Salmonella Analiz Yöntemleri (Kaynak 3) 1 01. Genel Bilgiler 02. Salmonella Analizi 02.01. Numune Hazırlama 02.02. Önzenginleştirme 02.03. Selektif Zenginleştirme 02.04. Selektif Katı Besiyerine Sürme 03. Klasik Yöntemle Salmonella İdentifikasyonu 04. Salmonella Kontrolünde Hızlı Kültürel Yöntemler 04.01. Membran Filitrasyon Tekniği 04.02. Oxoid Hızlı Salmonella Kontrolü 04.03. Modifiye Yarıkatı RV (MSRV) Besiyeri Kullanımı 05. Kondüktans Yöntemiyle Hızlı Salmonella Analizi 06. DNA ve İmmunoassay Esaslı Salmonella Analizi 01. Genel Bilgiler Gıda mikrobiyolojisi konuları içinde üzerinde en çok çalışılan bakteri kuşkusuz E. coli, izleyen bakteri ise Salmonella 'dır. Gıda mikrobiyolojisinin yanında tıp ve veteriner mikrobiyolojisi konuları içinde de yoğun olarak Salmonella çalışması bu bakterinin önemini artırmıştır. Salmonella üzerine yapılan araştırmalar salmonella varlığını belirleme ve tiplendirme üzerine yoğunlaşmıştır. Gıda maddelerinde salmonella belirlenmesi genellikle klasik kültürel yöntemler ile yapılmaktadır. Bu yöntemlere ilaveten membran filitrasyon ve enzim immunoassay yöntemleri ile de salmonella varlığı araştırılabilmektedir. Bunların yanında "geliştirilmiş kültürel - enzimatik yöntemler" olarak tanımlanan "hızlı analiz yöntemleri" üzerinde de son yıllarda büyük çalışmalar yapılmaktadır. Ancak bugün için yasal analiz kuruluşlarınca kabul edilen analiz yöntemleri çoğunlukla klasik kültürel yöntemlerdir. Salmonella 'nın klasik yöntemle tayininde önzenginleştirme, selektif zenginleştirme, selektif katı besiyerine sürme, biyokimyasal testler ve serolojik doğrulama aşamaları vardır ve bu tayin 7 gün sürmektedir. Bu yöntemde uygulamada görülen farklılıklar, çeşitli kuruluşlar tarafından farklı besiyerleri ve farklı inkübasyon sıcaklıkları önerilmesinden kaynaklanmaktadır. Gıdalardan Salmonella izolasyonu için uygulanabilecek herhangi bir metot, gıda prosesi boyunca ölüm düzeyinde zarar görmüş, düşük düzeydeki hücrelerin belirlenmesi için yeterli düzeyde hassas olmak zorundadır. Performans kolaylığı içeren geliştirilmiş yeni tekniklerin kabulünü etkileyen diğer faktörler arasında ise, sonuca ulaşmak için gereken zaman, normal çalışma saatleri içerisinde yapılabilme özelliği maliyet ve otomasyon imkanı yer alır. 1 Gıda Mikrobiyolojisi ve Uygulamaları, Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü 1
Farklı tiplerdeki numunelerde bulunan herhangi bir mikroorganizmanın saptanması için tek bir metodun optimal olması olası değildir. Birleştirilmiş ve standartlaştırılmış yöntemler, laboratuvarlar arası karşılaştırmanın yapılmasını sağlamak ve belirli bir laboratuvardaki çalışmayı kolaylaştırmak için arzu edilmektedir. Bir numunenin florasının önemli bileşeni olarak gösterilen organizmalar, belirli koşullar altında gelişmektedir. Örneğin, akut Salmonella gıda zehirlenmesi vakalarında kontamine gıdalardan Salmonella 'ların izolasyonunda sık sık büyük güçlükler görülmektedir. Klinik materyalin direkt olarak sürülmesi, istenilen mikroorganizmanın izolasyonunu kolaylaştırmakta, nadiren bu durum gıda ve çevre örnekleri ile başarılı olmaktadır. Klinik materyallerdeki mikroorganizmaların tespiti için kullanılan yöntemler diğer materyallerdeki mikroorganizmaların tespiti için nadir olarak uygun olmaktadır. Gıdalarda düşük sayılarda bulunabilecek salmonellaların ciddi sağlık problemleri yaratacağı günümüzde iyi bilinmektedir. Bu nedenle gıdalardan salmonella izolasyonunda kullanılacak yöntemlerin tam bir şekilde tanımlanması ve geliştirilmesi zorunludur. Gıdalardan salmonella izolasyonu için genellikle klinik örneklerde kullanılan yöntemler uygulanmaktadır. Ancak doğal olarak bulaşmış gıdalarda, Salmonella klinik materyale göre çok düşük sayıda, genellikle 25 gramda 1'den az bulunmaktadır. Ayrıca bu bakteri hücreleri çoğu zaman dondurma, ısıtma gibi işlemler ile strese uğramış diğer bir deyişle zayıflamış ve yaralanmış durumdadır. Diğer taraftan yumurta albümini, kakao ve bazı baharatlar gibi belirli gıdalar salmonella izolasyonunu güçleştirmektedir. Ayrıca salmonella izolasyonunda kullanılan kültürel metotların uzun zamana ihtiyaç gösterdiği, bir örnekte Salmonella olmadığına ilişkin raporun analize başlandıktan en az 4 gün sonra verilebileceği, salmonella şüpheli örneklerde ise kesin tanı için 3 günden sonra birkaç güne kadar ihtiyaç duyulduğu, bu durumun gıdaların depolama süresinin uzatılmasına neden olduğu, özellikle de ihracatta meydana gelen gecikmelerin büyük sorunlar yarattığı belirtilmiştir. Gıdalarda veya diğer örneklerde bulunan bakterilerin tespiti için, aşağıdaki aşamaların hepsini veya önemli bir bölümünü içeren bir plan gereklidir. -Seçici olmayan uygun sıvı besiyerinde önzenginleştirme, -Selektif sıvı ortamında zenginleştirme, -Selektif veya diferansiyel katı besiyerine ekim yapılarak saf bakteri kolonilerinin izolasyonu, -Morfolojik, biyokimyasal, fizyolojik ve serolojik testler kullanılarak organizmaların identifikasyonlarının yapılması. Doğal olarak bu aşamaların uygulamasına geçmeden önce numunenin uygun bir şekilde hazırlanması gereklidir. 02. Salmonella Analizi 02.01. Numune Hazırlama İncelenen numunede mikroorganizmaların heterojen olarak dağılmış bulunduğu iyi bilinen bir durumdur ve bunların homojen olarak dağıtılması gereklidir. Organizmaların homojen dağılımı, özellikle en muhtemel sayı tekniği kullanılarak bakteriyel sayım yapıldığında ve toplam numunenin sadece küçük bir fraksiyonu incelendiğinde özellikle önemlidir. 2
