AKUT APİKAL ABSELERDEN ALINAN ÖRNEKLERDE BULUNAN ANAEROBİK BAKTERİLERİN TÜR TAYİNİ VE KANTİFİKASYON. Nigar TAŞDEMİROĞLU YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ

AKUT APİKAL ABSELERDEN ALINAN ÖRNEKLERDE BULUNAN ANAEROBİK BAKTERİLERİN TÜR TAYİNİ VE KANTİFİKASYON Nigar TAŞDEMİROĞLU YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ŞUBAT 2013 ANKARA

NİGAR TAŞDEMİROĞLU tarafından hazırlanan AKUT APİKAL ABSELERDEN ALINAN ÖRNEKLERDE BULUNAN ANAEROBİK BAKTERİLERİN TÜR TAYİNİ VE KANTİFİKASYON adlı bu tezin Yüksek Lisans tezi olarak uygun olduğunu onaylıyorum. Prof. Dr. Leyla AÇIK Tez Danışmanı, Biyoloji Anabilim Dalı,G.Ü... Bu çalışma, jürimiz tarafından oy birliği ile Biyoloji Anabilim Dalında Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir. Prof. Dr. Semra SEVİMAY Endodonti Anabilim Dalı,G.Ü. Prof. Dr. Leyla AÇIK Biyoloji Anabilim Dalı,A.Ü.. Prof. Dr. Güven URAZ Biyoloji Anabilim Dalı,G.Ü... Tez Savunma Tarih: 21/02/2013 Bu tez ile G.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulu Yüksek Lisans derecesini onamıştır. Prof. Dr. Şeref Sağıroğlu Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürü..

iv TEZ BİLDİRİMİ Tez içindeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm. Nigar TAŞDEMİROĞLU

iv AKUT APİKAL ABSELERDEN ALINAN ÖRNEKLERDE BULUNAN ANAEROBİK BAKTERİLERİN TÜR TAYİNİ VE KANTİFİKASYONU (Yüksek Lisans Tezi) Nigar TAŞDEMİROĞLU GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Şubat 2013 ÖZET Periapikal enfeksiyonlarının çoğu, pulpa ve kök kanalı içindeki mikroorganizmaların apikal foramenden periapikal dokulara doğru yayılmasıyla oluşan iltihabi hücrelerdir. Periapikal doku enfeksiyonu ender olarak ise pulpada nekroz oluşturan kimyasal maddelere ve fiziksel nedenlere bağlı olabilir. Yapılan çalışmalarda periapikal doku ve pulpa enfeksiyonuna çoğunlukla anaerobik bakterilerin sebep olduğu gözlenmiştir. Öncelikle bakteriler dentin duvarlarına tutunarak, ağrılı alevlenmelerle şiddetli bağışıklık sistemi cevabı oluşturarak pulpa iltihabına sebep olur. Pulpa iltihabı ilerleyerek apikal dokulara ulaşır. Periapikal dokularda önce akut sonra kronik apikal doku enflamasyonu başlar. Akut apikal inflamasyon; kökün apeksi etrafındaki dokularda yaygın likefaksiyon şeklinde olabilen lezyonlardır. Periapikal iltihabi lezyonların oluşumdaki asıl sebep olan kök kanalında bulunan mikroorganizmaların teşhisi uygulanması gereken tedavi için önemlidir. Bunun için enfekte kök kanalından alınan örneklerin kültüre edilmesi gerekmektedir. Ancak endodontik patojenlerin çoğu özel anaerobik şartlarda ve geç üreyen bakteriler olması nedeniyle kültür yöntemini zorlaştırmaktadır. Bu çalışmada kök kanal enfeksiyonlarında en sık görülen bakterilerin tanımlanmasında hızlı,

v özgül ve güvenilir bir yöntem olarak kabul edilen ve karışık flora içinde bile hızlı tür tayinine imkan sağlayan polimeraz zincir yöntemi (PZR) uygulanmıştır. Materyal olarak pulpal ve periapikal enfeksiyon hastalıkları olan dişlerin kök kanallarından aseptik şartlarda kültür örnekleri Gazi Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi'nden alınmıştır. Alınan örneklerin bakteri DNA izolasyonları yapılmış; örneklerde Porphyromonas endodontalis, Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros, Prevotella nigrescens, Prevotella intermedia, Actinomyces israelii, Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, Streptococcus anginosus türlerinin 16S rrna bölgelerine ait primerler tasarlanarak PZR ile çoğaltılmıştır. Sonuç olarak Porphyromonas endodontalis %40, Prevotella intermedia %30, Peptostreptococcus micros %40, Prevotella nigrescens %25, Actinomyces israelii %30, Treponema denticola%37,5, Porphyromonas gingivalis %27,5, Streptococcus anginosus %17,5 oranlarında görülmüştür. Bilim Kodu : 203.1.105.Moleküler Hücre Biyolojisi Anahtar Kelimeler : Moleküler Biyolojisi, Endodontal Mikroorganizmalar, 16S rrna, PZR Sayfa Adedi : 87 Tez Yöneticisi : Prof.Dr.Leyla AÇIK

vi IDENTIFICATION AND QUANTIFICATION OF ANAEROBIC BACTERIEL SPECIES TAKEN FROM ACUTE APICAL ABSCESSES (M. Sc. Thesis) Nigar TAŞDEMİROĞLU GAZİ UNIVERSITY INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY February 2013 ABSTRACT Microorganisms, located in pulp and root canal, cause acute apical inflammation by progress from apical foramen to pericementum. But rarely the periapical tissue inflammation become due to the nonbacterial irritants. The experimental study demonstrate that pulp infection and pericementum tissue become mostly by anaerobic bacteria are defused to periapical tissue. Firstly, bacteria attack to dentin than enter to pulp with dolorous, long term fever and severe immune system responsive. Unless rooth canal treatment, inflammation advance from acute phase to chronic in pericementum. Acute apical inflammation which is localised or defused liquefaction lesion around root apex. Anaerobic bacteria has been accepted as the most important etiologic factors at these kind of infections. For this reason bacteria must be identified which exist in the interdentinal or root canal system for achivement of treatment. Thus, classical, conventional microbiological methods such as culture are needed. But this will take time because of the fastitious and/or slowly growing bacteria and also some of them are uncultivable bacteria. Besides for identification of the species within a mix population/flora will be needed more media, chemical agents and identification kits. So this will take long time and cost will be higher.

vii On the other hand, it was impossible to type every isolated strains by in vitro cultures. Polimerase chain reaction (PCR) is accepted as a rapid, specific, sensitive and every isolated strains by in vitro cultures. Polimerase chain reaction (PCR) is accepted as a rapid, specific, sensitive and reliable technique which enables identification of the species even among a mixed flora specifically. This impossible to type every isolated strains by in vitro cultures. Polimerase chain reaction (PCR) is accepted as a rapid, specific, sensitive and reliable technique which enables identification of the species even among a mixed flora specifically. This technique will be used in this study. Interdentinal samples taken from the patients aseptically from the root canal of the patients who has pulpal and periapical infections in Ankara University Faculty of Dentistry, Department of Endodontics. Then the bacterial DNA were isolated from the samples and amplification of the DNA samples with oligonucleotid primers targeted to the type specific region of 16S rrna of Porphyromonas endodontalis, Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros, Prevotella nigrescens, Prevotella intermedia, Actinomyces israelii, Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, Streptococcus anginosus's in the study. Then electrophoresis of the PCR samples in agarose gel and imaging of them were done. The result of study Porphyromonas endodontalis %40, Prevotella intermedia %30, Peptostreptococcus micros %40, Prevotella nigrescens %25, Prevotella intermedia %30, Actinomyces israelii %30, Treponema denticola %37,5, Porphyromonas gingivalis %27,5, Streptococcus anginosus %17,5 proportional odds was identified. Science code : 203.1.105. Molecular Cell Biology Key Words : Molecular Cell Biology, Endodontic Microorganisms, 16S rrna, PCR Page Number : 87 Adviser : Prof.Dr. Leyla AÇIK

viii TEŞEKKÜR Çalışmam boyunca desteğini esirgemeyen, bilgi ve tecrübelerini paylaşan saygı değer tez danişmanım Prof. Dr. Leyla AÇIK'a, A.Ü. Diş Hekimliği Fakültesi Öğretim Üyesi Prof.Dr. Semra Sevimaya a, Gazi Ünviversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji ABD Başkanı Yrd. Doç. Dr. Gülçin AKÇA ya ve her zaman yanımda olduklarını bildiğim sevgili aileme en içten teşekkürlerimi sunarım.

ix İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... iv ABSTRACT... vi TEŞEKKÜR... viii İÇİNDEKİLER....ix ÇİZELGELERİN LİSTESİ... xi ŞEKİLLERİN LİSTESİ... xii RESİMLERİN LİSTESİ... xiii SEMBOL VE KISALTMALAR... xiv 1. GİRİŞ.... 1 2. GENEL BİLGİLER VE KAYNAK ARAŞTIRMASI... 3 2.1. Diş Plak Oluşumu ve Gingivitis... 4 2.2. Çürük Oluşumu... 5 2.3. Çürük Kavitenin Bakteri Kompozisyonu... 7 2.4. Dentin Kanal Enflamasyonu... 8 2.5. Pulpa Enflamasyonu... 9 2.5.1. Bakterilerin pulpaya giriş yolları... 11 2.6. Kök Kanal Hastalıkları... 12 2.6.1.Kök kanal hastalıklarının sınıflandırılması... 13 2.6.2. Bakterilerin sınıflandırılması... 17 2.6.3. Enfekte kök kanalındaki mikroorganizmalar... 20 2.6.4.Bu çalışmada kullanılan anaerop mikroorganizmazlar... 25

x Sayfa 2.7.Mikroorganizmaların Tanımlanmasında Kullanılan Yöntemler... 28 2.7.1. Kültür tekniği... 29 2.7.2. Moleküler Tanı Yöntemleri... 30 2.7.3. Polimeraz Zincir Rekasiyonu... 30 2.7.4 PZR 'da Kullanılan Başlıca Bileşenler... 32 3. MATERYAL VE METOT... 36 3.1. Materyal... 36 3.1.1. Kök kanal materyali... 36 3.1.2. Tampon ve çözeltiler... 36 3.2. Metot... 39 3.2.1. Kök kanallarından örnek alınması... 39 3.2.2. DNA izolasyonu... 40 3.2.3. PZR deneyleri... 41 4.BULGULAR... 44 4.1. PZR Kullanılarak Bakteri Tür Tespiti....44 5.TARTIŞMA VE SONUÇ... 58 KAYNAKLAR... 64 ÖZGEÇMİŞ... 73

xi ÇİZELGELER LİSTESİ Çizelge Sayfa Çizelge 2.1. Endodontik Enfeksiyonlarda Etken Olan Bakteriler... 19 Çizelge 2.4. Periapikal enfeksiyonda genelde görülen bakteri türler... 24 Çizelge 3.1. Bakteri Primer Dizileri... 38 Çizelge 3.2. Porphyromonas endodontalis, Prevotella intermedia Peptostreptococcus micros, Prevotella nigrescens, Prevotella intermedia, Actinomyces israelii, Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, Streptococcus anginosu PZR Programları... 41 Çizelge 4.1. PZR Sonucu Örneklerde Saptanan Bakteri Türleri (Bakteri saptanan örnekler(+) ile bakteri saptanmayan örnekler ise(-) gösterilmiştir.)... 44

xii ŞEKİLLERİN LİSTESİ Şekil Sayfa Şekil 4.1. Porphyromonas gingivalis Agaroz Jel Görüntüsü... 50 Şekil 4.2. Porphyromonas micros Agaroz Jel Görüntüsü... 51 Şekil 4.3. Prevotella nigrescens Agaroz Jel Görüntüsü..... 52 Şekil 4.4. Treponema denticola Agaroz Jel Görüntüsü.. 53 Şekil 4.5. Actinomyces israelii Agaroz Jel Görüntüsü.... 54 Şekil 4.6. Streptoccocus angious Agaroz Jel Görüntüsü... 55 Şekil 4.7. Provotella intermedia Agaroz Jel Görüntüs... 56 Şekil 4.8. Porhyromonas endodontalis Agaroz Jel Görüntüs..... 57 Şekil 4.9 Çalışan Bakteri DNA Fragmenleri Uzunluğu.. 49

xiii RESİMLERİN LİSTESİ Resim Sayfa Resim 3.1. PZR Tekniği... 35

xiv SİMGELER VE KISALTMALAR Bu çalışmada kullanılmış bazı simgeler ve kısaltmalar, açıklamaları ile birlikte aşağıda sunulmuştur. Simgeler Açıklama bp Baz çifti gr Gram mm Milimolar Tm Primerlerin bağlanma sicaklığı µl Mikrolitre µm Mikromolar Kısaltmalar Açıklama A C DNA dntp EIA ELISA FRET G IF PZR RNA rrna T Adenin Sitozin Deoksiribo Nükleik Asit Deoksiribonükleotid trifosfat Enzim Immunoassays Antikorların Tanımlanması (Enzyme-linked Immunosorbent Assay ) floresans rezonans enerji transferi Guanin İmmunofloresans Polimeraz Zincir Reaksiyonu Ribo nükleik asit Ribozomal Ribo nükleik asit Timin

