T.C TRAKYA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 T.C TRAKYA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ALBİNO IRKI SIÇANLARDANSÜPEROVULASYON İLE PRONÜKLEER AŞAMADAKİ EMBRİYOLARIN ELDESİ, VİTRİFİKASYONU VE VİTRİFİKASYONSONRASI EMBRİYO KÜLTÜR KOŞULLARININ ARAŞTIRILMASI TOLGA AKKOÇ YÜKSEK LİSANS ZOOTEKNİ ANABİLİM DALI DANIŞMAN Prof.Dr. M. İHSAN SOYSAL EŞ DANIŞMAN Doç. Dr. HAYDAR BAĞIŞ

2 1. ÖZET. i 2. İNGİLİZCE ÖZET.. ii 3. GİRİŞ VE AMAÇ GENEL BİLGİLER Spraque Dawley Soyuna Ait Sıçanlarının Genel Özellikleri Dişi Sıçanlarda Üreme Fizyolojisi ve Aktiviteleri Sıçanlarda Süperovülasyon ve PN Embriyoların Eldesi Embriyoların Dondurularak Saklanmamaları (Kriyoprezervasyonu) PN Embriyoların Dondurulmasının Avantajları Embriyoların Dondurularak Saklanması Süresince Embriyoyu Olası Zararlardan Koruyan Unsurlar Hücre İçerisine Geçebilen Dondan Koruyan Maddeler Hücre İçerisine Geçemeyen Dondan Koruyan Maddeler Hücre İçerisine Geçebilen Düşük Molekül Ağırlıklı Dondan Koruyan Maddeler Hücre İçerisine Geçemeyen Yüksek Molekül Ağırlıklı Dondan Koruyan Maddeler Embriyolarda Kullanılan Dondan Koruyucu Yöntemler Camsı (Vitrifikasyon) Yöntem ile Dondurma MATERYAL VE METOT Kimyasal Maddeler ve Ortamlar Cihaz ve Ekipmanlar Spraque Dawley Soyuna Ait Sıçanların Üretilmesi ve Kullanılması Embriyo Yıkama Ortamlarının ve Hormonların Hazırlanması Yıkama (M2) Ortamının Hazırlaması Enzimli (M2) Ortamının Hazırlaması Süperovülasyonda Kullanılan Hormonların Hazırlanması Ozmotik Dengeleme (Ekilibrasyon),Camsı Yöntemle Dondurma (Vitrifikasyon) ve Çözündürme Çözelitilerinin Hazırlanması Sıçanlardan PN Embriyoların Eldesi Süperovülasyon Uygulaması Sıçanlardan Yumurta Kanallarının Eldesi Embriyoların Yumurta Kanalından İzolasyonu Embriyoların Katı Yüzey Camsı Dondurma (SSV) Yöntemi ile Dondurlması Saklanması ve Çözündürülmesi Deneysel 30 2

3 Düzen Farklı Hormon Dozları ile Süperovülasyon ve PN Embriyo Eldesi Farklı Kültür Medyumlarında ve Atmosfer Koşullarında PN Embriyoların Kültüre Alınması Katı Yüzey Camsı Dondurma (SSV) Tekniği ile Embriyoların Dondurulup Çözündürülmesive Kültür Edilmesi SONUÇLAR Farklı Hormon Dozları ile Süperovulasyon ve PN Embriyo Eldesi Sonuçları Farklı Kültür Medyumlarında ve Gaz Karışımlarında PN Embriyoların Kültür Sonuçları Etüvde Yapılan Embriyo Kültür Çalışmaları Etüv ve Cam Kavanozda Yapılan Embriyo Kültür Çalışmaları Katı Yüzey Camsı Dondurma (SSV) ile Vitrifiye Edilmiş Embriyoların ÇözündürmeSonrasındaki Kültürlerinin Karşılaştırılması TARTIŞMA EKLER KAYNAKLAR TEŞEKKÜR ÖZGEÇMİŞ

4 Bu Tez Çalışması, TÜBİTAK-MAM Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Araştırma Enstitüsü (GMBAE), Transgen ve Deney Hayvanları Laboratuarında Gerçekleştirilmiştir. 4

5 3. GİRİŞ VE AMAÇ Son yıllarda embriyoloji ve genetik alanında yapılan çalışmalar umut verici sonuçlar doğurmaktadır. Gen teknolojisi ile embriyo transfer çalışmalarının beraberce yürütülebilmesi ve çiftlik hayvanlarına adapte edilebilmesi için ihtiyaç duyulan koşulların ve pratiklerin öncelikle laboratuar hayvanlarında (fare, sıçan) sağlanması ve tekniğin oturtulması gerekmektedir. Türkiye de fare ve sıçan gibi hayvanların embriyo kültürü ve transferi çalışmaları laboratuar ortamında in vitro koşullarda yapılmaktadır. Laboratuar hayvanlarından özellikle sıçanda embriyo dondurma teknolojisi dünyada yaygın olarak uygulanırken, ülkemizde istenilen düzeyde çalışmalar yapılmamıştır. Embriyo dondurma teknolojisinin kullanılması, başta biyomühendislik alanı olmak üzere ülkemiz hayvancılığının geliştirilmesinde önemli katkılar sağlayacaktır. Son yıllarda transgenik canlı elde etme ve klonlama teknolojileri ile hayvan üretimi çalışmaları; biyoteknolojik ve fizyolojik çalışmalarda giderek önem kazanmaktadır. Özellikle laboratuar hayvanları, transgenik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunların başında fare ve sıçanlar gelmektedir. Sıçanlar, hipertansiyon, ENRfu (Okamoto 1969), diyabet (Zuker 1965), otoimmünite (Hammer vd 1990) gibi insanlarda görünen hastalıkları çalışmak için önemli transgenik hayvan modellerini oluşturmaktadır (Ishigame vd 2004). Transgenik sıçanlar ayrıca mikrocerrahi alanında uygulanan tranplantasyon çalışmalarında oldukça önemli bir yer tutmaktadır (Hammer vd 1990, Charreau vd 1996). Sıçanlar özellikle geniş vücut yapılarından dolayı cerrahi müdahalelerde model hayvan olarak kullanılmaktadır. Bundan dolayı, deneysel uygulamalarda farelere göre daha pratik olmaktadır. Bu avantajlara karşın sıçanlarda uygulanan üreme teknolojileri farelerle karşılaştırılıdığında, çok daha yetersiz kalmaktadır (Ishigame vd 2004). Biyoteknolojik çalışmalarda kullanılacak sıçanların yaşı, ırkı ve yetiştirme koşulları, bu hayvanlar ile yapılacak çalışmaların sonucunu önemli derecede etkilemektedir. Sıçanların kızgonlık (östrus) döngülerine göre süperovulasyon protokollerini oluşturmak son derece önemlidir. Ayrıca kaliteli ve yüksek sayıda embriyo eldesi için kullanılacak sıçanın ırkı, yaşı, akraba içi veya dışı yetiştirilmiş 5

6 (inbred veya outbred) olması, besleme ve barındırma sistemleri, çalışmanın ana basamaklarını önemli derecede etkilemektedir. Sunulan çalışmada; Spraque Dawley Soyuna ait Albino Sıçanlarından süperovulasyon tekniği ile çekirdek öncesi (pronükleer safha (PN) embriyolar) elde edilmiştir. Çeşitli hormon kompozisyonlarının sıçanlarda embriyo gelişimi üzerine etkileri ve embriyo sayıları araştırılmıştır. Elde edilen PN embriyolardan bir kısmı, katı yüzey dondurma (Solid Surface Vitrification, SSV) yöntemi ile dondurulup çözündürülmüştür. Çözündürülme sonucunda sağlam görünen PN embriyoların farklı ortamlardaki kültür koşulları araştırılmıştır. Sunulan çalışmada, ilk defa sıçan embriyoları katı yüzey camsı dondurma tekniği ile (SSV) dondurulmuş ve çözündürülmüştür. Yapılan bu çalışmadan elde edilen süperovulasyon, embriyo kültürü ve katı yüzey camsı dondurma sonuçları gelecek transgenik sıçan üretim çalışmalarına basamak oluşturacaktır. 6

