gelişimini sağlayacaktır. Son yıllarda Apoptozis mekanizması ve sağkalım sinyal iletim mekanizmaları nöroblastoma tedavisinin araştırılmasında hızla artarak kullanılan bir yaklaşımdır. 17

2.2. APOPTOZİS 2.2.1. Tanım Ökaryotik organizmadaki hücreler doğarlar, belirli bir süre yaşarlar ve sonra ölürler. Yaşam süresi hücre tipine göre değişmektedir. Örneğin derinin epidermal hücreleri 20-25 günlük bir sürenin sonunda ölmektedir. Fakat miyokard kası hücreleri veya nöronlar ömür boyu yaşarlar. Fakat buna rağmen miyositlerin veya nöronların kabaca % 10-15 i yaşam sonunda kaybedilmektedir. Bahsedilen bu hücre ölümleri apoptozisle gerçekleşir 58. Apoptozis kelime anlamı olarak ağaçların yapraklarını dökmesi ile benzeştirilen yaprak dökme anlamına gelen bir terimdir 67. Zamanı gelince ölen bu hücreler programlanmış bir şekilde ölürler (programmed cell death). Tüm bu ölümler fizyolojik şartlarda meydana geldiği için bu ölüm şekli fizyolojik hücre ölümü olarakta (physicological cell death) adlandırılır 50. Her saniyede yaklaşık 1 milyon hücre apoptozisle vücuttan uzaklaştırılmaktadır. Bunların yerine yenileri yapılmaktadır. Yapım (mitosis) ile yıkım (apoptozis) arasında kontrollü bir denge vardır. İşte bu dengenin apoptozisin lehine veya aleyhine bozulması birçok önemli hastalığın patogenezine katkıda bulunur 58. Dengenin korunması için apoptozis, organizmada doğru bir şekilde işlemelidir. Olmaması gerekirken gerçekleşen apoptozis veya hızlanmış ya da tam tersine yavaşlamış apoptozis organizma için tehlikelidir. Apoptozisin gereksiz yere oluştuğu veya hızlandığı hastalıklara örnek olarak AIDS, nörodejenereratif hastalıklar, insüline bağımlı diyabet, hepatit C infeksiyonu, miyokard enfarktüsü, ateroskleroz gibi hastalıklar verilirken; apoptozisin yavaşladığı hastalıklara örnek olarak ise otoimmün hastalıklar ve kanser verilebilir 57,58. Hücre zarının ya da hücredeki metabolik süreçlerin çok hızlı ve ağır biçimde hasar gördüğü ve hızla bozulan zar geçirgenliğinin hücrenin şişmesi ve zarın patlayarak hücre içi maddelerin dışarı saçılmasıyla sonuçlanan nekrotik süreçten farklı olarak apoptozda zar bütünlüğü bozulmaz 68. Apoptoz ve nekroz dışında otofaji, paraptozis ve onkozis gibi farklı hücre ölümü tipleri de tanımlanmışsa da apoptoz dışındaki isimlendirmelerin biyokimyasal ya da morfolojik tanımları ve klinik önemleri üzerinde bir uzlaşma bulunmamaktadır 69. 18

2.2.2. Apoptozis yolağı Tanımlandığı günlerden bu yana apoptozisin tüm çok hücreli canlılarda önemli ölçüde korunan ve hem temel adımlar hem de uygulayıcı proteinlerdeki özdeş yapılar açısından birbirine benzeyen genetik bir yolla belirlendiği saptanmıştır. Apoptozis temel olarak 2 yolla başlatılır: 1) hücre dışından tetiklenen, pozitif (TNFα varlığı) ya da negatif (büyüme faktörü yokluğu) dışsal yol 2) hücre içinde DNA hasarı, endoplazmik retikulum stresi ya da mitokondriden tetiklenen içsel yol. Mitokondri aracılığıyla düzenlenen hücre içi yol aslında hücre dışı ve hücre içi etkenlerin ortaklaştığı bir mekanizma oluşturur 51,57. Hücre içi ya da hücre dışında başlayan apoptotik süreç kaspazlar adı verilen proteolitik enzimler tarafından gerçekleştirilir. Kaspazlar, bugüne dek bir düzine farklı türü tanımlanan, sitoplazmada inaktif proenzimler halinde bulunan, aktif katalitik bölgesinde sistein içeren ve substratlarını aspartat içeren özgül bir bölgeden kesen proteaz enzimlerdir (caspase=cysteine-dependent aspartate spesific proteases) 57. Kaspaz ailesinin bazı üyeleri (Kaspaz 2, 8, 9, 10) başlatıcı kaspazlar olarak bilinirken bazıları da (3, 6, 7) efektör kaspazlar (hedef kaspazlar) olarak bilinir. Başlatıcı kaspazlar apoptotik uyarıyla başlayan ölüm sinyallerini efektör kaspazlara iletirler. Efektör kaspazlar ise ilgili proteinleri parçalayarak apoptotik hücre morfolojisinin oluşmasına neden olur 50. Kaspaz kaskadı, sitokrom c nin sitoplazmaya salıverilmesiyle prokaspaz 9 un aktivasyonu yoluya başlatılabileceği gibi, kaspazlar da sitokrom c nin salıverilmesine neden olabilirler. Bir kaspaz inhibitörleri ailesi olan IAP (inhibitors of apoptosis) ler, kaspazları ve hücre siklusunu inhibe ederek, apoptotik mekanizmayı durdurur. Kaspazlardaki defektler kanser oluşumuna neden olabilir hatta yapılan çalışmalarda kaspaz 8 in nöroblastomada tümör süpressörü olarak görev aldığı bulunmuştur 50,53,59. 19

Resim 3: Apotozisin içsel ve dışşal yol oluşum şekli Apoptozisi başlatan yolun mitokondri olduğu anlaşılmıştır. Bu nedenle mitokondrinin aktivasyonu apoptotik süreçte geri dönülmez bir noktadır. Mitokondrinin aktivasyonuna yol açan en önemli faktör Bcl-2 ailesidir. Bcl-2 ailesinin hem proapoptotik hem de antiapoptotik üyeleri vardır. Bcl-2 ailesinin Bax, Bad, Bid, Bak, Bok, Bcl-Xs üyeleri apoptozisi tetiklerken, Bcl-2 ve Bcl-XL apoptozisi inhibe eder. Pro-apoptotik olan üyeler sitokrom-c nin mitokondriden sitoplazmaya geçişini indüklerken, anti-apoptotikler mitokondriden sitokrom-c çıkışını baskılar 58,59. Herhangi bir nedenle DNA hasarı oluştuğu zaman bu hasara yanıt olarak p53 geni aktiflenir. Bunun sonucunda proapoptotik Bcl-2 üyesi olan Bax ın tetiklenmesine yol açarak apoptozisi başlatır. Tümör baskılayıcı p53 proteini, Bax ın dışında ölüm reseptörleri olarak bilinen Fas (CD95) TNFα aracılığıyla da apoptozisi başlatabilir. Apoptozis ayrıca reaktif oksijen radikallerinin mitokondri, plazma membranı ve genom 20

