attomol HLA-B*27 HLA-B*27 in tespitine yönelik kit (Doku tiplemesi için kullanmayın!) Sadece in vitro diagnostik kullanım içindir! 40 tespit sipariş numarası: 1030 1.Giriş İnsan lökosit antijenleri(hla) major doku uyum kompleksinin,major histocompatibility complex (MHC), glikoproteinidir. Bu antijenler imunologikal orijinalliğini tanımlar. HLA-B antijenleri, MHC sınıf I molekülleri HLA-A ve HLA-C ile beraberdir ve genleri kromozom 6'nın kısa kolunda saptanmıştır. (Thomas, 2000, Labor und Diagnose, 5. erweiterte Auflage, TH-Books Verlagsgesellschaft mbh, S. 878-888). Determinantları olan HLA-B antijenlerin farklı formları bulunur ( HLA-B7, -B8, -B15,...gibi). Bu determinantlardan birinin, 1973'te özellikle ankilozan spondilit gibi belli romatizmal hastalıklarla yakından ilgili olduğu bulundu (SPA, Morbus Bechterew) (Brewerton et al., 1973, Lancet 1:904-907). HLA-B27 taşıyıcıları, diğer determinant taşıyıcılarına göre 87 kat daha fazla ankilozan spondilit riskine sahiptir. Hastalık erkekler de bütün vakaların % 90 da görülür ve genellikle yaşamın 15. ve 30. yılları arasında kendini açıkça gösterir. HLA-B27 batı Avrupa nüfusunun yaklaşık 7% inde meydana gelir. Tüm vakaların 80-90 %ında SPAlı hastalar HLA-B27 taşır (Isselbacher et al., 1995, Harrisons Innere Medizin 1, 13. Auflage, Blackwell-Wissenschaftsverlag, S. 453-460). Ancak, patojenezler tamamen anlaşılmamaktadır (Lopez-Larrea et al., 1996, Curr. Opinion inrheumatology 8:296-308). Şimdiye kadar, HLA-B27 serolojik olarak tespit edildi. Son zamanlarda, bu metot giderek moleküler biyolojik teknikler ile değiştirildi, çünkü moleküler testler, canlı hücreler olmadan çalışır ve yapmak için daha ucuz ve daha kolaydır. 2. Genel Açıklamalar Bu kit sadece in vitro diagnostik uygulamalar için kullanılmalı. Bu kiti son kullanma tarihinden sonra kullanmayınız. Test çalışması için iyi eğitimli personel ve uygun laboratuar ekipman hususuna dikkat ediniz. Test uygulamasının tüm adımlarında eldiven giyiniz. Hasta numuneleri, potansiyel enfeksiyonlu madde olarak dikkate alınmalı ve mevcut yasalara göre hareket edilmelidir. PCR* a yönelik reaktifleri, DNA numuneleri ile amplifikasyon ürünlerinden ayrı saklayın.
3. Dahil olan malzemeler Sipariş numarası Reaktif Hacim Saklama Isısı 38 deiyonize PCR-H 2 O 0.2 ml -20 C 107 PCR-buffer III 1.0 ml -20 C 105 Primer HLA-B27 Liyofilize primerler -20 C (mor renkli tüp) içeren 2 tüp, tüp başına 450 μl PCRbuffer III (#107) ile çözündürme Kitteki tüm reaktiflerin miyadı, kutunun dış yüzeyinde bulunan esas etikette bulunmaktadır. 4. İlave Reaktifler ve Dahil olmayan malzemeler Hastaların DNA numuneleri ( genomik DNA kullanın, konsantrasyonu yaklaşık 20 ng/μl, distile suyla veya TE-buffer çözündürme) Qiagen tarafından sağlanan HotStarTaq DNA Polimeraz Kontrol template (HLA-B27 pozitif DNA) Eppendorf-tüpler (0.2 ml; 1.5 ml) Mikropipetler (hacim aralığı 0.5-1000 μl) ve steril filtre uçları Thermocycler Agoroz jel elektroforez ve sarf malzemeleri için ekipman (agoroz veya % 3 prekastlanmış agoroz jelleri, elektrot buffer, örnek buffer, DNA-boya, UV-transilluminator) 5. Test Prensibi Burada tanımlanan kit bir hastanın HLA-B27 alleli taşıyıp taşımadığını belirlemede kullanılabilir. Bu test kiti kullanımıyla daha ayrıntılı HLAB27 subtipleme veya diğer HLA-B tipleme determinantları bulmak mümkün değildir. Bu test sadece romatizmal hastalık riski için değerlendirebilir (Paragraf 1 e bakın) ve doku tipleme için bu test kullanılmaz. Hasta kanından izole edilen genomik DNA, bu kitin reaktifleri kullanarak amplifiye olur. Sonra, amplifikasyon ürünleri agoroz jel elektroforez tarafından analiz edilir. HLA-B27 için bir hasta numunesi pozitifse, bir amplifikate spesifik bant 284 bp de jelde gözükür. Tersine, numune negatif ise, bu bant gözükmez. Bütün numunelerde, negatif kontrol (PCR blank) hariç, iç standart olarak fonksiyonları HLA- B27 için spesifik olmayan bir kontrol bandında gözükmek zorundadır. Bu kontrol bandının