7 4. GENEL BİLGİLER Embriyoların dondurularak korunması çalışmaları günümüzde, biyoteknolojik çalışmalarda oldukça önemli bir yer tutmaktadır. Fare embriyolarının uzun süreli saklanmasında Camsı Yöntem ile Dondurma (Vitrifikasyon) tekniği dünya çapında yaygın olarak kullanılmaktadır (Bağış vd 2005). Özellikle laboratuar hayvanlarından sıçanların, transgenik çalışmalarda model hayvan olarak kullanılması yaygınlık kazanmaktadır (Pfaff vd 2000). Ancak bu hayvanların üretilmesi, beslenmesi önemli ölçüde zaman ve maliyet gerektirmektedir. Bunun için bu hayvanların embriyolarının donduralarak saklanacağı bir yapılandırma, bahsedilen zaman ve maliyetten tasarruf sağlamasına önemli ölçüde katkı sağlayacaktır. Bu nedenle laboratuarda üretilen çeşitli soylardaki sıçanların korunması için etkili dondurarak koruma metotlarının geliştirilmesi gerekmektedir. Fakat sıçanlar üzerinde uygulanan embriyo dondurma çalışmaları farelerde yapılan çalışmalarla karşılaştırıldığında oldukça yetersiz kalmaktadır. Dolayısıyla sıçan embriyoları, fare embriyolarına göre daha az sıklıkla dondurulmuş ve fare üzerinde yapılan araştırmalara göre daha sınırlı sayıda veri elde edilmiştir (Pfaff vd 2000, Han vd 2003). Aynı zamanda sıçan embriyolarının dondurularak korunmalarında kullanılan tekniklerin (kriyoprezervasyon) fare embriyolarına göre daha zor ve pahalı teknikler olduğu çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir (Pfaff vd 2000). Dondurma çalışmalarında sperma için gliserolün dondurularak korunma aktivitesinin keşfi (Polge vd 1949), embriyoların dondurularak korunmaları üzerindeki araştırmalar için yeni ufuklar açmıştır (Bağış vd 2005). İlk başarılı memeli embriyolarının dondurularak korunması farelerde gerçekleşmiştir (Whittingham 1971). Fakat bu çalışmada embriyolar C de 30 dakikadan uzun bir süre tutulmuş ve dondurmanın embriyo canlılıklarını azalttığı gözlenmiştir (Whittingham 1974). Embriyoların camsı (vitrifikasyon) biçiminde soğutularak korunması diğer tekniklere göre daha iyi neticeler alınmıştır. Sözü edilen teknik yine farelerde yapılmıştır ve bu teknolojinin uygulanması birçok çalışmada yol gösterici olmuştur. Fareler üzerinde yapılan bu araştırmalar ile kriyo-teknikler üzerinde ilerlemeler sağlanması birçok araştırmanın da önünü açmıştır (Bağış vd 2005, Bağış vd 2004, Whittingham vd 1972). 7

8 Embriyo dondurma çalışmalarında embriyonun yaşama gücünü doğrudan etkileyen nedenler olarak; ortamın kimyasal kompozisyonu, dondurmada kullanılan çözeltiler, embriyo soğutma düzeyleri, dondurulmuş embriyoların saklanması sırasındaki ısı değişiklikleri ve embriyo çözündürme düzeyleri gibi dondurarak koruma faktörleri sıralanmıştır. Bu çalışmaların sonucunda; fare embriyolarının C de dondurulduklarında ve C de, 8 günden fazla bir süre saklandıklarında canlılıklarını yitirmedikleri ve çözündürme sonrasında embriyoların yüksek yaşama düzeylerine (50-70 %) sahip oldukları gösterilmiştir. Sonraki çalışmalarda, embriyolar C de 8 ay kadar bir süre saklanmıştır. Bu embriyoların yaşama düzeyleri ise %100 e kadar yaklaşmıştır (Whittingham 1974). Donma ve çözünme sırasında, hücrelerin, dokuların ve organların zarar görmesini engellemek amacıyla, dondurma ve çözündürme solüsyonlarının içerisine dondan koruyucu (kriyoprotektan) maddeler katılmaktadır (Bağış vd 2002, Bağış 1994). Dondurma teknolojisinin başlıca avantajı; hücreler veya dokuların kriyoprezervasyon ile uzun süre canlılıklarını kaybetmeden saklanabilmesidir. Embriyo dondurma çalışmalarında vitrifikasyon tekniği yaygın olarak kullanılmaktadır (Bağış vd 2005). Sıçan embriyolarının dondurulmaları esanasında soğuğun etkilerinden korunması için camsı yapı dondurma metotları (vitrifikasyon) kullanılarak transgenik sıçan üretimi gerçekleştirilmiştir (Popova vd 2002) Spraque Dawley Soyuna Ait Sıçanların Genel Özellikleri Çalışmada kullanılan Spraque Dawley Soyuna ait sıçanlar; akraba dışı yetiştirilmiş (outbred) olup genetik bakımdan heterojendirler. Bu soydaki sıçanlar birbirleriyle akraba olmayan bireylerin kendi aralarında rastgele eşleştirilmesi sonucunda oluşturulmaktadır (Bağış vd 2006 ). Spraque Dawley Soyuna ait sıçanların dölverimine ilişkin çeşitli biyolojik özellikleri aşağıdaki Tablo-4.1 de özetlenmiştir. 8

9 Tablo-4.1. Sıçanların Döl Verimine İlişkin Çeşitli Biyolojik Özellikleri ÖZELLİKLER DEĞERLER ÖZELLİKLER DEĞERLER Erişkin vücut ağırlığı (Dişi) gram Erişkin vücut ağırlığı (Erkek) gram Doğum Ağırlığı 5-6 gram Vücut Sıcaklığı C Kromozom Sayısı 40 Yaşam Süreleri yıl Yem Tüketimi 5-6 gr / 100 gr / ml/100 Su Tüketimi Gün gr/gün Cinsi Olgunluk (Dişi) 12 Hafta (60-100) Gün Cinsi Olgunluk (Erkek) 12 Hafta (60-100) Gün Kızgınlık Döngüsü Uzunluğu 4-5 Gün Gebelik Süresi Gün Yavru Sayısı 6-12 Adet Yavru Üretimi 4-5 (Ayda) Sütten Kesilme 21 Gün Doğurganlık Süresi Gün Ortam Isısı C Ortam Nemi % Dişi Sıçanlarda Üreme Fizyolojisi ve Aktiviteleri Dişi sıçanların kızgınlıkları, yılın her mevsimine bağlıdır. Kızgınlık döngüleri 4-5 gündür. Cinsi olgunluğa (seksüel olgunluğa ulaştığı ve ikinci eşey karakterlerinin ilk olarak görüldüğü döneme) yaklaşık 50 ± 10 günler arasında ulaşırlar. Bu rakamın kesin sınırlar içerisinde olmamasının sebebi; erginliğe ulaşma yaşının; ırka, türe ve çevre koşularına bağlı olarak değişmesidir. Üreme işlevinin başlayabilirliği (Vajinal açılma) günler arasında gerçekleşmektedir. En yüksek döllenme kabiliyeti 100 ile 300 gün arasında gözlenmektedir (Sharp vd 1998, The Laboratory Rat; Patrick E.Sharp, Marie C.La Regina,1998). Normal üretimlerde iki dişi, bir erkek ile aynı kafeste tutulmaktadır. Embriyo eldesi yapılacaksa bire bir eşleşme uygulanır, yani bir erkek bir dişi ile eşleştirilmesi 9

10 yoluna gidilmektedir. Bir yaşını aşmış dişiler eğer farklı bir çalışma öngörülmemiş ise üretimden çıkarılarak damızlık grubundan ayrılır. Uzun süre bireysel kafes bölmelerinde barındırılmış dişiler farklı bir kafeste tekrar bir araya getirilmemelidir. Aksi taktirde birbirlerini yaralamadan kaynaklanan stres faktörleri oluşabilir (Resim 4.1). Resim-4.1. Hayvanlıktan Genel Bir Görünüş 4.3 Sıçanlarda Süperovulasyon ve PN Embriyoların Elde Edilmesi Sıçanlar, dört günde bir kızgınlık göstermektedir. Deneysel çalışmalarda kızgınlık döngüsünün (östrus siklusu) takibi ve hayvanların gruplara ayrılması zor olmaktadır. Bu nedenle dişilerin aynı anda kızgınlık döngülerine ulaşmaları için bütün sıçanların aynı anda kızgınlık göstermeleri için yapılan işlem (senkronizasyon) gerekir. Senkronizasyon; çeşitli hormonlar ile sağlanmaktadır. Bunun için çeşitli gonadotropinlerler; örneğin, Gebe Kısrak Serum Hormonu (PMSG) ve İnsan Korinonik Gonadotropin (hcg) enjeksiyonu dişilerde hormonal bakımdan aynı anda kızgınlık göstermelerine neden olarak eşzamanlı kızgınlık döngüsünün oluşumunu 10

11 sağlamaktadır (Mukumoto vd 1995, Popova vd 2002, Bağış 1994, Bağış vd 2000). Hormonlar ile dişiler eşzamanlı bir biçimde uyarılırken aynı zamanda yumurtlayacak (ovule olacak) yumurta sayısı da arttırılmış olur. Bu olaya süperovulasyon denir. Dolayısıyla daha fazla sayıda embriyo elde etmek amacıyla uygulanan süperovulasyon, aynı zamanda yumurta veya (PN) embriyo elde edilecek dişilerin eş zamanlı bir biçimde uyarılmalarına olanak sağlayacaktır (Bağış 2004, Bağış vd 2000). Süperovulasyon ile sıçanlardan elde edilecek fazla miktarda PN embriyo ve yumurta transgenik hayvan üretimi ve embriyo dondurma çalışmalarında kullanılabilmektedir. (Ishigame vd 2004). Erkek ve dişi pronükleusların birleşmelerinden önceki faza singami denir Singami sonrasındaki tek hücreli embriyo, zigot evresi olarak tanımlanır. İleriki safhaları, 2,4,8,16 blastomerli evrelere sahip embriyolar izler. Sonraki safhalar; morula, kompakt morula, erken blastosist ve şişmiş blastosist, ve iç hücre kitlesinin zona pellisudadan dışarı çıkması olarak adlandırılan, sarkmış blastosisit devreleri izler. Sarkmış olan iç hücre kitlesi rahimde uterus duvarına yerleşir (implantantasyon). Sıçanlardan embriyo eldesine ilişkin metotlar, istenilen gelişme dönemindeki embriyoya göre değişiklik gösterilmektedir. Tek hücreli çekirdek öncesi safhada bulunan embriyo (zigot) eldesi için vericilerin eş zamanlamalarından saat sonra oviduktun ampulla bölgesinden, 2-16 hücreli embriyolar gün sonra ovidukt yıkamasıyla, kompakt morula ve blastosistler ise gün sonra uterus yıkamasıyla elde edilir (Bağış 1994, Hogan vd 1986). 11