üzerinde oluştulabileceği hasarlara bağlı olarak da başlatılabilirler (AIF=apoptozis indükleyici faktör yolu). Apoptozis büyüme faktörlerinin ortamdan eksilmesiyle de başlatılabilir. Burdaki mekanizma p53 aktivasyonuna bağlı olarak gerçekleşir 51.52.57.58. Apoptoz, ölüm reseptörleri adı verilen birbiriyle yapısal olarak akraba olan birkaç reseptör tarafından aktif olarak uyarılır. En iyi bilinen örnekleri TNFα ve Fas reseptörleridir.bu reseptörler hücre zarında bulunan bir çeşit integral membran protein yapısındadırlar. Hücre zarında bulunan kendileri için özgün reseptörlere bağlanan ligandlar prokaspaz-8 i iki farklı büyüklükte parçaya böler. Başlatıcı kaspaz denen aktif kaspaz-8, inaktif durumdaki proenzimler olan kaspaz-3, kaspaz-6 ve kaspaz-7 nin bir zincir biçiminde aktiflenmesine yol açar. Aktiflenen tüm kaspazlar hücre makromoleküllerini parçalayarak tipik apoptoz morfolojisinin oluşumuna yol açarlar 51,52,57,58. Aktif kaspaz-8, Bcl-2 ailesi proteinlerinden biri olan Bid in de proteolitik olarak aktifleşmesine yol açar. Bid, mitokondriden sitokrom c, bazı başka proteinlerin (SMAC) ve kalsiyumun serbestlemesine yol açar. Böylece ölüm reseptörleri yolu mitokondriyal yolu da aktiflemiş olur 51,52. Mitokondri hücre içi ya da dışı yollardan gelen ölüm sinyallerinin üzerinde birleştiği bir organeldir. Mitokondri iç ve dış zarla çevrili yapıdadır, bu zarlar tıpkı hücre zarında olduğu gibi bir zar potansiyeline sahiptir. Dış zar geçirgenliğinde artış sonucu mitokondri zarı potansiyelinin bozulması dış zarda hızlı bir şişmeyi izleyerek iki zar arasında bulunan çeşitli proteinlerin hücre sitoplazmasına çıkmasına yol açar. Temel olarak mitokondrideki solunum zincirinde yer alan bir enzim olan sitokrom c, apoptoz indükleyici faktör (AIF), SMAC ve ENDO G adlı DNA z enzim, sitoplazmaya dağılır. Sitokrom c, sitoplazmada inaktif monomerler halinde bulunan Apaf-1 (apoptotik proteaz aktive eden faktör) molekülüne bağlanarak apoptozom adı verilen yapının oluşumunu sağlar 72. Apoptozom, kaspaz-9 u aktifleştirmek üzere keser, kaspaz-9, diğer kaspazları proteolitik bir zincir halinde aktifleştirerek apoptozun gerçekleşmesini sağlar. Mitokondride dış zar potansiyelinin değişmesi Bcl-2 ailesi adı verilen bir protein grubu tarafından düzenlenir 51,57. Hücrede antiapoptotik aile üyeleri olan Bcl-2 ve Bcl-XL, yine aynı ailenin üyeleri olan Bad, Bim, Bax, Bad, Bid, Bak, Bok, Bcl-Xs proteinleri gibi proapoptotik proteinler tarafından baskılanır. Ailenin proapoptotik üyeleri normal koşullarda inaktif durumdadır, bu nedenle mitokondriyal zar geçirgenliği Bcl-2 ve 21

benzerlerinin etkisi sayesinde değişmez. Ancak çeşitli uyarılar proapoptotik grubun aktifleşmesine yol açarlar, sonuçta Bcl-2, proapoptotik aile üyeleri tarafından baskılanır, Bcl-2 tarafından inaktif durumda tutulan ve yine aynı aileden olan Bak ve Bax proteinleri etkinleşerek mitokondri dış zarında geçirgen kanalların oluşumuna, zar potansiyelinin değişimine yol açar. Bu da uygulamacı kaspazların aktivasyonu ve apoptozla sonuçlanır. Kaspazlar inhibitör apoptoz proteinleri (İAP) denen bir grup protein tarafından baskılanır 50,52. p53, DNA gardiyanı da denen ve bugüne dek üzerinde en çok çalışılan tümör süpresör proteinlerden biridir. p53 sitoplazmada bulunan ve DNA nın ya da hücrenin ağır biçimde hasar görmesi durumunda, DNA da belli genlerin aktivasyonuna, böylece yapımlarının artmasına (Bax, Apaf-1, Fas) belli genlerin de baskılanmasına (Bcl-2, Bcl- X) yol açarak apoptozu tetikleyen bir transkripsiyon faktörüdür. DNA hasarı, hipoksi ya da onkogenlerin aktivasyonu, sürekli yapılan ama ubikitinleyici bir protein (mdm2) tarafından belli bir hızda yıkılan p53 ün fosforillenmesine, fosforillenme ubikitinlemenin bozulmasına yol açar. Miktarı artan p53 çekirdeğe geçerek ilgili genlerin ifade edilmelerini değiştirerek hücreyi apoptoza sokar 50,51,54. Apoptozis, kaspazlara bağlı olan ve olmayan çok sayıda sinyal yollarıyla tetiklenebilen bir süreçtir. AIF yolu nöron ve aşırı stres koşullarına maruz kalan hücrelerin bundan önce belirtilen kaspaz bağımlı 2 apoptoz mekanizmasından farklı olarak kaspaz yoluna alternatif biçimde AIF yolunu kullandığı bir apoptoz türüdür. Normal koşullarda mitokondri zarları arasındaki ara bölmede yer alan AIF proteini, hücrenin ölmesi gerektiğini belirten bir sinyal ile sitokrom-c ile birlikte mitokondriden dışarı çıkarak nükleusta DNA ya bağlanır. AIF ün DNA ya bağlanması; nükleaz aktivitesine yol açarak DNA fragmentayonunu stimüle eder 57. Nöroblastomada apoptozis mekanizmasında oluşan hasarlarla ilgili bilgiler mevcuttur. MYCN amplifikasyonun hücre siklusu, farklılaşma ve apoptozisde kritik rolleri üstlendiği gösterilmiştir 2,15,16. Kaspaz-8 in nöroblastomalarda tümör süpresör geni olduğu bulunmuştur 49,50. Nöroblastomalarda gerçekleşen apoptozisin mitokondride oluşan içsel yol ile oluştuğuna dair bulgular vardır 2. Nöroblastoma tedavisinde, apoptozis mekanizmalarının önemi günden güne artmaktadır. Yeni tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi yeni fırsatlar sağlamaktadır. 22

