EMBRĐYO TRANSFERĐ Dr. Numan Akyol Lalahan Hayvancılık k Merkez Araştırma rma Enstitüsü lalahanakyol 1
lalahanakyol 2
EMBRĐYO TRANSFERĐNĐN AVANTAJLARI Normalden 20 kat daha fazla sayıda yavru Genetiğin %100 ünün kontrolü Projeni test çalışmalarında etkinlik Canlı hayvan nakil zorluğunun ortadan kalkması Taşıyıcı annenin antikorlarından faydalanma Verim yönünün değiştirilebilmesi Etkin gen kaynağı muhafazası imkanı lalahanakyol 3
EMBRĐYO TRANSFERĐNĐN AŞAMALARI SÜPEROVULASYON ÖSTRUS SĐNKRONĐZASYONU UTERUS YIKAMASI EMBRĐYO DEĞERLENDĐRME VE SINIFLANDIRMASI EMBRĐYO DONDURULMASI VEYA TAZE TRANSFERĐ lalahanakyol 4
Östrus Siklusunda hormon profilleri (Sığır) östrojen progesteron LH FSH 70 60 hormon konsantrasyonu 50 40 30 20 10 0 18 19 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0 1 2 3 siklus günleri lalahanakyol 5
Pro-östrus 18-21.siklus günleri Gerileyen bir CL GnRH etkisi ile FSH lalahanakyol 6
Östrus 12-18saat süreli Gerilemiş bir CL Fluktuan bir Graaf Follikülü Östrojenik etki lalahanakyol 7
Met-östrus Östrus bitiminden sonraki 3gün Gelişmeye aday bir CL Kanlı akıntı lalahanakyol 8
Di-östrus Siklusun en uzun dönemi 10-14 gün Olgun bir CL Uterus gevşek lalahanakyol 9
SÜPEROVULASYON lalahanakyol 10
SÜPEROVULASYON Fol Fol Fol 7.5MhZ Linear Prob Fol Fol Fol lalahanakyol 11
SÜPEROVULASYON Fl Fl Fl Fl Fl Fl Fl 5,0MhZ Linear Prob Fl Fl Fl Fl Fl lalahanakyol 12
SÜPEROVULASYON 5,0MhZ Linear Prob lalahanakyol 13
SÜPEROVULASYON CL CL 5,0MhZ Linear Prob CL CL CL lalahanakyol 14
SÜPEROVULASYON 5,0MhZ Linear Prob lalahanakyol 15
SÜPEROVULASYON CL CL CL 5,0MhZ Linear Prob CL CL lalahanakyol 16
lalahanakyol 17
UTERUS YIKAMASI lalahanakyol 18
Embriyo Değerlendirilmesi ve SAFHA sınıflandırılması 16 HÜCRE MORULA...6 GÜN KOMPAKT MORULA...7 ERKEN BLASTOSĐST...7 BLASTOSĐST...8 GENĐŞLEMĐŞ BLASTOSĐST...8 HATCHING BLASTOSĐST HATCHED BLASTOSĐST KALĐTE MÜKEMMEL - ĐYĐ VASAT ZAYIF DEJENERE UFO lalahanakyol 19
lalahanakyol 20
Embriyo kalite sınıflandırmasında kriterler (G.M.Lindner et al.,1983) Mükemmel : Đdeal embriyodur, küresel, simetrik tarzda, renk ve yapısal açıdan uniformite gösterir. Đyi Vasat Zayıf : Önemsiz birkaç blastomer düzensizliği ve kopmaları, düzensiz bir şekil, gözlenebilen birkaç vezikül varlığı. : Vezikül oluşumu ve ayrılmış birkaç blastomer gibi gözlenen bazı problemlerin varlığı, %10-30 arasında tespit edilen dejenerasyon ve düzensizlik. : Ana embriyo kısmında gözlenen ayrılmalar, bir miktar dejenere hücre, çok miktarda vezkül oluşumu, %30-50 arasında düzensizlik ve dejenerasyon. lalahanakyol 21
lalahanakyol 22
lalahanakyol 23
lalahanakyol 24
lalahanakyol 25
lalahanakyol 26
lalahanakyol 27
lalahanakyol 28
lalahanakyol 29
lalahanakyol 30
lalahanakyol 31
lalahanakyol 32
lalahanakyol 33
lalahanakyol 34
lalahanakyol 35