fragman boyutu 383 bpdir (fig. 1 bak). Kontrol bandı jelde gözükmezse, amplifikasyon reaksiyonu fonksiyon vermediği sonucuna varılmalıdır. Bu numunenin analizi tekrarlanmalıdır. Doğru genotipleme işlemi sağlamak için, pozitif bir kontrolde jelin içindeki bantların belli kalibrasyonu her numune serisini kapsamalıdır. Tek başına bir diagnostik metodun sonuçlarından klinik tanıya gidilmemelidir. Doktor mevcut tüm laboratuar ve klinik sonuçları dikkate almalıdır. 6. Manuel Hastaların numunelerine ek olarak PCR reaksiyonlarını kontrol etmek için aşağıdaki kontrolleri eklemeniz önerilir: 1. Negatif kontrol (PCR-blank) 2. Pozitif kontrol (HLA-B27 pozitif kontrol template kullanın [genotiplendirilmiş, genomik DNA]) Kontrol template ayrı olarak üreticisinden de sipariş edilebilir(sipariş numarası 106). Doğru şekilde genotiplendirilmiş olan hasta numuneleri kullanıcı tarafından kontrol template olarak da kullanılabilir. Protokol: Standart prosedürlere göre hasta kanından DNA-hazırlama Tüp başına 450 μl PCR-buffer III kullanarak (sipariş numarası 107) primerleri çözündürün, PCR Premix içinde pipet kullanarak uygun şekilde karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dk. İnkübe edin. Dikkat: 450 μl den daha az PCR premixe ihtiyacınız varsa geri kalanı -20 C de saklayabilirsiniz. PCR premix e hot start Taq DNA polimeraz ilavesiyle PCR mix hazırlama: Bir reaksiyon için kullanılacak toplam PCR premixin miktarını hesaplamak için her bir numune ve kontrol sayıları ile premix miktarı (20 μl) çarpılmalıdır ve bir miktar fazla hacim eklenmelidir (8 reaksiyon için örnek: 8 x 20 μl + 10 μl fazladan hacim = 170 μl PCR premix). Daha sonra, hot start Taq DNA polimeraz (5 U / μl) premix içine son dilüsyon 1:100 olacak şekilde ilave edilmelidir. (örneğin: 170 μl PCR premix + 1,7 μl 5 U / μl polimeraz). Şimdi, PCR mix iyice karıştırılmalıdır. PCR mixi 0.2 ml lik tüplerde eşit hacimlere ayırma: Negatif kontrol: Pozitif Kontrol: Hasta numuneleri: 20 μl PCR mix 20 μl PCR mix 20 μl PCR mix
+ 5 μl PCR-H2O + 5 μl kontrol template (ca. 20 ng/μl) + 5 μl DNA (ca. 20 ng/μl) PCR thermocyclerde aşağıda listelenen sıcaklık rejimi kullanılarak yapılmaktadır: İlk denatürasyon: 15 dak. 95 C 5 döngü: 1 dak. 94 C 1 dak. 60 C 1 dak.72 C 30 döngü: 30 s 94 C 30 s 60 C 30 s 72 C Final sentezi: 2 dak. 72 C Durdurma: 4 C zaman sınırı yok PCR ürünlerinin analizleri uygun laboratuvar şartlarında bir agoroz jel üzerine (2,5 % 3) 10 μl PCR ürünü ilavesi ve sonra elektroforez ile gerçekleştirilir. Hasta numunelerinin genotiplemesi kontroller ile numunelerin bant modeli kıyaslanarak yapılır(fig. 1'i gör). Test uygulaması sırasında sorunlar ile ilgili olarak üretici veya distribütör firmayla bağlantı kurmakta tereddüt etmeyin. EK 1 Kit etiketlerinde kullanılan sembollere genel bakış Sembollerin açıklaması Üretici Lot numarası Son kullanma tarihi
2 C ve 6 C arasında saklayın Max. -20 C de saklayın Katalog numarası In vitro diagnostik medikal ürünler <n> determinations için yeterli içerik Kullanım talimatına bakınız