2.2.3. Apoptozis Direnç Mekanizmaları Apoptozis mekanizmalarını hedeflemek kanser tedavisine yeni yaklaşımlar getirmiştir. Sitotoksik ajanlar ve irradasyon apoptozis indüksiyonuyla hücresel stres ve esas olarak hedef hücre ölümünde etkindir. Apoptozis tümör hücrelerini yoğun bir şekilde ortadan kaldırabilir. Apoptotik mekanizmaların düzenleyicilerini kodlayan genler kanser hücrelerindeki genetik lezyonların aktivite veya inaktivitesi direk hedeftir. Örneğin Bcl-2 ve Bcl-2 bağımlı genler apoptotik sinyal ve düzenlemeden sorumludur. Bcl-2 orijinalinde protoonkojen olarak izole edilmiştir 60. Tek başına oldukça zayıf bir transform onkojen olan Bcl-2 karsinogenezde farklılaşarak c-myc gibi büyümeyi teşvik edici onkojenlere dönüşürler 61. Bcl-2 nin fonksiyonu nöroblastomada dahil olmak üzere bütün kanser türleriyle ilişkilidir 62. Bcl-2 ekspresyonu, apoptozis altında olan nöroblastoma hücrelerinin oranlarıyla ilişkili olarak, MYCN amplifikasyonu ve olumsuz bir histoloji ile sonuçlanır 63. Ayrıca mutasyonlar veya Bcl2 proteinlerinin upstream düzenleyicileri, Akt ve PTEN dahil olmak üzere bir çok kanserle ilişkilidir. c Flip (yalancı kaspaz grubuna giren bir protein) in upregulasyonundan bu yana çeşitli kanser hücrelerinin apoptozise dirençli olduğu rapor edilmiştir. IAP s in de kanser türlerinde apoptozis direnç gelişime ilgili olduğu bilinmektedir. Bunların yanında antiapoptotik genlerin ekspresiyonu, proapoptotik genlerin inaktivasyonuyla apoptozisle birlikte tümörler karşı direnç gösterebilirler. Ayrıca içsel apoptotik yolun bozulması, mutasyon ya da p53 fonksiyon kaybı, kanser hücrelerinde fazlasıyla görülür. p53 DNA hasarında önemli bir molekülü temsil ettiğinden ve DNA hasarı apoptozisi indüklediğinden, p53 kaybı apoptozise direncin bir sonucudur 64. Apoptozise direnç nöroblastoma dahil olmak üzere çeşitli tümörlerde kaspaz 8 in fonksiyon kaybıyla ilişkilidir. Kaspaz 8 in reekpresyonu ölüm reseptörleri ve ilaçla indüklenen apoptoziste nöroblastoma hücrelerinin duyarlılığını eski haline getirmiştir. 65. Apoptozis direncini yenmek için yeni yaklaşımlar geliştirmek çok önemlidir. 23

2.3. SİNYAL İLETİM MEKANİZMALARI VE KANSER Kanser oluşumunun temelinde, hücrenin yaşaması, büyümenin kontrolü ve diferansiasyon gibi biyolojik olayları etkileyen mutasyonların aşamalı olarak biraraya gelmesi yer almaktadır. Kanserin gelişim sürecinde tümör hücreleri bir çok fenotipik özellik kazanmaktadır. Bu değişimler tümör hücrelerinin hızlı ve sınırsız çoğalmalarına ve çevre dokuya yayılmalarına neden olur. Ayrıca bu hücreler özgün mikroçevreden bağımsız olarak yaşamını devam ettirme ve metastaz yapma özelliğine sahiptir. Protoonkogenlerin ve tümör baskılayıcı genlerin seri mutasyonları farklı mekanizmalar aracılığıyla malign fenotipin oluşumuna katkıda bulunur 20. Sinyal iletim yollarını ve sinyal proteinlerini hedef alan onkojenik mutasyonlara sık olarak rastlanmaktadır 70. Sinyal iletiminde meydana gelen değişimler hücrenin çoğalma ve/veya yaşama işlevlerinin kontrolünü ortadan kaldırır. Böylelikle, onkojenik sinyal iletimi invazyon/metastaz sürecinde etkili rol oynamaktadır 26. 2.3.1. PI-3 kinaz/akt sinyal iletim yolu Fosfotidil inositol-3 kinaz (PI-3K) ailesi büyüme, yaşama sinyallerinin iletiminden sorumlu proteinlerdir. Mitojenik ligantlara yanıt olarak RTK (reseptör tirozin kinaz) PI3K (fosfotidil inositol 3 kinaz) aktive eder. PI3K lar PIP2 (fosfatidil inositol (4,5) bifosfatı) fosforilleyerek PIP3 (fosfatidil inositil 3,4,5 trifosfat) dönüştürür. Oluşturulan PIP3 ler membrana bağlı demirleme bölgeleri şeklinde protein kinazları küçük GTPaz düzenleyicileri ve iskelet proteinlerini etkiler 27,30,32,34,35,36,. Fosfotidil inositol 3 kinazlar yapısına, bağlanma şekline, aktivasyonu ve substratına göre PI3KI, PI3KII ve PI3KIII olmak üzere 3 gruba ayrılır. IA sınıfı enzimleri en iyi nitelendirilmiş PI3K grubudur. Class IA grubu PI3K lar iki alt üniteden oluşur 37. a)p110 katalitik alt ünite (p110α, p110β, p110γ) b)p85 regülator alt ünite (p85α, p85β, p55γ, p55α, p50α) 37. 24

Resim 4: p85 ve p110 genlerinin PI3-K mekanizmasına etkisi 2.3.2. Akt yolu : Ekstraselüler sinyal RTK (reseptör tirozin kinaz) nın aktive olmasını sağlar, inaktif PI3K SH 2 domainleri ile RTK nın fosforillenmiş tirozinlerine bağlanarak aktive olur. Aktif PI3K katalitik üniteleri p110 ile PIP2 yi PIP3 e dönüştürürler. Hücre membranının sitosolik kısmında PIP3 artışıyla Akt ve PDK1 proteinleri yapılarındaki PH domainleriyle PIP3 e bağlanırlar. Böylece Akt ve PDK1 hücre membranına tutulur. PDK1 Akt yi fosforilleyerek aktive eder 21,22,23,24,25. Sitokinler ve büyüme faktörleri Akt ve PI3K yolunu aktive ederek hücreler için yaşama sinyalleri oluştururlar. Tümör baskılayıcı proteinlerden PTEN ise, PIP3 oluşumunu inhibe ederek negatif düzenleyici rol oynar 28,29,38. Protein kinaz B uyarısı hücre içinde çeşitli proteinlerin aktivitelerini etkilemektedir. Bunlardan biri, mammalian target of rapamycin (mtor) proteinidir. Kinaz aktivitesine sahip olan bu proteinin rapamisin tarafından inhibe olduğu gösterilmiştir 31,20. 25