Numunenin önzenginleştirilmesinden önce, analizi yapan kişi numune hazırlanması için en uygun tekniğe karar vermek zorundadır. Karıştırma granüler gıdalar için, ezme ise toz gıdalar için uygundur. Buna karşın çikolata, et, sebze ve kabuklu hayvan ürünleri gibi gıdalar genellikle blender ile homojenize edilmektedir. Yüzey kontaminasyonu veya çapraz kontaminasyon söz konusu olduğunda çalkalama yöntemi kullanılmaktadır. Blender ile karıştırmaya alternatif olarak Schizmann ve arkadaşları "Stomaching" yöntemini önermektedir. Numune hazırlanmasında diğer bir metot ıslatma metodudur. Van Schothorst ve arkadaşları birkaç farklı örnek/broth oranında, süt tozundan rekonstitüye edilen sütten Salmonella 'nın geri kazanılmasını karşılaştırmıştır. Islatma metodu, önzenginleştirme ortamı üzerine numunenin yavaşça dökülmesini içermektedir. Önzenginleştirme ile bütün numunelerin rekonstitüsyonu 1:1,5 oranı ile gerçekleştirilir, oda sıcaklığında 2 saat sonra numuneler son konsantrasyon olan 1:9 oranına seyreltilir. Numuneler hızlı rehidrasyon koşullarına oranla yavaş rehidrasyon koşulları altında önzenginleştirildiğinde, dehidre hücrelerin ozmotik basınçtaki kademeli değişim ile travmatize olmasının daha az olası olduğu ileri sürülmüştür. 02.02. Önzenginleştirme Salmonella 'nın tespit edilmesinde geleneksel kültürel metodun ilk adımı önzenginleştirmedir. Önzenginleştirmenin başlıca fonksiyonlarından birisi, bu mikroorganizmaları içeren gıdaların proses süresince dehidre olan hücrelerinin rehidre olmasını sağlamaktır. Önzenginleştirme işlemi ile zarar görmüş olan hücrelerin onarılması sağlanmaktadır. Çeşitli kuruluşlar önzenginleştirme aşamasında değişik besiyerlerinin kullanılmasını önermektedir. Bunlar arasında Laktoz Broth, Tripticase Soya Broth, Yağsız Süttozu Besiyeri, Nutrient Broth, Tamponlanmış Peptonlu Su bulunmaktadır. Örnekte çok sayıda G + bakteri varlığında brilliant green ya da kristal viyole gibi boyalardan düşük konsantrasyonlarda ilavesinin yararlı olacağı belirtilmektedir. Enterobakter dışındaki bakteriler ile yoğun kontaminasyon durumunda Tamponlanmış Peptonlu Suya % 0,01 konsantrasyonda malachite green boyası katılmasının salmonellanın geri kazanılmasında yararlı olduğu gösterilmiştir. Gıda mikrobiyolojisi konusunda dünyanın önde gelen kuruluşlarından biri olan AOAC, önzenginleştirme için Laktoz Broth besiyerinde 35 o C 'de 24 saat inkübasyon önermekte, ISO ise Tamponlanmış Peptonlu Su ile 35-37 o C 'de 16 saatten az 20 saatten çok olmamak üzere önzenginleştirme yapılması gerektiğini belirtmektedir. Türk Standartları Enstitüsü, Tarım ve Köyişleri Bakanlığı İl Kontrol Laboratuvar Müdürlükleri ile Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Bilimi ve Teknolojisi Bölümü önzenginleştirme ortamı olarak yine Tamponlanmış Peptonlu Suyu göstermektedirler. TSE önzenginleştirme için 35-37 o C 'da 16-20 saat inkübasyon, İl Kontrol Laboratuvar Müdürlükleri ile Ankara Üniversitesi 35 o C 'da 24 saat inkübasyon önermektedirler. Salmonella 'ların geri kazanılmasında önzenginleştirme ortamlarının seçimi konusunda birçok tartışma olmasına rağmen inkübasyon sıcaklığı hakkında daha az bilgi vardır. Genelde önzenginleştirme kültürlerinin 37 o C 'de inkübasyonu önerilmektedir. 3
Önzenginleştirme genel olarak 37 o C 'da bir gece ya da 43 o C 'da 18 saat süre ile yapılmaktadır. Önzenginleştirme işleminin atlanıp doğrudan selektif zenginleştirmeye geçilmesi ya da önzenginleştirmenin 6 saat inkübasyon ile yapılması özellikle hasar görmüş bakteriler açısından tatmin edici sonuçlar vermemiştir. Bu şekilde analiz süresi büyük ölçüde kısaltılmış olmakla beraber kabul edilemeyecek düzeyde sahte negatif sonuçlar saptanmıştır. D'Aoust hem çiğ hem de işlenmiş gıdalarda önzenginleştirmede kullanılan farklı besiyerlerinin önemli olmadığını ve metodun duyarlılığına etki etmediğini belirtmektedir. Andrews ise zayıflamış Salmonella 'nın kendini toparlaması amacı ile basit ve kompleks olarak hazırladığı 2 değişik besiyerini kullanmıştır. Araştırıcı 50 o C 'de değişik sürelerde ısısal işlem uygulayarak strese uğrattığı bakterileri bu besiyerlerine aşılayarak zenginleştirmiş, basit olandan daha iyi sonuç almıştır. Kompleks besiyeri ısısal işlem görmüş DNA 'nın parçalanmasına neden olmuştur. Özellikle işlenmiş gıdalarda bakteriler yukarıdaki gibi fizyolojik olarak zarara uğramaktadır. Bu nedenle optimal iyileşmeyi sağlamak için kompleks olmayan besiyerlerinin kullanılması önerilmektedir. Önzenginleştirmede, belirli hacımda besiyerinin aşılanabilmesi için doğru aşılama hacminin seçimine dikkat edilmelidir. Fazla yükleme zenginleştirme tekniğinin azalan etkisine katkıda bulunmaktadır. Aşılama materyalinde bulunan bakteri sayısı önemli bir faktördür. Özellikle fazla miktarda inokulum kullanımı, zenginleştirme kültüründeki bakterilerin gelişimi üzerinde zararlı etkilere sahip olabilen metal, yağ asitleri ve antibiyotik gibi maddelerin fazla miktarda zenginleştirme ortamına geçişine neden olur. Ayrıca birçok organizmanın gelişmesi için iz elementler gerekirken, konsantrasyondaki nispeten küçük bir artış ciddi şekilde gelişme oranını geriletebilir. Birçok materyalde, özellikle mandıra orijinli gıdalarda bulunan yağ asitlerinin bakteri gelişimi üzerinde inhibitör etkisi yaptığı gösterilmiştir. Kulshresthal ve Marth tarafından bazı yağ asitlerinin 10 ppm 'lik konsantrasyonlarının S. typhimurium gelişimini inhibe ettiği gösterilmiştir ve diğer araştırmacılar da benzer bulgularla bu görüşü desteklemişlerdir. Bir diğer deyiş ile, doğru inokülasyon oranı kullanılmak zorundadır. Fazla miktardaki inokülant için büyük hacımda ortam kullanılmalı ya da numune bölünerek birkaç küçük hacımdaki zenginleştirme ortamına aşılanmalıdır. Yapılan çalışmalar ile 25 g numunenin önzenginleştirmesinin Salmonella 'yı tespit için yeterli olduğu gösterilmiştir. Zenginleştirme besiyerleri için kullanılan aşılama hacmi besiyeri hacmi, doğası ve test