1 1. GİRİŞ Periapikal enfeksiyonlar dişin kök ucunda ve yakın çevre dokularında görülen odontojenik bir enfeksiyondur. Periapikal doku hastalıkları ve kök kanal enfeksiyonlarının büyük çoğunluğu bakterilerin pulpayı istila ettiği, pulpada kan dolaşımının tamamen durduğu, periapikal dokuların da olaya katıldığı lokalize veya diffüz likefaksiyon lezyonlardır [5]. Apikal iltihaplar daha ender olarak ise periodontal cepten bölgeye ulaşan mikroorganizmalar nedeniyle de oluşabilir [14]. Periapikal enfeksiyonlar, dönüşümsüz iltihaplı pulpadan gelen iltihabı mediatörler veya nekrotik pulpadan bakteri toksinleri, kimyasal maddeller, yüksek kalmış olan restorasyonlar, kanal aletlerinin apeksten dışarı çıkması, taşkın kanal dolgusu veya çatlak diş sendromundan (fiziksel nedenler) dolayı başlayabilir. Periapikal doku enfeksiyonları önce akut sonra kronik ilerleyen iltihabi enfeksiyondur [14,2]. Ağız boşluğu, nazofarenks ve gastrointestinal kanalda bulunan mikroorganizmalar pulpa veya kök kanalını enfekte edebilir. Ağız florası özellikle çürük kavite oluşumuyla periodontal enfeksiyonlarda ana nedendir. Ağız florası hem aerobik hem anaerobik bakteri türlerini barındıran bir floradır. Bu karışık florada tür teşhisi tedavinin başarısı için ana unsurudur. Eğer bakteri ortadan kaldırılmazsa tedavi sonrası daha inatçı türlerle karşılaşılır. Bunun sonucu diş kanal tedavisi başarısız olur ve diş çekimi yapılır. Bakteri tür teşhisi için enfekte alanlardan alınan örneklerin kültür çalışması ile laboratuvar koşullarında üretilmesi oldukça zordur. İnsan vücudu, oral kavite ve kök kanalındaki mikrobiotanın kültüre edilemeyen birçok türü bulunmaktadır. Son yıllarda ise mikrobiyal yöntemlerle apikal periodontitise sebep olan patojenlerin tespit edilmesi zaman alıcı ve çelişkili sonuçlar vermesi sebebiyle mikrobiyolojik

2 kültür ve biyokimyasal yöntemler tercih edilmemektedir. Bu yüzden moleküler genetik yöntemlerle yapılan deney sonuçları periapikal inflamasyona sebep olan mikroorganizmaları tanımlamada ve kişiye özel periodontolojik tedavide önemlidir. Kültüre edilemeyen birçok mikroorganizma ve hastalıklar arasındaki ilişki konusunda moleküler çalışmalar yoğunluk kazanmıştır. Mikroorganizmaların tanımlanması amacıyla kullanılan moleküler yöntemlerden günümüzde en sık kullanılanı Polimeraz Zincir Reaksiyonu dur (PZR). PZR yöntemi, moleküler biyolojideki en önemli gelişmelerden biridir. Yöntem dizisi bilinen belli uzunluktaki DNA parçasının in vitro replikasyonu ile 25-35 döngü DNA polimeraz enziminin hedef DNA'yı çoğaltması esasına dayanır. PZR reaksiyonu araştırılacak örnekteki DNA'nın iki zincirinin yüksek sıcaklık ile birlikte birbirinden ayrılmasını (denatürasyon), daha sonra sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA'ya bağlanmasını (hibridizasyon), sonra zincirin uzamasını (polimerizasyon) ve bu döngülerin belirli sayıda tekrarlanmasına dayanır. Bu işlemlerden sonra çoğaltılan ürün jel elektroforezinde yürütülür ve enfeksiyonda bulunan bakteri türü belirlenir [3]. Bu çalışmada DNA izolasyonu için örnekler, genellikle sorunlu dişlerin kök kanallarından ve periapikal lezyonlarından elde edilmiştir. Gazi Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Endodonti kliniğine başvuran hastalardan alınan örnekler ve daha önce Ankara Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesinden alınmış olan DNA örnekleri kullanılmıştır. Alınan örneklerden DNA izolasyonu yapılmış ve Porphyromonas endodontalis, Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros, Prevotella nigrescens, Prevotella intermedia, Actinomyces israelii, Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, Streptococcus anginosu türü bakteri için sentezlettirilen 16S rrna bölgesine özgü primerlerle PZR işlemi yapılmıştır.

3 2. GENEL BİLGİLER VE KAYNAK ARAŞTIRMASI Periapikal enfeksiyonlarının çoğu mine defektiyle çürük kaviteden giren mikroorganizmaların pulpayı enfekte etmesiyle başlar. Daha ender olarak ise periodontal cepten bölgeye ulaşan mikroorganizmalar nedeniyle oluşur. Ayrıca fiziksel ve kimyasal etkenlerle de oluşabilirler (çatlak diş sendromu, travma vb.) [2]. Çürük ve pulptis başlangıcında ilk olarak görülen mikroorganizmalar periapikal abse gelişiminde en önemli sebep olarak görülmektedir [2]. Diş çürüğü, öncelikle diş üzerinde bulunan bakteri plağındaki mikroorganizmalar, besinlerle alınan sakkarozu plak içinde sindirerek asit oluşturmasıyla başlar. Dişin temel sert tabakası olan mine ve sement bundan dolayı zayıflar. Artık bu fazda plakta görülen Actinomyces, Lactobacillus, Streptococcus mutans bakterilerin ürettiği hücredışı polisakkariti salgılar. Diş plağı oluşturarak diş yüzeyine diğer bakterilerin turunmalarını artırır. Artik dişin periodontis ve tüm yumuşak doku hücreleri tehdit altındadır [4]. Ağız florasında fungi, arkea ve virüsler de bulunmasına rağmen bakteriler konakçıda oluşan infeksiyonda metabolizma ürünleri, sebep olduğu fizikokimyasal değişimler, virülans faktörleri ile bağışıklık sistemini hızla zayıflatır çürüklere ve abseye sebep olurlar [2]. Dentin mikroorganizmaların bulunması sonucu zayıflar. Pulpal doku lokal olarak kronik enflamatuar hücreler (makrofaj, lenfosit, plazma hücreleri gibi) ile infiltre olur. Çürük pulpaya ilerledikçe kronik enflamasyon yaygınlaşır ve akut lezyonlar periapikale doğru (ağrı, diş etinde şişme, sızlama gibi) enflamasyon cevap oluşumuyla ilerler [102].

4 Pulpitisde gram pozitif ve fakültatif olan Propionibacterium, Streptoccus ve Eubacterium türlerine enfeksiyonun ilk fazlarında rastlanmaktadır [4]. Çürüğün son evresinde kavite tabanındaki bakteriler gram pozitif sakkorilitik bakterilerdir. Özellikle Streptococcus, Lactobacillus, Leptothrischia, Bifidobacterium, Actinomyces, Rothia gibi türlerdir. Kök kanalındaki bakteri suşları, dişte oluşan biofilm ve nekrotik pulpa yapısını başlatan bakterilerdir [2]. Normal ağız florasında fakültatif anaerobik türler yoğun iken çürük kaviteler ve apekse doğru olan enfeksiyonlarda tür sayısı azalır. Gram negatif ve anaerobik rodlar baskındır. Akut ve kronik periapikal lezayonlarda sıklıkla bulunan türler gramnegatif (Fusobacterium, Dialister, Porphyromonas (assakkarolitik Bacteroides ler), Prevotella, Tannerella, Treponema, Campylobacter ve Veillonella) ve gram-positif (Parvimonas, Filifactor, Pseudoramibacter, Olsenella, Actinomyces, Peptostreptococcus, Streptococcus, Propionibacterium ve Eubacterium) bakterilerdir [2]. 2.1. Diş Plak Oluşumu Ve Gingivitis Gingivitis tanımı; 1999'da yeni bir kategori olarak kabul edilmiştir. Biofilm kısmındaki plak tabakası hastalık gelişiminde çok önemli bir rol oynamaktadır. 5.Avrupa Periodontitis Çalıştayı'nda (2005), gingivitis ve periodontitisin inflamatuar hastalıklarda ilişki içinde olduğu kabul edilmiştir [7]. Diş plağının oluşmasına sebep olan bakteriler bir dış yüzey katmanı oluşturarak diş eti iltihabı olan gingivitis başlatırlar. Diş eti iltihabı ilerleyerek periodontitis iltihabına sebep olur. Böylece dişi kemiğe bağlayan tüm yumuşak doku ve lıgamentler tehdit altındadır böylece bakteri periapikal dokulara doğru daha hızlı ilerler [6].

5 Diş yüzeyine başlıca ilk kolonize olan bakteriler Streptococcus (S. sanguis, S. mutans, S. sobrinus ve S. mitis) ve Actynomyces plak ve tartar oluşuturur. Fusobacteria fizyolojik köprülerle mikro çevreyi genişletirler. Lactobacillus organizmaları dentinin daha ileri yıkımı için primer ajan olmuştur [33]. Pulpada oluşan enfeksiyon, dentin kanallarından bakterilerin girişi, pulpa odasının açılmasıyla, kandan gelen bakteriler ya da bitişikte enfekte dişlerden kaynaklanan bir periapikal infeksiyonun yayılmasıyla başlayabilir [6]. Pulpa tamamen öldükten sonra bakteriler periapikal dokulara ve alveolar kemiğe doğru yayılırlar. Periodontal apse, dişin destek yapılarının hızla yıkılmasına yol açan akut bir lezyondur. Oluşumu ve patogenezi tam olak anlaşılamamıştır. Periodontal apsenin iki klinik tipi vardır. Periodontitise bağlı olarak daha önceden var olan periodontal ceplerle ilgili olan apselerdir. Diğeri ise periodontitise bağlı olmayarak yabancı cisimlerin impaktasyonu veya kök morfolojisindeki değişimler apse oluşumununda rol oynar [9]. Periodontal apse periodontal cepte oluşan boşluk ve bunu takiben cepten destekleyici dokulara ulaşan enfeksiyon ve süpüratif enflamasyonun lokalizasyonu sonucunda oluştuğu anlaşılmaktadır [8]. 2.2.Çürük Oluşumu ' Diş minesi bir tür hidroksiapatitten oluşmaktadır ve formülü Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 dır. Tüketilen yiyecek ve içeceklerin etkisi ile ağız içindeki ph mikroorganizmalar sayesinde sürekli değişir. Burada karbonhidratları kullanarak anaerobik fermantasyonla glukoz, asetik asit ve propionik asit üretilmektedir [24]. Dişlerin morfolojik olarak kompleks yapısından dolayı okluzal yüzeylerinde plak birikimi daha fazla olmaktadır. Dişlerin pit ve fissür bölgeleri çürük oluşumuna en

6 uygun bölgeleridir. Pit ve fissürlerin plak birikimini önlemek ve bu sayede çürük oluşmasını engellemek için fissür örtücüler kullanılmaktadır. Dişin kimyasal yapısında hidroksiapatit Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2, flor ile birleşerek hidroksiapatitten daha dayanıklı bir molekül olan Flor apatit oluşturur [ 24]. Yapılan çalışmalar floridlerin en yüksek antikaryojenik etkiyi düşük seviyelerdeki miktarların uzun sürelerle ağız ortamında bulunmalarıyla gerçekleştirdiğini göstermiştir [25]. Ağız ph'sı düşmesiyle ve 5,5 >ph ise flora tehlike altındadır. Ağızdaki serbest H + iyonları sebebiyle Ca ayrılır ve dişin inorganik kısmın çözünmesiyle çürüme ve plak oluşumu başlar. Dişin kimyasal yapısı ; Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 +2F - ------> Ca 10 (PO 4 ) 6 F 2 + 2 OH Çürüme reaksiyonu ise ortamdaki serbest H + iyonlarınca başlatılır, dişteki kalsiyum dişten ayrışır. Şöyle ki; Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 + 8 H + -----> 10 Ca +2 +6 HPO 4 + 2 H 2 O Diş yüzeyinin ilk yerleşimcileri en yüksek oran Actynomyces ve S. mutans da içeren Streptococcus türleridir. Bu öncü türlerin sayısının artması ve metabolizmaları diş bakteri plağını oluşturarak daha etkin türlerin diş minesine tutunmasına neden olur. Özellikle sukrozu glukansükraz enzimi ile aside dönüştürerek diş miesi bozulmasında büyük rol oynar [26]. Mine çürüğü başladığında lezyonun yüzey ve derin tabakasında bol miktarda Streptokok (mutans grubu) ve Laktobasil bulunmaktadır. Çürüğün son evresinde kavitede tespit edilen bakterilerin ortak özelliği gram pozitif ve sakkarolitik olmalarıdır [28].