12 Resim 4.2 de dişi sıçanların üreme organları genel bir biçimdegörülmektedir. Resim 4.2. Dişi Sıçan Eşey Organları Işık gün uzunluğu, yumurtlamanın oluşumunu birinci dereceden tetikleyen faktörler arasındadır (Mukumoto vd 1995). Süperovulasyonda uygulanan hcg enjeksiyonunun hemen ardından dişiler fertil erkeklerle bire bir eşleşmeye alınırlar. Çünkü hcg enjeksiyonunu takiben saatlerde yumurtlama meydana gelmektedir (Bağış 1994, Hogan vd 1986). Eşleşmenin gerçekleşip gerçekleşmediğinden tam olarak emin olmak için vaginal plak kontrolü yapılır. Vaginal plak, erkeğin seminal sıvısının pıhtılaşmasıyla (koagule olmasıyla) şekilllenen ve vaginayı eşleşme sonrasında kapayarak tıkaç görevi üstlenen bir bariyerdir. Bu da eşleşmelerin kontrolünde önemli bir belirteçtir (Resim 4.3). Vaginal plak gösteren dişilerin tümü embriyo elde etmek için kullanılır (Bağış 1994, Mukumoto vd 1995). 12

13 Resim-4.3. Vaginal Plak Vaginal Plak 4.4. Embriyoların Dondurularak Saklanmaları (Kriyoprezervasyonu) Embriyoların dondurulmaları ve saklanmaları önemlidir. Bu teknikle çiftlik hayvanlarının, laboratuar hayvanlarının, yaban hayvanlarının ve insanların embriyoları uzun süre dondurulularak uzun süre saklanabilmektedir (Kasai 1996). Embriyoların dondurulmaları esnasında meydana gelen ani ısı değişiklikleri hücrelerin metabolik aktivitelerini ve canlılıklarını olumsuz yönde etkiler. Bunlardan en önemlisi hücrelerdeki ozmotik dengenin bozulmasıdır (Sağırkaya ve Bağış 2003). Dondurma solusyonlarında kullanılan ve hücreleri soğuk etkiden koruyan bu maddeler aynı zamanda uzun süre dondurmanın oluşturacağı zararları engelleyen maddeler olmaktadır (Sağırkaya ve Bağış 2003, Kasai 1996). Dondurmanın başarısını etkileyen faktörler; dondurma süresince koruyucu unsurların zehir etkileri, soğutma hasarı, hücre dışı donma ile oluşan fiziksel zarar, yoğun elektrik geçirgenliğigibi unsurların zararlı oluş niteliği, hücrelerin uygun olmayan sıcaklıklara maruz bırakılmayla oluşan hücre içi buz kristallerinin şekillenmesi ve ozmotik denge olarak sıralanabilir (Kassai 1996, Sağırkaya 2000, Bağış vd 2002). Dondurma ve çözündürme işlemlerinde hücrelerin canlılıklarını doğrudan etkileyen başka faktörler de bulunmaktadır. Bunlar; türler arasındaki farklılık, hücrelerin geçirgenlik özellikleri, embriyoların büyüklükleri ve hücrelerin bulundukları safhalardır (Sağırkaya ve Bağış 2003). 13

14 4.4.1 PN Embriyoların Dondurulmasının Avantajları PN embriyoların dondurularak korunmaları; insan embriyolojisinde ve gen bankası programlarında (Bağış vd 2005), transgenik teknolojide (Bağış vd 2004), nükleer transfer ve in-vitro embriyo üretiminde (Dinnyes vd 2000) ve hayvancılık alanındaki çalışmalarda (Dinnyes vd 2003) önemli bir yere sahiptir. Transgenik çalışmalarda mikroenjeksiyon sonrası elde edilmiş embriyoların, embriyo transferi için kullanılması birtakım sorunları ve güçlükleri de beraberinde getirmektedir. Öncelikle embriyo transferinin yapılacağı yalancı anne olan alıcı dişilerin (recepient) embriyo transferine uygun halde olması (eş zamanlı olarak uyarılması) gerekmektedir. Bu durum, mikroenjeksiyon sonrası embriyoların transferinde güçlük ortaya koymaktadır (Bağış vd 2005, Bağış vd 2004, Sağırkaya ve Bağış 2003). Embriyoların dondurulması ile eş zamanlı uyarım (senkronizasyon) işleminden ortaya çıkan alıcı anne sorunu aşılmış olacaktır. Dondurulmuş transgenik veya normal embriyolar alıcı annelerin uygun oldukları bir zamanda transfer edilebilir (Sağırkaya 2001, Sağırkaya ve Bağış 2003, Bağış vd 2005). Dondurulan embriyolar C de olan sıvı azot içerisinde uzun süre canlılığını bozmadan saklanabilmektedir. Dondurma teknolojisinin birçok avantajı vardır. Dondurulan embriyolar üzerinde çalışılan canlının genetik bilgilerinin güvence altına alınmasını sağlar. Olası bir doğal afet, yangın, mutasyonlar ya da nesli tükenme tehlikesi olan canlılarda, genetik materyal sabit kalacağından ilerideki çalışmaların devamlılığını sağlar. Bununla beraber laboratuarlarda üretilen transgenik ve nakavt fareler ile sıçanlar güvence altına alınmış olunur. Embriyo bankalarının oluşturulması ile bu riskler ortadan kalkar (Sağırkaya 2001, Whittingham 1974, Dinnyes vd 2003, Bağış vd 2004). Embriyo dondurulması ile birlikte hayvanlardaki genetik çeşitliliğin korunması büyük ölçüde kolaylaşacaktır. Mevcut bölgelerden başka bölgelere dondurulmuş embriyolar metabolik özelliklerini kaybetmeden transfer edilebilirler ve istenildiği zaman çözündürülüp kullanılabilirler. Üstün niteliklere sahip hayvanlar farklı bölgelere taşınmadan sadece embriyolarının uygun koşullarda dondurulması ve embriyo transferi ile istenilen gen kaynakları farklı bir bölgeye aktarılabilir (Sağırkaya 2001, Sağırkaya ve Bağış 2003). 14

15 Hayvan üretim çiftliklerinde veya deney hayvanları laboratuarlarında sürekli üretilen hayvanlarda genlerinde mutasyonların meydana gelme riski vardır. Embriyoların dondurulup saklanmasıyla bu riskler en aza indirilmiş olmaktadır (Sağırkaya 2001) Embriyoların Dondurularak Saklanması Süresince Embriyoyu Olası Zararlardan Koruyucu Unsurlar. Embriyoların dondurmak sureti ile korunması sırasında hücrelerin soğuk etkilerden zarar görmesini engellemek amacıyla bir takım dondan koruyan maddeler kullanılmaktadır. Bu maddeler, hücrelerde, dokularda ve organlarda donma ve çözündürme sırasında meydana gelebilecek ani ısı değişikliklerinin yaratmış olduğu olumsuz etkilerden korumaktadırlar (Palasz ve Mapletoft 1996, Sağırkaya ve Bağış 2003). Uygulanan tüm dondurma yöntemlerinde amaç, dondurma ve çözündürme işlemleri sırasında hücrelerde meydana gelebilecek hücre içi buz kristallerinin oluşumunun engellenmesidir. Hücre içi sıvının hücre zarının içine nüfuz edebilen dondan koruyan (kriyoprotektan) maddeler ile yer değiştirmesi; hücre içi buz kristallerinin oluşumunu engeller (Sağırkaya 2001, Sağırkaya ve Bağış 2003) Hücre İçerisine Geçebilen Dondan Koruyan Maddeler Hücre içerisine geçebilen dondan koruyan maddelerden en az biri dondurma solüsyonlarının içerisinde kesinlikle bulunmalıdır. Hücre içi osmotik basınç farkından dolayı hücre içi sıvı bu dondan koruyan maddeler ile yer değiştirir. Böylece hücre içinde buz kristallerinin oluşumu engellenmiş olunur (Sağırkaya 2001, Sağırkaya ve Bağış 2003). Hücre içerisine nüfuz eden dondan koruyan maddeler; Dimetilsülfoksit (DMSO), Gliserol, Etilen Glikol (EG), 1.2 Propanediol, 2.3 Bütanediol, Propilen Glikol ve diğer bazı alkol çeşitleridir. 15

