Laboratuvar Başarısında Kriyoprezervasyonun Rolü

Transkript

1 Laboratuvar Başarısında Kriyoprezervasyonun Rolü Ayşen Durmaz, PhD Ege Üniversitesi Aile Planlaması İnfertilite Araştırma ve Uygulama Merkezi

2 Tanım Kriyoprezervasyon; hücrelerin ve dokuların sıfır derecenin altındaki ısılara kadar soğutularak, bütün biyolojik aktivitelerinin durdurulması ve gelecekte kullanılması amacıyla saklanmasını ifade eder. (ASRM 2012)

3 Tarihçe M.Ö soğuğun medikal alanda kullanımı Spallanzani L. kar içerisinde dondurduğu spermleri çözdükten sonra hareketlilik gözlemiştir. İlk kriyoprezervasyon denemeleri başarısız! 1940 yılında gliserolün sperm hücresini kriyo hasarına karşı koruduğu keşfedilmiştir yılında Bunge ve ark. dondurulmuş-çözülmüş insan sperminden elde edilen ilk canlı doğumu bildirmişlerdir.

4 Tarihçe 1970 yılında propanediol, EG, DMSO keşfi 1972 programlanabilen dondurucuların kullanıldığı yavaş dondurma tekniğinin geliştirilmesi 1984 dondurulmuş-çözülmüş insan embriyosundan elde edilen ilk canlı doğum 1986 dondurulmuş-çözülmüş insan oositinden elde edilen ilk canlı doğum

5 IVF Laboratuvarında Kriyoprezervasyon Gamet (oosit ve sperm) Testis ve over dokusu Embriyo (2PN, Klivaj, Blastosist)

6 Laboratuvar Başarısında Kriyoprezervasyonun Rolü

7 Laboratuvar Başarısı Kriyoprezervasyon Başarısı

8 Laboratuvar Başarısı Kullanılan indüksiyon ajanlarına Mikromanipulasyon tekniğine Kültür medyumunun içeriğine Kültür ortamının ph, ısı ve osmolaritesine Sterilite

9 Kriyoprezervasyon Başarısı Gamet, zigot, ve embriyo kalitesine Kullanılan malzemelere Kullanılan yönteme Yöntemi uygulayan kişinin tekniğine ve becerisine bağlıdır. Sterilite

10 Kriyoprezervasyon Hasarı Hücre içi/dışı buz kristali oluşumu Kimyasal toksisite Osmotik şişme/büzüşme Zona hasarı Mayotik spindle hasarına ve dolayısıyla da anöploidilere neden olmaktadır.

11 Kriyoprezervasyon Yöntemleri Yavaş dondurma Şok dondurma (ultra-rapid) Vitrifikasyon

12 Yavaş Dondurma CPA kons. düşük (1M Sukroz; 1,5M 1,2 propanediol) -7 o C de seeding işlemi ile buz oluşumu başlatılır. Dondurma hızı yavaş (0,3-0,5 o C / dk.) İşlem ~ 3 saat sürmektedir. Dezavantajları Uzun sürmesi Pahalı olması Buz kristali oluşturması

13 Şok Dondurma Yavaş dondurma ile vitrifikasyon arasında bir yöntem Yavaş dondurmaya göre daha hızlı ve pahalı ekipmana gereksinim yok Yavaş dondurmaya göre CPA kons. yüksek Vitrifikasyona göre CPA kons. düşük

14 Vitrifikasyon Herhangi bir sıvının yoğunluğunun arttırılarak buz kristali oluşmaksızın camsı hale getirilmesi Sıvı haldeki madde Buz kristali oluşmadan camlaşma

15 Vitrifikasyon CPA konsantrasyonu yüksek (%15 EG, %15 DMSO) Soğutma hızı yüksek (15,000-30,000 o C/dk.) Soğutma hızı ne kadar arttırılabilirse CPA kons. İşlem süresi kısa (10-15 dk.) Buz kristali oluşmaz Dondurma cihazına gereksinim yok. Dezavantajı Yüksek CPA kons. hücreler için toksiktir!!!