7 Diş yüzeyinde başlıca ilk kolonize olan bakteriler Streptococcus ve Actynomyces lerdir. Fusobacteria fizyolojik köprülerle mikro çevreyi genişletirler. Lactobacillus organizmaları ise dentinin daha ileri yıkımı için primer ajandır. Karyojenik bakteriler mineye yapışma, asitleri üretme ve tolere etme, sukroz açısından zengin çevrede gelişme ve rekabet ettiği mikroorganizmaları öldüren bakteriosin üretme özellikleri yüzünden öncelikle başlangıç çürüğüne neden olurlar [29]. Çürük oluşumundaki biofilm tabakada bakteriler arasında çapraz beslenme ve metabolik işbirliği vardır Veillonella; S. mutans ve P. gingivalis tarafından üretilen laktik asit ve T. denticola tarafından üretilen süksinik asitten faydalanabilir [26]. Hazır gıdalarda besinlerin ömrünü arttırmak için kullanılansodium benzoate (SB), potassium sorbate (PS) and sodium nitrite (SN) gibi maddeler biofilm tabakada Streptococcus mutans türlerinin in vitro şartlarda sayılarının arttığı gözlenmiştir [27]. 2.3. Çürük Kavitenin Bakteri Kompozisyonu Oral kavite insan vücudundaki mikroorganizmalrın çoğunu barındırmaktadır. Şimdiye kadar 700'den fazla bakteri tür teşhisi yapılmaktadır. Çürük kavite florasının incelendiği bir çalışmada 224 bakteri türü ve filotipi PZR ile teşhis edilmiştir [16]. Çürük başlangıcında sakkorilitik ve fakültatif gram pozitif anaerobik türler hakimdir Ancak apikale doğru gram negatif anaerobik, proteolitik ve gram - bakteriler baskındır. Eğer tedavi sonrası tekrarlayan apikal apse mevcutsa yine gram pozitif ve fakültatif türlere rastlanabilir [15]. Streptokoklar oral mikrofloranın çoğunluğunu oluştururak ağzın tüm bölgelerinde tespit edilebilmektedir. Ancak bu cinste Streptococcus mutans ağız florasındaki hızlı değişen çevresel şartlara ve toksik maddelere karşı oldukça dayanıklıdır. Çürük

8 başlangıcındaki ağız boşluğu florası incelendiğinde gram pozitif, fakültatif anaerobik bir bakteri olan Streptococcus mutans ve Lactobacillus türleri etkilidir [10]. Sağlıklı bir oral kavitede ise özellikle Streptococcus sangius, Streptococcus gordonii, Abistrophia defectiva, Actinomyces türleri özellikle diş yüzeyinde kolonize olmaktadır. Çoğu gram pozitif çomaklar ve flamenlerdir [56]. Çürük esnasında ağız florasında Streptococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium, Actinomyces, Rothia ve bazen Peptostreptococcus üyeleridir. Dentin çürümeye başladığında Porphyromonas ve Provetalla üyeleri dentin çürüğü florasına katılmazlar. Ancak pulpitis esnasında Porphyromonas ve Provetalla üyeleri floraya eklenmekte ve ağrıyı başlatmaktadırlar [2]. Ağız florasında bulunan S. aureus, Streptococcus türleri ve Enterococcus türleri aynı zamanda kalp kapakçığına tutunma ve enfekte vejetasyonlar yetiştirebilmektedir. Gram pozitif bu bakteriler treombosit aktivasyonu direnç gösterir ve matriks moleküllerine tutunmaktadır. Özellikle kronik periodontisten sonra bu bakteriler vucudun çoğu yerinde bulanbilir [14]. 2.4. Dentin Kanal Enflamasyonu Dentin, dişlerin mezoderma kökenli kemiğe benzer yapıdaki temel tabakasıdır. Kuru ağırlığının %70-75'inin kalsiyum tuzu olması nedeniyle kermikten daha serttir. Dentin, içinde sinir hücresi veya uzantısı barındırmaz ancak içindeki dentin kanalları nedeniyle hassas bir dokudur. Dentin kanalındaki sıvı hidrosatatik basınca neden olan diş eti çekilmelerinde sızlama tarzında keskin bir ağrı olur [19]. Odontoblast hücreler dentin organik matriksi salgılamakla görevlidir. Ancak dentin kanalları bakteri istilasına uğrarsa dentin ve pulpal fizyoloji bozulur ve pulpa-dentin kompleksi kendini savunamaz [20].

9 Dentin kanalarına farklı bakteri türleri girebilme yetenekleri hem in vivo hem de in vitro olarak yeterince bilinmemektedir. Ancak yapılan çalışmalar en azından bazı Gram pozitif türlerin Streptococcus ve Lactobacillus dentin tübüllere gram negatiflere göre daha kolay enfekte ettikleri açıklanmaktadır [21]. Dentin kanallarındaki bakteriler kanal gövdesindekine göre daha az sayıda olduğu kanal periapikal dokulara doğru sayıları ve etkinlikleri artmaktadır [22]. Yumuşak dentin kanal enfeksiyonunda %50'sinde Lactobacillus %25 oranında polisakkarit üreten Streptokoklar ve çürük dişlerin ilerlemesinde gram pozitif pleomorfik rodların yer aldığı bakteri grupları baskın olduğu tespit edilmiştir [4]. 2.5. Pulpa Enflamasyonu Pulpa dişin orta kısmında bulunan yumuşak dokuya verilen isimdir. Kökün ucuna kadar devam eder, kan damarları ve sinirler ile sarılıdır. Herhangi bir nedenden dolayı oluşan çürüğe ve diğer etkenlere karşı odontoblastlar dentin hücreleriyle pulpayı korumaktadır [100]. Dentin zayıflayarak mikrobiyal ürünler, organik asitler ve diğer metabolitler ve çeşitli enzimler pulpaya gelir. Enfekte pulpada fibroblastlar Type I ve Type II kolejenleri, fibronektin ve lökosit yapılarını oluşturur [30]. Bakteri yüzey bileşenleri özellikle kapsül yapıları; konakçının savunma proteinleri denilen immunoglobinleri, tamamlayıcı proteinleri ve gerekli olan serum proteinleri indirgeyen proteolitik enzimlere sahiptir. Akut infeksiyonda ve infeksiyona geçişte proteolitik enzimler en önemli virulans faktörler olarak yer alır. Özellikle lipopolisakkarit (LPS) endotoksin önemi vurgulanmaktadır [12]. Çürük başlangıcında veya sağlıklı bir ağız florasında baskın türlerden biri olarak bulunan Fusobacterium nucleatum ile yapılan çalışmada LPS-endotoksin

10 faktörlerinin kök kanalına uygulandığında hızlı bir şekilde enflamasyonel cevap ve kemik kaybı periapikal bölgelerde yaşandığı tespit edilmiştir [13]. Bakteriler pulpayı enfekte etmeden önce çürük lezyonlarına karşı pulpa reaksiyon vermeye, bağışıklık cevabı oluşturmaya başlamıştır [18]. Bağışıklık sisteminin temel cevabı olarak kabul edilen kandaki lökosit sayısı pulpada artar. Özellikle bağ dokusu ve kan damarlarındaki endotel hücrelerde E-selektin, P-selektin, ICAM-1, VCAM-1 and PECAM-1 moleküllerinin artışı bağışıklık cevabın uyarıldığını göstermektedir [17]. Özellikle biofilm tabakasında ve normal ağız florasında yoğun olarak bulunan Fusobacterium nucleatum tek başına çürük oluşturmada baskın bir tür değildir. Ancak P. gingivalis, T. forsythensis ile etkileşen F. nucleatum türlerinin patojen etkisi artmakta ve periapikal periodontitistede yoğun olarak bulunması ağız florasının temizliğine dikkat edilmesi gerektiğini vurgulamaktadır [14]. Pulpaya ilk gelen sakkorilitik, fakültatif türlerdir. Bunlar Actinomyces, Bifidobacterium ve Eubacterium cinsleridir [14]. İleri safhada Propionibacterium acne gibi hem proteini hem karbonhidratı tüketen tür sayısı artar. Pulpanın kök kısımlarında ise sakkorilitik gruplar yerine proteolik kabiliyeti yüksek bakteriler görülür. Gram pozitif anaerobik koklar başlangıç enfekisiyonunda %7 oranında Streptococcus intermedia, Streptoccus constellatus ve %6 oranında fakültatif Streptokoklar S. mutans, S. mitis ve S. angious bulunur [2]. İnfekte pulpa dokosunda %98 Gram pozitif rodlar, %32'sinde Gram pozitif koklar, %11,6'sında gram negatif koklar, %5 Gram negatif rodlar bulunduğu tespit edilmitir [23].

11 Daha ileri fazda Lactobaccillus ve sakkorilitk Bacteriodes üyeleri florayı terk ederken proteolitik kabiliyeti yüksek bakteriler yer alır. Artık Fusobacterium, Prevotella, Peptostreptococcus, Porphyromonas, Actinomyces, Camphylobacter proteolitik türleri yaygındır. Bağışıklık sistemindeki eksiklik geri döndürülemezse, kolleteral hasar gelişir ve pulpa yavaş yavaş nekrotik bir hal alır. Pulpada toplanan enflamatuar eksuda sinir uçlarına basınç yapıcak ağrı şiddeti artacaktır [101]. Pulpitisin ileyerek; akut periodontitis, kronik periodontitis ve sık tekrarlanan apikal periodontitis rahatsızlıkları görülür. 2.5.1. Bakterilerin pulpaya giriş yolları Koronal yol Pulpa dokusunun kron yoluyla bakteriler tarafından invaze olmasıdır. Pulpanın açılması ve bakteriyel bulaşma iyatrojenik performanslarda ve travma sonucu kırılan dişlerde de görülebilir. Operatif işlemler sırasında da bakteriyel bulaşma tükürük kontaminasyonu ile de olaşabilir [100]. Retrograd yol Diş eti cep derinliğinin artması periodontal membran bakterilerinin pulpaya geçişine uygun hale gelir. Bağ doku bağışıklık cevabı uyarılmış ve fagositoz sayısı yetersiz kalmışsa bakteriler hızla pulpaya ilerler [100]. Bazı bakteriler burdan foramen apikaleye ulaşabilirler Spirocet, Selenomonas ve Wolinella recta periodontal aralığı ilk geçebilen mikroorganizmalardır. Hemotejen yol Organizmanın herhangi bir yerinden tesadüfen kana veya lenfatik dolaşıma geçen bir bakteri buraya sürüklenerek gelebilir ve enfeksiyonu başlatabilir. Böyle

12 enfeksiyonlar ender olarak görülür. Anamnezde çoğu defa sistemik sorunlar bağışıklık cevabı hasarları görülür [100]. Enfekte kök kanal üyeleri genelde ağız ve plak florasından gelir. Bakteri plağı kök kanalı florasının oluşumuna yardım eder. Pulpada bağışıklık sistemi yapılarını sağlayan fibroblastlarda bakteriye özgü lipopolisakarit yapılarına karşı TLRS ve NOD reseptörlerini kullanarak bağışıklık sistemi moleküler cevap verir [31]. 2.6. Kök Kanal Hastalıkları Kök kanal enfeksiyonları çoğunun kaynağı tedavi edilmemiş olan çürük, kırılmış ya da çatlamış bir diş veya dental cebten buraya gelen mikroorganizmalardır. Enfeksiyon nedenleri minede bir delik açar ve bakterilerin diş pulpasına doğru girmesine izin verir [32]. Kök kanal enfeksiyonu başlangıcında bakteriler kendileri için iyi bir besi yeri olan pulpaya girer, çoğunlukla pulpa ölür ve kanal boyunca ilerleyerek foramen apikalden dışarıya çıkar, periapikal dokulara yayılır ve burda iltihabi olaylara neden olur [32]. Pulpanın kron kısmı öldükten sonra kök kısmında diş kökünün alttan 1/3 'lük kısmını abse kaplar. Abse, dişin merkezi içinde bulunan bir bakteriyel enfeksiyona tepki olarak oluşan irin toplanmasıdır. Periapikal iltihaplar yani kök ucu etrafındaki dokuların zararlı etkenlere karşı reaksiyonu akut veya kronik şekilde olur Periapikal abseler akut fazda ya da düşük ölçekli sürekli (kronik) enfeksiyon şeklinde minimal semptomlarla geçirilebilir. Ancak enfeksiyon temizlenmediği sürece periapikal abseler kronik olarak devam edicektir [32]. Enterococcus feacalis, Pseudomonas spp. türleri özellikle kanal tedavisi olmuş dişlerin tekrar apikal periodontitisini başlatan inatçı türlerdir [2].