16 Hücre İçerisine Geçemeyen Dondan Koruyan Maddeler Bu gruptaki dondan koruyan maddeler düşük molekül ağırlıklı ve yüksek molekül ağırlıklı maddeler olmak üzere iki gruba ayrılmaktadır Hücre İçerisine Geçebilen Düşük Molekül Ağırlıklı Dondan Koruyan Maddeler Bu maddelerin temel görevi, hücre içinde mevcut olan suyu dışarı çıkararak hücrede suyun giderilmesini sağlamaktır. Hücre içi sıvının uzaklaştırılması ile donma sırasında meydana gelebilecek hücre içi buz kristallerinin oluşumu engellenmiş olunur (Sağırkaya 2001, Sağırkaya ve Bağış 2003, Rall 1992). Galaktoz, Sükroz, Glikoz, Trehaloz hücre içine nüfuz edemeyen düşük molekül ağırlıklı dondan koruyucu maddelerdir. Şekerler, dondan korumada genellikle ozmotik tampon oluşturmak amacıyla kullanılırlar (Sağırkaya 2001, Palasz ve Mapletoft 1996, Bağış vd 2004) Hücre İçerisine Geçemeyen Yüksek Molekül Ağırlıklı Dondan Koruyan Maddeler Hücrelerin dondurulması ve çözündürülmesi sırasında meydana gelen buz kristallerinin yaratmış olduğu zararı minimum düzeye indiren maddelerdir. Buz kristallerinin şekil ve büyüklüklerinde birtakım değişikliklerin oluşmasını sağlamaktadır (Sağırkaya ve Bağış 2003, Rall 1992,). Bu maddelerden bazıları; PoliVinilPirrolidon (PVP), PoliVinil Alkol (PVA), Sodyum Hyaluronat ve HidroksiEtil Nişasta (Sağırkaya 2001, Palast ve Mapletoft 1996) ve buz kristallerinin oluşumunu engelleyen Antifriz Proteinlerdir (AFP) (Bagis vd 2006). 16

17 Embriyolarda Kullanılan Dondan Koruyucu Yöntemler Embriyoların dondurma işlemi sırasında koruma amaçlı kullanılan yöntemler başlıca üç gruba ayrılmaktadır. Bunlar; a- Geleneksel Yavaş Dondurma b- Hızlı Dondurma c- Camsı Yapı Dondurma Yöntemi (Vitrifikasyon) ile Bu yöntemlerin içerisinde en yaygın olarak kullanılan dondurma tekniği camsı yapı görünüm yöntemi ile dondurmadır Camsı Yapı Yöntem (Vitrifikasyon) ile Dondurma Camsı yöntem ile dondurma, uygulama tekniklerinde basit ve kısa işlembasamakları içermesi ve düşük maliyet gerektirmesi nedeniyle diğer dondurma sistemlerine göre daha avantajlı bir tekniktir. Hücrelerin, dokuların ve organların dondurulmaları ve çözündürülmeleri sırasında hücre içerisinde oluşan buz kristalleri ve dondan koruyan maddelerin yaratmış olduğu zararlı etkiler; hücrelerin bu işlemler sırasında ciddi zararlar görmesine neden olmaktadır. Bu nedenle belirtilen olumsuz etkilerin verebileceği zararları önlemek amacıyla geleneksel dondurma tekniklerin yerini alabilecek yeni tekniklerin geliştirilmesi söz konusu olmuştur. Camsı yapı yöntemi ile dondurma için dondan koruyucu madde; hücre içerisine alınır, fakat kristalleşme oluşmaz. Bu metot, soğutma sırasında hücre içerisinde viskozite son derece yüksek olur. Viskozitenin yoğun olması camsı yöntem ile yapılan dondurmanın başarısını doğrudan etkiler. Neticede hücre içinde buz kristalleri şekillenmez. Bu nedenle hücre içerisinde vitröz yani camsı bir görünüm elde edilir (Sağırkaya 2001, Dinnyes vd 2003, Sağırkaya ve Bağış 2003, Bağış vd 2004, Bağış vd 2005). Camsı yapı yöntemi ile dondurma süresince oluşabilecek zararlı yan etkileri en aza indirgemek veya önlemek amacıyla camsı dondurma çözeltilerine hücre içerisine geçebilen bazı makromoleküller ve şekerlerin ilave edilmesi gerekmektedir. Ancak, 17

18 hücre içerisine geçebilen çeşitli dondan koruyucu maddelerin de camsı dondurma çözeltileriyle birlikte kullanılması, donma işlevinin sağlanması için gerekli ozmotik denge süresinin kısa tutulması, iki aşamalı olarak uygulanması, olası zararlık yan etkileri önemli derecede engelleyecektir (Bağış vd 2004, Sağırkaya 2001, Palasz ve Mapletoft 1996). Camsı yapı yöntemi ile dondurma tekniğinin uygulanmasında en önemli amaç olan hücre içi buz kristallerinin oluşumunun ve çözündürme sırasında devitrifikasyonun önlenmesi amacıyla bu uygulamaların yapılması gerekmektedir. Camsı dondurma (vitrifikasyon) süreci sırasında hücre içerisine geçmiş olan donan koruyucu maddelerin çözündürme sırasında hücre içerisinden dışarıya alınması ile hücre içerisine buz kristallerinin yeniden ve daha hızlı şekillenmesi önemli bir risk olmaktadır (Palasz vd 1993). Bunu engellemek amacıyla çözündürme sırasında, hücre içerisine geçemeyen yüksek molekül ağırlıklı dondan koruyucu maddeler kullanılmalıdır. Örneğin, Fikol, Antifiriz Proteinler (Bagis vd 2006), Sodyum Hyaluronate (Palasz vd 1993), Rafinoz, Sükroz ve Trehaloz gibi şekerlerin, çözündürme solüsyonlarına uygun konsantrasyonlarda ilave edilmesi gerekmektedir (Bağış vd 2004, Sağırkaya ve Bağış 2003, Palasz ve Mapletoft 1996, Dinnyes vd 2003). Bunların dışında çözündürme sırasında hücre içi buz kristallerinin oluşumunu engellemek amacıyla, uygun olan çözündürme hızları kullanılmalıdır (Sağırkaya ve Bağış 2003). Dünyada camsı yapı yöntemi ile dondurma ile ilgili yapılan son çalışmalarda; 1 hücreli, 2 hücreli ve morula fazlarındaki sıçan embriyolarının dondan korunmasında camsı yöntem ile dondurma tekniğinin oldukça başarılı olduğu bildirilmiştir (Pfaff vd 2000). Bu çalışmalar çoğunlukla Wistar sıçanları ve değişik genetik yapılara sahip diğer sıçanlarda uygulanmıştır (Pfaff vd 2000). Günümüzde camsı yöntem (SSV) ile dondurma tekniği çok farklı genetik özelliklere sahip sıçan embriyolarında henüz test edilmemiştir. 18

19 5. MATERYAL VE METOT 5.1. Kimyasal Maddeler ve Ortamlar Tablo:1 Embriyo kültürü ve dondurma çalışmalarında kullanılan kimyasal maddeler ve ortamlar Kimyasal Maddeler Katalog. No Firma Molekül Ağr. Gr/Mol NaCl S-5886 Sigma KCl P-4504 Sigma MgCl 2 M-2393 Sigma KH 2 PO Merck MgSO 4-7H 2 O 549 Merck Sodium Lactate L-4263 Sigma Glucose G-6152 Sigma Penicilin-G P-7794 Sigma Streptomycin S-6501 Sigma NaHCO 3 S-5761 Sigma Phenol Red P-4758 Sigma Sodium Pyruvate P-2256 Sigma 110 CaCl 2-2H 2 O C-7902 Sigma Hepes Solid H-6147 Sigma BSA A-3311 Sigma PVA P-8136 Sigma EG E-9129 Sigma Trehalose T-0167 Sigma PMSG G-4877 Sigma hcg Organon Min. Ess.A.A B-6766 Sigma Non.Ess.A.A M-7145 Sigma Glutamin G-3126 Sigma Mineral Oil M-8410 Sigma Hyaluronidase H-3884 Sigma Embryo Tested Water W-1503 Sigma

20 5.2. Cihaz ve Ekipmanlar Çalışmada kullanılan cihaz ve ekipmanların bir bölümü Resim 5.1 de gösterilmiştir. Tablo:2 Araştırmada Kullanılan Aygıtlar ve Nitelikleri Cihaz Firma Katalog No İnverted Mikroskop Carl Zeiss Axiovert 35 M Stereo Mikroskop Soif DA 0671 Etüv Ehret 3023 CO 2 İnkübatör Nuare Hava Yastıklı Masa Newport M-MV-3660-OPT Hassas Tartı Sartorius 13P 221S Osmometre Gonotec Osmomat-30 ph Metre Hanna Instruments HI 9321 Isıtıcı Tabla Electrothermal Azot Tüpü Bos Otoklav Medexport Otomatik Pipet Eppendorf µl. Video Monitor Sony Pvm-122CE (31CM) Mikroskop Kamerası Sony CCD Mikroskop Fotograf Mak Contax 167 MT Cerrahi Set Eusclap 20

