Kullanım Talimatları Hb Isoelektrik Focusing-10 Katalog No: 100900
KULLANIM AMACI Hb-IEF 10 kit agaroz jel elekroforez ile insan hemoglobinlerini ayırmayı amaçlar. Baş fonksiyonlara sahip bir protein grubu olan hemoglobinler (Hb) ters yönde karaciğerde karbon dioksit ve dokudan oksijen taşımaktadır. Hemoglobinler polipeptit zincirlerleri oluşturur ve buna globin ve demir protoporfirin Heam denir. Dört polipeptid zincirlerin her biri spesifik bir amino asit sırası oluşturur. Her normal hemoglobin molekülü alfa olmayan bir zincir çifti ve bir alfa zinciri çifti içerir. Normal yetişkin hemoglobininde (HbA), alfa olmayan zincirlere beta denir. Fetal hemoglobinin alfa olmayan zincirine gama denir. Minör (% 3) bir hemoglobin fraksiyonuna HbA 2 denir ve bu alfa ve delta zincirleri içerir. Diğer iki zincir embriyo içinde oluşur. Normal yetişkin eritrositleri içinde majör hemoglobin HbA dir ve eritrosit içinde HbA 2 ve Hbf küçük miktarlarda bulunmaktadır. Ayrıca, günümüzde 400'den fazla mutant hemoglobin bilinir özellikle diğer anormal hemoglobin ile kombinasyonunda veya homozigot durumunda bazı hemoglobinler ciddi klinik etkilere neden olabilir. Wintrobe1 de hemoglobin sentezinin anormallikleri üç grupta ayrılır. 1. Anormal protein molekülünün üretimi (orak hücreli anemi gibi). 2. Normal protein sentezinin miktarında azalma (e.g. thalassaemia). 3. Gelişimsel anormallikler (hereditary persistence of foetal haemoglobin (HPFH) gibi). En sık rastlanan iki mutant hemoglobin HbS ve HbC dir. Hb Lepore, HbE, HbGPhiladelphia, HbD-Los Angeles ve HbO-Arap genellikle daha az görülebilir 2. Hb-IEF 10 prosedürü çeşitli diğer anormal hemoglobinlerin yanı sıra HbS, HbC ve Hbf varlığında tamamlayıcı ispatını sağlamak için hemolizatin dakikalık miktarını gerektiren basit bir prosedür. UYARILAR VE ÖNLEMLER Tüm kitler yalnızca in-vitro diyagnostikte kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini ağzınızla pipetlemeyin, ağzınıza sürmeyin. Tüm kit bileşenlerinin işlemi sırasında eldiven giyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kılavuzuna başvurun. BİLEŞENLER 1. Alkaline Hb Gel (x10) Koruyucu olarak ph 6-8 lı sodyum azid ve thiomersal ayırıcı ve agaroz içerir. Paket içindeki jel kullanım için hazırdır. 2. Hb-IEF Anot Solüsyonu. (1x 25ml) 0.3M asedik asit içerir. Paket içindeki solüsyon kullanım için hazırdır. 3. Hb-IEF Katot Solüsyonu. (1x 25ml) 1M NaOH içerir. Paket içindeki solüsyon kullanım için hazırdır. 4. Mor Asit Boya (1x 2g) Toz şekilde mor asit boya içerir. Şişe içeriği 1000ml boya arındırıcı solüsyon ile çözdürülür. Kullanım öncesi karıştırılır ve filtre edilir. İyi kapatılmış bir şişede saklanır. 5. Hb-IEF Lizin faktörü (1x 25ml) Koruyucu olarak potasyum siyanür, ve tiyomersal ile saf suda saponic içerir. Paket içindeki Lizis Agent kullanım için hazırdır. 6. Diğer Kit Bileşenleri Her kit kullanım talimatları ve 10 jeli tamamlamak için yeterli Numune Aplikasyon Kalıbı (Templayt 2 =10 x 8 örnek, Templayt 4 = 10 x 10 örnek), kurutma kağıdı A,B,C ve D, Elektrot Wicks, Wick kurutma kağıdı ve Soak-away kurutma kağıdı içerir. 1
SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ 1. Alkaline Hb Jel Jeller 15-30 derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. DOLABA KOYMAYIN VEYA DONDURMAYIN. Jelin bozulmasını belirtebilir,1) jelin dondurulması kristal görünümü belirtir, 2) jelin kuruması, çatlama ve kuruluğu veya 3)bakteriyal yada fungal kaynaklı agarozun görülür kontaminasyonunu belirtir. 2. Hb-IEF Anot Solüsyonu Solüsyon 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Partikül kirlenme veya bulanıklık bozulma göstergesidir. 3. Hb-IEF Katot Solüsyonu Solüsyon 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Partikül kirlenme veya bulanıklık bozulma göstergesidir. 4. Asit Mor Boya Toz boya 15...30 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Çözünmüş boya 15...30 C de 6 ay boyunca stabildir. Boyama azaldığında hemen atılmalıdır. Az boyama performansı boya solüsyonunun bozulduğunun göstergesidir. 5.Hemoglobin Lizin Faktörü Lizin Faktör 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Partikül kirlenme veya bulanıklık bozulma göstergesidir. SAĞLANMAYAN FAKAT GEREKSİNİLEN ÖĞELER Katalog No. 4065 Helena IEF Tank Katalog No. 1525 EPS 600 Güç kaynağı Katalog No. 1349/1111 REP IEF/SPIFE IEF Electrode Assembly Katalog No. 5014 Development Weight Katalog No. 3039 Tank Soğutma Cihazı Katalog No. 3100 REP Prep Katalog No. 5331 AFSC Hemo Kontrol Katalog No. 5330 AFSA2 Hemo Kontrol Katalog No. 5329 ASA2 Hemo Kontrol Katalog No. 5328 AA2 Hemo Kontrol 60-70 derece hava üfleme kapasiteli kurutma fırını Protein Fiksatif (35% metanol içine 5% trikloroasidik asit) Boya arındırıcı solüsyon: 500 ml saf su ve 500 ml metanolu karıştırın. 100ml glasial asetik asit ekleyin. İyi kapatılmış bir şişede saklanır. Tuz solüsyonu (%0.85 NaCl) Saf su NUMUNE TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI Tercih edilen numune taze toplanmış EDTA ya da heparin antikoagulant edilmiş kandır. Numuneler 1 haftaya kadar 2-6 derecede buzdolabında saklanabilir. Optimal sonuçlar için, salinle yıkanan kırmızı hücreler lizin hazırlamak için kullanılır. Bu plazma proteinlerinin olası girişimini engeller. a) 1000μL saline solüsyonu ile iyi karışmış 200μL tam kanı karıştırın. b) Kırmızı hücrelerin sedimenti için santrifüjleyin. c) 1000μL süzüntü ve atığı uzaklaştırın. d) İlaveten 1000μL saline solüsyonu ekleyin ve iyice karıştırın. e) b-d x2 adımları tekrar edin. f)son santrifüjün ardından 1000μL süzüntüyü uzaklaştırın ve tam kan gibi kalan numuneyi işleyin veya tüm süzüntüyü uzaklaştırın ve yıkanan paketlenmiş hücreler gibi kalan numuneyi işleyin. 2
Boyanmış jel için 1.0-2.0 g/dl veya boyanmamış jel için Hb Lizis Faktöre sahip 2.0-4.0 g/dl hemoglobin konsantrasyonu için her bir hasta numune/kontrolünü dilüe edin. ADIM-ADIM PROSEDÜR 1.Jeli paketinden çıkarın ve kağıt havlu üstüne koyun. Ambalajını çıkarın ve kurutucu C ile jel yüzeyini kurutun ve kurutucuyu atın. 2.Jel köşesindeki oklarla numune aplikasyon templaytı hizalayın ve templaytın başına kurutucu A yı koyun ve iyi temas sağlaması için yarığın içine parmağınızı sürtün. Kurutucuları alın ve adım 5'te kullanmak için saklayın. 