13 2.6.1. Kök kanal hastalıklarının sınıflandırılması Periapikal lezyonlar 5 ana grupta toplanmaktadır. Bunlar akut apikal periodontiti, akut apikal apse, kronik apikal periodontitits, kronik apikal apse ve yoğun osteitis'dir. Akut apikal periodontitis: Nekrotik pulpa dokusunda yerleşmiş olan mikroorganizmaların sebep olduğu periodontal membranda ortaya çıkan bir seröz iltihaplanmasıdır. Dişin destek yapılarının hızla yıkılmasına yol açan akut bir lezyondur [34]. Pulpa iltihabının periradikular dokulara ilk gelişimi, ''akut apikal periodontitis'' olarak adlandırılır. Nedeni dönüşümsüz iltihaplı pulpadan gelen bakteri toksinleri, kimyasallar, yüksek kalmış olan restorasyonlar, kanal aletlerinin apeksten dışarı çıkması ve taşkın kanal dolgusu olabilmektedir [35]. Proteolitik bakteriler Porphyromonas, Prevotella, Peptostreptoccus ve Fusobacterium gibi proteolitik bakteriler baskındır [36]. Etiyolojik faktörlerin cinsine göre iltihap alanı septik veya aseptik olabilir. Septik ve aseptik rahatsızlıklardaki mikrobiyolojik yönden en büyük farklılık ise bir kanaldaki ortalama tür çeşitliliğidir. Apikal pardodonsiyumda biriken seröz eksuda, dişi alveolünden dışarı doğru yükseltmiştir. Sinir uçları basınç altındadır ve devamlı spontan bir ağrı vardır. Ağrı, zaman zaman kendiliğinden azalır veya çoğalır, zonklama tarzındadır ve tamamen ortadan kalkmaz [37]. Aynı çalışmlar aynı zamanda akut septomlar ve siyah pigmentli bakteriler Bacterioides (Gram negatif anaerobik rodlar) türleri arasında bir etkileşim olduğunu göstermektedir [38].

14 Akut apikal abse: Çoğunlukla akut apikal periodontitisten sonra gerçeklerşir. Ancak bu ilerlemeyi klinik olarak takip etmek oldukça zordur. Akut abselerde çoğunlukla diş şişlikle karakterizedir [39]. İnfeksiyon kortikal damağa girdiğinde ve yumuşak dokulara yayıldığında selulit adını alır. Bununla birlikte yumuşak dokulara yayılım neticesınde ağrıda azalma görülür [40]. Periapikal radyografik görünüm; periodontal ligament boşluğunun hafif genişlemeden nükseden görünümdedir. Bazı akut enfeksiyon durumlarda abseler yayılarak baş, boğaz bölgelerine yerleşmekte ve hastanın yaşamını tehdit etmektedir [38]. Mikrobiyal veya mikrobiyal olmayan irritanların oluşturduğu şiddetli iltihabi tepkidir. Belirtileri akut apikal apseli hastalarda orta / şiddetli rahatsızlık veya şişkinlik vadır. Ağrı oldukça keskin veya çevre dokulara vurma şeklindedir. Kısa süreli olarak ağrılar devam etmektedir. Sıcaklık değişimlerine karşı çok ender olarak etkilenmektedir. Ilık maddeler hafif drenajı çoğaltarak ağrıda geçici bir azalma yaparlar. Peridontal boşluklara doğru yayılma görülebilmektedir [41]. Radyografik görüntüsü; akut apikal periodontitisle benzerlik göstermektedir. Kronik apikal abse: Periapikal bağ dokusunun irritanlara karşı uzun süreli ve düşük düzeyli iltihabi reaksiyonlara ''kronik apikal abse '' denir [46]. Eksüdasyon sınırlı olup bağ dokusunda granülasyon dokusu oluşumu ön plandadır. Granülasyon dokusu lenfosit, plazma hücreleri, lökosit inflitrasyonu gösteren bir doku yapısıdır [45].

15 Epitel dokudaki histolojik durum genel olarak çok miktardaki lenfosit içeren granulomatus dokusu oluşumunda damarlanmaların görülmesidir. Granulomatus dokusunda inflamatuar hücreler fibroblastlar ve ileri seviyede kolejenaz kapsul bulunmaktadır. Kişisel bağışıklığın rolü büyüktür [48]. Dental granülom ya da radiküler kist gibi kök ucu alanındaki diğer şartlar da kronik apikal apseleri oluşturabilir. Bu problemlerin orjinal kaynağı yine dental pulpadaki bir enfeksiyondur. Pulpadaki enfeksiyon sebebiyle vücutta ateşlenme ve boyundaki lenf düğümlerinde şişme görülebilir. Apse tedavi edilmezse çevredeki yumuşak dokularda, çene kemiğinde ya da vücuttaki başka bir yerde çok daha ciddi enfeksiyonlar görülebilmektedir [33]. Parulis ve fistül ağzından drenaj ile karakterizedir. Kronik apikal apsede histolojik olarak oluşan bölgeler apeks çevresinde cerahat bulunması dışında periapikal granülomlarla karıştırılabilir [49]. Sakin dönemdeki kronik apikal abse klinikte belirti vermez. Ağrılar akut hale geçtiği zaman başlar. Fistül ağzı koagülüm veya epitelyal gelişimiyle tıkandığında hafif ağrılı semptomlar oluşur. Her devital dişte kronik apikal abse varlığından şüphe etmek gerekir [50]. Kronik apikal periodontitis: Devamlı pulpal irritasyonların uzun süreli etkileri sonucu periapekste yavaş yavaş genişleyen kronik bir iltihaptır. Genellikle pulpa kaynaklı apekste konumlanmış yaygın enflamatuar yanıt mevcuttur. Dokularda oluşan abse kendine yol bularak fistül ile drenaj olursa en az dirençle karşılaştığı vücut yüzeylerinden birine tutunabilir. Bu yüzden diğer enfeksiyon hastalıklarına da sebep olmaktadır [1]. Klinikte hassasiyet görülmez, perküsyona pozitif cevap veren diş çiğnemeye ve palpasyona karşı hassasiyet gösterebilir [43].

16 Devamlı pulpal irritasyonlara karşı tepki olarak granülasyon dokusu ''periapikal granülom'' genişlemektedir. Şiddetli irritasyonların uzun süre etkileri sonucu periapekste uzun süreli kronik ilerler [44]. Bu oluşumlar bakteri kolonileri, nekrotik doku kalıntıları, antijen, ekzotoksin, endotoksin ve çeşitli bakteri enzimlerine karşı bağışıklık cevabının sonucu olarak kendi kendine oluşmaktadır [46]. Periapikal kist ler oluşur. Bunlar merkezi bölümü eozinofilik sıvı veya yarıkatı bir maddeyle dolu bir kavitedir. Pulpa kaynaklı periapikal kistler; iltihabi kistlerdir ve iltihabi kompleksin de bir parçasıdırlar [47]. Kronik lezyonların çoğunda lökosit hücreleri olan lenfosit, plazmozid ve makrofajlar çok sayıda bulunmaktadır [45]. Apikal enfeksiyonda; damarlarda tıkanıklık, bağ dokusunda ödem, nötrofillerin dışarı doğru çıkması ve kemik emiliminde sınırlamanın başlamasıyla hiperemi görülür ve rayolusensle fark edilmeyebilir. Nekrotik pulpaya sahip hastaların endodontik rahatsızlık sırasında 20 hastanın 4'ünde kanında bakteriye rastlanmıştır (%20). Eğer bu tür bakteriler lenf düğümlerine ulaşırsa kan dolaşımına katılır ve septisemi rahatsızlığına neden olabilirler [42]. Kemik dokunun oluşması: Kemik dokunun oluşması düşük düzeyli ve uzun süreli pulpal irritasyonlara karşı periapikal kemik yoğunluğunda bir artma görülmesidir [51]. Periapikal dokuların ileri derecede harabiyetidir. Pulpadaki enfeksiyon nekroza dönüşerek alveolar kemiğe yayılır ise osteitis adı verilir [40]. Bu durum kemikteki mineral madde yoğunluğunun artmasından değil osteoblastik aktivitenin artmasından kaynaklanamktadır [50]. Kemik trabüküllerinin kalınlıkları artar ve kemik iliği boşlukları ortadan kalkar. Birim alanda daha fazla kemik dokusu vardır [51].

17 2.6.2. Bakterilerin sınıflandırılması Hücre duvar yapılarına göre bakteriler Gram + ve Gram - olmak üzre iki gruba ayrılır. Bakterileri ayırt etmede gram boyama kullanılır. Gram pozitif bakterilerin duvarlarında kalın bir peptidoglikan tabakası vardır ve boya parçacıklarını tutar. Gram pozitiflerde bu boyalar hücre çeperindne zor ayrılan bileşikler yaparak fuksın veya safranin uygulandığında mor renklerini kaybetmezler. Gram negatif bakterilerin hücre duvarı ise sadece ince bir peptidoglıkan katmanından oluşur. Gram boyama tekniğinde gram negatif bakteriler mor renklerini kaybederek kırmızı-pembe renge boyanırlar [56]. Ağız ortamında, çok çeşitli mikroorganizmaların bulunduğu bilinmektedir. Bakteriler pulpa nekrotik hale geldikten sonra artık bakteriler apikal periodontitis ve apekse doğru ilerlemektedir. Bu nedenle endodontide mikroorganizmaların önemli bir yeri vardır. Mikroorganizmaların ortadan kaldırılması endodonik tedavilerin gidişi ve prognozu açısından birinci derecede önem taşımaktadır [52]. Odontojenik enfeksiyondaki bakteriler normalde bireyin vücudunda yaşayan canlılardır. Ağız florasını oluşturan plakta, mukoza yüzeylerinde, gingival sulkusta bulunan bakterilerdir. Bu bakteriler, aerobik gram pozitif koklar ve anaerobik gram negatif çubuklardır. Kök kanal enfeksiyonlarının dinamiği üzerine yapılan çalışmalar şunu göstermiştir; aneorobik mikroorganizmaların ve bakteri hücrelerinin nisbi oranlarda zamanla arttığı fakültatif anaerobik bakterilerin 3 ay ve daha uzun süreli enfekte olan kanallarda aşırı derecede arttığıdır. Enfeksiyon esnasındaki mikrobiyal türler ve populasyon geçişleri arasında gelişen ilişkiler, kök analındaki özel çevresel ve seçici baskılar kadar bu etkileşimlerin sonucu olarak oluştuğu belirtilmektedir [56].

18 Gram negatif bakterilerin çoğu patojendir. Bu hastalık yapma yetisi Gram negatif hücre duvarlarında bazı özelliklerinden ve lipopolisakkarit içeriğinden kaynaklanmaktadır [53]. Hücre duvar yapılarındaki farklılık sebebiyle antijenik yapılar konakçının savunma mekanizmasına karşı verilen cevap ve hastaların antibiyotiğe karşı hassasiyeti değişmesine sebep olmaktadır [58]. Apikal periodontitiste bakteriler kök kanalında simbiyotik bir ilişki içindedirler. İmmunoglobin ve diğer proteinleri proteolitik parçalanması sadece konak savunma sistemini etki etmez aynı zamanda diğer bakterilere de besin olarak peptid ve amino asitler sağlanır [53]. Mikroorganizmalar sınıflandırırsak: AEROPLAR: Oksijenli ortamda üreyebilirler. Enerji sağlamak için yaptıkları tek metabolik reaksiyon oksijene elektron transfer etmektedir. Örnek; Bacillus, Pseudomonas, Spirochaetes 'dir. ZORUNLU ANAEROPLAR: Bunlar ancak oksijensiz ortamda ürerler. Superoksit dismutaz enzimleri ve genellikle de katalazları olmadığından, oksijen bulunan ortamda kendi kendilerini yok ederler. Zorunlu anaeroplar, ağız boşluğunda endojen enfeksiyonların başlamadında ve ilerlemesine neden olabilirler. Bu enfeksiyonlardan izole edilen anaeroplar genellikle; Eubacteria, Peptostreptococci, Peptococci, Fusobacteriave Bacteroides' dir. FAKÜLTATİF ANAEROPLAR: Üremelerini arttırmak için oksijen kullanırlar. Bunlar oksijen olmadan da üreyebilirler. Kök kanalı infeksiyonlarında fakültatif Streptokoklara sık rastlanır. Katalaz ve dismutaz üreten gruptur. Çizelge 2.1. Endodontik Enfeksiyonlarda Etken Olan Bakteriler

19 GRAM POZİTİF GRAM NEGATİF FAKÜLTATİF ZORUNLU FAKÜLTATİF ZORUNLU ANAEROBİK ANAEROBİK ANAEROBİK ANAEROBİK KOKLAR Streptococcus Peptostreptococcus Neisseria Veillonella Staphylococcus Peptococcus ÇUBUK Actinomyces Actİnomyces Camplobacter Capnocytophaga Lactobacillus Propionibacterium Enterobacteriace Eikenella Corynebacterim Bifidobacterium Bacteriodes Eubacterium Fusobacterium SPİROKET Triponema SPORLAR Clostridium Kısaca kök kanal florası anaerobik bakteriler tarafından baskındır. Bu anaerobik bakteriler kısıtlı bir gruptur ve enfekte olmuş kanallarında çok ya da az bir şekilde her zaman mevcuttur [57]. Fakültatif olarak anaerobik bakteriler, streptokoklar, floranın önemli bir kısmını oluştururlar. Özellikle oral kaviteye maruz kalmış çürüğün pulpa yüzeyi ile dişteki kanalın koroner kısmındadır. Aerobikbakteriler ise başlangıçta enfekte olmuş kök kanallarında çok nadir bulunmuş fakat tedavı esnasında ise kanala bulaşmış olabilirler [55].