edilen numune ile değişkendir. Bazı durumlarda fazla aşılama miktarı yararlı olmakla beraber besiyerinin fazla yüklenmesi önlenmelidir. Salmonella izolasyonunda önzenginleştirmeden sonra Selenit Sistin Broth veya Tetratiyonat Broth kullanılacaksa, genellikle kabul edilen oran 1/10 (v/v) dur. Ayrıca birçok teknik en azından 24 saatlik zaman zarfında zenginleştirme kültürlerinin inkübasyonu önermektedir. Doğal olarak kontamine olmuş numunelerin direkt olarak selektif besiyerine inokülasyonu sık sık, ilgili organizmaların geri kazanılmasında başarısızlıkla sonuçlanır. Bu durum iki nedenden dolayı meydana gelmektedir. Bazı sağlıklı bakteri hücreleri selektif kültür ortamına eklendiğinde çoğunlukla ölür ve sayıları azalır. Bu durum ilgili organizmaların tüm populasyonunun ölümüne neden olabilir. Önzenginleştirme kültürleri organizma sayısının artışına izin vermekte ve böylece başlangıç ölümlerinin zararlı etkilerini azaltmaktadır. Ayrıca zarar görmüş hücreler, selektif maddelere karşı zarar görmemiş hücreler oranla daha duyarlıdır. Bu durumda önzenginleştirme besiyeri, ilgili hücrelerin yaralarını tamir etmesine izin verir. Selektif maddelere olan rezistanzlığın kazanılması önzenginleştirmenin zenginleştirmeye olan üstünlüğüdür. Salmonella 'lar son yıllarda önzenginleştirme ve zenginleştirme koşullarında üzerinde geniş şekilde çalışılan mikroorganizmalardır. 4
Önzenginleştirme tekniği, zarar görmüş bakteri bulunduran numunelerden Salmonella izolasyonunun daha iyi olduğunu göstermiştir. Önzenginleştirme tekniği 16-24 saat için, selektif olmayan bir ortamda numunenin inkübasyonunu gerektirir. Laktoz Broth ve Tamponlanmış Peptonlu Su en yaygın olarak kullanılan önzenginleştirme besiyerleridir. Süttozu ve yumurta ürünlerinden Salmonella 'ların geri kazanılmasını destekleyen Tamponlanmış Peptonlu Su ve Laktoz Broth'un kullanıldığı önzenginleştirmelerin etkinliği konusunda çeşitli çalışmalar kaydedilmiştir. Zarar görmüş Salmonella 'ların zenginleştirilmesi için fermente olabilir karbohidrat kaynaklarının gerekli olmadığı öne sürülürken, Van Schothorst ve Van Lausdon, doğal olarak kontamine olmuş yumurta ürünlerinden Salmonella 'ların geri kazanılmasında Laktoz Broth 'un, Tamponlanmış Peptonlu Su 'dan biraz daha fazla etkili olduğunu saptamıştır. Önzenginleştirme besiyerleri hakkındaki bu karşı görüşlerden dolayı, bugün rutin kullanımlar için Tamponlanmış Peptonlu Su önerilmektedir. Bu seçim kuramsal tartışmalardan çok deneysel verilere dayanarak ortaya çıkmaktadır. Van Schothorst ve Van Leusden yumurta ürünlerinin Laktoz Broth 'da önzenginletirmeye alındığında ortamın ph 'sının bazen 4,5 'in altına düştüğünü göstermiştir. Benzer numunelerin Tamponlanmış Peptonlu Su içerisine alınması durumunda ph 'da sadece minimal değişiklikler oluşmuş ve ph 'da sağlanan en düşük değer 6,0 olarak saptanmıştır. Bu çalışmanın sonucunda Van Leusden Salmonella 'nın ph 4,5 'de gelişemediğini açıklamıştır. Böylece Laktoz Broth ile yapılan önzenginleştirmede ph değerindeki düşme Salmonella 'ların geri kazanılmasını önleyebilmektedir. Tamponlanmış Peptonlu Su ise fosfat tampon sistemini kullanır ve böyle sistemlerin kullanımı geri kazanmayı artırır. 02.03. Selektif Zenginleştirme Geleneksel kültürel metotlar ile Salmonella 'nın tespit edilmesinde ikinci aşama selektif zenginleştirmedir. Bu amaç için birçok besiyeri geliştirilmiş bulunmakla beraber Selenit Sistin Broth ve Tetratiyonat Broth en yaygın olarak kullanılanlardır. Her iki besiyerinde, rekabetçi bakteri türlerinin çoğalması sınırlanırken Salmonella hücrelerinin artışına izin verilir. Zenginleştirme kültürlerinin amacı, floranın asıl komponenti olmalarından dolayı, organizma karışımlarında bulunan mikroorganizmaların belirli fizyolojik tiplerinin gelişimini teşvik etmektir. Son zamanlarda, selektif zenginleştirme klinik, veteriner ve gıda mikrobiyolojisi alanlarında bakteri izolasyonunda geniş çapta kullanılmaktadır. Selektif zenginleştirme ortamı olarak AOAC Tetratiyonat Broth ve Selenit Sistin Broth kültürlerinin 35 o C 'de 24 saat inkübasyonunu ; ISO Rappaport Vassiliadis Broth 'da 42 o C 'de 13-24 saat inkübasyon ile Selenit Sistin Broth 'da 35-37 o C 'de 18-24 saat inkübasyon; TSE Tetratiyonat Broth'da 43 o C 'de 24 saat ve Selenit Sistin Broth'da 34 o C 'de 24 saat inkübasyon ; İl Kontrol Laboratuvar Müdürlükleri ve Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Bilimi ve Teknolojisi Bölümü Selenit Sistin Broth ve Tetratiyonat Broth 'da 35 o C 'de 24 saat inkübasyon önermektedirler. Kullanılan selektif ortama göre değişmek üzere selektif zenginleştirmenin 35-37 o C 'da veya 41 o C 'da 24 saat süre ile yapılması gerektiği önerilmektedir. Genel olarak, yüksek sıcaklıklardaki inkübasyonun daha etkili olduğu kabul edilmektedir. 5
Diğer mikroorganizmalar üzerinde herhangi bir etkisi bulunmamasına karşın Sodyum Selenit 'in bazı bakterilerin gelişimini inhibe ettiği bulunmuştur. Selenit 'in toksisite mekanizması tam olarak açıklanamamıştır. Fakat iki olası mekanizma tartışılmıştır. -Selenyum, sülfür analoglarını içerebilir (Seleno amino asitler) -Selenyum bazı hücre komponentlerinin sülfidril grupları ile reaksiyon verebilir. Birçok bakteri, sodyum selenit tarafından inhibe edilmektedir. Fakat Salmonella 'ların yanı sıra Proteus suşları ve Pseudomonas suşları sodyum selenit'in etkisine nispeten daha dirençli görünmektedirler. Selenit'in selenyuma indirgenmesi ph değerinde bir artışa neden olur ve bu durum selenitin toksisitesinde bir artışa eşlik eder. Selektif zenginleştirme ortamı olarak Selenit Sistin Broth güvenlik nedeni ile giderek daha az kullanılmaktadır. Tetratiyonat Broth, Müller Kauffmann tarafından ox-bile ve Brilliant green ile