Resim 5: Protein kinaz B/Akt yolunun işlevleri 2.3.3. Akt nin rol aldığı süreçler : 2.3.3.1. Hücre döngüsü üzerindeki etkisi; Hücre siklusunda G1 fazından S fazına geçişte esas olarak D ve E tipi siklinlerle beraber Cdk2 ve Cdk4 (ve bazı hücrelerde Cdk6) tarafından düzenlenmektedir. D tipi siklinlerle Cdk4 ve Cdk6 nın oluşturdukları yapılar, G1 deki kısıtlama noktasından geçişte kritik bir rol oynamaktadır. Büyüme faktörü uyarısı ile hücre döngüsünün ilerlemesi arasındaki kritik bağlantı D tipi siklinler tarafından sağlanır. D tipi siklinler çok hızlı yıkılırlar, bu nedenle eğer büyüme faktörleri ortadan kalkarsa hücre içindeki yoğunlukları da aniden düşer. Bu bakımdan G1 boyunca büyüme faktörleri var oldukça, Cdk 4,6/ siklin D kompleksleri hücreleri kısıtlama noktasından geçirir. Öte yandan eğer büyüme faktörleri hücre döngüsünde anahtar rolü oynayan bu düzenleyici noktadan önce kaybolursa, hücrede siklin D seviyesi hızla düşer ve hücreler G1 den S evresine geçmek yerine G0 a 26

girerek dinlenme durumunda kalırlar. Büyüme faktörü uyarısı için önemli bir hedef olması açısından siklin D nin düzenlenmesindeki hataların kanser hücrelerindeki çoğalma kontrolü kaybına katkıda bulunduğu düşünülmektedir 50,59. Bu beklentiye uyumlu olarak insanlarda görülen pek çok kanser çeşidinin hücre döngüsü düzenlenmesindeki hatalardan, diğer bir çoğununda büyüme faktörleri tarafından aktifleştirilen hücre içi sinyal yollarındaki bozukluklardan kaynaklandığı saptanmıştır. Protein kinaz B aktivasyonunun hücre döngüsü üzerindeki etkileri de karsinogenez sürecinde önem taşır. p21 proteini hücre döngüsünün erken G1 fazında siklin D ve siklin bağımlı kinaz 4/6 (cdk4/6) kompleksi üzerinde pozitif uyarıcı etki yapmaktadır. Protein kinaz B, p21 in stabil formunun oluşumunu tetikler ve hücre döngüsünün ilerlemesine uyarıcı yönde etki eder. Buna ek olarak, p21 in degradasyonunu uyaran proteini de inhibe etmektedir 39,73. Ayrıca hücre döngüsünün inhibitör proteinlerinden olan p27 onkojenik uyarı halinde (PTEN mutasyonu, EGFR aktivasyonu, HER2 aktivasyonu) fosforilasyona uğrar. Bunun sonucunda p27 nin inhibitör etkisi ortadan kalkar. Bu çalışmalar sürekli ve/veya kontrolsüz protein kinaz B uyarısı ile tümör hücrelerinin çoğalması arasındaki doğrudan ilişkiyi göstermektedir 20. 2.3.3.2. Apoptozisin İnhibisyonu : Akt uyarısının doğrudan etkili olduğu hücresel işlevlerden biri de apoptozistir. Akt, proapoptotik BAD proteini ile kaspaz-9 üzerinde inhibitör etki gösterirken, NFKB uyarısı ile antiapoptotik cevabı desteklemektedir 39,27. 2.3.3.3. Transkripsiyonun kontrolü :Forkhead transkripsiyon faktörleri (FH ya da FoxO) hücre döngüsünü ilerlemesini inhibe eden proteinlerin (p27, Rb2, GADD45) ve hücre ölümünü hızlandıran proteinlerin (Bim, Fas, TRAIL, TRADD) ekspresyonlarını uyarır. FKHR, Forkhead transkripsiyon faktörü FOXO alt ailesinin bir üyesidir ve insülin ve büyüme faktörü sinyallemesinde önemlidir. Akt Forkhead (FH ya da FoxO) transkripsiyon faktörlerinin fosforilasyonunu sağlar. Forkheadlar fosforilasyonu ile inaktifleşirler ve apoptozisin başlaması için gerekli transkripsiyonel aktivitenin azalmasına neden olur 74. 27

2.3.3.4. p53 üzerine etkisi: Tümör gelişimini baskılama özelliğinden dolayı tümör süpresör protein olarak tanımlanan p53 proteini, hücre döngüsü kontrolü ve apoptozis de oynadığı rolden dolayı, genomun bekçisi veya gardiyanı olarak fonksiyon görür 50. p53 bozuklukları anormal hücre bölünmesine neden olduğu için de kanserleşmeye neden olur ve günümüzde insan kanserlerinin % 50 den fazlasının p53 mutasyonu ile ilgili olduğu anlaşılmıştır. Normal hücrelerde p53 düzeyi düşüktür. DNA hasarı veya diğer stres sinyallerin varlığı; bölünmenin durdurulması, DNA tamiri ve apoptozis fonksiyonları p53 ün düzeyinin artışını tetikler 70. p53 ayrıca bir transkripsiyon faktörü olan Mdm2 (murine double minute 2) tarafından ya transkripsyonu ya da kendisine bağlanılarak hem aktivitesi inhibe edilir hemde yıkımı hızlandırılır (down regülasyon). Fakat DNA nın hasar görmesi halinde p53 ün fosforilasyonu artar ve buna bağlı olarakta Mdm2 den ayrılır, böylece yarılanma ömrü uzadığı için aktiviteside artar 50,75. Akt ye bağımlı fosforilasyonu Mdm2 nin nuklear lokalizasyonunu kolaylaştırdığı ileri sürülmektedir ancak bilgiler yetersizdir. DNA hasarına karşı p53 ve 14-3-3 proteinlerinin aktivitesi arttığında Akt aktivasyonunun azaldığı ileri sürülmüştür 75 2.3.3.5. mtor yolağı: Rapamisin 1975 yılında Rapa Nui adasında keşfedilmiştir. Öncelikle antibiyotik olarak geliştirilmiş olmasına rağmen antiprofileratif özelliklere sahip olduğu da saptanmıştır. Bin dokuzyüz doksan bir yılında rapamisinin hedefi mayalarda keşfedildi ve target of rapamisin (TOR) olarak adlandırılmış. Memelilerde homolugu bulunmasıyla ve mtor (mammalian target of rapamycin) adı verilmiştir 41,42. mtor sinyalleri hücre büyümesinde, protein translasyonunda, otofajide ve metabolizmada önemli bir rol oynamaktadır 20. Tümör süpresör fosfataz ve PTEN PI3-K sinyallarinin negatif düzenleyicileridir. PTEN in azalması meme, endometrial, tiroid, prostat kanseri, Glioblastoma nın oluşmasına neden olur. mtor sinyallerinin aktivitesi Cowden sendromu (PTEN mutasyonları), Peutz-Jeghers sendromu (LKB1 mutasyonu), nörofibramatozis ( NF1) mutasyonu ile ilgilidir. mtor sinyallerinin aktivasyonu bir çok kanser çeşidinde etkilidir. mtor kinaz aktivitesine sahip proteinlerden biridir. Kinaz aktivitesine sahip olan bu proteinin rapamisin tarafından inhibe olduğu gösterilmiştir. mtor un önemli fonksiyonları şunlardır 35,36. 28