20 Kök kanalında oldukça az bulunan fakültatif anaerobik bakteriler burda ilk bulunan bakterilerdendir ancak zamanla yerini oksijeni tüketerek anaerobik bakterilere bırakmıştır [54]. 2.6.3. Enfekte kök kanalında bulunan mikroorganizmalar Apikal periodontitiste anaerobik bakterilerin baskın olduğu karmaşık bir mikrobiyal yapıdadır. Apikal periodontitisteki türlerin çoğu periodontal cep, enfekte pulpada bulunan benzer türlerdir [52]. Apikal periodntitisdeki bakterilerin çoğu dental kök kanal sistemi kanal gövdesi, yan kanallar ve dentin kanalarındaki bakteriler olduğu bu yollarla buraya yerleştikleri kabul edilmektedir [62]. Actinomyces cinsi: Bazıları zorunlu anaerop, bazıları mikroaerofilik, bazıları da aerotoleran veya kapnofilik olan, genellikle hareketsiz çomaklardır. Ayırdedici olarak bir hücrenin dallanabildiği görülür. Gram pozitifitr fakat düzensiz biçim aldığından granüler görünebilir. Alkalin fosfataz, C 8 esteraz, arilamidaz, kondritin sülfataz sentez ederler. Ayrıca hücre dışına sümüksü polisakkaritler sentez ederler, bu maddeler konak sert dokusuna tutunmaya yardım eder. Actinomycesler genelikle tonsiller üzerinde, ağız, barsak, göz ve vajina florasında bulunmaktadır. Diş plağının, diş taşı oluşumunda ve kök kanalı enfeksiyonlarının patogenizinde rol alır. Sıklıkla alt çenenin bazal kemiğini içerisine alan odontojen apseler yaparlar. Daha çok penisillin ve B-laktam grubu antibiyotiklere duyalıdır. Sodyum florid (1000pm), gümüş nitrat (30 ppm), stronsiyum klorit (10.000 ppm ) ve diğer metaller üremesini engeller. Aminoglikozitlerin hepsine dirençlidir.

21 Enfekte kök kanalı enfeksiyonlarında en sık rastlanan Actinomycesler şunlardır: A. denticolens, A. israellii, A. meyerii, A. naeslundii, A. odontolyticus, A. pyogenes ve A. viscosus. Bacteroides cinsi: Bu genus zorunlu anaerop, Gram negatif, hareketsiz, bazıları ovoid kokobasil bazıları ise uzun çomaklar halinde yüzlerce bakteriyi içerisine alır. Daima bakterinin uçları yuvarlak sonlanır. Üreyecekleri ortamda Vitamin K ve kan bulunması gerekmektedir. Elektron mikroskobunda bir dış duvar tespit edilemediği halde gram negatif boyanabilirler. Oral anaerobik Gram negatif rodların büyük çoğunluğu, Bacteroides genusunun içinde yer almaktadır. Bu gruptaki bazı organizmalar, kanlı agarda üretildiklerinde karakteristik kahverengi veya siyah pigmentli koloniler meydana getirmektedir. Bu nedenle siyah pigmentli anaeroblar olarak bilinmektedirler. Ayrıca endodontik enfeksiyonlarla yakın ilişki içerisindedirler [62]. Son yıllarda Megamonas, Mitsoukella, Porphyromonas, Provotella, Ruminobacter, Sebaldella, Tsierella gibi alt genuslara bölünmüştür. B. eggerthii, B. gracilis, B. levii, B. nodsus, B. ovatus, B. pneumosintes, B.uniformis, B.ureolyticus enfekte kök kanalında daha sık bulunmaktadır. Porphyromonas ve Prevotella cinsi: Bacteroides cinsi yeni sınıflandırmada asakkoralitik ve sakkoralitik oral türler sırasıyla Porphyromonas ve Prevotella generasına ayrılmıştır. Provotella genusunda yer alan sakkarolitik bazı türler asetik süksinik ve glukozun diğer asitlerini üretmektedir. Bu türlerin başlıcaları ve yeni sınıflandırma aşağıda özetlenmiştir.

22 Porphromonas: Siyah - pigmentli (asakkorilitik Bacteroides türleri) Porphyromonas asaccharolyticus, Porphyromonas gingivalis, Porpyromonas endodontalis Prevotella: Siyah-pigmentli (sakkarolitik Bacteroides türleri) Prevotella melaninogenica, Prevotella denticola, Prevotella loescheii, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens,prevotella corporis,prevotella tannerae Bazıları sadece aminoasitleri fermente edebilirler, açığa çıkardıkları amonyak ve H 2 S kök kanalındaki diğer bakteriler için azot ve karbon aynağı oluşturur. Son yılarda Megamonas, Mitsoukella, Porphromonas, Provotella, Ruminobacter; Sebaldella gibi alt cinslere bölünmekle kalmamış aynı zamanda alt cinslserin içerisine aldıkları bakterilerin de isimlendirmeleri değiştirilmiştir. Bu sebeple bu ailenin üyelerinin 16S ribozamal ünitindeki baz sıralamasına bakılarak yapılan sınıflandırma en çok destek bulandır. Kök kanal tedavisindeki akut alevlenmeler ve çevre dokulardaki yıkıcı harabiyetlerle özellikle siyah pigmentli mikroorganizmalar arasında anlamlı bir ilişki olduğu düşünülmektedir. Prevotella ve Porphyromonas türleri gibi pulpal lezyonlarda varolan siyah pigmentli bakteriler, iltihabi mediatörlerin, doku yıkımı ve kemik tekrarlanmasında rol oynayan yıkıcı enzimlerin aktivasyonu ile klinik semptomların gelişiminde önemli rol oynamaktadır [63]. Özellikle periodontal hasarın ciddiyeti ile beraberlikleri arasında ilişkili buldukları P. gingivalis, T. forsythia ve Treponema denticola üçlüsüne kırmızı kompleks' adını vermişlerdir [65]. Periapikal enfeksiyonlarda en sık rastlanan siyah pigmentli anaerob rodlar P. gingivalis, P. endodontalis, Prevotella intermedia, P. nigrescens tir. Siyah pigmentli bakterilere üye olmamasına karşın Treponema denticola kırmızı komplekse dahildir.

23 P. gingivalis ile sinerjist ilişkisi bulunur ve bu sinerjinin akut periapikal semptomlarla yakın ilişkili olduğu gösterilmiştir [64]. Fusobacterium cinsi: Zorunlu anaerob Gram negatif bakterilerin bir başka ana grubu Fusobacterium genusuna ait bakterilerdir. Çoğu zaman asakkarolitik olarak tanımlanan ve uzun filamanlar halinde bulunan bu hücreler; Fusobacterium alocis, F. sulci, F. periodonticum, F. nucleatum, F. vincentii 'i kapasmaktadır. Bifidobacterium cinsi: Gram pozitif dallanabilen, zorunlu anaerop çomaklardır. Ortamda karbondioksit bulunduğunda oksijeni fdaha fazla tolere edebilirler. Karbonhidratları özel bir yol ile kullanırlar, bu nedenle bulundukarı ortamda daima transaldolaz, transketolaz ve ksloz 5 fosfat fosfoketolaz bulunur, hücre lipitlerinde poligliserol ve fosfolipit bulunur, bunlar konak doku için toksiktir. Katalaz negatiftir. Genellikle barsak vajına ve göz florasında bulunmasına rağmen derin dentin çürüklerinden de izole edilmektedri. Lactobacillus ve Actinomycesler ile akrabalıkları vardır. Kök kanalında pek sık olmamamkla birlikte bulunabilicek Bifidobacteriumlar şunlardır: B.bifidum, B.dentium. Spirochaete cinsi: Gram negatif, harektli, sıkıca dolanmış bakterilerdir. Tipik olarak şekilleri incecik ve esnek görünümlüdürler. Sucul ortamlarda ve hayvanlarda spiroketlere sıklıkla rastlanır. Bu bakterilerin bazıları hastalık yapıcı özeliktedir. Oral spiroket türleriyle endodontik enfeksiyonlarda farklı prevelanslarda karşılaşılmaktadır. Üretilebilen oral spiroket türlerinin en iyi karakterize edileni T. denticola'dır. İki aileye ayrılmıştır.

24 Birinci ailede Spiroket, Treponema, Cristispira ve Borrelia, ikinci ailede ise Leptospira, Leotonema, Brachyspira, Brevinema cinsi bulunmaktadır. Enfekte kök kanalına girebilen spiroketler; T. macrodentium, T. minitum, T. orale, T. paraluiscuniculi, T. refringes, T. scoliodontum, T. vincentii dir [66]. Çizelge 2.4 Periapikal enfeksiyonda genelde görülen bakteri türler [2]. AKUT ABSE APİKAL KRONİK APİKAL PERİODONTİTİS TEDAVİ SONRASI İNATÇI TÜRLER FLORA Karışık Karışık Karışık/ Tek EN YAYGIN GRUPLAR Gram negatif anaerob Gram negatif/ Gram pozitif anaerobik Gram pozitif/ Fakültatif EN YAYGIN TÜRLER Treponema spp. Treponema spp. Enterococcus faecalis Tannerela Tannerela forsythia forsythia Candida albicans (maya) Porphyromonas Porphyromonas spp. spp. Streptococcus spp. Pseudoramibacter Dialister spp. Dialister spp. alactolyticus Fusobacterium Propionibacterium Filifactor alocis nucleatum propionicum Eikenella Pseudoramibacter corrodens alactolyticus Filifactor alocis Fusobacterium Synergistes spp. nucleatum Dialister spp. Prevotella spp. Synergistes spp. Actinomyces spp. Eikenella Olsenella spp. corrodens Pseudomonas aeruginosa Parvimonas micra Prevotella spp. Enterik çubuk Olsenella spp. Parvimonas micra Peptostreptococcus spp. Campylobacter spp

25 2.6.4.Bu Çalışmada Kullanılan Anaerop Mikroorganizmazlar Porphyromonas endodontalis Gram negatif anaeorobik siyah pigment grubundaki bir bakteridir. Periodontal dokulardaki kronik inflamasyona sebep olan sürekli infeksiyonda rol oynayan bir bakteridir. P. intermedia, P. nigrescens ve Fusobacterium cinsi grublarla özellikle simbiyotik bir ilişkidedirler. Bu cinsler bereaber olduklarında sürekli devam eden ağrılı periapikal lezyonlardan sorumlu tutulmaktadır [67]. Asakkorilitik siyah pigmentli bakteri olrak P. gingivalis plak ve tikrükte çok daha fazla iken Porphyromonas endodontalis çoğunlukla enfekte kök kanallarında daha fazla bulunmaktadır. Bu seçicilikte rol oynayan mekanizma ise tam olarak bilinmemektedir [68]. Porphyromonas gingivalis Gram negatif zorunlu anaerobik bakteridir. Son 10 yıl içerisinde üzerinde en fazla çalışma yapılan oral periodontitis bir patojendir. P. gingivalis in hastalık yapabilmesi için hemine ihtiyacı vardır. Pek çok diş ve diş eti enfeksiyonunda izole edilmektedir. Bağ dokusu yıkımını başlatır. Lökositlerin fagositozunu engelleyen ve bağışıklık cevabını baskılayan pek çok enzimin bu bakterilerin ekstraktlarında bulunduğu gösterilmiştir [69]. Çoğunlukla subgingival bölgelerde ve dişeti oluğunda bulunur; dil ve tonsillerden de izole edilebilmektedir. Daha çok periodontal sorunlu dişlerin periodonsiyumlarında rastlanılsa da, son yıllarda yapılan moleküler mikrobiyolojik çalışmalar P. gingivalisin enfekte kök kanalının da başlıca patojenlerinden biri olduğunu

26 göstermiştir. Gingivitis ve periodontitiste oldukça fazla şekilde ağız florasında bulunan patojenik bakteridir [70]. Streptococcus anginosus Streptokoklar Gram pozitif, hareketsiz fakültatif kok zincirleridir. Ağızda ve kök kanalı enfeksiyonlarında rastlananlar genellikle a hemolitik streptokoklardır. Ancak kök kanalında oldukça azdır. S. anginosus insan vücudunda çok geniş bir yayılım göstermektedir bu yüzden çoğu enfeksiyonlu hastalıklara katılır. Genelde ağız, boğaz ve vajinadan hemolitik ve hemolitik olmayan suş örnekleri alınır [71]. Treponema denticola T.denticola, hareketlilik özelliği yüksek, helezonik kıvrım gösteren asakkarolitik, anaerobik Gram negatif bir bakteridir. Uzun zamandır. periodontal hasarla ilişkilendirilen T. denticolanın patojenitesine katkıda bulunan birçok virülans faktörü bulunmaktadır. Fibroblastlara, epitelyal hücrelere, eritrositlere, fibronektine, hyalürona, serum ve dişeti sıvısına bağlanabilme yeteneğine sahiptir [72]. T. denticola, konak hücrelere ve diğer doku elemanlarına adezyon göstermektedir. sitotoksit aktiviteli yüzey proteinleri; hücre dışı veya membranla ilişkili proteolitik, hidrolitik enzimler ve metabolitlerdir. T. denticola'nın başlıca virülans faktörleri Msp ve kemotripsin benzeri proteaz kompleksi gibi sitotoksik aktiviteli yüzey proteinleri; hücre dışı veya membranla ilişkili proteolitik, hidrolitik enzimler ve metabolitlerdir [72]. Actinomyces israelii İnsanlarda ağız boşluğunda (tonsillalar, dişler), gastrointestinal sistemde ve genital bölgede normal flora üyesi olarak bulunan, nadiren hastalığa neden olan anaerobik gram pozitif bir bakteridir. A. israelii; çok virülans bir mikroorganizma değildir.