kullanılarak modifiye edilmiştir. Tetratiyonat Broth'un etkinliği, diğer bakterilerde bulunmamasına karşın, Salmonella 'larda bulunan tetratiyonat redüktaz varlığından kaynaklanmaktadır. Muller- Kauffman Tetratiyonat Broth rekabetçi bakteriyel florayı inhibe etmesine karşın Salmonella üzerinde de toksik etki gösterebilmektedir. Yüksek nemli gıdalardan salmonellanın geri kazanılmasını artırmak için, yüksek sıcaklıkta selektif zenginleştirme ortamının inkübasyonu araştırılmış, buna karşın düşük nemli gıdalar ile olan sonuçlar arasında 35 o C 'de veya 43 o C 'de inkübe edilen salmonellaların geri kazanılmasında herhangi bir farklılık görülmemiştir. Buna rağmen bazı kuruluşlar Tetratiyonat Broth ve Selenit Sistin Broth'un 43 o C 'de inkübasyonunu önermektedir. Düşük nemli gıdalar ile yapılan diğer bir çalışmada ise Tetratiyonat Brilliant Green Broth ile Selenit Sistin Broth besiyerlerinden yapılan izolasyonlar arasında %10 dan daha az fark olduğu görülmüştür. Ancak hem nemli, hem de düşük nemli gıdalarda en az 2 seçici zenginleştirme sıvısının birlikte kullanılması izolasyon olasılığını artırmaktadır. Diğer taraftan D'Aoust Tetratiyonat iyonları, brilliant boyası ve yüksek inkübasyon sıcaklığı arasında sinergist etki bulunduğunu, Tetratiyonat Brilliant Green besiyerinin rekabetçi floranın baskı altına alınmasında daha etkin olduğunu ileri sürmüştür. Salmonella ile bulaşmış nemli gıdalar Bizmut Sülfit Agar ve Brilliant Green Sulphat Agar'a ekim yapılmış ve %92 'sinden salmonella izole edilmiştir. Selektif zenginleştirme besiyeri olarak Selenit Sistin kullanılması durumunda ise örneklerin ancak %63 'ünden salmonella izole edilebilmiştir. Salmonella izolasyonu son yıllarda mikrobiyologların çok fazla çalıştıkları bir konudur. Uluslararası standartlar komitesi Tetratiyonat Broth 'un kullanımını önermesine rağmen, birçok araştırıcı Rappaport-Vassiliadis besiyerinin çok daha etkili olduğunu savunmaktadır. Lağım çamurundan salmonellanın izolasyonunda Rappaport Vassiliadiz Broth besiyerinin Müller Kaufman Tetratiyonat Broth'a göre üstün olduğu gösterilmiştir. Rappaport Vassiliadis besiyerinin rekabetçi baskılanması ve hem de Salmonella gelişimi için daha etkili olduğu belirtilmiştir. Rappaport Vassiliadis Broth besiyeri geliştirilerek, orijinal formüldeki tripton yerine soya pepton veya mikolojik pepton kullanılmıştır. RV soyanın, RV sıvı besiyerine göre 6
salmonellanın çok daha hızlı çoğalmasını ve inkübasyon süresinin kısalmasını sağladığı belirtilmiştir. Salmonella cinslerinin, rekabetçi floranın özellikle Enterobacteriaceae üyelerinin geliştiği örneklerde yapılan çalışmalar, Tamponlanmış Peptonlu Su önzenginleştirme ve Tetratiyonat Broth 'da selektif zenginleştirme adımlarını içermektedir. Önzenginleştirme kültürü kıyma ve nalidiksik aside dirençli Salmonella içeren üç referans örnekle aşılanmıştır. Salmonella pozitif testlerde laktoz negatif Enterobactericeae sayısında azalma olmamıştır. Salmonella pozitif testlerde salmonellaların sayısı, Tamponlanmış Peptonlu Su ortamında ml'de 10 3-10 7 adet düzeyine çıkmıştır ve daha sonra Tetratiyonat Broth besiyerine transfer edildiğinde yavaş yavaş ml 'de 10 4 adete ulaşmıştır. Bütün bu durumlarda Brilliant Green Agar'da salmonella sayısı rekabetçi flora sayısını geçmiştir. Salmonella negatif testlerde salmonella sayısı Tamponlanmış Peptonlu Su 'da daha az artmıştır ve Tetratiyonat Broth Besiyeri 'nde zenginleştirme sırasında sayı azalmıştır. Bu negatif testlerin hiçbirinde salmonella sayısı Brilliant Green Agar 'da rekabetçi florayı geçmemiştir. Salmonella negatif testlerin çoğunluğunda sadece E. coli 'nin hakim olduğu gösterilmiştir. Bu sonuçlar salmonella bulunmasında laktoz pozitiflerin etkisinin laktoz negatiflerden daha fazla olduğunu öne sürmektedir. Ayrıca Schothorst ve Renauld, eğer rekabetçi flora önzenginleştirme ortamı ph 'sında kuvvetli şekilde azalmaya neden oluyorsa, bu durumunu salmonellaların gelişimini geciktirdiğini göstermiştir. Bu durum, Tamponlanmış Peptonlu Su ph 'sının 6,0 'ın altına inmediği için bu çalışmada problem olmamıştır. Salmonellaların son sayısı sadece Tamponlanmış Peptonlu Su 'daki çoğalmaya değil aynı zamanda Tetratiyonat Broth'daki zenginleştirmeye de bağlıdır. Organizmaların selektif ortamdaki gelişme durumu, kullanılan selektif madde yapısı tarafından etkilenir. Van Schothorst ve Renaud salmonella için Rappaport Vassiliadis Soya Broth ortamında ortalama generasyon süresinin yaklaşık 1 saat olduğunu hesaplamışlar, fakat Tetratiyonat Broth 'da generasyon süresinin değişken olduğunu saptamışlardır. Van Schothorst ve Renaud tarafından da belirtildiği gibi, salmonella gelişimi rekabetçi floranın sayısından çok tipine bağlıdır. Tetratiyonat Broth 'da L (-) ve L (+) organizmaların gelişme durumunun karşılaştırılmasında, salmonellaların saptanması açısından L (+) 'lerin etkisinin L (-) 'lerden daha fazla olduğu gösterilmiştir. 02.04. Selektif Katı Besiyerine Sürme Uygun sürme ortamının kullanımı, katı besiyeri üzerinde gelişebilecek bütün bakterilerin yeterli izolasyonu için çok önemlidir. Yıllardır çok çeşitli sürme ortamları salmonellaların izolasyonu için sık sık kullanılmıştır. Bu besiyerlerinin çoğu ayırt edici besiyerleri kadar selektiftirler. Ayırtedici besiyerlerinin iki karakteristiği hidrojen sülfür üretimi ve belirli karbohidratların (Laktoz ve Sakkaroz) fermantasyonundaki yetersizliktir. Salmonellalar için sürme ortamlarında kullanılan selektif maddeler boyaları, antibiyotikleri ve safra tuzlarını içermektedir. Zenginleştirme ortamlarında olduğu gibi selektif katı besiyerleri de pek çok modifikasyonlar ile kullanılmaktadır. Selektif katı besiyeri olarak AOAC Bizmut Sülfit Agar, Hektoen Enterik Agar ve Ksiloz Lisin Deoksiçolat Agar; ISO ve TSE Brilliant Green Fenol Red Agar ile kullanıcı tarafından seçilecek bir başka selektif katı besiyeri, İl Kontrol Laboratuvar Müdürlükleri ve Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Brilliant Green Fenol Red Agar ve Bizmut Sülfit Agar; Salmonella konusunda yetkili kuruluşlardan biri olan Etlik Hayvan Hastalıkları Araştırma Enstitüsü ise Endo Agar, 7