1- S6 fonksiyonu ile (S6K) aktivasyonuyla S6 ribozomal proteinini aktive ederek, 5 TOP mrna ların translasyonunu uyarır. 2- Ökaryotik inisiasyon faktörü 4E ile bağlanan proteini (4EBP) inaktive ederek, 4E nin serbest hale gelmesini sağlar. Aktif hale gelen 4E ribozomal proteinlerin translasyonunu uyarır. 5 TOP mrna lar, hücredeki RNA miktarının % 20 sini oluşturur ve translasyon işlevinde etkilidir. 4E proteinide bu mesajların, translasyonunda etkilidir. Sentezlenen proteinlerin, büyüme faktörleri, onkoproteinler veya hücre döngüsünün düzenleyici proteinleri olması mtor un önemini ortaya koymaktadır. Rapamisinin, mtor sentez artışı görülen tümörlerde antitümör etki gösterdiği bilinir 20. 2.3.4. Karsinogenezde etkili olan PI-3K sinyal yolu değişimi ; PI-3K nın sentezi artabilir, PTEN tümör baskılayıcı proteini mutasyon ile fonksiyon kaybına uğrayabilir, Akt sentezi kanser hücrelerinde artabilir, PTEN in işlev kaybı veya Akt nin aşırı sentezlenmesi sürekli mtor aktivasyonuna yol açmaktadır, Bu noktalar göz önüne alındığında karsinogenezde mtor un etkileri şu şekilde özetlenebilir: a.pi-3k sinyal yolu aracılı karsinogenezde mtor un temel bir rolü vardır. b.rapamisin PKB aktivitesine etki etmemektedir. c.s6k nın aktivasyonu ve 4E-BP nin inaktivasyonu tümör gelişimi ile direk ilişkilidir 20. 2.3.5. PI3-K sinyallerinin Nöroblastomadaki rolü Nöroblastoma tümörügenezinde PI3-K aracılı büyüme sinyallerinin güçlü etkilere sahip olduğuna dair kanıtlar günden güne artmaktadır. IGF reseptörlerinin ekspresyonu ve IGF aktivasyonunun nöroblastomalarda hücre proliferasyonunu, motiliteyi, invazyonu ve sağkalımı düzenlenlediği gösterilmiştir 3. IGF reseptörlerinden gibi Trk B-BDNF yolağının PI3-K bağımlı bir şekilde nöroblastomalarda apoptozis direncini ve sağkalımı harekete geçirdiğine dair bulgular vardır. Akt nin genetiği, nöroblatoma hücrelerinde, Trk B-BDNF ilişkili sağkalım sinyallerinde ve kemoterapiye dirençte önemli roller üstlendiğine dair bulgular vardır 18. EGFR reseptörlerininde nöroblastomalarda PI3-K sinyalleriyle ilişkili olduğu gözlemlenmiştir. MYCN proteinine PI3-K sinyallerinde ve nöroblastomalarda birbirine bağımlı olarak 29

saptanmıştır 11. Bu bilgilere dayanarak, nöroblastoma hastalarının tedavisinin, klinik olarak gelişmesi için PI3-K/Akt sinyal iletiminin düzenlenmesinin ümit verici sonuçlar doğuracağını söyleyebiliriz. PI3-K/Akt inhibitörleri preklinik çalışmalar adı altında halen araştırılmaya devam etmektedir. 30

3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1.Hücre kültürü Hücre kültürü besiyerleri laboratuvar ortamında hücrelerin normal metabolik aktivitelerini sürdürebilmeleri için gerekli olan mikroçevreyi sağlayan besleyici solusyonlardır. Hücre kültürü besiyerleri içeriklerindeki aminoasit, karbonhidrat, vitamin ve iyonlarla hücreleri gelişimini desteklerler 76. Hücre kültürü metodunda; RPIM 1640 medium (Life tecnologies, Inc), Dulbecco s modified eagle medium (Life Tecnologies, Inc), Trypsin/EDTA solüsyonu (Biochrom), HEPES buffer (Biochrom), PBS (Biochrom), Penicilinne/Streptomycine (Biochrom), L-Glutamine (Biochrom), Fetal calf serum (Biochrom), Trypan blue (invitrogene) maddeleri kullanılmıştır, Her 500 ml medium içerisine ; + 12,5 ml HEPES + 5 ml Pen/Strep + 2.5 ml L-Glutamin + 50 ml FCS eklenmiştir. Çalışmada kullanılan nöroblastoma hücre hatları; SH-EP (S-type subadherent cell) DMSZ Lan 5 (S-type neuroblastıc cell) DMSZ Kelly (N-type neuroblastic cell) DMSZ Bu çalışmada nöroblastoma hücrelerinden SH-EP hücre hatları DMEM, lan 5 hücre hatları DMEM +RPIM 1640, Kelly hücre hatlarıysa RPIM 1640 besiyerleri kullanılmıştır. İn vitro deneylerde SH-EP hücreleri 0,35x10 5 cells/cm², lan 5 hücreleri 0,6x10 5 cells/cm² 5, kelly hücreleri ise 1,3x 10 5 cells/cm² yoğunluklarında ekilmiştir. Hücre kültürü uygulama basamakları aşağıda belirtilmiştir. DMEM ve RPIM 1640 hücrelerin beslenebilmeleri için gerekli glukoza, canlılıklarını sürdürebilmeleri için uygun ozmolarite ve ph a, fonksiyonlarını görebilmeleri için gerekli aminoasitlere ve vitaminlere sahiptir. Ancak tek başına hücre gelişimi için yeterli değildir. FCS hücrelerin tutunabilmeleri ve çoğalmaları için kullanılan ve içeriği tam olarak tanımlanmamış zengin bir protein çözeltisidir 77. Bu protein çözeltisinin içinde hormonlar, enzimler, hücrenin büyümesi ve çoğalmasını sağlayan büyüme faktörleri, yüzeylere tutunabilmesini sağlayan hücrelerarası matris 31

proteinleri bulunur 77. HEPES hücre kültürlerinde yaygın olarak kullanılan bir çözeltidir, çünkü karbondioksit konsantrasyonu değişikliklerine rağmen fizyolojik olarak ph dengesini korumayı başarır. Hücreleri pasajlamak için kullanılan temel enzim tripsindir. Tripsin bir serin proteaz tipi enzimdir, lizin ve arjinin aminoasitlerinden peptidleri yıkar. Hücrelere tripsin uygulanmadan önce Ca ve Mg içermeyen PBS ile yıkandı yüzeylerindeki serum uzaklaştırıldı. PBS hücre içi ve dışındaki ozmotik basıncı dengede tutan bir tuz solüsyonudur. İçeriğindeki inorganik tuzlar ve su hücre metabolizmasını destekler. Hücreler yüzeyden ayrılır ayrılmaz tripsinin inhibe edilmesi önemlidir. Tripsin hücreleri yüzeyden ayrıldıktan sonra hücre membranlarına zarar vermeye başlar. Kültür ortamı kontaminasyon riski yüksek ortamlar olduğu için manipulasyonlarda steriliteye özen gösterilmiştir. Tüm manipulasyonlar laminar kabin içinde yapılmıştır 78. Hücre kültürü uygulama basamakları aşağıdaki sıralamayla gerçekleşmektedir. 1-Hücreler inkibatörden alınır ve mikroskopta incelenir. 2-Flasktaki eski medium boşaltılır. 3-Steril PBS ile yıkanır ve PBS boşaltılır. 4-Trypsin eklenir.(kullanılan flaskın büyüklüğüne göre 3-6 ml arasında) 5-Hücreler tekrar 2-7 dakikalığına tekrar 37 C lik inkübatöre alınır.(kullanılan hücrelere göre bu zaman değişebilir. SH-EP, Lan5 ve Kelly hücreleri 5 dakika bekletilmiştir) 6-Bir sonraki çalışma için yeni bir flaska 24 ml medium hazırlanır. 7-Hücre pasajlama içinse 50 ml lik falkona kullanılan tripsinin 2 katı kadar medium eklenir. 8-İnkübatöre bırakılan hücreler alınır ve mikroskopta incelenir. Hücreler belirgin bir şekilde flasklara tutunmuş olmalıdır. 9-Bir sonraki çalışma için hazırladığımız flaskı 1:3 veya 1:6 oranında split edilir. 10-Tripsinli hücreleri 50 ml falkona pasajlama için eklenir, mediumla iyice karıştırılır. 11-Hücre sayısını hesaplamak için tripsin-medium karışımını 60 µl tripan blue boyası 40 µl medium+tripsin eklenir. 15-Hücre sayılarını hesaplanır. 32