21 Resim Çalışmada Kullanılan Cihaz ve Ekipmanlar M2 Ortamının İçeriği Tablo:3 Embriyoların sıçanlardan eldesinden sonra yıkamalarında kullanılan M2 ortamının içerdiği kimyasal maddeler Kimyasal Maddeler Gr/Litre NaCl KCl CaCl.2H 2 O KH 2 PO MgSO 4.7H 2 O NaHCO Hepes Sodium Lactate Sodium Pyruvate Glucose BSA Penicilin G. Potassium Streptomycin Sulfate Phenol Red Ticari Embriyo Test Edilmiş Su ile 1 lt ye tamamlanır (Bağış 2004). 21

22 Ayrıca M2 Medyumu hazırlamadan önce çeşitli stoklar oluşturulmaktadır ve bu stoklar kullanılarak günlük taze M2 ortamı istenilen miktarda hazırlanabilmektedir (Bağış1994). M2 Ortamının hazırlanmasın 5 farklı stok kullanılır. Bunlar, Stok A,D,C,D, ve E olmaktadır. Öncelikle bu stoklar hazırlanır. Stok E, Hepes tamponu içerir. Hepes, medyumun CO2 siz ortamda (dış ortam) Ph nın sabit kalmasını sağlar. Ana stok hazırlanacağı zaman bu 5 stok protokol dahilinde belirli oranlarda karıştırılır. Sonra bu karışım embriyo bakımından test edilmiş su ile en son konsantrasyona tamamlanır. M2 Ana Çözeltilerin Hazırlanışı Çözelti A Kimyasal Maddeler Gr/100 ml (10 x Konsantrasyon) NaCl KCl KH 2 PO MgSO 4.7H 2 O Sodium Lactate Glukose Penicilin Streptomycn Çözelti B Kimyasal Maddeler Gr/100 ml (10 x Konsantrasyon) NaHCO Phenol Red Çözelti C Kimyasal Maddeler Gr/100 ml (100 x Konsantrasyon) Sodium Pyruvate Çözelti D Kimyasal Maddeler Gr/100 ml (100 x Konsantrasyon) CaCl 2.H2O

23 Çözelti E Kimyasal Maddeler Gr/100 ml (10 x Konsantrasyon) Hepes Phenol Red Ana Çözeltilerden Çeşitli Miktarlardan Kullanıma Hazır M2 Adlı Ortamın Hazırlanışı Çözelti 10 ml. 50 ml. 100 ml. A (X 10) B (X 10) C (X 100) D (X 100) E (X 100) H 2 O BSA 40 mg. 200 mg. 400 mg. Ana çözeltilerden kullanılarak hazırlanan M2 ortamı, yanal akış adı verilen kap içerisinde 0.22 µm.lik filtrelerde süzülerek falkon özel adı verilen tüplerde +4 0 C de son kullanma tarihine kadar bekletilirler (Gordon ve Ruddle 1983). 23

24 R1ECM (Rat Embryo Culture Medium) Sıçan Embriyo Kültür Medyumunun Birleşimi Unsur Mili Molar Molekül Ağırlığı mg/100 ml NaCl KCL CaCl MgCl NaHCO Sodyum laktat Sodyum piruvat Glukoz PVA 25 BSA 100 Minimal Essansiyel Medyum (MEM) Aminoasit 2 ml. Non Essansiyel Medyum (MEM) Aminoasit 1 ml. Glutamin Ticari Embriyo Test Edilmiş Su ile 100 ml ye Tamamlandı. KSOM Kısa Gösterimli Potasyum Kelium Bileşik En Uygun Ortamı (Potassium Simplex Optimized Medium) Kültür Ortamının Hazırlanışı Bileşik mg/100ml NaCl KCl 18.5 KH 2 PO MgSO 4 x 7H 2 O 4.95 Sodyum laktat %60 Glukoz 3.6 EDTA ml. NaHCO Glutamin 14.5 Sodyum piruvat 2.2 Penicilin G 6.3 Streptomycin 5.0 Phenol red 0.1 CaCl 2 x 2H 2 O

25 BSA Spraque Dawley Soyuna Ait Sıçanlarının Üretilmesi ve Kullanılması Bu çalışmada kullanılan Spraque Dawley Soyuna ait Albino Sıçanlar TÜBİTAK-MAM-GMBAE Transgen ve Deney Hayvanları Laboratuarında üretilmiş ve yetiştirilmiştir. Çalışmamızda 81 adet sıçanda süprovulasyon uyguladık. Vajinal plak gösteren 62 hayvan çalışmada kullanıldı. Plağın görülmediği 19 sıçan denek dışı olarak değerlendirildi ve gebeliklerinin kontrollerei amacıyla ayrı bir kafeste gözetim halinde tutuldular. Sıçanların kusursuzca yetiştirilmesi; çalışmanın sonunda elde edilecek verilerin güvenilirliğini birinci dereceden etkileyen faktör olmaktadır (Bağış vd 2006). Bu amaçla yetiştiricilikte standart koşullar sağlanmıştır. Sıçanlar dezenfekte edilmiş olan plastik alt tabanlı, zeminine temiz otoklavlanmış talaş serili, üzeri metal korumalı 27 x 17 x 39 cm. boyutlarındaki sıçan kafeslerinde tutulmuştur. Her kafese 6 dişi veya 6 erkek olacak şekilde konuldu ve besinsel olarak uygun rasyonlar içeren pelet yemler kullanıldı. Yem ve su sınırsız miktarda (ad libidum) olarak verilmiştir. Bayatlayan yemler tazeleri ile değiştirilmiş, eksilen yemlerin üzerlerine taze yemler ilave edilmiştir. Yem ve su otoklav aygıtında 120 C 0, 1.5 Atmosfer basınç içerisinde dakika boyunca sterilize edilerek verilmiştir. Altlık olarak meşe talaşı kullanılmıştır. Talaşlarda sterilizasyon otoklav aygıtıyla yapılarak sağlanmıştır. Haftada bir kez altlıklar değiştirilmiştir. Ortam ısısının C, nemin ise % arasında olmasına dikkat edilmiştir. Işık periyodu 12 saat aydınlık (07:00-19:00), 12 saat karanlık (19:00-07:00) olarak ayarlanmıştır Embriyo Yıkama Ortamlarının ve Hormonların Hazırlanması Yıkama (M2) Ortamının Hazırlanması Elde edilen yumurtalık yolları (oviduktlar) ve PN embriyolar M2 yıkama ortamında tutuldu. M2 yıkama ortamı ana çözeltiler kullanılarak hazırlandı. Her 25

26 çözelti birbirlerinden farklı kimyasal maddeleri farklı oranlarda içermektedir (Tablo 2). Medyumun Ph sı Çözelti E nin hazıranması sırasında ölçüldü, çünkü çözelti E nin içerisinde Hepes Tamponu var. Hepes, CO 2 siz ortamda Ph yı sabit tutmaktadır. Çözelti E nin Ph sı 7.4 e ayarlandı. M2 final konsantrasyonun ozmotik basıncı 280 Osm. olarak ayarlandı Enzimli (M2) Yıkama Ortamının Hazırlanması Enzimli M2 ortamı; M2 ortamı içerisine Hyaluronidaz enziminin eklenmesiyle oluşturulmuştur. Bu ortamın kullanılmasındaki amaç; PN embriyoların çevrelerinde bulunan kumulus hücrelerinin hyalin bağlarını parçalamak ve PN embriyoları kumulus hücrelerinden uzaklaştırmaktır. Ana stok; 60 mg Hyaluronidaz enzimi tartılıp serum fizyolojik ile 1000 µl ye tamamlanarak oluşturuldu. Bu ana çözeltiden 160 µl. alınarak 1 ml. lik ependorf tüplere bölündü. Bu tüpler 840 µl. serum fizyolojik ile tamalandı. Böylece 2. çözelti oluşturuldu. Çözeltiler C lik derin dondurucuda saklandı. Enzimli M2 nin kullanılacağı zaman 2. çözeltiden 30 µl. alınıp 970 µl. normal M2 solüsyonu ile 1 ml ye tamamlandı. Hazır bulunması amacıyla çözeltiler ve kullanıma hazır M2 ortamları önceden hazırlanıp C lik derin dondurucuya kondu. Deneye başlamadan 1 saat önce emzimli M2 ortamı, C den çıkarılp 37 0 C lik ısıtıcı etüve kondu ve çözünmesi sağlandı. Artan ve kullanılmayan enzimli M2 ler tekrar kullanılmamak üzere atık olarak değerlendirildi Süperovulasyonda Kullanılan Hormonların Hazırlanması Araştırmada iki çeşit hormon kulanılarak eş zamanlı uyarım (senkronizasyon) ve süperovulasyon sağlanmştır. Bu işlemlerin uygulanması ile embriyolar elde edilmiş ve eld edilen bu embriyoların sayıları hormon miktarlarına bakılarak karşılaştırılmıştır. PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) (Sigma Firması, Gebe Kısrak Serum Hormonu): Sigma firmasından ticari olarak satın alınan 1000 ünitelik tozlar halinde bulunan PMSG; kullanılana kadar ambalajında C de saklandı. Kullanıma 26