MacConkey Agar, Eosin Metilen Blue Agar, Salmonella-Shigella Agar ve Brilliant Green Fenol Red Agar besiyerlerini önermektedirler. Salmonellalar için geliştirilen selektif besiyerlerinde temel prensip çoğu salmonellanın laktozu bazılarının ise sakkaroz ve salisini kullanamaması esasına dayanır. Safra içeren besiyerleri salmonellaların H 2 S üretmeleri esası üzerine ikinci bir diagnostik sistem oluşturur. Salmonella için geliştirilmiş selektif katı besiyerleri tatmin edici sonuçlar vermekle beraber hiçbiri tam selektif değildir. Proteus türleri gibi laktoz fermente etmeyen enterobakteriler yanında Enterobacteriaceae üyesi olmayan Pseudomonas ve Aeromonas türleri de bu besiyerlerinde gelişebilir ve salmonella kontrolünde sorun çıkarabilirler. Zenginleştirme işleminden sonra salmonellayı saf olarak izole etmek için değişik seçici, ayırt edici besiyerleri kullanılmaktadır. Bu amaçla en çok kullanılan besiyerleri Ksiloz Lisin Deoksiçolat Agar, Bizmut Sülfit Agar, Salmonella-Shigella Agar olup bunlar üzerinde Salmonella cinsine ait bakteri kolonilerinin görünümleri tipik renk ve özellikte olmaktadır. D'Aoust tarafından yapılan çalışmalar izolasyon aşamasında kullanılan besiyerinin analizin sonucuna etki etmediğini göstermektedir. Salmonellanın izolasyonunda kullanılan besiyerlerindeki trifenilmetan boyaları arasındaki ilişki, Proteus suşlarının gelişimini inhibe eder. Bu amaç için Brilliant Green yıllardır kullanılmıştır. Safra tuzları içeren katı besiyerleri, enterik patojenlerin tespiti için yaygın olarak kullanım alanı bulmuştur. Safra tuzları ve saf sodyum deoksiçolat böyle besiyerlerinde Gram pozitif bakterilerin baskılanması amacı ile, sodyum sitrat ile Brilliant green ise bazı gram negatif bakterilerin inhibisyonu için sık sık kullanılmaktadır. Salmonella-Shigella Agar, Salmonella 'lara ilave olarak Shigella suşlarının gelişimini tamamen destekleyebilme yeteneğindedir ve rekabetçi flora üzerinde güçlü bir inhibatör etkisi vardır. Rekabetçi floraya daha az inhibitör etkisi bulunan bu tip selektif besiyerleri arasında Ksiloz Lisin Deoksiçolat Agar, Hektoen Enterik Agar ve Mac Conkey Agar bulunmaktadır. Bizmut Sülfit Agar sık sık salmonellaların izolasyonu özellikle de Salmonella typhi için önerilmektedir. Salmonellalar fermente olabilir karbohidrat varlığında geliştiğinde tanınabilir, sülfid demir varlığında ortamın siyahlaşması ile ortaya konulur. Koliform bakteriler üzerinde Bizmut Sülfit Agar 'ın inhibitör etkisi, sodyum sülfit, bizmut sülfit ve brilliant green varlığından kaynaklanmaktadır. Bizmut Sülfit ortamının duyarlılığının depolama ile de etkilendiği belirtilmiş ve besiyerinin 4 o C 'de 3 gün depolanması ile selektivitede bir düşme olduğu kaydedilmiştir. 03. Klasik Yöntemle Salmonella İdentifikasyonu Selektif katı besiyerinden elde edilen salmonella kültürlerine bir seri biyokimyasal test uygulanarak identifikasyona başlanır. İdentifikasyonda son aşama serolojik testlerdir. Biyokimyasal testler konusunda da farklı kuruluşlar farklı testler önermektedirler. AOAC izolatların Triple Sugar Iron Agar ve Lisin Iron Agar 'daki reaksiyonlarının izlenmesini, bu besiyerlerinde tipik reaksiyonlar olmaz ise üre testi yapılmasını, üre (-) izolatlarda ise ilaveten Lisin Dekarboksilaz Broth, Fenol Red Dulsitol Broth, Tripton Broth, Potasyum Siyanid Broth, Malonat Broth besiyerlerindeki reaksiyonların incelenmesini ve indol testi yapılmasını, daha sonra ise serolojik testlere geçilmesini önermekte, ayrıca Voges-Proskauer, Metil Red ve Sitrat testlerinin de yapılması gerektiğini belirtmektedir. 8
ISO ise Triple Sugar Iron Agar, Üre Agar, Lisin Dekarboksiloz Broth 'daki reaksiyonların saptanması ile β -galaktozidas testi, Voges-Proskauer testi, İndol testi uygulanmasını sonra serolojik testler yapılması gerektiğini belirtmiştir. TSE ise ISO ile aynı identifikasyon yöntemini göstermektedir. Etlik Hayvan Hastalıkları Araştırma Enstitüsü Norveç 3 'lü Tüp Yöntemini önermektedir. İlk kez Oslo 'daki Norveç Ulusal Halk Sağlığı Enstitüsü Mikrobiyoloji Bölümü 'nde ortaya konulan bu yöntemde 3 tüp kullanılmakta, 1. tüpte glukoz fermentasyonu, laktoz fermentasyonu, hidrojen sülfür oluşumu, Lisin dekarboksilaz testi, b-galaktozidaz testi; 2. tüpte mannitol fermentasyonu, hareketlilik; 3. tüpte ise üreaz testi, indol testi, triptofan deaminaz testi yapılmaktadır. Enstitü testlere sodyum malonat deneyi, tartaratların, mukatın ve sodyum sitratın fermentasyonu testleri ile ornitin dekarboksilaz, arjinin dihidrolaz ve lisin dekarboksilaz testlerinin de yapılmasını ve en sonra serolojik testler ile salmonellanın doğrulanmasını önermektedir. İdentifikasyonda bir başka yaklaşım ise biyokimyasal testlerin hazır kitlerde yapılmasıdır. API, BBL gibi birçok ticari firma tarafından pazarlanan bu kitler özellikle plate okuyucuları ile geniş bir kullanım bulmaktadırlar. 04. Salmonella Kontrolünde Hızlı Kültürel Yöntemler 04.01. Membran Filitrasyon Tekniği Salmonella 'nın hızlı bir şekilde tespitine yönelik çalışmalar arasında membran filtrasyon teknikleri de yer almaktadır. Bunlardan hızlı, duyarlı nitroselüloz membran filitre tekniği tavuk derisine bulaşmış olan Salmonella 'ları tespit etmek için geliştirilmiştir. Membran, Ksiloz Lisin Deoksiçolat Agar üzerinde 37 o C 'da 18 saat inkübe edilmiştir. Beyaz renkli membran üzerinde siyah koloni oluşumu Salmonella'lar için olası pozitif sonuç olarak göz önüne alınmıştır. Daha sonra membran üzerinde kolonilerin immunolojik olarak boyanması Salmonella varlığını veya yokluğunu doğrulamak için kullanılmıştır. Bu teknik, 24 saatten daha az zamanda tavuk derisindeki Salmonella kontaminasyonunu tanımlamak için kullanılabilmektedir. 