3.2. Nicoletti (DNA Fragmentasyonlarının Analizi) Nicoletti analizleri hücredeki nicel % apoptozis miktarını ölçmek amaçlı yapılmıştır. Deneylerin 1. Aşamasında eş zamanlı tedavi ile farklı zamanlı tedavi arasındaki farkı göstermek amaçlanmıştır. Bu deneylerde nöroblastoma kültür hücrelerinden SH-EP hücre hattı kullanılmıştır. PI3-K inhibitörlerinden BGT-226 0,2 μm, BEZ-235 0,6 μm ve BKM-120 yi 0,6 μm konsantrasyonlarda kullanılmıştır. Kemoterapi ajanı olarak doksorubisin 0,1 μg/ml ve 0.2 μg/ml konsantrasyonlarda kullanılmıştır. Kontrol grubu olarak DMSO kullanılmıştır. 24 saatlik inkübasyonun ardından nicoletti prosedürünü uygulanmıştır. Deneylerin 1. aşamasında kombine tedavi denenmiştir (Resim 6). Resim 6: Eş zamanlı tedavi ile farklı zamanlı tedavi deneylerinin hazırlanması İkinci aşamada PI3-K inhibitörleri tek ajan olarak kullanılmıştır. BGT-226 0,2, 0,6, 1, 1,5, 2 μm konsantrasyonlarda, BEZ-235 0,6, 1, 2, 3, 5 μm konsantrasyonlarda ve BKM-120 0,6, 1, 1,5, 2, 3 μm konsantrasyonlarda kullanılmıştır. Kontrol grubu olarak DMSO kullanılmıştır. 24 saat, 48 saat ve 72 saat zaman aralıklarında inkübasyona bıraktıktan sonra nicoletti prosedürü uygulanmıştır (Resim 7,8,9). 33

Resim 7: BGT 226 nın tek ajan olarak kullanılan deneylerde kuyucukları hazırlama şekli Resim 8: BEZ 235 in tek ajan olarak kullanılan deneylerde kuyucukların hazırlaması 34

Resim 9: BKM 120 nin tek ajan olarak kullanılan deneylerde kuyucukların hazırlaması Deneylerin üçüncü aşamasında apoptozisin kaspaz bağımlı olup olmadığını öğrenmek için kültür ortamına 20 μm Zvad (kaspaz inhibitörü) eklenmiştir. 24 ve 48 saatlik zaman aralıklarında inkübasyona bırakılmıştır (Resim 10). Son aşamada ise BGT-226 ya yoğunlaşarak kültür ortamına p53 ve Bcl-2 geni ekleyip 24 saat ve 48 saat zaman aralıklarında nicoletti prosedürünü uygulayarak apoptotik hücre yüzdesine bakılmıştır (Resim 11,12). 35

Resim 10: BGT 226 nın zvad (kaspaz inhibitörü) ile yapılan deneylerde hazırlanması Resim 11: Kültür ortamına p53 ve BGT 226 eklerenek yapılan deneylerin hazırlanması Resim 12: Kültür ortamına Bcl-2 ve BGT 226 eklenerek yapılan deneylerin hazırlanması Nicoletti solüsyonunun içeriği : A:0,1 % Trisoduimcitrate-Dihydrate (100 mg/100 ml H2O) B:0,4 % Triton x 100 (400 mg/100 ml H2O) C:Prodiumiodide (1 mg/1 ml H2O) Nicoletti solüsyonu: 50 ml A+50 ml B+5 ml C Bu analizler buz içinde yapılmıştır ve steril değildir. 1-Öncelikle facs tüpleri etiketlenir. 2-Her kuyucuktaki karışım tüplere boşaltılır. 3-Her kuyucuğa 200 μl tripsin eklenerek 5 dakika inkübasyonda bekletilir 36

4-Daha sonraki aşamada her bir kuyucuğa 400 μl PBS eklenir, 5-Karışım tekrar facs tüplerine boşaltılır. 6-1800 devir 4 C ta 5 dakika santrifüj edilir. 7-Süpernatant boşaltılır. 8-Her bir tüpe 1 ml PBS eklenir. 9-Tekrar 1800 devirde 4 C ta 5 dakika santrifüj edilir. 10-Süpernatant boşaltılır. 11-100 μl nicoletti solüsyonu eklenir. 12-4 C de 3-4 saat bekletildikten sonra facs analizi yapılır. Nicoletti (DNA Fragmentasyonlarının analizi) deneylerinde; BGT 226 (Novartis Pharma AG), BEZ 235 (Novartis Pharma AG), BKM 120 (Novartis Pharma AG), DMSO (Merck), zvad.fmk (Bachem9), p53 geni, Bcl-2 geni, FACScan (BD Biosciences), İnkibatör BBD 6220 (Heraeus Instruments), Otomatik pipetler (Abimed), Multipipette plus (Eppendorf AG) gibi materyaller kullanılmıştır. 3.3.Western Blotting Elektroforez işlemiyle poliakrilamid jelde göç ettirilen proteinlerin destek membrana transferi ve membrandaki proteinlerin immünolojik metodlarla gösterilmesidir. Western blot ile antikor antijen etkileşimi yardımıyla doku ve hücrelerdeki protein ekspresyonlarına bakılabilir. Blotlamadan önce çalışılan numunedeki proteinler elektriksel ortamda jel üzerinde göç ettirilmektedir. Proteinlerin elektroforezleri sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jelde gerçekleştirilir. Elektroforez işleminden sonra; jeldeki proteinlerin nitroseluloz membrana aktarılması (blotlama), spesifik olmayan reaksiyonları engellemek için membranda protein bağlanmamış bölgelerin ilgisiz proteinlerle kaplanması (bloklama), özgül antikorlarla tepkime ve en son adımsa proteinlerin görüntülenmesi aşamalarıdır 79. Western blotting deneyleri için önce protein determinasyonu işlemi yapılır, daha sonra protein örnekleri ölçülür, poliakrilamid jel elektroforezi hazırlanır ve western blotting protokolü uygulanır. Bu protokoller aşağıdaki şekilde uygulanmaktadır. 3.3.1 Protein Determinasyonu 1-Ependorf tüpleri ve falkonlar etiketlenir.(tarih, kullanılan hücre, konsantrasyon, kaç saat inkübe edildiği) 37