ÜLKEMiZDE YAPILAN ilk EMBRĐYO TRANSFERĐ ÇALIŞMALARI 1981 TAVŞANLARDA (Kılıçoğlu ve Tekeli) 1983 FARELERDE (Ünal) 1984 KOYUNLARDA (Kılıçoğlu ve ark.) 1986 ĐNEKLERDE (Đleri ve Sayın) 1989 Đneklere dond. emb. Trans. (Sungur ve ark.) 1997 ANKARA KEÇĐLERĐNDE (Kılıçarslan ve Şenünver) 1997 KISRAKLARDA (Ekici) 2001 %70 GEBELĐK (Akyol ve ark.) 2005 Ülkemizin ilk IVF buzağısı (Akyol ve ark.) 2005 Ülkemizin ilk direkt transfer ve vitrifiye embriyo gebelikleri (Kızıl ve ark.) 2005 Ülkemizde ilk OPU çalışması (Akyol ve ark.) lalahanakyol 36
ENSTĐTÜMÜZDE YAPILAN EMBRĐYO TRANSFERĐ ÇALIŞMALARI 1989 yılında 64 baş Đsviçre Esmeri düveye dondurulmuş ithal Brangus embriyosu nakli yapıldı ve %32.8 gebelik elde edildi (Sungur ve ark. 1989) 1991 yılında taze nakilden %22.2 gebelik elde edildi (Sungur ve ark. 1991) 1994 yılında 5 baş vericiden 24 adet embriyo alınıp, 17 embriyo dondurulmuş ve 14 donmuş-çözünmüş embriyo naklinden %28.5 gebelik elde edilmiştir. (Sungur, 1994) 2001 yılında 20 uterus yıkaması yapılmış 70 embriyo bulunmuş 10 adet taze nakilden 7 gebelik elde edilmiştir. (Akyol ve ark. 2004) lalahanakyol 37
Kısa süreli muhafaza & Embriyo muameleleri lalahanakyol 38
Embriyo dondurulmasıyla ilgili gelişmeler Yıl Araştırmacı Sığırlardaki ilk başarılı çalışma 1973 Wilmut & Rowson Freezing of Embryo (DMSO) 1979 Bilton & Moore Freezing of Embryo (Glycerol) 1982 Renard et al. One Step Straw Method 1983 Lehn-Jensen et al. Freezing of Bisected Embryo 1987 Massip et al. Vitrifrication lalahanakyol 39
Kısa süreli embriyo muhafazası D-PBS + %10-20 Buzağı Serumu * Embriyo elde edildikten sonra mümkün olduğunca çabuk taşıyıcıya transfer edilmelidir. * Transfer mediumu olarak kullanılabilir. TCM199 + 10-20% FCS + 0.1mM beta-mercaptoethanol * Đki gün embriyo kültürü yapılabilir (inkubatör şartlarında) lalahanakyol 40
EMBRĐYO ĐLE ÇALIŞIRKEN... a. Steril teknik ve uygulamalar b. Kontaminasyon riski c. Isı değişimleri d. Ultravioleye maruz kalma e. Medium lalahanakyol 41
Embriyonun Transferi * Cerrahi metot * Cerrahi olmayan metot Serviks kanalından By-pass (Sugie s method) lalahanakyol 42
lalahanakyol 43
lalahanakyol 44
EMBRĐYO TRANSFERĐNDE BAŞARIYI ETKĐLEYEN BAZI FAKTÖRLER EmbrĐyo kalitesi Transfer tekniği Hijyenik kurallara uygunluk CL tarafına transfer Donor ve taşıyıcı arasındaki östrus sinkronizasyonu farkı Taşıyıcının durumu (Đnek Düve) Taşıyıcının beslenme ve çevresel koşulları lalahanakyol 45
Embriyo CL bulunan tarafa transfer edilmeli (ipsilateral transfer) Cerrahi olmayan metotda transfer yerinin derinliğinden ziyade uterus endometriumuna bir zarar verip vermemek kanusu daha önemli Cerrahi olmayan Cerrahi CL lalahanakyol 46
KATETERĐN SERVĐKSTEN GĐRĐŞĐ 1 lalahanakyol 47
lalahanakyol 48 2