3.Her yarığa 2μl numune uygulayın ve 10-15 dakika emmesi için bırakın. 4. Numune emiliyorken, katot solüsyonu içinde 1 elektrot fitili ıslatın ve iki fitil kurutucu arasında kurutun. Jelin katot (-) köşesi boyunca bu fitili hizalayın. 5.Numune emilimi ardından, adım 2 den kalan kurutucu A ile templaytı kurutun ve hem kurutucuyu hem de templaytı alın. 6.Anot solüsyonu içinde bir elektrot fitili ıslatın ve iki fitil kurutucu kağıdı arasında kurutun. Jelin anot (+) köşesi boyunca bu fitili hizalayın. Anot ve katot solüsyonlarını karıştırmamasına dikkat edin. NOT: Cihaza göre prosedürü izleyin: 7a. Bir REP biriminde çalışma: i. Bir REP IEF elektrot bağlama kullanın. Tank üzerine 500μl REP Prep pipetleyin. Dış katot elektrotu altına katot fitili ve Bir REP IEF elektrot bağlamanın merkez anot elektrotu altına anot fitili yerleştirerek tankın içine jeli koyun. Fazla sıvıyı kurutmak için katot elektrotun dışına bir emici kağıt ve anot elektrot dışına bir emici kağıt koyun. Emici kurutma kağıdının jeli ile temasından emin olun. ii. REP içine aşağıdaki parametreleri programlayın (program ekranın diğer tüm bölümleri bırakarak): iii. Tankın kapağını kapatın ve başlatmak için F1 basın. 7b. Bir SPIFE / SAS-3 birimi içinde çalışma: i. SPIFE / SAS-3 IEF elektrot bağlama kullanın. 7a (i) de açıklandığı gibi jeli ayarlayın. ii. SPIFE / SAS-3 içine aşağıdaki parametreleri programlayın: iii. Tankın kapağını kapatın, START basın ve elektroforezi başlatmak için isteneni izleyin. 3
7c. SAS-1 biriminde çalışma: i. Isı küveti içine 400μL REP Prep pipetleyin. Uygun elektrot çubukları ile negatif ve pozitif kısmını agarozun üst yüzeyine hizalayın ve ısı küveti üzerine jeli koyun, jelin altında hava kabarcığı oluşturmamaya dikkat edin. ii. Elektrotları elektrot çubuklarının üst yüzüne takın böylece tampon fitilleri ile temas ederler. iii. Hb-IEF elektroforezi gerçekleştirin: 7d. Eski IEF sisteminde çalışma: i. Aşağıdaki parametreler eğer alternatif IEF sistemi kullanılırsa, kullanılmalıdır: 7e. Helena IEF Tankında çalışma: i. Aşağıdaki parametreler Helena IEF tankında kullanılmalıdır: ii. Soğutma cihazının kullanım öncesi en az 30 dakika 2...6 C de saklandığından emin olun. Tankın merkezine doğru yerleştirin. NOT: Voltaj, zaman ve sıcaklık seçimleri fokuslama için her bir laboratuar tarafından belirlenmelidir. Sıcaklık jel yüzeyinde yoğunlaşmayı minimize etmesine göre seçilmelidir. Eğimin katot kayması katot fitili içinde proteinin kaybolması ile sonuçlandığı için jelin fazla fokuslanmasından kaçının. Helena IEF tankı kullanıldığında, soğutma cihazı kullanım öncesi 5 C ye soğutulmalıdır. 7F. SAS-M1 biriminde çalışma: i. Aşağıdaki parametreler SAS-M1 birimi ile kullanılmalıdır: ii. Soğutma cihazının kullanım öncesi en az 18 saat 2...6 C de saklandığından emin olun. 8. Elektroforez ardından, 60...70 C de jeli kurutun. Daha kalıcı kayıt için, jeller aşağıdaki gibi fokuslama sonrası boyanmalıdır: NOT: Fokuslama ardından, jeli kurutmayın. 9. 15 dakika Protein Fixative içinde jeli fiksleyin. 10. 10 dakika boya arındırıcıda yıkayın. 4