2-Hücre kültürünün bulunduğu petri kapları inkübatörden çıkartılır. 3-Cell scraper ile yüzeyleri temizlenir. 4-Petri kaplarının tamamı etiketlenen falkonlara boşaltılır. (Falkonda buz dolu kapta olmalıdır) 5-4 C de 1800 rpm de 5 dakika santrifüj edilir. 6-Süpernatant boşaltılır. 7-Yıkama amaçlı her falkona 10 ml PBS eklenir. (PBS soğutulmuş olmalıdır) 8-Tekrar 4 C 1800 rpm de 5 dakika santrifüj edilir. 9-PBS dökülür. 10-Kalan pellet ependorf tüplerine doldurulur. 11-4 C, 1800 rpm de 5 dakika santrifüj edildikten sonra üstte kalan natant boşaltılır 12-Lysis buffer eklenir. (25-40 dakika arası beklenir) * Lysis buffer içeriği ; Trsi HCL 30 mm (1 M stok) NaCl 150 mm (4 M stok) Triton X 1 % Gliserol 10 % 13-Lysis buffer ın içine 1 ml olacak şekilde; PMSF 5μl/ 1 ml LB DTT 2 μl/ 1 ml LB Sodiumorthovanadate 2 μl/1 ml LB β-glycerophosphate 10 μl/1 ml LB Sodyum florid 10 μl/ 1 ml LB eklenir. 14-Lysis Buffer pellet miktarına göre genelde 100 μl olacak şekilde ekleyip 30 dakika buzun içinde tutulur. 15-14000 rpm, 4 C de 25 dakika santrifüj edilir. 16-Hazırladığımız etiketlenmiş ependord tüplerine sıvı kısımı alınır. Protein Determinasyonu yapıldıktan sonra protein örnekleri ölçülür. 3.3.2. Protein Örneklerinin Ölçülmesi 1-Protein markerları alınır. 2-96 lık well-platte hazırlanır. 38

3-En üst kısıma her bir kuyucuğa 10 μl olacak şekilde sırayla 8 protein markerı eklenir. 4-Markerların alt kısımına her kuyucuğa 1 μl olacak şekilde protein örnekleri eklenir. 5-Markerlara ve proteinlere protein reagent A ve B eklenir.(her kuyucuğa A+B 200 μl olacak şekilde) 6-10 dakika inkübasyona bırakıldıktan sonra ölçümler yapılır. 7-Ölçümler için Gen5 programı kullanıldı. 8-Lineer dağılıp dağılmadığı kontrol edilir. Bu aşamadan sonraki aşama jellerin hazırlanmadısır. 3.3.3. Poliakrilamid jel elektroforezi Running jel ve stacking jel olarak 2 ye ayrılır. Bu jellerin içeriği ; Running jel (40 ml-%12) 40 ml H2O 13,2 ml 30% acrylamide mix 16.0 ml 1.5 M Tris (ph 8.8) 10.0 ml 10%SDS 0,4 ml 10% ammonium persulfate 0,4 ml TEMED 0.016 ml Stacking jel 10 ml H2O 5.5 ml 30% acrylamide mix 1.7 ml 1.0 M Tris (ph 6.8) 2.5 ml 10% SDS 0.1 ml 10% ammonium persulfate 0.1 ml TEMED 0.01 m 3.3.4. Western Blotting aşamaları 1-Daha önceden analizi yapılmış olan protein örnekleri hazırlanır. 2-Hazırladığımız jel buzdolabından alınır. 3-Elektroforez sistemi kurulur. 4-Sisteme 1xruning buffer eklenir. 39

5Taraklı kısımda ilk ve son boşluklara 20 μl olacak şekilde protein markerı eklenir. 6-Diğer boşluklara daha önce analizi yapılan proteinler sırasıyla eklenir. 7-Boş kalan kısımlaraysa normal boya eklenir. 8-Düzeneği kurduktan sonra sistemin üzeri kapatılıp voltajlar ayarlanır.(80 V, 400 Amp) 9-Proteinlerin en alt kısıma çökmesine yakın blotter hazırlanır. 10-Hazırladığımız 10x70 cm boytundaki karton ve nitroselüloz membran üstüne jel dikkatli bir şekilde yerleştirilir. 11-Baloncuk kalmamasına özellikle dikkat edilmelidir. 12-Blotter 20 V, 70 Amp olacak şekilde voltaja bağlanıp, 80 dakika bekletilir. 13-Voltaj çözüldükten sonra karton kısım ve jel atılır. 14-Nitroselüloz membran PBST ile yıkanır. 15-Membranın üstüne milk eklenip 1 saat bekletilir. 16-Milk boşaltıldıktan sonra 3 defa 10 ar dakika PBST ile tekrar yıkanır. 17-1. Antikor eklenir. 18-Gece boyunca difrizde bekletilir. 19-1 gün sonra difrizden aldığımız membran 3 er defa 10 dakika arayla PBST ile yıkanır. 20-2. antikor eklenir.(15 ml milk+3 ml 2. antikor) 21-1 saat oda sıcaklığında çalkalanır. 22-Ardından tekrar 3 defa 10 ar dakika arayla yeniden PBST ile yıkanır. 23-Proteinlerin görüntüleme işlemleri yapılıp sonuç filmlere aktarılır. * Aynı büyüklükteki 2 antikorun karışmaması için membran 4 dakika NaOH içerisinde yıkanır.ardından 1 saat milk içerisinde bekletilmelidir. Western blotting deneylerinde kullanılan gereçler; Polyacrilamid Rotiphorese 30 (Merck), 2-Mercaptoethanol (Merck), Bovines Serum Albumin BSA (Serva), ProSieve color protein markers (BMA), Milk powder (Roth), Enhanced Chemiluminescence (Amersham Bioscience), Nitroselüloz membran (Amersham Bioscience), Hyperfilm ECL (Amersham Bioscience), BCA protein assay reagent kit (PIERCE), 6xLoading dye solution (Fermentas), 100 bp DNA ladder (invitrogene), etanol, PI103, soğutmalı santrifüj, mikrosantrifüj, elektroforez sistemi, Agaroz jel aparatı ( Appligene), elektroforez güç kaynağı (Pharmacia Biotech), 40

developer kodak M1000 (Kodak), cell scraper (inotech), MS minishaker (MS laborgrate) gibi gereçler kullanılmıştır. 3.5..Verilerin Değerlendirilmesi Bu çalışmada in vitro ortamda yapılan tüm deneyler en az 3 er defa tekrarlanarak gerçekleştirilmiştir. Her konsantrasyon için bir çalışmada 3 kuyucuk kullanılmıştır. Toplamda en az 9 kuyucuktaki sonuçlar alınmıştır. Bu sonuçların ortalamaları ve standart sapmaları belirlenmiştir. Excel programı üzerinde grafiklere aktarılmıştır. Ayrıca veriler Spss programına aktarılarak Mann-Whitney U testi ile değerlendirilmiştir.(p<0.05 değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.) 41