27 İnfeksiyonun başlaması için diş çürüğü, cerahi girişim veya bir tarvma olmalıdır. Aktinomikoz infeksiyonları genellikle polimikrobiyaldir. Pulpaya tutunmaların sağlayan ekstraselüler polimer sentezleyerek kendilerinin ve diğer bakterilerin tutunmalarını sağlarlar. Periapikal bölgede protein antijenler sentezleyerek tahriş etmektedir. Hücre duvarlarında ısıya duayarlı lipitler ve fimbranlarnda ısıya dirençli protein antijenler bulunur. Üçüncü dönem kök kanalı infeksiyonlarında en sık rastlanan türlerdendir [70]. Prevotella intermedia Gram negatif, anaerobik rodlardandır. Özellikle akut ve kronik apicalperiodontitiste izole edilir. Akut apical periodontitste Porphyromonas ile ilk haftadan sonra sayıları hızla artar. Kolonileri hemolitiktir. Bilinen suşların sadece üçte biri tavşan kanı içeren agara ekildiğinde ikinci gün siyah pigment oluşturur. Başlıca diş, diş eti ve ağız mukozası ile ilgili enfeksiynlardan, bazen plörit ve abdominal enfeksiyonlardan izole edilebilir. Enfekte kök kanalında bulunma sıklığı %63 'tür [73]. Prevotella nigrescens Gram negatif anaerob siyah pigmentli bakteri grubunda bulunan bir basildir. Periodntal infeksiyonda, akut nekrotik gingivitiste %16.7 oranında P. gingivalis ve P. endodontalis gibi bakterilerle beraber bulunmaktadır bulunur. Oral kavite harici mide boşluğu ve nazofarinks enfeksiyonunda da bulunur. Peptostreptococcus micros Gram pozitif anaerob olarak ağız patolojisinde rol oynayan bir koktur. Periodontal hastalığı olmayan sağlıklı kişilerin diş eti oluğunda nadiren fakat bu bakteriyi kök kanalı enfeksiyonu bulmak hemen daima mümkündür. İlerleyeci tip periodontit ve endodontik apselere sebep olurlar [75].

28 2.7. Mikroorganizmaların Tanımlanmasında Kullanılan Yöntemler Mikroorganizmaların (bakterilerin cins ve türlerini ayırmada mikroskopi, Gram Boyama, Kültür Teknikleri (Aerobik ve Anaerobik Teknikler), Immunolojik Teknikler (İmmunodot / Blot, Flow Sitometri, Enzim -bağımlı Immunosorbent), Moleküler Teknikler (Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR), DNA-DNA Hibridizayon) gibi yöntemler kullanılmaktadır. Bu yöntemlerden en güncel olanı bakteri tanımlanmasında hala 'altın standard' olarak kabul edilen kültür yöntemleri ile bakterilerin özgül DNA dizilerini taklit eden oligonükleotid primerlerin kullanıldığı 'Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) 'dır. Doğrudan İnceleme Mikroskopi Gram Boyama Kültür ve Duyarlılık Testleri Kültür Teknikleri Aerobik ve Anaerobik Teknikler Özelleştirme Teknikleri Gaz-sıvı Kromatografi DNA-DNA Hibridizasyon Antimikrobiyal Duyarlılık Testleri Broth Dilusyon Testleri Broth Disk Testi Bakteriyel Disk Difüzyon Testi

29 Antimikrobiyal Duyarlılık için Hızlı Test Immunolojik Testler: İmmunofloresans (IF) Enzim Immunoassays (EIA) Latex Aglutinasyon Immunodot/Blot Flow Sitometri Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Diğer Testler Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Antikorların Tanımlanması (ELISA)[73] 2.7.1. Kültür tekniği Kültür işlemleri mikroorganizmaların laboratuar şartlarında üretilmesini esas almaktadır [75]. Bu teknik bir örnek içerisindeki çok çeşitli mikrobiyal türlerin tanımlanamsına izin vermektedir. Ayrıca bakterilerin mikrobiyal duyarlılıklarının da incelenmesine de olanak sağlamaktadır. Bu avantajlarına karşın kültür yöntemlerinin sahip olduğu bazı kısıtşılık ve eksik kısımlar da bulunmaktadır [76]. a) Kültür yöntemleri aneorobik mikroorganizmayı zor üremektedir, b) Bazen diagnostik sonuç almak için çok yavaş kalmaktadır. c) Bakterilerin fenotipik özellikleri nedeniyle düşük özgüllüğe sahiptir. Bu nedenle mikrobiyal türlerin birbirinden ayrılmasında belirgin sınırlamalar bulunmaktadır.

30 d) Düşük sayıdaki ve zor üreyen mikroorganizmaları hesaplamada düşük duyarlılığa sahiptir. e) Örneklerin taşınma tipine göre sonuçlar değişkenlik gösterebilir. Örneklerin taşınma ortamı anaerobik bakterilerin yaşamasına izin vermelidir. f) Zaman alıcı ve pahalıdır. 2.7.2. Moleküler Tanı Yöntemleri Günümüzde moleküler tanı yöntemlerinden daha çok genom hairtalarının hazırlanmasında, bireyel genotipin hazırlanmasında, DNA polimorfizmin saptanmasında, ebevyn ve karabalıklarn tespitinde, parmak izi tayininde, adli tıpta kullanılmakatdır. Hastalık etmeninde enfeksiyon nedeni mikroorganizmanın endojen mi yoksa dış kaynaklaı mı olduğunu belirlenmesinde, virülan ve kommensal mikroorganizmaların incelenmesinde moleküler teknikler kullanılmaktadır. Ayrıca enfeksiyon etkeni olan bir bakteri suşu, kolonize suşları arasındaki fenotipik farklılıklar elektroforetik karyotipleme ile açığa çıkarılmaktaı Moleküler tanı yöntemlerinde bir çığı açan PZR özellikle çoğu moleküler tekniğin temel aracı olarak kullanılmakatdır. Moleküler tekniklerden tanı için kullanılan RFLP (DNA kesme enzimi uzunluk çeşitliliği), RAPD (Rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA, Elektroforetik karyotipleme modelinde (PFGE), Baz dizi analiznden kesin sonuçlara götürmede kulanılan en temel araçtır. 2.7.3. Polimeraz zincir reaksiyonu Polimeraz Zincir Reaksiyonu in vitro koşullarda DNA dizilerinin çoğaltılması esasına dayanmaktadır. PZR; basit, özgül ve hassas bir tekniktir [84].

31 Endodontik patojenleri tanımlamada çok çeşitli moleküler biyolojik teknik kulanılmaktadır. Moleküler metodların çoğu mikroorganizmaları tanımlamak için kültüve edilmelerine gerek duymadan ribozomal RNA genleri başta olamak üzere, varlığı gösterilmek istenen bakteriyel patojenin özgül DNA dizilerinin saptanmasına dayanır. 16S rrna'nın tüm bakteriler için aynı olan bazı bölgeleri bulnuken türden türe de değişim gösteren dizileri de bulunmaktadır ki bunlar mikroorganizma türlerinin tanımlanmasında ve birbirinden farklılaştırılmasında rol oynar [77-84]. Mikroorganizmların tanımlanması amacıyla kullanılan genotip tabanlı moleküler mikrobiyolojik yöntemlerden günümüzde en popüler olanı, 16S ribozomal RNA genlerindeki özel bölgelerinin çoğaltıldığı Polimeraz Zincir Reaksiyonudur. 1938 yılında Kary Mullis tarafından ilk kez bilim dünyasına sunulan Polimeraz Zincir Reaksiyonu, modern bilim dünyasını değiştirmiştir. Kary Mullis bu buluşundan dolayı 1993'te Nobel ödülüne hak kazanmıştır [78]. PZR yönteminin icadı ve gelişimi, kuşkusuz son yuzyılda moleküler teknolojideki en önemli ilerlemedir. Günümüzde PZR kullanarak herheng bir organizmadan herhangi bir geni çoğaltmek mümkündür. Yöntem, DNA nın in vitro replikasyonu ve basit replikasyonların tekrarlayan döngülerinden oluşmaktadır. Aynı zamanda PZR in vitro klonlanma olarak da kullanılmaktadır [79]. PZR tekniği, temelde üç aşamadan oluşmaktadır [85]. DNA zincirinin açılması Kalıp DNA 92-95 ºC de 1-2 dakika tutularak çift sarmal yapıdaki DNA iplikçikleri birbirlerinden ayrılmaktadır. DNA zincirini ayırmak için, bazı durumlarda 5-10 dakika ön ısıtma yapmak gerekebilir [86].

32 Primerlerin açılan DNA zincirlerine yapışması Reaksiyon sıcaklığının, 37-65 ºC ye düşürülerek oligonükleotid primerlerinin açılan DNA zincirlerinin kendi baz dizilerine karşılık gelen bölgeye yapışması işlemidir. Bu işlem, üretilecek baz uzunluğuna bağlı olarak 30-60 saniyede gerçekleşmektedir [87]. Primer uzaması DNA zincirleri üzerine yapışan primerlerin DNA polimeraz enzimi (Taq DNA polymerase) vasıtasıyla uzatılmasıdır [87]. Üç basamaktan (denatürasyon, primerlerin bağlanması, sentez) oluşan işlem, bir PZR döngüsünü temsil eder. Bu işlem, genel olarak 25 ile 40 defa tekrar edilerek başlangıçtaki DNA dizisinden milyonlarca yeni DNA parçacığı çoğaltılır. PZR sonucunda elde edilen DNA parçacıkları agaroz veya poliakrilamit jellerde yürütüldükten sonra, ethidium bromide (EtBr) veya gümüş nitrat (GN) ile boyanarak gözlemlenir [35]. 2.7.4. PZR 'da kullanılan başlıca bileşenler Hedef DNA İncelenmek istenen örneğin DNA'sı PZR reaksiyonuna eklenir. Oligonükleotid Primerler Hedef DNA'nın dizilerini tamamlayan tek zincirli sentetik oligonükleotid primerler reaksiyona genellikle 1mM konsantrasyonda eklenir. Bu miktar, çoğunlukla 30 döngülük bir PZR için yeterlidir [83]. Primerlerin yüksek konsantrasyonları bölgelere yapışmalarına neden olarak, istenen hedef DNA dışındaki bölgelerde çoğalma meydana getirebilir. Yetersiz konsantrasyonları ise PZR ürününün çok az miktarda oluşmasına neden olur [110,82].