11. 3 kurutucu D ardından jel yüzeyine kurutucu B koyun. 15 dakika Development Weight kullanarak jeli presleyin. 12. Jeli kurutun. 13. 10 dakika boyunca boya solüsyonu içine kuru jeli koyun. 14. 5 dakika boyunca saf su içinde jeli yıkayın. 15. Arka kısmı temizlenene ve kuruyana kadar boya arındırıcı solüsyonda jeli arındırın. 595nm de tarayın. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Kalitatif Değerlendirme: Numunelerde bulunan hemoglobin tiplerinin olası tanımlanması tamamlanmış jelin görünür değerlendirmesi ile tespit edilebilir. Hemo kontrolleri bant tanımlanması için bir işaretleyicidir. Kantitatif Değerlendirme: Jelde her bir hemoglobinin relatif yüzdesi 595nm de tamamlanmış jelin dansitometri tarafından belirlenir. Şekil 1 en sık rastlanan hemoglobin türlerinin olası tanımlanmasını gösterir. Hemoglobin değişkenleri klinik semptomlarla ayırt edilmezler bundan dolayı araştırmacıların öncelikli ilgisini çekmezler. Değişken varlığı Talasemi sendromlar, yaşam boyu siyanoz, hemolitik anemi veya eritrositler veya orak bozukluğuna neden olduğunda veya eğer heterozigot genetik olarak yeterli yaygınlığa sahipse klinik olarak önemlidir. HbS-S, HbS-D- Los Angeles, ve HbS-O Arab ın kombinasyonları ciddi orak bozukluklara neden olurlar. HbH, E-Fort Worth ve Lepore dahil olan çeşitli değişkenler talasemik bir kan resmine neden olur. 2 Patoloji ve frekans açısından en önemli iki değişken hemoglobin Hbs and HbC2 dir. Orak hücreli anemi (HbSS) acı verici ve ölümcül bir hastalıktır. Yaklaşık olarak 5-6 ayın ilk aylarında ortaya çıkar. Klinik seyri vücudun neredeyse tüm organlarında enfarktüs, halsizlik, letarji ve anemi ile sıcaklık artışı ve ağrı olması ile kendini gösterir. Homozigot HbCC tek tek eritrosit içinde HbC in kristalleşmesi ya da çökelmesine neden olan hafif hemolitik anemiye maruz 5
kalır. HbSC hastalık vakalarında orak-hücreli anemi daha hafif bir hemolitik anemi ile karakterize edilmektedir. Diğer zincirler normal olarak sentezlenirken globin(α veya β) zincirinin azalmış sentezinden dolayı hipokromi ve mikrositoz tarafından hemoglobin bozuklukları talasamiaları karakterize edilir. 9, 10 Kararsız globin zincirleri bu dengesiz sentezin sonuçlarıdır. Kırmızı hücre içinde bu çökelme, hücrenin kısa ömürlü organlarının dahili ile oluşturur. α-talasemide, α-zinciri azalır veya hiç bulunmaz ve β-talasemide β-zincirleri etkilenir. Hbf in devam eden yüksek yüzdesinin sonucu olan doğumdan sonra yaklaşık dört ayda gama zinciri sentezinde son bulan mekanizmaların genetik bir hatası hemoglobin kantitatif bozukluğu sentezi ve kalıtsal persistan fetal hemoglobini (HPFH) gösterir. HPFH için homozigot normal gelişime sahiptir, asemptomatiktir ve anemiye sahip değildir. En sık hemoglobin anormallikleri: Orak Hücre özelliği HbA2 in normal bir miktarını ve HbA ve HbS gösteren bir heterozigot durumdur. Sonuçlar HbA ve HbS göçmen pozisyonlarında (bölge) hemoglobin gösterir. Orak Hücre Anemi HbF in az bir miktarında var olmasına rağmen, bu bir