27 hazır solüsyonun hazırlanmasından önce ana stoklar hazırlandı. PMSG ambalajı içerisinde 1000 IU/ml de olacak şekilde, serum fizyolojik ile çözündürüldü. Ana stok, hormonun serum fizyolojik içerisinde tamamen çözündürülmesiyle oluşturuldu. Hazırlanmış olan bu ana stoktan 50 µl. alınarak 1.5 ml.lik ependorf tüplerine bölüştürüldü. Üzerine 950 µl. serum fizyolojik eklenerek 1 ml ye tamamlandı. Ependorf tüpler iyice karıştırıldı ve hormonun serum fizyolojik ile homojen bir şekilde karışması sağlandı. Hazırlanan tüpler C lik derin dondurucuya kondu. Ependorf tüpler her bir ependorf tüpte 50 ünite PMSG olacak şekilde hazırlandı (50 IU/1 ml) ve kullanıma dek C de bekletildi. hgc (Human Chorionic Gonadotropin) (Pregnyl; Organon Firmasının Ticari Adı ile Belirtilen İnsan Gonadotropin Hormonu): 1 ml.de 500 IU olacak şekilde serum fizyolojik ile hormon sulandırıldı. Aynı şekilde iyice karıştırılıp hormonun tamamıyla serum fizyolojik içerisinde çözünmesi sağlandı. Oluşturulan bu ana stoktan 100 er µl. alınarak 1.5 ml lik ependorf tüplerinin içerisine bölüştürüldü. Üzerine 900 µl. serum fizyolojik eklenerek hormon solüsyonu 1 ml ye tamamlandı. hcg, her bir ependorf tüpün içerisinde 50 ünite olacak şekilde hazırlandı (50 IU/1 ml). Kullanıma hazır hormon, C lk derin dondurucuda saklandı Ozmotik Dengeleme (Ekilibrasyon), Camsı Yapı Yöntem ile Dondurma (Vitrifikasyon) ve Çözündürme Çözeltilerinin Hazırlanması Tüm çözeltilerin hazırlamasında kullanılan kimyasallar, taze olarak hazırlanmış M2 ortamı içerisinde çözündürülmüştür. Ozmotik denge solüsyonu, hüclerin dondurulmalarından önce hücre içi ortam ile hücre dışı ortam arasında ozmotik dengeyi sağlamak amacıyla kullanılmaktadır. Ozmotik Dengeleme Çözeltisi (%4 Etilen Glikol, EG): Kimyasal Maddeler Etilen Glikol M2 Ortamı Miktar 0.4 ml. 9.6 ml. 27

28 Camsı yöntem ile dondurma Çözeltisi (%35 Etilen Glikol, %5 PolivinilPirolidon ve 0.4 M Trehalose): Camsı yapı (vitrifikasyon) ile dondurma çözeltisi, hücrelerin soğuk etkiden korunmaları amacıyla hücre içi sıvının birtakım dondan koruyan (kriyoprotektan) maddeler ile yer değiştirmesini sağlar. Dolayısıyla hücre içi sıvı tamamıyle hücre dışına çıkar ve hücre içi buz kristallerinin şekillenmesi önlenmiş olunur. Kimyasal Maddeler Miktar Etilen Glikol 3.5 ml. Polivinil Pirolidon 0.5 gr. Trehalose gr. M2 Ortamı 4.5 ml. Çözündürme Çözeltisi (0.3 M Trehalose). Çözündürme çözeltisi, hücre içinde mevcut olan dondan koruyucu maddelerin hücre dışına çıkmasını ve hücre içerisine hücre dışına çıkmış sıvının tekrar hücre içerisine girmesini sağlar. Kimyasal Maddeler Trehalose M2 Ortamı Miktar gr. 10 ml Sıçanlardan PN Embriyoların Eldesi Süperovulasyon Uygulaması (Fazla Sayıda Yumurta Elde Etme) Döllenme sırasında spermanın yumurta içerisine girmesiyle erkek ve dişi pronükleuslar oluşur. Erkek ve dişi pronükleusların birleşmesinden önce (singami öncesi) görünen safhaya pronükleer safha denir. PN embriyoların eldesinde, haftalık ve ortalama gram ağırlığındaki Spraque Dawley Soyuna ait sıçanlar kullanıldı. Tüm bireyleri eş zamanlı aynı kızgınlık döngü safhasına sokma işlemi (Senkronizasyon) için PMSG ve hcg hormonları kullanıldı. PMSG dozu 5 UI/0.1 ml. olmak üzere, 30 UI. karın zarı içine (intra peritonel) saat 12:00 de verildi. PMSG 28

29 enjeksiyonunu takiben 48 saat sonra 15 UI. hcg hormonu saat 12:00 de aynı yöntemle verildi. hcg hormonunun enjeksiyonundan hemen sonra sıçanlar kafeslerde tekli olarak bekletilen döllenme yeteneğine sahip (fertil) erkeklerle bire bir eşleşmeye alındı. Vajinal plak hcg enjeksiyonundan yaklaşık bir saat sonra, birer saat aralıklarla yapılan kontrollerle tespit edildi. Plak gösteren dişilerin plak gösteriş saatleri not edildi. Deney saatine kadar plak gösteren ve göstermeyen dişiler erkeklerin yanından alınmadılar. Deneye başlamadan hemen önce, plak kontrolleri tekrar yapıldı ve vajinal plakları görülen hayvanlar ayrı bir kafese toplanarak deneye alındılar. Plak göstermeyen dişiler ayrıldı ve gebelik şüphelerinden dolayı farklı bir kafeste bekletildiler Sıçanlardan Yumurta Kanallarının (Oviduktların) Eldesi Vajinal plak gösteren hayvanlar, hcg enjeksiyonunu takiben 21. saatte erkeklerin yanından alınarak ameliyathaneye getirildi. Oviduktların eldesinden önce yıkama (M2) ortamı +4 derecedeki dolaptan çıkarıldı, iki adet 35 mm lik petri kutusunda 25 er µl lik damlalar oluşturuldu. Ortamın petri kaplarındaki kontaminasyonu ve buharlaşmayı engellemek amacıyla damlaların üzerleri tamamıyle örtülecek şekilde mineral yağ ile kapatıldılar. Petriler 1 saat boyunca ozmotik bakımdan dengelenmeleri için 37 0 C lik etüvde bekletildiler. Petri kapları 1 ve 2 olmak üzere numaralandı. Yumurta kanallarının izolazyonundan sonra transfer edilmeleri amacıyla bir adet 35 mm lik petri kabına 3 ml M2 ortamı kondu ve petri kabı ısıtıcı tablada bekletildi. Enzimli M2, C deki derin dondurucudan çıkarıldı ve çözünmeleri için 37 0 C lik etüve kondu. Hayvanlar, boyun kırma (servikal dislokasyon) yöntemiyle itlaf edildi. Batın bölgeleri %70 lik alkol ile dezenfekte edildi. Batın dikey olarak bistüri ile kesildi, deri yatay olarak açıldı. Saatçi makası yardımı ile karın zarı uzunlamasına kesilerek iç organlara ulaşıldı. Forsep adı verilen tutucu makas ile karın bölgesinde organlar vücudun üst kısmına alındı. Uterus boyunları ve bunlara bağlı yumurta kanalı (ovidukt) ve yumurtalık bölgeleri (ovaryum) bulundu. Üreme organlarının etrafını 29

30 çevreleyen yağlar dikkatlice uzaklaştırıldı; böylece materyalin daha temiz olması sağlandı. Forseps yardımıyla uterus boynuzu (cornu uterus) gerilerek yumurta kanalı infindibilum ve yumurtalık arasından ve uterus boynuzunun yumurta kanalına geçiş bölgesinden kesilerek ısıtıcı tabla üzerinde bulunan M2 olarak adlandırılına yıkama ortamı içeren petriye transfer edildi. Aynı işlem diğer yumurta kanalı için de uygulandı. Uterus Resim-5.2. Uterus, Ovidukt ve Ovaryum Yumurta Kanalı Yumurtalık Embriyoların Yumurta Kanallarından İzolasyonu Yumurta kanalları, M2 ortamı içerisinde bekletilirken, 50 şer µl lik enzimli ve emzimsiz M2 damlaları 100 mm lik petri kutusu içerisinde oluşturuldu. Damlaların karıştırılmamaları için petri kutusu ortadan dikey olarak çizildi, enzimli bölüme artı, enzimsiz bölüme eksi işaretler konuldu. Oviduktlar hyaluronidaz enzimi içeren M2 damlalarının üzerine kondu. Stereo mikroskop altında 20 misli büyütme ile yumurta kanallarının döllenmenin gerçekleştiği bölgeleri (ampulla) bulundu. İnce bir pens yardımıyla ampullalar uzunlamasına yırtılarak kumuluslarla kaplı hücrelerin damlanın içerisine dağılmaları sağlandı µm çapındaki aktarım pipeti yardımıyla embriyolar birkaç kez pipet içerisine çekilip bırakılarak zona pellusida tabakasını kuşatan kumulus hücreleri enzimin varlığında uzaklaştırıldı. Aktarım pipeti değiştirildi ve embriyolar enzimli M2 de 3-5 dakika beletildikten sonra, enzimsiz M2 ye aktarıldı. Her damlada aktarım 30