4. BULGULAR İn-vitro ortamda gerçekleştirilen, Nöroblastoma hücre hatlarından SH-EP hücreleriyle yapılan deneylerin 1. aşamasında BEZ 235, BKM 120 ve BGT 226 nın farklı konsantrasyonlarında pakt, Akt, ps6 ve S6 proteinlerine western blotting yöntemiyle bakılmıştır. Daha sonra BEZ 235 in 0.6 μm konsantrasyondaki eş zamanlı tedavi ve farklı zamanlı tedavi (12 saat) deneyleri gerçekleştirilmiştir. Deneylerin 1. aşamasında kombine tedavi deneylerinde kemoterapi ajanı olarak doksorubisin in 0,1 ve 0,2 μg/ml konsantrasyonu kullanılmıştır. Bu deneylerde amaçlarımız; Bu yolaktaki proteinlerin varlığını göstermek, eş zamanlı tedavi ile farklı zaman aralıklarında gerçekleşen tedavi arasındaki farkları göstermek ve PI3-K inhibitörlerinin kombine tedavi denemelerindeki sonucu karşılaştırmaktır.yapılan deneylerin sonuçlarına göre ; Eş zamanlı tedavi deneylerinde BGT 226 kullanıldığında apoptotik hücre yüzdesi ; DMSO kontrol grubu ve 0.1 μg/ml dokso; % 14.94±0.38 BGT 226 ve 0,1 μg/ml dokso; %21.11±0.06 DMSO kontrol grubu ve 0.2 μg/ml dokso; %19.34±0.87 BGT 226 ve 0.2 μg/ml dokso; % 24.93±0.96 şeklindedir. 12 saat zaman aralıklı tedavi deneyleri sonucunda apoptotik hücre yüzdesi; DMSO kontrol grubu ve 0.1 μg/ml dokso; % 14.74±0.8 BGT 226 ve 0,1 μg/ml dokso; % 36.77±1.13 DMSO kontrol grubu ve 0.2 μg/ml dokso; % 22.49±1.28 BGT 226 ve 0.2 μg/ml dokso; %41.31±1.36 şeklindedir, Eş zamanlı tedavi deneylerinde BKM 120 kullanıldığında apoptotik hücre yüzdesi ; DMSO kontrol grubu ve 0.1 μg/ml dokso; % 14.85±1.22 BKM 120 ve 0,1 μg/ml dokso; %17.60±1.70 DMSO kontrol grubu ve 0.2 μg/ml dokso; %17.82±1.23 BKM 120 ve 0.2 μg/ml dokso; % 24.55±2.26 şeklindedir 12 saat zaman aralıklı tedavi deneyleri sonucunda apoptotik hücre yüzdesi; DMSO kontrol grubu ve 0.1 μg/ml dokso; % 18.37±1.54 BKM 120 ve 0,1 μg/ml dokso; % 26.43±0.79 DMSO kontrol grubu ve 0.2 μg/ml dokso; % 26.26±2.40 BKM 120 ve 0.2 μg/ml dokso; %37.10±2.01 şeklindedir. 42

Eş zamanlı tedavi deneylerinde BEZ 235 kullanıldığında apoptotik hücre yüzdesi ; DMSO kontrol grubu ve 0.1 μg/ml dokso; % 13.40±2.97 BEZ 235 ve 0,1 μg/ml dokso; %18.60±2.18 DMSO kontrol grubu ve 0.2 μg/ml dokso; %19.67±2.98 BEZ 235 ve 0.2 μg/ml dokso; %22.80 ±2.1 şeklindedir. 12 saat zaman aralıklı tedavi deneyleri sonucunda apoptotik hücre yüzdesi; DMSO kontrol grubu ve 0.1 μg/ml dokso; % 11.37±1.54 BEZ 235 ve 0,1 μg/ml dokso; % 23.43±0.79 DMSO kontrol grubu ve 0.2 μg/ml dokso; % 21.90±2.52 BEZ 235 ve 0.2 μg/ml dokso; %44.60±2.28 şeklindedir. Bu deneylerin Western blotting sonuçları ve grafikleri aşağıdaki şekildedir 43

Resim 13: BEZ 235 in 0.6, 0.2, 0.06, 0.02 μm konsantrasyonlardaki western blotting sonuçları 50 45 40 35 Apoptosis [%] 30 25 20 15 10 5 0 DMSO BEZ BEZ 0.1 0.2 [µg/ml] Doxoribucin Grafik 1: SH-EP hücre hattına 0.6 μm BEZ 235 ve 0.1, 0.2 μg/ml konsantrasyonlarda Doxorubicin eklenerek oluşturulan eş zamanlı tedavi deneylerinin grafiği 50 45 40 35 Apoptosis [%] 30 25 20 15 10 5 0 BEZ DMSO BEZ 0.1 0.2 [µg/ml] Doxorubicin Grafik 2: SH-EP hücre hattına 0.6 μm BEZ 235 ve 0.1, 0.2 μg/ml kons. Doxorubicin eklenerek oluşturulan farklı zamanlı tedavi deneylerinin grafiği (p<0.05) 44

Resim 16: SH-EP hücrelerinde BGT 226 nın 0.2, 0.06, 0.02 μm konsantrasyonlardaki Western blotting sonuçları 50 45 40 35 Apoptosis [%] 30 25 20 15 10 5 0 DMSO BGT 0.1 0.2 [µg/ml] Doxorubicin Grafik 3: SH-EP hücre hattına 0.2 μm BGT 226 ve 0.1 ve 0.2 μg/ml konsantrasyonlarda Doxoribucin eklenerek oluşturulan eş zamanlı tedavi deneylerinin grafiği 50 45 40 35 Apoptosis [%] 30 25 20 15 10 5 0 DMSO BGT 0.1 0.2 [µg/ml] Doxorubicin Grafik 4: SH-EP hücre hattına 0.2 μm BGT 226 ve 0.1 ve 0.2 μg/ml konsantrasyonlarda Doxoribucin eklenerek oluşturulan farklı zamanlı tedavi deneylerinin grafiği (p<0.05) 45

Resim 19: BKM 120 nin 2.0, 1.0, 0.6 μm konsantrasyonlardaki western blotting sonuçları 50.00 45.00 40.00 35.00 Apoptosis [%] 30.00 25.00 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 DMSO BKM 0.1 0.2 [µg/ml] Doxorubicin Grafik 5: SH-EP hücre hattına 0.6 μm BKM 120 ve 0.1 ve 0.2 μg/ml konsantrasyonlarda Doxoribucin eklenerek oluşturulan eş zamanlı tedavi deneylerinin grafiği 50.00 45.00 40.00 35.00 Apoptosis [%] 30.00 25.00 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 DMSO BKM 0.1 0.2 [µg/ml] Doxorubicin Grafik 6: SH-EP hücre hattına 0.6 μm BKM 120 ve 0.1 ve 0.2 μg/ml konsantrasyonlarda Doxoribucin eklenerek oluşturulan farklı zamanlı redavi deneylerinin grafiği (p<0.05) 46