1985 yılında hidrofobik grid membran filtre (HGMF) yöntemi bazı gıdalardan Salmonella 'ların hızlı bir şekilde tespiti için AOAC tarafından resmi yöntem olarak kabul edilmiştir. Bu yöntemin uygulanabilirliği, çikolata, karkas, yağsız süt tozu, yumurta tozu, peynir tozu ve tane karabiber ile sınırlanmıştır. 30 laboratuvar arasında bir ortak çalışma yürütülerek gelenek-sel kültürel metot ile geliştirilmiş HGMF yönteminin etkinliği karşılaştırılmıştır. Bu çalışma 6 gıda ürününü içermektedir. 5 ürün belirli Salmonella serotiplerinin düşük düzeydeki konsantrasyonu ile aşılanmıştır. BAM/AOAC metodu ile 11 sahte negatif sonuç elde edilmiş, geliştirilmiş HGMF ile ise 18 sahte sonuç elde edilmiştir. Membran filitrasyon tekniği selektif zenginleştirme aşamasını atlayarak analize 6-18 saat kazandırır. Hızlı bir analiz yöntemi olmakla beraber diğer hızlı yöntemlerden daha uzun süre alır. 04.02. Oxoid Hızlı Salmonella Kontrolü 9
Salmonella 'nın hızlı bir şekilde tespitine yönelik olarak hareketliliğe dayanan test kitleri geliştirilmiştir. Test alt bölümlerinde, farklı dehidre zenginleştirme ortamlarını ve üst kısımda dehidre selektif ortamları bulunan iki tüp içeren kültür kabından oluşmaktadır. Ortam steril destile su ile rehidre edilir ve salmonella elektif ortam kültür kaplarına ilave edilir. Ayrıca kültür kaplarına novobiocin ilavesi söz konusudur. Kültür kabı aşılandıktan sonra (1 ml önzenginleştirme kültürü ile) 41 o C 'de 24 saat inkübe edilir ve her tüpün üst kısmındaki ortam Salmonella 'nın varlığında renk değişimi açısından incelenir. Pozitif tüpler lateks aglütinasyon testi kullanılarak Salmonella için daha ileri olarak test edilir. Salmonella 'lar aktif bir şekilde tüplerin alt kısmındaki selektif ortamdan üst kısımlardaki indikatör ortama doğru hareket eder. İndikatör ortamda meydana gelen renk değişimi pozitif reaksiyona işaret eder. Metodun performansı, geniş ölçüde kontamine olmuş gıdalara karşı 5 ülkede 9 gıda mikrobiyolojisi laboratuvarında bağımsız olarak test edilmiştir. Bütün muhtemel Salmonella 'lar standart testler kullanılarak tanımlanmıştır. 04.03. Modifiye Yarıkatı RV (MSRV) Besiyeri Kullanımı Bu yöntem ilk kez De Smetz ve ark. tarafından ortaya konulmuş ve ucuzluğu ile kolay kullanımı nedeniyle kısa zamanda popüler olmuştur. Metodun prensibi modifiye edilmiş yarıkatı RV ortamında Salmonellanın hareketidir. Tüm serolojik doğrulama da dahil olmak üzere analiz 48 saat sürer. Bu sürenin ilk 20 saati önzenginleştirme, 8 saati Tetratiyonate Brilliant Green Broth 'da selektif zenginleştirme ve son 16 saati MSRV 'de hareketin izlenmesidir. Hareketsiz suşların varlığı açısından bu yöntem çok yaygın kullanım bulamamıştır. 05. Kondüktans Yöntemiyle Hızlı Salmonella Analizi Bakteriyel gelişmenin kondüktans ölçümü ile belirlenmesindeki prensip ilk kez 1978 yılında Richards tarafından açıklanmıştır. Bu yöntemin Salmonella kontrolünde kullanılabilmesi için başta selektif besiyeri olmak üzere pek çok çalışma yapılmış, analizi basitleştirecek cihazlar geliştirilmiştir. Bu yöntem ile önzenginleştirme sonrasında 6-8 saat sonra Salmonella varlığı gösterilebilmektedir. Kondüktans yönteminde çeşitli fajlar da kullanılmaktadır. Kondüktans yöntemi çabukluk ve doğruluk açısından genel olarak kabul görmüş olmakla beraber yüksek analiz maliyeti rutin kullanımı kısıtlamaktadır. 06. DNA ve İmmunoassay Esaslı Salmonella Analizi Salmonellanın gıda mikrobiyolojisindeki önemi çok iyi bilinmekte ve izolasyon süresinin kısaltılması ile daha duyarlı yeni tekniklerin geliştirilmesi üzerinde yoğun araştırmalar yapılmaktadır. Kültürel metotlar ile yapılan Salmonella izolasyonunda son çalışmalar önzenginleştirme veya zenginleştirme aşamasını kaldırmanın sakıncalı olduğunu ve inkübasyon süresinde yapılan kısaltmaların izolasyon oranlarını düşürdüğünü ortaya koymuştur. Gıdalarda Salmonella izolasyonunda uygulanan standart kültürel metot zahmetlidir ve kontaminasyon varlığının ilk verisini almak için minimum düzeyde 4 gün gerektirir. Hammaddenin depolama ekonomisi ve işlem görmüş gıdaların mikrobiyolojik muayenesi açısından daha hızlı ve geçerli metotlara gereksinmesi vardır. Enzyme Linked İmmunosorbent 10
teknikleri ve serolojik teknikleri içeren metot kısalığına yönelik son girişimler genellikle selektif zenginleştirme kültürlerinde odaklanmıştır. Bu teknikler ile, standart kültürel metotta olası sonuçları elde etmek için gerekli zaman 1 gün azalmıştır. Ayrıca gıdalarda ve yemlerde salmonellanın hızlı tespiti üniversiteler, gıda endüstrisi ve yönetimdeki düzenleyici mekanizmalar için araştırmaların temel konusu olmuştur. Hızlı Salmonella tespitinin kullanışlılığına yönelik avantajlar arasında gıda endüstrisi için depo masraflarının azaltılması, kontaminasyon problemine hızlı bir şekilde yanıt verilmesi, test edilen ve Salmonella bulunmadığı saptanan dayanıksız gıda katkıları ve çiğ etin satın alınma olanağı yer almaktadır. Son 30 yıl boyunca yapılan girişimler gıdalarda ve gıda ürünlerinin incelenmesinde salmonellanın hızla tespitine yöneliktir. Bu metotlardan Fluorescent Antibody (FA) tekniği salmonellanın olası tespiti için resmi metot olarak uygun bulunmuştur. Resmi olarak kabulüne karşın, FA tekniği gıda endüstrisi tarafından yaygın olarak kabul edilmemiştir. Sahte pozitif sonuçlar, FA pozitif numunelerin