31 pipeti değiştirilerek embriyolar en az 3 kez yıkandı ve kumulus hücrelerinden iyice arındırılmaları sağlandı (Resim 5.3). Daha sonra embriyolar ısıtıcı etüvde bulunan ve yaklaşık 1 saat bekletilen M2 damlarına aktarıldı. Resim-5.3 Yumurtalık Yollarının M2 Damlalarından Enzimli M2 Damlalarına Aktarılışları Embriyoların Katı Yüzey Camsı Dondurma (Solid Surface Vitrification) (SSV) Yöntemiyle Dondurulması, Saklanması ve Çözündürülmesi İzole edilen embriyolar arasından sağlam ve kaliteli görünenler, Katı Yüzey Camsı Dondurma (SSV) yönteminde kullanılmak için ayrıldılar. Tüm dondurma, çözündürme ve ozmotik dengeleme ortamları, kullanımlarından yarım saat önce 37 0 C lik etüve kondu. Embriyoların ozmotik bakımdan dengelenmeleri amacıyla M2 medyumu kullanılmıştır. % 4 Etilen Glikol, M2 içerisinde (osmotik dengeleme çözeltisi) hazırlanmıştır. % 35 Etilen Glikol, %5 Polivinil Pirolidon ve 0.4 M Threhalose çözündürülmüştür. Bu çözelti dondurma çözeltisi olarak kullanılmıştır. Çözündürmeçözeltisi ise 0.3 M Threhalose M2 içerisinde çözündürülerek hazırlanmıştır. 31

32 Katı yüzey camsı dondurma işlemi Şekil-1 deki düzenek yardımı ile gerçekleşmiştir. Sıçan Embriyolarının Vitriyiye Olmuş Mikrodamlaları c Metal Küp Aluminyum Folyo Köpük Kap Sıvı Azot (LN 2 ) Şekil-1. Embriyoların Katı Yüzey Camsı Dondurma (SSV) Yöntemi ile Dondurulmasında Kullanılan Düzenek (Dinnyes vd, 2000, Bağış vd, 2002, 2004). Dondurma Düzeneğinin Hazırlanması: İlk önce 100 mm lik petri kabına ozmotik dengeleme çözeltisine 1 adet 65 µl.lik damla ve hemen yanına 3 adet 35 µl.lik dondurma çözeltisiyle damlalar oluşturuldu. Embriyolar 5-7 şerli gruplar halinde M2 ortamından alınarak ozmotik dengeleme çözeltisine aktarıldılar. Burada embriyolar 12 dakika bekletilerek ozmotik bakımdan dengelenmeleri sağlandı. Oniki dakika sonunda yeni embriyo aktarım pipetiyle ozmotik dengeleme çözeltisinde (ekilibrasyon çöezeltisi) bekletilmiş olan embriyolar 1. dondurma damlasına aktarıldı. Yaklaşık her damlada 5 er saniye bekletilerek 3. dondurma damlalarında embriyolar bekletildi. Dondurma çözeltisine bekletilen embriyolar şekil olarak daha yassı ve ince bir hal aldılar. Böylece hücre içi sıvının dondan koruyucu maddeler ile yer değiştirdiği açıkca görülmüştür. Dondurma çözeltisinden alınan embriyolar, önceden hazırlanmış düzenek (Dinnyes vd 2000, Bağış vd 2002) içerisinde bulunan C ye kadar soğutulmuş aluminyum yüzeye her damlada 5-7 adet embriyo olacak şekilde 1,5-2 µl. dondurmaçözeltisi ile birlikte bırakıldı. Sıvı azotun buharı ile embriyoların çok kısa süre içerisinde donduğu gözlendi. Damlaların aluminyum yüzey üzerinde şeffaf 32

33 olmaları gerekmektedir. Mat renkte görünen damlalarda buz kristallerinin şekillendiği unutulmamalıdır. Dondurulmuş embriyolar saklanmak amacıyla daha önceden Sıvı Azot ta (Likit nitrojen LN2) soğutulmuş dondurma tüplerine kondu. Dondurma tüplerinin kapak kısımları 4-5 kez steril enjektör iğnesi ile delindi. Azot tankı içerisine dondurmatüpleri konuldu. Embriyoların çözündürülmesinde yani dondan koruyucu maddelerin hücre içerisinden uzaklaştırılmasında kullanılan çözündürme çözeltisi 37 0 C ye kadar ısıtılmıştır. Dondurma tüpleri sıvı azot tankından çıkarıldıktan sonra kapağı açılıp boncuk taneleri şeklinde donmuş embriyolar direkt olarak 37 0 C de olan çözündürme çözeltisine bırakıldılar. Çözündürme çözeltisinde 3 dakika kadar bekletilen embriyolar daha önce hazırlanan kültür ortamlarına transfer edildiler Deneysel Düzen Bu deneyde aşağıdaki faktörlerin etkileri incelenmiştir: Farklı hormon dozları ile süperovulasyon ve PN embriyoların eldesi. Farklı kültür ortamlarında ve gaz karışımlarında pronükleer safhadaki embriyoların kültür edilmesi. Katı Yüzey Camsı Dondurma (SSV) tekniği ile PN embriyoların dondurulup çözündürülmesi ve kültür edilmesi Farklı Hormon Dozları ile Süperovulasyon ve PN Embriyoların Eldesi Sekiz-12 haftalık Spraque Dawley Soyuna ait sıçanlarının süperovulasyonu için iki farklı hormon dozları kullanıldı. a- Birinci Gruba: PMSG hormonu, 15 IU (300 µl.) - hcg hormonu, 30 IU (600 µl.) b- İkinci Grunba: PMSG hormonu, 30 IU (600 µl.) hcg hormonu, 15 IU (300 µl.) 33

34 Hayvanların ortalama yaşları, ağırlıkları, ışık döngüsü, ısı, nem, yemleme ve sulama, her iki hormon kompozisyon uygulamasında sabit kalmıştır. Herhangi bir değişiklik uygulanmamıştır. hcg enjeksiyonunu takiben dişiler fertil erkeklerle eşleştirildi. hcg enjeksiyonundan 21 saat sonra kumulus hücreleri ile çevrili PN embriyolar elde edildi. Kumulus hücreleri embriyolar hyaluronidaz enzimli M2 ortamı içerisinde kumulus hücrelerinden temizlendi. Kumuluslarından ayrılan PN embriyolar enzimsiz M2 medyumunda 3-4 kez yıkanarak kumulus hücrelerindan iyice arındırıldı ve kültür yapılana kadar M2 medyumunda bekletildi Farklı Kültür Medyumlarında ve Atmosfer Koşullarında PN Embriyoların Kültüre Alınması Elde edilen PN embriyolar, etüvde ve jarda olmak üzere, iki farklı gaz kompozisyonunda kültüre alındılar. a- Etüv (İnkübatör), %5 CO 2 ve %95 hava b- Cam kavanozu (Jar), %5 CO 2, %5 O 2 ve %90 N 2 gaz kompozisyonunda 5 dakika gazlanarak 37 0 C lik inkübatörde bekletildiler. Bütün embriyoların, kültür ortamalarına aktarılmadan önce, kumulus hücreleri enzimli M2 ortamı ile uzaklaştırıldı ve yıkama (M2) ortamı ile transfer öncesi yıkandılar. Bu sistem her iki kültür ortamında da uygulanmıştır. Farklı Gaz Karışımlarında ve Farklı Kültür Medyumlarında Embriyoların KültüreAlınmaları: 1. %5 CO 2 ve %95 hava gaz karışımı koşullarında embriyolar M16 (Withingam)- R1ECM (Sıçan Embriyo Kültür Ortamı) transfer, HECM-1 (Hamster Embriyo Kültür Ortam) sabit, M16 sabit, KSOM (Potasyum Simpleks Optimize Ortamı) sabit, (Gardner) G1 gibi sabit kültür ortamlarında kültüre alındılar. 34