33 Deoksinükleotid trifosfatlar (dntps) DNA sentezi sırasında serbest deoksiribonükleoıid trifosfatlara ihtiyaç duyulmaktadır. PZR reaksiyonu sırasında en fazla özgüllüğü sağlamak için dntp'lerin konsantrasyonları 20-200M düzeyi arasında olmalıdır. Herbir dört bazın yoğunluk içerisindeki oranları eşit olmalıdır. Ardarda yapılacak dondurmaçözdürme işlemleri de dntp'nin raf ömrünü kısaltabilir [83]. Bu yüzden daha sonra başlangıç çözelti 10mM kadar seyreltildikten sonra, küçük hacimlere ayrılıp +20 ºC de saklanmalıdır. dntp yoğunluğunun yüksek olması yeni sentezlenen DNA dizilerinde istenilenden farklı dizilerin hatalı çıkmasına sebep olabilir. Bu yüzden mümkün olduğu kadar düşük yoğunlukta tutularak PZR özgünlüğü ve güvenilirliği artırılmalıdır [109, 82]. Tamponlar Standart PZR tamponunun 10 x konsantrasyonundaki stoğu, 500mM KCl, 100 mm Tris-Cl, 15 mm MgCl 2 içermektedir. PZR sırasında 1 x konsantrasyona sulandırılan tampondan gelen Mg +2 iyonunun optimal konsantrasyonu oldukça düşük olduğundan (1.5 mm), kalıp DNA hazırlanırken yüksek konsantrasyonda şelasyon yapıcı ajanların bulunmaması gerekir. Mg +2 iyonları dntp'ler ile çözünebilir kompleksler oluşturarak, polimeraz aktivitesini uyarır ve çift iplikçikli DNA'nın Tm değerini arttırırlar. PZR karışımı içerisine 50mM KCI ilave edilirse primer bağlanmasını kolaylaştırır. Fakat 50mM'ın üzerindeki KCI veya 50mM NaCI Taq DNA polimeraz aktivitesini engeller. Ayrıca, PZR çözeltisi Jeletin, bovin serum albümin veya Tween 20 deterjanı ilave edilirse enzim daha iyi çalışması sağlanır. Fakat bu maddeler eklenmeden de PZR protokolü çok iyi bir şekilde çalışabilmektedir [82].

34 Enzim Konsantrasyonları DNA polimerizasyonunda en önemli nokta DNA polimerazın doğruluğudur. Saflaştırışmış DNA polimerazlar, moleküler biyolojinin en önemli araçlarından birisidir. En çok kullanılan DNA polimeraz Thermus aquaticus adı verilen termofilik bir bakteriden izole edilen ve yüksek sıcaklıklara dayanabilen bir enzimdir. DNA'nın DNA polimerazlar aracılığıyla sentezi, hem çok kompleks hem de önemli ölçüde sıralı bir işlemdir [82]. Diğer PZR şartları optimum seviyede olduğu zaman 100 µl reaksiyon için önerilen Taq DNA polimeraz enzim yogunluğu 1-2.5 Ünit dir. Fakat enzim gereksinimi kullanılan kalıp DNA veya primere göre değişebilir. Enzim yogunluğu düşük olursa elde edilecek ürün az olur. Enzim yogunluğu yüksek olursa oluşan PZR ürün miktarı artmaz, ancak hata oluşma şansı artar. Özgül olmayan bantlar ortaya çıkabilir [80]. Serbest Mg +2 konsantrasyonunun azalması ve reaksiyonun ph ının düşürülmesi ile Taq polimerazın doğruluğu arttırılabilir [82]. Mikrobiyolojik örneklerde bakteri tanımlanması için genellikle yukarıda anlatıldığı gibi konvansiyonel bir PZR döngüsü kullanılırken zaman zaman in-situ PZR, nested PZR, multipleks PZR, Gerçek Zamanlı POlimeraz Zinci Reaksiyonu, Arms PZR, RFLP, SSCP, kantitif PZR gibi varyasyonlarda da başvurulmaktadır [81].

35 POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU Zincir Açılması Birinci adım: Ayrılma fazı Hibridizasyon İkinci adım: Bağlanma Fazı Uzama Üçüncü adım: Resim 2.1: Polimeraz zincir reaksiyonu [111]

36 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Materyal 3.1.1. Kök kanal materyali Bu tez çalışmasında enfekte kök kanallarından örnek almak için öncelikle Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurul undan Etik Kurul Raporu alındı. Gazi Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Diş Hastalıkları ve Tedavisi Anabilim Dalı na başvuran, kök kanal tedavisi endikasyonu konan ve yaş aralığı 18-70 arasında değişen 42 hastanın enfekte pulpaları incelendi. Ayrıca daha önceki bir tez çalışmasında kullanılan A.Ü. Diş Hekimliği fakültesinden alınan örneklerden izole edilen DNAlar kullnıldı. Hastaların son üç ay içerisinde herhangi bir antibiyotik kullanmamış olmalarına dikkat edildi. Seçilen dişler, daha önce endodontik tedavi görmemiş, tek kanallı, nekrotik pulpalı ve periapikal radyografilerinde değişen derecelerde radyolüsent alan sahip olan dişlerdi. 3.1.2. Tampon ve çözeltiler Örnek alırken kullanılan materyaller %3 lük hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) çözeltisi :100ml distile su 3ml H 2 O 2 % 2.5 lik sodyum hipoklorit (NaOCl): 100ml distile su 2,5 ml hipoklorit Steril elmas fissür frez % 5 lik sodyum tiyosülfat :100ml distile su 5 gr tiyosülfat Steril salin çözeltisi 15 numaralı K tipi eğe Kağıt konlar

37 DNA izolasyonu için kullanılan çözeltiler Proteinaz K AL Tamponu Saf Ethanol AW1 Tamponu AW2 Tamponu AE Tamponu PZR için kullanılan çözeltiler Taq polimeraz tamponu (10X) : 100 mm Tris-HCI (Ph 8,3), 500 mm KCL 1mg/ml jelatin MgCl 2 : 25mM Nükleotit karışımı: 10mM dntp (datp, dttp, dgtp, dctp) Taq polimeraz 5 u/µl Distile su Primerler: Kullanılan primer dizileri Çizelge 3.1 de belirtilmiştir.

38 Çizelge 3.1. Çalışılan bakterilerin primer dizileri Bakteri tür adları Oligonükleotid dizisi 1 Prevotella nigrescens 2 Peptostreptococcus micros 3 Porphyromonas gingivalis 4 Treponema denticola F 5 ATG AAA CAA AGG TTT TCC GGT AAG 3 R 5 CCC ACG TCT CTG TGG GCT GCG A 3 F 5 TCG AAC GTG ATT TTT GTG GA 3 R 5 TCC AGA GTT CCC ACC TCT 3 F 5 AGG CAG CTT GCC ATA CTG CG 3 R 5 ACT GTT AGC AAC AAC TAC CGA TGT 3 F 5 TAA TAC CGA ATG TGC TCA TTT ACA T 3 R 5 TCA AAG CAT TCC CTC TTC TTC TTA 3 5 Actinomyces israelii F 5 AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3 R 5 CCA AAA CAC CAC AAA AGT GA 3 6 Porphyromonas endodontalis 7 Prevotella intermedia F R F R 5 GCT GCA GCT CAA CTG TAG TC3 5 CCG CTT CAT GTC ACC ATG TC3 5 TTT GTT GGG GAG TAA AGC GGG3 5 TCA ACA TCT CTG TAT CCT GCG3 8 Streptococcus anginosus F 5 AGG CAG CTT GCT ATA TTG CG 3 R 5 CCA AAA CAC CAC AAA AGT GA 3 Agoroz jel için kullanılan materyaller % 2 lik agaroz jel: 2 gr agaroz 100 ml TAE tamponu içerisinde çözülerek hazırlandı. TAE tamponu (Tris asetat tamponu): 242 gr Tris base, 57,1 ml glasial asetik asit, 100 ml 0,5M EDTA (ph 8,0) distile suda çözülerek hazırlandı. Yükleme tamponu: %40 sukroz, %0,025 bromfenol mavisi, %0,25 ksilen siyanol Etidyum bromür: 10mg/ml derişimde hazırlandı

39 3.2. METOD 3.2.1. Kök kanallarından örnek alınması Örnek alınacak tüm dişlere pomza ve su ile temizleme yapıldıktan sonra rubber-dam izolasyonu uygulandı. Operasyon sahası önce %3'lük hidrojen peroksit ile temizlendi; ardından % 2,5'lik sodyum hipoklorit (NaOCl) ile dekontamine edildi. Endodontik giriş kaviteleri steril elmas fissür frezlerle (Brasseler Dental Products, Savannah, A.B.D), su spreyi kullanılmadan açıldı. Pulpa odasını da içeren operasyon sahası, %2,5'luk sodyum hipoklorit ile yıkandı. Ardından bu solusyon %5'lik sodyum tiyosülfat kullanılarak aktifliği giderildi. Kök kanalının kuru olduğu durumlarda az miktarda steril tuz çözeltisi kanala uygulandı. 15 numaralı K tipi eğe ile (Dentsply, Maillefer, İsviçre) kullanılarak kök ucuna doğru girildi. Eğe ile çalışma usunluğu tespit edildi ve kök kanalından çevirme ve hafifçe kazıma işlemi yapıldı. Ardışık numaralı iki kağıt kon (Diadent, Kore) ölçülen seviyeye kadar yerleştirilip kanaldaki sıvıyı emmesi sağlandı. Kanala uygun kağıt kon eğe ile aynı seviyeye kadar yerleştirlirp kanaldaki sıvıyı emmesi sağlandı. Kağıt konlar kanal içerisinde bir dakika bekletilmeye çalışıldı. Daha sonra kağıt konlar 1,5 ml 'lik ependorf tüplere kondu. Tüpler, DNA izolasyonundan önce -80 ºC ye ayarlanmış derin donduruculara aktarıldı ve burada bekletildi.

40 3.2.2. DNA izolasyonu Bu çalışmada DNA'ların izolasyonu için; QIAGEN Minikit Spin Kolon DNA İzolasyon (Paper POİNT) kullanıldı. Uygulamada üretici firmanın önerilerine sadık kalındı. Toplanan kanal örnekleri 1,5 µl lik ependorf tüplere alındı. Üzerlerine 20µl proteinaz K ilave edildi. Üzerine 200µl AL tamponu ilave edildi. Tüpler 15 sn vortekslenip spinlendi. 56 derecede 10 ' inkübe edildi. Isı bloğundan alınan örneklere 200 µl saf etanol eklendi. 6-15 sn vortekslenip spinlendikten sonra örnek kit içinden çıkan spin kolon tüpüne aktarıldı. Örnek içeren bu tüpler 8000 rpm 'de 1' santrifüjlendi. Spin kolonlar temiz toplama tüplerine alındı. Üzerine 500 µl AW1 tamponun dan eklendi. 8000 rpm 'de 1' santrifüjlenir. Spin kolonlar tekrar temiz toplama tüplerine alınır. Altteki tüpler atılır ve yeni bir ependorf tüpüyle değiştirilir. Üzerine 500 µl AW2 tamponu konur. 14000 rpm de 3 dakika santrifüj edilir. Son olarak filtreli tüp değiştirlir ve yeni 1,5 µl santrifüj tüpüne aktarıldı. Üzerine 200 µl AE tamponu konulur. 5' oda ısısında inkübe edildi. 8000 rpm 'de 1' santrifüj edildi. En son spin kolonlar ependorf tüplerinden çıkarıldı ve atıldı. DNA zaten altında bulunan ependorfta saklandı. DNA, PZR da kullanılmak üzere -20 C ye kaldırıldı.

41 3.2.3.PZR deneyleri PZR karşımı örnek başına 10 µl Taq Polimeraz tamponu (10X), 4 µl 25 mm MgCl2, 1 µl dntp, 1 µl primer, 5 µl kalıp DNA ve 0,2 µl Taq polimeraz enzimi (Promega, USA) eklenmiş ve reaksiyon hacmi steril distile su ile 50 µl ye tamamlanmıştır. Her DNA örneği için hazırlanan bu karışım PZR cihazına (Biometra) yerleştirilerek çizelgede belirtilen programlar ile kullanılmıştır. Çizelge 3.2. Porphyromonas endodontalis, Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros, Prevotella nigrescens, Prevotella intermedia, Actinomyces israelii, Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, Streptococcus anginosu PZR Programları PZR PROGRAMLARI Peptostreptococcus micros Porphyromonas gingivalis Actinomyces israelii 1-94 ºC 5 dakika 2-94 ºC 1 dakika 3-55 ºC 1 dakika 4-72 ºC 1.30 dakika 5-72 ºC 1 dakika 1-95 ºC 2 dakika 2-94 ºC 30 saniye 3-60 ºC 1 dakika 4-72 ºC 2 dakika 5-72 ºC 10 dakika 1-94 ºC 1 dakika 2-55 ºC 1 dakika 3-72 ºC 2.30 dakika

42 Çizelge 3.2. (Devam) Porphyromonas endodontalis, Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros, Prevotella nigrescens, Prevotella intermedia, Actinomyces israelii, Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, Streptococcus anginosu PZR Programları Prevotella nigrescens 1-94 ºC 30 saniye 2-95 ºC 30 saniye 3-55 ºC 1 dakika 4-72 ºC 2 dakika 5-72 ºC 10 dakika Treponema denticola 1-95 ºC 2 dakika 2-95 ºC 30 saniye 3-60 ºC 1 dakika 4-72 ºC 1 dakika 5-72 ºC 2 dakika Porphyromonas endodontalis 1-94 ºC 2 dakika 2-94 ºC 1 dakika 3-55 ºC 2 dakika 4-72 ºC 1.30 dakika 5-72 ºC 1 dakika Prevotella intermedia 1-94 ºC 5 dakika 2-94 ºC 1 dakika 3-55 ºC 2 dakika 4-72 ºC 30 saniye 5-72 ºC 1 dakika Streptococcus anginosus 1-94 ºC 1 dakika 2-55 ºC 1 dakika 3-72 ºC 3dakika

43 PZR ile çoğaltılan DNA ların elektroforezde yürültülmesi ve DNA ların görüntülenmesi PZR ürünleri %2 lik agaroz jelde yürütülmüştür. Bunun için 2 gr agar hassas terazide tartılıp 100 ml 1x TAE içinde çözülmüş ve mikrodalga fırında kaynatılmıştır. Agaroz homojen bir şekilde eridikten sonra jel kasedine dökülmüş, uygun taraklar takılarak kuyucukların oluşması sağlanmıştır. 30 dk. kadar beklenip jelin polimerizasyonu sağlandıktan sonra tarak jelden ayrılmış ve kaset agaroz jel elektroforez tankına (BIOMETRA) yerleştirilmiştir. 1x TAE tamponu agarozun üzerini geçecek kadar tanka eklenmiştir. İlk kuyucuğa 2 µl DNA marker, diğer kuyucuklara ise 10 µl PZR ürünü 2-4 µl yükleme tamponu (bromfenol blue) ile karıştırılarak yüklenmiştir. Örnekler 30-45 dk. 80 V luk bir voltaj uygulanarak yürütülmüştür. Yürütme işleminin ardından 10 dk. etidyum bromid ile muamele edilen PZR ve kesim ürünleri Biometra BioDoc Analyze görüntüleme cihazı ile UV ışık altında görüntülenmiş ve fotoğrafları kaydedilmiştir.