16 Hangi Yöntem? 1) Vitrifikasyon 2) Yavaş dondurma 3) Şok dondurma

17 Hangi Yöntem? Vitrifikasyon-Yavaş Şok-Yavaş dondurma Klinik gebelik oranı OR= 1,55 %95 CI=1,03-2,32 OR= 0,35 %95 CI= 0,16-0,76 Devam eden gebelik oranı OR= 1,82 %95 CI=1,04-3,20 OR= 0,37 %95 CI= 0,17 0,81 İmplantasyon oranı OR= 1,49 %95 CI=1,03-2,15 -

18 Yavaş dondurma - Vitrifikasyon Düşük oranda CPA Yüksek oranda CPA Dondurma hızı düşük (0,3-0,5 o C / dk.) Yavaş dehidrasyona bağlı olarak buz kristali oluşumu Dondurma hızı yüksek (15,000-30,000 o C / dk.) Buz kristali oluşmaz İşlem süresi uzun (3 saat) İşlem süresi çok kısa (10-15 dk) Pahalı ekipman Dondurma cihazına ihtiyaç yok

19 Ege Üniversitesi IVF Lab. Sonuçları Siklus sayısı Transfer sayısı Gebe sayısı Gebelik oranı (%) 2010 yavaş , vit , yavaş , vit , yavaş , vit , yavaş , vit ,68

20 Vitirifikasyon Başarısı 1985 Rall ve Fahy fare embriyoları ile gerçekleştirilmiştir. CPA kombinasyonu denenmiş, Çeşitli taşıyıcı sistemler tasarlanmıştır. Dondurma çözme hızı CPA konsantrasyonu

21 Kriyoprotektanlar Hücre içine geçebilen DMSO, EG, PROH, Gliserol Hücre içine geçemeyen (Sakkaritler) Sukroz, Trehaloz Makromoleküller Fikol, PVP, PEG

22 Hücre içi su Kriyoprotektan

23 CPA Seçimi Hücre üzerine olan toksik etkisi Diffüzyon hızı yüksek olan CPA seçilmelidir. En çok kullanılan ve kabul edilen EG dür. Kriyoprotektan toksisitesini azaltmak için iki farklı CPA kombinasyonu kullanılabilir!!! Major CPA kombinasyonu EG/DMSO kombinasyonudur.

24 Hücre içine geçemeyenler Başarılı bir vitrifikasyon için gerekli olan CPA kons. Toksik etkiyi azaltırlar Osmotik etki Çözme işlemleri sırasında osmotik tampon gibi davranarak osmotik şoku engeller. H 2 O Ice Kontrolsüz rehidrasyon sonucu şişme

25 Çözme Solüsyonları 1.0 M Sükroz Çözme Solüsyonu 0.5 M Sükroz Dilüsyon Solüsyonu Sükrozsuz Yıkama Solüsyonu

26 Makromoleküller Fikol, PVP, PEG Vitrifikasyonu kolaylaştırmakta Etki mekanizmaları konusunda farklı yorumlar bulunmaktadır.

27 Soğutma Hızı Örnek hacmi ne kadar az olursa soğutma hızı Vit. solusyonu ne kadar az olursa toksik ve ozmotik etkisi de o kadar azalır. VitMaster sıvı azotun ısısını -205/ -210 kadar düşürür Taşıyıcı sistemlerin ısı iletim hızları farklıdır.

28 Taşıyıcı Sistemler Açık Sistemler Soğutma ve ısıtma oranlarını hızlandırarak hücrelerin vitrifikasyon solüsyonlarında tutulma zamanlarını azaltırlar. Kapalı Sistemler İzolasyon katının bulunması soğutma ve ısıtma oranlarını yavaşlatır.