homozigot durumdur ve neredeyse sadece HbS gösterir. Orak-C Hastalığı Bu bir heterozigot durumudur, HbS ve HbC gösterir. Orak Hücre -Talasemi Hastalığı Bu durum HbA, HbF, HbS ve HbA2 gösterir. Orak Hücre βo-talasemi HbA içinde yoktur. Orak Hücre β +-talasemi HbA içinde azaltılmış miktarda bulunur. Talasemi-C Hastalığı Bu durum HbA, HbF ve HbC gösterir. C Hastalığı Bu homozigot durumdur ve neredeyse sadece HbC gösterir. Talasemi Major Bu durum Hbf, HbA ve HbA2 gösterir. SINIRLAMALAR Bazı anormal hemoglobinler benzer elektroforetik mobilite ve diğer metodolojiler tarafından farklı olmalıdır. Testler için gerekli olanlar: 1. Globin zincir analizi (hem asit ve hem de alkali) ve yapısal çalışmalar nadiren bazı haemoglobinleri olumlu olarak tanımlamak için gerekli olabilir. 2.Anyon değişimli kolon kromatografisi HbA2 miktarının belirlenmesi için en doğru yöntemdir.hbs in varlığında HbA2 in kantitasyonu için Helena Biyoteknoloji Orak-Thal Quik Sütun Yöntemi (Kat. No 5334) veya Helena Biyoteknoloji Beta-Thal HbA2 Quik Sütun Prosedürü (Kat. No 5341) tavsiye edilir. HbA2 kantitasyonu, b-talasemi özelliğinin teşhisinde en önemli tanısal testlerden biridir. 3.HbF (1-10%) in düşük seviyelerinde Helena Biyoteknoloji HbF-QuiPlate prosedürü (Cat. No 9325) kullanarak radyal immunodiffuzyon tarafından doğru şekilde miktarı belirlenebilir. REFERANS DEĞERLERİ Doğumda, normal bir bireyin eritrositinde hemoglobin çoğunlukla fetal hemoglobindir, HbF. Çoğu yetişkin hemoglobinlerin bazıları, HbA ve HbA 2 in küçük bir miktarı da bulunur. Yetişkinken ve bebekken çoğunlukla hemoglobin % 2 HbF den daha az ve 3.7% kadar HbA2 e sahip HbA bulunur. 6
BİBLİYOGRAFİ 1. Wintrobe, Maxwell M., Clinical Hematology, 6th Edition, Lea and Febiger, Philadelphia, 1967. pages 145-167. 2. Fairbanks, V.F., The Nomenclature and Taxonomy of Hemoglobin Variants, Diagnostic Medicine, Nov/Dec., 53-58, 1980. 3. Schneider, R.G., Hightower, B.J. and Barwick, R.C., Laboratory Identification of the Hemoglobins, Lab Management, 1981; August: 29-43. 4. Center for Disease Control, Laboratory Methods for Detecting Hemoglobinopathies, U.S. Department of Health and Human Services/Public Health Service, 1984. 5. Schneider, R.G., Methods for Detection of Hemoglobin Variants and Hemoglobinopathies in the Routine Clinical Laboratory, CRC Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences, 1978. 6. Schneider, R.G., Hightower, B., Hosty, T.S., Ryder, H., Tomlin, G., Atkins, R., Brimhall, B., and Jones, R.T., Abnormal Hemoglobins in a Quarter Million People, Blood, 1976; 48(5) : 629-637. 7. Huisman, T.H.J. and Schroeder, W.A., New Aspects of the Structure, Function and Synthesis of Hemoglobins. CRC Press, Cleveland, 1971. 8. Schmidt, R.M., Huisman, T.H.J.,and Lehmann, H., The Detection of Hemoglobinopathies. CRC Press, Cleveland, 1974. 9. Weatherall, D.J. and Clegg, J.B., The Thalassemia Syndromes, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1972. 10. Lehman, H. and Huntsman, R.G., Man s Haemoglobins, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1974. 7