44 4. BULGULAR 4.1. PZR Kullanılarak Bakteri Tür Tespiti Pulpal ve periapikal enfeksiyonu olan 40 hastadan yukarıda belirtilen yöntemle kök kanalından örnekler alınmıştır. Örneklerin DNA'ları yukarıda belirtildiği gibi izole edilmiştir. İzole edilen DNA' lar Peptostreptococcus micros, Porphyromonas gingivalis, Actinomyces israelii, Prevotella nigrescens, Treponema denticola, Porphyromonas endodontalis, Prevotella intermedia, Streptococcus anginosus türlerine ait primerlerle PZR'atabi tutulmuştur. Çalışmamızdaki periapikal apse örneklerinde PZR sonucu tespit edilen bakteriler Çizelge 4.1 de gösterilmiştir. Çizelge 4.1. PZR Sonucu Örneklerde Saptanan Bakteri Türleri (Bakteri saptanan örnekler (+) ile bakteri saptanmayan örnekler ise (-) gösterilmiştir. Tür Adı A. israelii P. gingivalis P. micros T. denticola P. nigrescen P. endodontalis P. intermedia S. anginosu 1 - - - - - - - - 2 - + - + + + + + 3 - + - - + + - - 4 - + - + + + - + 5 - + + - + + - - 6 - + - - + + + - 7 + +. - - - + + 8 - - - + - + - - 9 - - + + - + + + 10 - - + - - + + + 11 + - + - - + - -

45 Çizelge 4.1. (Devam) PZR Sonucu Örneklerde Saptanan Bakteri Türleri (Bakteri saptanan örnekler (+) ile bakteri saptanmayan örnekler ise (-) gösterilmiştir. 12 + - + - + + - - 13 + - + - - + + - 14 - - + + + + - + 15 + - + + - - - - 16 + - + - + - - + 17 - - + - + - + + 18 - - - - + - + + 19 - + - - + - - - 20 - + - - + - - + 21 + + - + + - + - 22 - - - - - - - - 23 + - - - - - - + 24 - - - + + + - - 25 + - + - - - - - 26 - + - + - - - - 27 - + + + - + + 28 - + - + - - - - 29 + - - + - - - - 30 - - + - + - + + 31 - - - - - - - - 32 - - + + + - + + 33 - + + + + - - 34 + - + + + - - -

46 Çizelge 4.1. (Devam) PZR Sonucu Örneklerde Saptanan Bakteri Türleri (Bakteri saptanan örnekler (+) ile bakteri saptanmayan örnekler ise (-) gösterilmiştir. 35 + - + - + - - - 36 - + - + + - - + 37 - + - - - + + - 38 + - + + + + + - 39 - + + - + + - - 40 - + - + - - - - 41 - - - - - + + - 42 + - - - + - - -

47 P. gingivalis bakterisine özgü primerlerle yapılan PZR sonucunda (Şekil 4.1). Çizelge 4.1 e göre toplam 14 adet örneğin 11 tanesinde P. gingivalis bakterisi pozitif bulunmuştur. P. gingivalis bakterisine rastlanma sıklığı %27,5 olarak hesaplanmıştır. P. micros özgü primerlerle yapılan PZR sonucunda DNA fragmenti elde edilmiştir (Şekil 4,2). Çizelge 4.1 e göre toplam 42 adet örneğin 16 tanesinde P. micros bakterisi pozitif bulunmuştur. P. micros bakterisine rastlanma sıklığı %40 olarak hesaplanmıştır. P. nigrescens özgü primerlerle yapılan PZR sonucunda DNA fragmenti elde edilmiştir (Şekil 4.3). Çizelge 4.1 e göre toplam 42 adet örneğin 10 tanesinde P. nigrescens bakterisi pozitif bulunmuştur. P. nigrescens bakterisine rastlanma sıklığı %25 olarak hesaplanmıştır. T. denticola özgü primerlerle yapılan PZR sonucunda DNA fragmenti elde edilmiştir (Şekil 4.4). Çizelge 4.1 e göre toplam 42 adet örneğin 15 tanesinde T. denticola bakterisi pozitif bulunmuştur. T. denticola bakterisine rastlanma sıklığı %37,5 olarak hesaplanmıştır. A. israelii özgü primerlerle yapılan PZR sonucunda DNA fragmenti elde edilmiştir (Şekil 4.5). Çizelge 4.1 e göre toplam 42 adet örneğin 12 tanesinde A. israelii bakterisi pozitif bulunmuştur. A. israelii bakterisine rastlanma sıklığı %30 olarak hesaplanmıştır. S.angious özgü primerlerle yapılan PZR sonucunda DNA fragmenti elde edilmiştir (Şekil 4.6). Çizelge 4.1 e göre toplam 42 adet örneğin 13 tanesinde S. angious bakterisi pozitif bulunmuştur. S. angious bakterisine rastlanma sıklığı %7,6 olarak hesaplanmıştır. P. intermedia özgü primerlerle yapılan PZR sonucunda DNA fragmenti elde edilmiştir (Şekil 4.7). Çizelge 4.1 e göre toplam 42 adet örneğin 12 tanesinde P.

48 intermedia bakterisi pozitif bulunmuştur. P. intermedia bakterisine rastlanma sıklığı %30 olarak hesaplanmıştır. P. endodontalis özgü primerlerle yapılan PZR sonucunda DNA fragmenti elde edilmiştir (Şekil 4.8). Çizelge 4.1 e göre toplam 42 adet örneğin 12 tanesinde P. endodontalis bakterisi pozitif bulunmuştur. P. endodontalis bakterisine rastlanma sıklığı %40 olarak hesaplanmıştır.

49 Belirteç 1 2 3 4 5 6 7 8 400bp 300bp 200bp 100bp Şekil 4.9. Çalışan bakterilere özgü hedef 16S rrna uzunluğuu Hat1 : Belirteç Hat2 : 1 numaralı örnek DNA sı P. endodontalis Hat3 : 2 numaralı örnek DNA sı P. nigrescens Hat4 : 3 numaralı örnek DNA sı Streptoccus angious Hat5 : 4 numaralı örnek DNA sı P. intermedia Hat6 : 5 numaralı örnek DNA sı P. micros Hat7 : 6 numaralı örnek DNA sı T.denticola Hat8 : 7 numaralı örnek DNA sı Actinomycess israelii Hat9: 8 numaralı örnek DNA sı P. gingivalis Bakterilere uygun hedef rrna bant uzunlukları sırasıyla 2 numaralı kuyucukta P. endodontalis 310 bp, 3 numaralı hatta P. nigrescens 320 bp, 4 numaralı hatta Streptoccus angious 310 bp, 5 numaralı P. intermedia 200bp, 6 numaralı hatta P. micros 310 bp, 7 numaralı hatta T. denticola 200 bp, 8 numaralı hatta A. israelii 250 bp, 9 numaralı kuyucukta P. gingivalis 300 bp olduğu gözlenmiştir.

50 1 2 3 4 5 6 7 8 Belirteç 300bp 200bp 100bp Şekil 4.1. P. gingivalis agaroz jel görüntüsü Hat1 : 1 numaralı örnek DNA sı P. gingivalis negatif Hat2 : 2 numaralı örnek DNA sı P. gingivalis negatif Hat3 : 3 numaralı örnek DNA sı P. gingivalis pozitif Hat4 : 4 numaralı örnek DNA sı P. gingivalis negatif Hat5 : 5 numaralı örnek DNA sı P. gingivalis negatif Hat6 : 6 numaralı örnek DNA sı P. gingivalis negatif Hat7 : 7 numaralı örnek DNA sı P. gingivalis negatif Hat8 : 8 numaralı örnek DNA sı P. gingivalis pozitif Hat9 : 9 Belirteç

51 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Şekil 4.2. P. micros agaroz jel görüntüsü Hat1 : 1 numaralı örnek DNA sı P. micros negatif Hat2 : 2 numaralı örnek DNA sı P. micros pozitif Hat3 : 3 numaralı örnek DNA sı P. micros pozitif Hat4 : 4 numaralı örnek DNA sı P. micros negatif Hat5 : 5 numaralı örnek DNA sı P. micros pozitif Hat6 : 6 numaralı örnek DNA sı P. micros pozitif Hat7 : 7 numaralı örnek DNA sı P. micros pozitif Hat8 : 8 numaralı örnek DNA sı P. micros pozitif Hat9 : 9 numaralı örnek DNA sı P. micros pozitif Hat10 : 10 numaralı örnek DNA sı P. micros negatif

52 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Şekil 4.3. P. nigrescens agaroz jel görüntüsü Hat1 : 1 numaralı örnek DNA sı P. nigrescens negatif Hat2 : 2 numaralı örnek DNA sı P. nigrescens pozitif Hat3 : 3 numaralı örnek DNA sı P. nigrescens pozitif Hat4 : 4 numaralı örnek DNA sı P. nigrescens negatif Hat5 : 5 numaralı örnek DNA sı P. nigrescens pozitif Hat6 : 6 numaralı örnek DNA sı P. nigrescens pozitif Hat7 : 7 numaralı örnek DNA sı P. nigrescens pozitif Hat8 : 8 numaralı örnek DNA sı P. nigrescens pozitif Hat9 : 9 numaralı örnek DNA sı P. nigrescens pozitif Hat10: 10 numaralı örnek DNA sı P. nigrescens negatif

53 1 2 3 4 5 6 7 Şekil 4.4. T. denticola agaroz jel görüntüsü Hat1 : 1 numaralı örnek DNA sı T. denticola pozitif Hat2 : 2 numaralı örnek DNA sı T. denticola pozitif Hat3 : 3 numaralı örnek DNA sı T. denticola pozitif Hat4 : 4 numaralı örnek DNA sı T. denticola pozitif Hat5 : 5 numaralı örnek DNA sı T. denticola pozitif Hat6 : 6 numaralı örnek DNA sı T. denticola negatif Hat7 : 7 numaralı örnek DNA sı T. denticola negatif

54 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Şekil 4.5. A. israelii agaroz jel görüntüsü Hat1 : 1 numaralı örnek DNA sı A. israelii negatif Hat2 : 2 numaralı örnek DNA sı A. israelii negatif Hat3 : 3 numaralı örnek DNA sı A. israelii pozitif Hat4 : 4 numaralı örnek DNA sı A. israelii negatif Hat5 : 5 numaralı örnek DNA sı A. israelii pozitif Hat6 : 6 numaralı örnek DNA sı A. israelii negatif Hat7 : 7 numaralı örnek DNA sı A. israelii pozitif Hat8 : 8 numaralı örnek DNA sı A. israelii pozitif Hat9: 9 numaralı örnek DNA sı A. israelii negatif Hat10 : 10 numaralı örnek DNA sı A. israelii negatif

55 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Şekil 4.6. S. anginosus agaroz jel görüntüsü Hat1 : 1 numaralı örnek DNA sı S. anginosus negatif Hat2 : 2 numaralı örnek DNA sı S. anginosus negatif Hat3 : 3 numaralı örnek DNA sı S. anginosus negatif Hat4 : 4 numaralı örnek DNA sı S. anginosus pozitif Hat5 : 5 numaralı örnek DNA sı S. anginosus pozitif Hat6 : 6 numaralı örnek DNA sı S. anginosus pozitif Hat7 : 7 numaralı örnek DNA sı A. israelii negatif Hat8 : 8 numaralı örnek DNA sı S. anginosus negatif Hat9: 9 numaralı örnek DNA sı S. anginosus pozitif Hat10 : 10 numaralı örnek DNA sı S. anginosus pozitif