29 Taşıyıcı Sistemler Açık sistemler Cryotop OPS Flexipet-denuding pipet Hemistraw sistemi Cryoloop Cryoleaf Elektron mikroskop grid Fibre-plug Kapalı sistemler Cryotip High security straw Rapid-I Straw-straw sistemi Cryopet

30 Açık Sistemlerin Dezavantajı Açık sistemlerde oosit/embriyo kaybolma ihtimali Bakteriyel, viral ve fungal kontaminasyon riski Kontaminasyon embriyonun in vitro yaşamını olumsuz yönde etkiler. Lab. da high security straw kullanmaktayız

31 Azot Kontaminasyonu

32 Azot sterilizasyonu

33 Azot Buharında Saklama

34 Oosit Kriyoprezervasyonu Isı değişimlerine ve ekstrasellüler ozmotik basınca karşı oldukça duyarlıdır. Hücre içi sıvı miktarı yüksek CPA kons. ve soğutma hızı yüksek olan vitrifikasyon!! En uygun CPA ise EG dur. Literatürde 900 ün üzerinde doğum Anomali insidansı normal

35

36 İmmatür oosit kriyoprezervasyonu Mayotik iğcik hasarını engellemek için bir alternatif Mayoz bölünme profaz I evresindedir

37 İmmatür oosit vitrifikasyonu immatür oosit cryo + IVM prematüre ovaryan yetmezliği

38 İmmatür oosit vitrifikasyonu

39 İmmatür oosit vitrifikasyonu PCO li hastalardan alınan immatür oositlerin vitrifikasyon yöntemi ile dondurulması sonrasında %90 ında klivaj gördüklerini ancak implantasyon elde edemediklerini açıklamışlardır.

40 Zigot Kriyoprezervasyonu Almanya Danimarka İsveç Avusturya İsviçre İtalya En iyi yöntem vitrifikasyon

41 IVF ICSI IVF/ ICSI sonrası dondurulan 2PN aşamasındaki zigotlarda benzer canlılık ve gebelik oranı bildirilmiştir.

42 Zigot Kriyoprezervasyonu Griesinger ve ark. yaptığı çalışmada dondurulan zigotların doğal sikluslarda çözülerek transfer edildiği çalışmada embriyonun canlılığını sürdürme oranının %77, devam eden gebelik oranının da %36 olduğu bildirilmiştir.

43 Embriyo kriyoprezervasyonu En iyi yöntem vitrifikasyon 8 hücreli embriyolarda canlılık oranı %79,2 Hücre sayısı < 6 olanlarda canlılık oranı %21,1 Canlılık oranı blastomer sayısının artmasıyla artar

44 Embriyo kriyoprezervasyonu Dondurma işlemleri sırasında ZP sertlerşir Transfer öncesi AH uygulanması gebelik ve implantasyon oranlarını arttırır.

45 Blastosist Kriyoprezervasyonu Blastosistlerdeki hücre sayısı fazla Birkaç hücre hasar görse bile embriyonun bütünlüğü bozulmaz En iyi yöntem vitrifikasyon Blastosöl sıvısının boşaltılması başarıyı arttırmaktadır.

46 Artificial Shrinkage Needle used shrinkage Laser pulse shrinkage Mukaida et al., 2006

47 Blastosist Kriyoprezervasyonu Konjenital anomali insidansı normal

48 Saklama Süresi

49 Saklama Süresi Oosit Canlılık, fertilizasyon, klivaj, embriyo kalitesi, implantasyon ve canlı doğum Embriyo Yaşam kapasitesi Gebelik oranları İmplantasyon oranlarına etkisi yoktur.

50 Tekrar dondurma Bir kez çözünmüş embriyoların tekrar dondurulması ile ilgili çok fazla veri olmamasına rağmen Kumasako ve ark. yaptıkları araştırmada tekrar vitrifiye edilmelerinin belirgin bir olumsuzluk yaratmadığını bildirmişlerdir.