kültürel metot ile doğrulanma gereksinmesi, pahalı araçlara ihtiyacı FA tekniğinin temel dezavantajları olarak yaygın şekilde bahsedilmiştir. Ayrıca fluoresans için her numunenin birkaç mikroskobik alanının incelenmesinde tedium içermesi ve bakteri hücrelerinin fluoresans intensitesi ile ilgili problemler FA tekniğinin endüstride yaygın kabulünün eksikliğine katkıda bulunmuştur. Enzyme immunoassay (EIA) gıdalarda ve yemlerde salmonellanın rutin tespiti için basit, hızlı ve güvenilir bir metottur. Salmonella serotiplerinin genel epitopları ile spesifik reaksiyon veren monoklonal antiserumların tanıtımı, fluorojenik substratların tanıtımı ve sonuçların miktarını belirlemek için büyük hassasiyet ve uygun alet ekipman gıda endüstrisi tarafından kullanım için bu metodun potansiyelini artırmıştır. Bu metot yüksek derecede otomasyonu da sağlamaktadır. Selektif zenginleştirmeden sonra Salmonella tespiti için immunoassaylar kullanıldığında geleneksel metodun üzerinde zamandan, materyalden ve efordan dikkate değer ölçüde kazanç sağlanmıştır. Ayrıca immunoassaylar fazla sayıdaki numunelerin rutin analizleri için güven vermiştir ve analizler aynı günde yapılabilmiştir. Kek karışımı ve çiğ karides ile yapılan bir çalışmada kültürel metot ve sonuçları doğrulanan EIA arasında fikir birliğinin eksikliği dikkate değer bulunmuştur. 11 adet kek karışımı örneği salmonella (+) olarak teşhis edilmiştir ve sonuçları EIA tarafından doğrulanmış, fakat BAM/AOAC (Bacteriological Analytical Manual/Association of Offical Analytical Chemistry) tarafından negatif bulunmuştur. Diğer taraftan BAM/AOAC tarafından pozitif bulunan 6 karides numunesi EIA tarafından teşhis edilememiştir ve 7 numune kültürel olarak doğrulanamamış, EIA ve BAM/AOAC arasında önemli farklılık oluşmuştur. Fakat bu durum negatif sonuçlardan değil de, pozitif olarak doğrulanamayan sonuçlardan kaynaklanmaktadır. Ibrahim ve arkadaşlarının araştırma çalışmalarının bir kısmı genellikle radioizotopları kullanmayan analizlerin kullanıldığı salmonellanın hızlı tespiti ile ilgilidir. Edwards ve Hilderbrand esas izolasyon ortamında Salmonella ve Shigella kolonilerinin olası identifikasyonu için bir metot tanımlamıştır. Bu metot hassas hale getirilmiş hassas protein A preparatı ile ticari polyvalent Salmonella H antiserumu ilavesi ile kolaylaştırılmıştır. Hassas hale getirilmiş protein A partiküllerinin aglutinasyonu pozitif sonuca işaret etmektedir. Araştırmacılar çeşitli mikroorganizmalar ile metodu test etmişlerdir. Gerekli hassasiyete sahip test reaktifleri için yüksek titreli antiserumun önemli olduğu not edilmiştir. 18 adet et ve süt ürünü numunesi kullanılarak kültürel metot ve analizler arasında tam bir fikir birliği olduğu rapor edilmiştir. 11
Enzyme immunometric assay 'in etkinliği 82 gıda örneğinde Salmonella açısından standart kültürel metoda karşı araştırılmıştır. Standart kültürel metot sonuçlarının Mannitol Selenit Sistin Broth'da selektif zenginleştirmeden sonra uygulanan Enzyme Immunometric Assay (EIMA) ile sağlanan sonuçlar ile tamamen uyum içerisinde olduğu gösterilmiştir. Bu örneklerde, her iki metot ile 24 Salmonella pozitif numune tanımlanmıştır. Buna karşın önzenginleştirmeden sonra uygulanan EIMA ile sadece 7 Salmonella pozitif numune tespit edilmiştir ve önzenginleştirme kültürünün testleri açıkça güvenilmez bulunmuştur. EIA metodu doğal olarak kontamine olmuş yemlerde Salmonella 'nın tespiti için geleneksel kültürel metoda karşı değerlendirilmiştir. Test edilen 50 numuneden 30 'unda her iki metot ile Salmonella pozitif bulunmuştur. Sadece 1 numune EIA ile pozitif bulunmuştur. EIA hatalı negatif sonuç vermemiştir. Salmonella gelişmekte olan dünyanın bir bölümünde gıda kaynaklı hastalıkların başlıca nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir. Bu nedenden dolayı Salmonella varlığı açısından gıdaların artan gözetimi söz konusudur. Uzun yıllardan beri gıdalarda ve hayvan yemlerinde Salmonella tespiti için daha hızlı ve ekonomik metotlara artan bir ilgi olmuştur. Enzyme immunosorbant assay kitleri bu amaç için geliştirilmiştir. Bir çalışmada salmonella tespitinde iki adet ticari olarak hazır enzyme immunosorbant assay kiti Salmonella "Bio Enza BEED Screen Kit" ile "ELISA Screening kit" ve standart izolasyon metodu karşılaştırılmıştır. İncelenen 45 numuneden 35 'i, Bio-Enza Beed Screen kit ile, 28 adedi ELISA Screening Kit ile ve 32 adeti standart izolasyon metodu ile pozitif sonuç vermiştir. EIA testleri, rekabetçi flora etkisine benzer hassasiyet göstermesine rağmen, selektif zenginleştirmeden sonra uygulanması ile geleneksel Salmonella izolasyon tekniğine bir alternatif olarak ortaya çıkmaktadır. Salmonella Bio-Enzabeed Screening kit, magnetik kuvvet kullanarak, bir reaksiyon karışımından diğerine kolayca hareket edebilen demir metal boncukların yüzeyine tutturulmuş MOPC 467 ve 6H4 2 monoklonal antiserumlar ile ELISA testi esasına dayanır. Test peroksidaz ile işaretli Salmonella konjugantları aracılığı ile boncukları kaplayan antiserumlara Salmonella 'nın yükseltgenmesini tespit eder. İlk denemelerde test edilen gıdaların çoğunluğu yapay olarak kontamine edilmiştir. Bu çalışma sonucunda olumlu sonuçlar elde edilmiştir. Bio-EnzaBeed immunoassay kullanımı, süt endüstrisinden elde edilen pratik numuneler için önerilmekmektedir. Bu durumun esas nedeni negatif sonuçlardır. Ayrıca oldukça fazla sayıda sahte pozitif reaksiyon elde edilmiştir. Bu sonuçlara Citrobacter freundii neden olmuştur. Üreticiler, pozitif Bio-Enzabeed sonuçlarının doğrulanmak zorunda olduğu konusu üzerinde birleşmiştir. Bio Kontrol 1-2 Test R (Bio control Systems Inc., Bothell, WA) gıdalarda bulunan hareketli Salmonella 'lar için bir immunodifüzyon tarama metodudur. Bio Kontrol 1-2 Test R iki bölmesi olan plastik atılabilir bir materyal ile yürütülmektedir. Materyalin bir bölmesi zenginleştirme örneği ile aşılanmaktadır. Buna karşın, ikinci bölmede bulunan yarı katı ortamın yüzeyine bir damla antiserum ilave edilmekte ve ünite inkübe edilmektedir. 14 saatlik inkübasyon bantının oluşumunun gözlenmesi pozitif sonuca işaret etmektedir. GENE TRAK Salmonella Assay (GENE TRAK Systems, Inc., Framingham, MA) 32 p ile işaretlenmiş DNA problarını kullanabilen hibridizasyon metodudur. 12