Memeli embriyolarının ilk başarılı dondurma çalışmaları Tür Araştırmacı Yıl Fare Whittingham ve ark. 1972 Rat Whittingham 1975 Tavşan Bank ve Mourer 1974 Sığır Wilmut ve Rowson 1973 At Yamamoto ve ark. 1982 Koyun Willadsen ve ark. 1974 Keçi Bilton ve Moore 1976 Đnsan Trounson ve ark. 1982 lalahanakyol 49
Sığır embriyo dondurulmasının tarihçesi Author Year Cryoprotectant Notes Wilmut and Rowson 1973 DMSO First calves Leibo et al. 1982 Glycerol One step dilution method using sucrose Renard et al. 1982 Glycerol One step dilution method using sucrose Leibo 1983 Glycerol One step straw method 1984 Suzuki et al. 1983 Glycerol One step straw method 1985 Willadsen et al. 1978 DMSO Direct transfer Massip and Van der Zwalmen 1984 Glycero + sucrose Direct transfer Massip et al. 1987 Glycero + sucrose Direct transfer Suzuki et al. 1990 Propylene Direct transfer glycol(sucrose) Dochi et al. 1991 Ethylene glycol Direct transfer Voelkel and Hu 1992 Ethylene glycol Direct transfer lalahanakyol 50
EMBRĐYO DONDURULMASI Klasik embriyo dondurulması Buz kristalleri oluşumu Programlı soğutma için dondurma cihazı gerekli Vitrifikasyon Buz kristali oluşmaz Embriyo sıvı azot içerisine direkt olarak alınır, dondurma cihazı gerekmez lalahanakyol 51
Dondurma Metotları Aşamalı metot %10 (1.36M) Gliserol (Bilton & Moore, 1979) Direkt Transfer metodu %10 (1.8M) Etilen glikol (Dochi et al, 1991) lalahanakyol 52
Embriyo dondurulmasının önemli aşamaları (Embriyo toplanması) Kriyoprotektanlarla ekilibrasyon Soğutma & Seeding LN2 Çözündürme Kriyoprotektanlardan arındırma Canlılık kontrolü (Transfer) Direkt transferde gerekmez lalahanakyol 53
lalahanakyol 54
S e e d i n g lalahanakyol 55
VĐTRĐFĐKASYON NEDĐR? Vitrifikasyon buz kristalleri oluşmadan, embriyonun bulunduğu ortamı cam şeklinde katılaştırmak anlamındadır. Bu amaçla ekstrem bir viskozite (kriyoprotektan yoğunluğu) ve soğutma süresi kullanılır. lalahanakyol 56
Çeşitli Vitrifikasyon Solusyonları Araştırmacı Kriyoprotektan Hayvan (yıl) (Aşama) Rall,WF DMSO %20.5 (w/v) Fare & Fahy,GM Asetamid %10.5 (w/v) (8-Hücre) (1985) PG %10 (w/v) PEG %6 (w/v) Scheffen,B. PG %25 (v/v) Fare et al (1986) GL %25 (v/v) (KM, EB) Massip,A. PG %25 (v/v) Sığır et al (1987) GL %25 (v/v) (KM, EB) Kasai,M. EG %40 (v/v) Fare et al(1990) Fikol %18 (w/v) (M) Sakkaroz 0.3 M Yang, et al GL %25 (v/v) Sığır (1992) EG %25 (v/v) (BL-IVF) lalahanakyol 57
lalahanakyol 58
lalahanakyol 59
lalahanakyol 60
lalahanakyol 61
Embriyo Kültürü lalahanakyol 62
Embriyo Kültürü için Kullanılan Mediumlar Posfat Tampon Solusyonu (PBS) Đnkubatör dışındaph değişimlerinden korunmak için oldukça iyi bir tampon Uzun süreli kültür için uygun değil Bicarbonate buffered media Ham's F10 BMOC-3 Menezo's B2 TCM-199 38.5 de %5 CO2 inkubasyon lalahanakyol 63
Mikrodroplar içerisinde ve inkubatörde kültür için... lalahanakyol 64