51 KOH Kriyoprezervasyon İlişkisi YÜT de başarıyı gösteren en önemli parametrelerden bir tanesi implantasyondur. embriyo kalitesine endometriyal reseptiviteye embriyo-endometriyum arasındaki ilişkiye bağlıdır. YÜT de implantasyon başarısızlıklarının; 3/2 den endometriyum hasarı 3/1 den ise embriyo sorumludur.

52 KOH Kriyoprezervasyon İlişkisi E 2 ve P düzeyleri endometriyum morfolojisi ve biyokimyasını bozar. İmplantasyon Başarısızlığı! Embriyo ile endometriyum arasındaki senkronizasyon bozulur.

53 KOH Kriyoprezervasyon İlişkisi FET de endometriyum doğal ya da doğala yakın dozlarda ilaç kullanılarak hazırlanmaktadır. Bu nedenle FET de endometriyum reseptivitesi fresh siklusa kıyasla daha iyidir.

54 Fresh embriyo vs. FET KOH nun embriyo-endometriyum senkroznizasyonu üzerine olan olumsuz etkisinden kaçınmak için elektif embriyo kriyoprezervasyonun yapılması Bir sonraki siklusta endometriyum reseptivitesinin yüksek olduğu FET nin yapılması YÜT de kümülatif başarıyı arttıracaktır.

55 Çoğul gebeliklerin önlenmesi KOH protokolleri çok oosit çok embriyo Siklusların %60 ında transfer için uygun çok sayıda emb. Embriyo kriyoprezervasyonundaki başarının artması Transfer edilen embriyo sayısının azaltılmakta Çoğul gebelikler önlenebilmektedir.

56 Fertilitenin Korunması Bayanlar Ciddi ovaryan hastalıklar Kistler Over kanserleri Kemoterapi Radyoterapi Baylar Testiküler yetmezlik Ejakülatuvar disfonksiyon Cerrahi girişimler Kemoterapi Radyoterapi

57 SONUÇ Oosit kriyoprezervasyonu yerine Embriyo kriyoprezervasyonu Klivaj aşamasında 8 hücreli embriyo Transfer öncesi AH yapılması Hücre sayısı fazla olduğundan blastosist dondurma daha avantajlı Blastosöl sıvısının boşaltılması Fresh embriyo transferi yerine FET yapılması

58 TEŞEKKÜRLER

59 Sperm kriyoprezervasyonu Sıvı içeriği az olduğu için daha dayanıklıdırlar. İnsan semeninde en çok kullanılan CPA Gliserol egg yolk sitrattır. Daha çok manuel yöntem tercih edilmektedir. Motilite, Morfoloji, Fertilizasyon kapasitesi azalır. Sperm DNA integritesi tartışmalı

60 Blastosist Vitrifikasyonu Current data on the vitrification tablo 2

61

62

63

64

65 Canlılık oranı (%) Gebelik oranı (%) Oosit 54 14,2 Embriyo 67 28,2

66 Human Oocyte Vitrification (Kuwayama et al. Highly Efficient Vitrification of Human Oocytes. RBM Online 11: , 2005) Parameter Result (% of # vitrified) # oocytes vitrified 107 # Surviving (normal morphology) 86 (80%) Fertilized (by ICSI) 77 (72%) Blastocyst development 40 (37%) # embryo Transfers 29 (18 D2, 11 D5) Total # embryos transferred 64 (53 D2, 11 D5) Avg # embryos/ transfer 2.2 (3 D2, 1 D5) % Pregnancy (# sacs by ultrasound) 12 (41.3%) # deliveries 7 babies (3 ongoing pregnancies)

67 Irvine Scientific s Vitrification System: Vit Kit - Freeze Solutions Basal medium is M199-H + 20% DSS 7.5% ethylene glycol 7.5% DMSO Equilibration Solution (ES) 15% ethylene glycol 15% DMSO 0.5 M sucrose Vitrification Solution (VS)