Salmonella tek ise sandviç tip enzyme immunoassayde peroksidaz ile konjuge olmuş poliklonal antiserumları ve mikrotitrasyon kuyucuklarının duvarlarına kodlanmış 6H4 ve MOPC 467 şeklinde dizayn edilmiş iki monoklonal antiserumu kullanmaktadır. Yukarıda genel prensiplerinden bahsedilen 3 kit kullanılarak bir çalışma yapılmış ve kültürel metot ile karşılaştırılmıştır. Bu çalışmada toplam 250 gıda örneği incelenmiş, Salmonella (+) bulunan 131 örneğin 120 'si (%91,6) geleneksel kültürel metot ile, 128 'i (% 97,7) Bio Kontrol 1-2 Testi ile 119'u (% 90,8) GENE-TRAK ve 120'si (%91,6) Salmonella TEK ile tespit edilmiştir. Testlerde sahte pozitif reaksiyon dağılımı çeşitlilik göstermiş, Salmonella TEK 108, GENE-TRAK 10 ve BIO KONTROL 1-2 Test 5 adet belirlenemeyen reaksiyon vermiştir. Mikrotitrasyon plağı, antibody-capture enzyme linked immunosorbant assay, Salmonella typhimurium 'un tespiti için geliştirilmiştir. Bunlar Salmonella olmayan türler ile karşı reaksiyon göstermeyen monoklonal belirleyici antiserumu kullanırlar. Enzyme linked immunosorbant assay 'den önce sadece bir tek kültürel adım kullanılarak gıdalardaki düşük sayıdaki hücre 19 saat içerisinde tespit edilmiştir. Salmonella olmayan rekabetçi organizmalar 10 6 :1 oranında olsa bile S. typhimurium tespiti başarılmıştır. Assay-antiserum teknolojisi ile Salmonella suşları 1 gün içinde test edilerek hızlı uygulanabilme kolaylığı göstermiştir. Bu metotlar ile daha fazla sayıda numunenin test edilmesi sağlanmıştır. Dezavantajları ise bir dereceye kadar sahte negatif ve sahte pozitif sonuç vermeleridir. TECRA TM Vioval immunoassay ve standart kültürel metodun Salmonella tespiti açısından karşılaştırılmasında toplam 173 numune incelenmiştir. Bunların 75 adedi yapay olarak düşük ve yüksek düzeyde 5 genel Salmonella serotipi ile aşılanmıştır. Aşılanmamış 98 örneğin 28 adedinin doğal olarak Salmonella içerdiği saptanmıştır. Geleneksel kültürel metottan elde edilen sonuçlar bu çalışmadan elde edilenlerle yakın bir uyum içerisindedir. Sahte negatif sonuçlar elde edilmemiştir ve sahte 4 pozitif sonuç düzeyi ise oldukça düşüktür. Aşılanmamış numunelerde sahte pozitif reaksiyonlar iki grup gıdada elde edilmiştir. Bunların her ikisinin de yüksek düzeyde rekabetçi floraya sahip olduğu saptanmıştır. TECRA TM assay uygulamasının basit olduğu ve kültürel metot tarafından gereksinilen 5 gün yerine 3 çalışma günü içerisinde sonucun elde edilebildiği gösterilmiştir. Salmonella TEK Screen Kit kullanılarak micro ELISA 45 adet doğal olarak kontamine olmuş gıda örneğinde, yapay olarak kontamine edilmiş gıda ve buna ek olarak saf kültürlerde Salmonella türlerinin tespiti için test edilmiştir. Yapay olarak kontamine edilen kıyma numuneleri Tamponlanmış Peptonlu Suda zenginleştirilmiş, inkübasyondan sonra farklı selektif sıvı zenginleştirme besiyerlerinde test edilmiştir. MICRO ELISA optik yoğunluğunun farklı besiyerlerinde zenginleştirme ve izolasyon sonunda çok benzer olduğu görülmüştür. Farklı gıdalarda Salmonella türlerini tespit etmede kullanılan bir başka hızlı metot, Salmosyt broth ile zenginleştirmedir. Bu durum toplam analiz süresini 34 saate indirgemiştir. Salmonella TEK kitlerinin düşük konsantrasyonda mevcut olduğunda bile 1-5 adet/25 g Salmonella tespiti için ümit verici olduğu saptanmıştır. Anti-salmonella antiserumlarının, özellikle diğer gram negatif bakterilerle karşı reaksiyonunun sıfır olduğu belirtilmiştir. DNA hibridizasyon (DNAH) assay oluşturulmadan önce kültür adımının gerekliliğini içeriyor ise DNAH metodu 48 saat içerisinde sonuç sağlamaktadır. Testin verimliliği, selektif ve önzenginleştirmenin her ikisi de kullanılarak test edilmiştir. Önzenginleştirme kültüründen Salmonella tespiti güvenilir olmamıştır. Buna karşın selektif zenginleştirme adımının işlenmesi Salmonella tespitinde kültürel metot kadar verimli olmuştur. 13
Gıdalarda Salmonella tespiti açısından 11 laboratuvarda DNA hibridizasyon metodunu değerlendirmek için ortak bir çalışma yapılmıştır. Bu çalışmada 6 farklı gıda kullanılarak DNA hibridizasyon metodu standart kültür metodu ile karşılaştırılmıştır. Hindi dışındaki her bir gıda grubunda doğal olarak kontamine, aşılanmış ve aşılanmamış örnekler analize alınmıştır. Sonuçlara göre hindilerde Salmonella tespitinde DNAH metodu % 5 olasılık düzeyinde standart kültür metodundan önemli derecede iyi bulunmuştur. Diğer 5 gıda tipinde önemli bir farklılık kaydedilmemiştir. Ayrıca ticari hazır (GENE-TRAK R ) DNA hibridizasyon testi, doğal olarak kontamine olmuş inek karkaslarında Salmonella tespiti açısından kültürel metot ile karşılaştırılmıştır. Kültürel metot ile pozitif bulunan hemen hemen bütün örnekler DNAH metodu ile de pozitif sonuç vermiştir. DNAH metodu ile sahte pozitif sonuç % 3,7 olarak saptanmış, ancak sahte negatif sonuç elde edilmemiştir. DNAH metodu ile yapılan diğer bir çalışmada geleneksel mikrobiyoloji testleri geniş sayıdaki rekabetçi organizma göstermesine rağmen herhangi bir sahte pozitif sonuç elde edilmemiştir. İşaretleme başladıktan sonra 3 günden daha az zamanda sonuçlar elde edilmiştir. Böylece geleneksel metotlara göre birkaç gün kazanılmıştır. 14