35 2. %5 CO 2, %5 O 2 ve %90 N 2 gaz kompozisyonunda cam kavanozu içinde ve %5 CO 2 ve %95 hava gaz karışımın etüv içinde yapılan embriyo kültürlerinde, M16, KSOM, M16-R1ECM transfer, R1ECM sabit, G1 sabit olarak kullanılmıştır. Not: Cam kavanozunda yapılan embriyo kültür çalışmaları etüvde yapılan embriyo kültür çalışmaları ile karşılaştırılmıştır Katı Yüzey Camsı Dondurma (SSV) Tekniği ile Embriyoların Dondurulup Çözündürülmesi ve Kültür Edilmesi Embriyoların dondurulup hemen çözündürülerek kültüre alınması ve embriyoların dondurulup 15 gün sonra çözündürülerek kültüre alınması olarak iki farklı yöntem kullanılmıştır. Her iki yöntemde de gerek dondurma gerekse kontrol gruplarında farklı kültür ortamları kullanılmıştır ve aynı camsı dondurma ve çözündürme metotları uygulanmıştır. Yapılan kültürlerde kontrol grubu olarak camsıdondurmanın uygulanmadığı taze embriyolar kulanılmıştır. 1.Yöntem: Embriyoların dondurulup hemen çözündürülerek kültüre alınması Çözündürme sonrası elde edilen embriyoların gelişimleri üzerinde kültür koşullarının etkisi iki farklı deneyde araştırıldı. Her iki deneyde de embriyolar, yıkama ortamı içerisinde en az 3 kez yıkanarak embriyoların çözündürme ortamından iyice arındırılmaları sağlandı. 1. Deneyde; embriyolar KSOM ve R1ECM-BSA kültür ortamlarında (medyum) iki grup olarak kültüre alındı. Kültür ortamı %5 CO 2, %95 hava, 37 0 C ve %90 nın üzerinde nem içeren inkübatörlerde saklandı. Kültür sonucunda 2 ve 4 hücreli embriyoların gelişimleri incelendi. 2. Deneyde; M16 ortamına aktarılan çözündürülmüş embriyolar 5,5 saat sonra R1ECM-BSA ortamına aktarıldılar. Birinci deneydeki kültür koşulları aynen sağlandı. 35

36 alınması 2. Yöntem: Embriyoların dondurulduktan 15 gün sonra çözündürülüp kültüre Embriyolar dondurulduktan hemen sonra sıvı azot ile soğutulmuş dondurma tüplerine aktarıldı. Dondurma tüpleri sıvı azot tankı içerisine kondu ve muhafaza edildiler. Embriyolar 15 gün boyunca sıvı azot tankı içerisinde bekletildi. İki günde bir tanktaki azot miktarı kontrol edildi, eksilen azot tamamlandı. On beş, gün sonunda çözündürülen embriyolar iki farklı kültür ortamında kültüre alındı. Çözündürme sonucunda embriyoların bir bölümü KSOM ortamına, diğer bölümüde R1ECM-PVA ortamına aktarıldılar. Yirmi bir saat sonra embriyolar kontrol edildi. İki hücreli faza gelen KSOM ortamındaki embriyolar bir gün önceden hazırlanıp gazlanmış R1ECM-PVA ortamına aktarıldı. KSOM-PVA ortamında yapılan kontrollerde iki hücreli faza geçen embriyolar ise bir gün önceden hazrılanmış ve gazlanmış yeni R1ECM-PVA ortamına transfer edildi. 36

37 6. SONUÇLAR Bu çalışmada; süperovulasyon uygulamaları, kullanılan kültür ortamları ve farklıgaz karışımlarında embriyoların kültüre alınmaları, SSV yöntemi ile camsı bir şekilde dondurulmuş embriyoların çözündürme sonrasındaki kültür koşullarının araştırılması olmak üzere üç farklı deney düzeneği oluşturulmuştur Farklı Hormon Dozları ile Süperovulasyon ve PN Embriyo Eldesi Sonuçları Süperovulasyonda kullanılan hormonların kaliteli ve fazla sayıda PN embriyo eldesini sağlayacak komposizyonlarının saptanması amacıyla yapılan çalışmada;15 UI PMSG - 30 IU hcg ve 30 IU PMSG 15 IU hcg olmak üzere iki farklı protokol kullanılmıştır. Hormon uygulaması iki grupta uygulanmıştır. Birinci grupta 15 IU PSMG 30 IU hcg uygulanmıştır. İkinci grupta 30 IU PSMG 15 IU hcg uygulanmıştır. 15 IU PSMG 30 IU hcg hormon kompozisyonunun uygaldığı birinci grupta 10 sıçandan 175 adet PN embriyo elde edildi (17 PN embriyo/sıçan). Sonuçlar Tablo 6.1 de özetlenmiştir. Tablo IU PMSG, 30 IU hcg Hormon Uygulamasında Elde Edilen Pronükleer Safhadaki Embriyo Sayıları Deney Tarihi Süperovule Edilen Dişi Sayısı Plak Gösteren Dişi Sayısı Elde Edilen Zigot Sayısı Sıçan Başına Zigot Sayısı TOPLAM Ortalama: 15 37

38 30 IU PSMG 15 IU hcg hormon kompozisyonunun uygulandığı ikinci grupta 52 sıçandan 1407 adety PN embriyo elde edilmiştir (27 PN embriyo/sıçan).. Sonuçlar Tablo-6.2 de özetlenmiştir. Tablo IU PMSG, 15 IU hcg Hormon Uygulamasında Elde Edilen Pronükleer Safhadaki (PN) Embriyo Sayıları Deney Tarihi Süperovule Edilen Dişi Sayısı Plak Gösteren Dişi Sayısı Elde Edilen PN Embriyo Sayısı Sıçan Başına PN Embriyo Sayısı TOPLAM Ortalama: 27 38

39 Tablo-6.3. Değerleri İki farklı Hormon Kompoziyonunu Zigot Eldesi Üzerindek İstatistiki Hormon miktarı Sıçan sayısı Zigot sayısı Sıçan başına zigot sayısı Grup 1 15 IU PMSG + 30 IU hcg a Grup 2 30 IU PMSG + 15 IU hcg b a-b Aynı kolondaki harfler istatiksel farklılığı göstermektedir. P < Elde edilen sonuçlara göre, 30 IU PMSG + 15 IU hcg hormon uygulaması 15 IU PMSG + 30 IU hcg hormon uygulamasına göre, sıçan başına istatistiksel olarak anlamlı düzeyde daha fazla sayıda PN embriyo elde edildiği görülmektedir (p <0.05). Sıçan Başına Zigot Sayısı Hormon Dozlarının Zigot Sayılarına Etkisi 15 IU PMSG - 30 IU hcg 30 IU PMSG- 15 IU hcg HCGHCGHCGHCGHCGHCGHCGHCGHCGHCGHCGHC 39

40 Farklı Kültür Medyumlarında ve Gaz Karışımlarında PN Embriyoların Kültür Sonuçları Kültür medyumlarının ve gaz kompozisyonlarının hücre gelişmeleri üzerindeki etkilerinin karşılaştırılması iki farklı çalışma ile özetlenmiştir. a- Etüvde ( %5 CO 2 ve %90 hava) yapılan embriyo kültürü çalışmaları b- Hem etüv hem cam kavanozunda (%5 CO 2, %5 O 2 ve %90 N 2 ) karşılaştırmalı olarak yapılan embriyo kültürü çalışmaları Etüvde Yapılan Embriyo Kültür Çalışmaları Süperovulasyon yöntemi ile elde edilen PN embriyoların en uygun kültür koşullarını saptamak amacıyla yapılan denemelerde, 4 farklı ortam ve kültür sistemi kullanılmıştır. Bu deneyde kullanılan toplam PN embriyo sayısı 151 adettir. G1, M16 ve HECM-1 embriyo kültür ortamlarında yapılan kültür çalışmalarında, PN embriyolar kültür boyunca aynı kültür damlaları içerisinde bırakılmıştır. M16-R1ECM/BSA Embriyo-BSA ortamlarında yapılan kültür çalışmasında PN embriyolar ilk önce M16 ortamına aktarılmış ve 20 saat sonra iki hücreli PN embriyolar R1ECM-BSA ortamına transfer edilmişlerdir. G1 ortamına aktarılan 13 adet PN embriyoda herhangi bir gelişme görülmemiştir. M16 ortamında ise 49 adet PN embriyo kültüre alınmış, %28.5 i 2 hücreli, %10.2 si 3 hücreli ve % 6.1 i 4 hücreli safhaya gelmiş ve gelişmeleri durmuştur. HECM-1 kültür ortamında 54 adet PN embriyo kullanılmış, %25.9 u iki hücreli, %12.9 u 3 hücreli safhaya ulaşmıştır ve ilerleme kaydedilmemiştir. M16 ortamına 35 adet PN embriyo aktarılmıştır. 20 saat sonra PN embriyoların %65.7 si iki hücreli safhaya gelmiş ve bu PN embriyolar bir gece önceden hazırlanmış olan R1ECM-BSA ortamına transfer edilmiştir. Transfer sonrası PN embriyoların % 34.2 si 3 hücreli, %22.8 i 4 hücreli safhaya gelmiştir. Yüzde 2.8 i ise morula safhasına gelmiştir. M16-R1ECM/BSA (20 saat sonra transfer) ortamında yapılan kültür çalışmalarında gözlemlenen embriyo bölünme oranları, G1, M16 (sabit) ve HECM-1 ortamlarındakinden daha iyi bulunmuştur. Sonuçlar aşağıdaki Tablo-6.4 te özetlenmiştir. 40

41 Tablo-6.4 Etüvde Kullanılan Kültür Ortamlarındaki Hücre Bölünme Sayıları. ORTAM ZİGOT 2 HÜCRE 3 HÜCRE 4 HÜCRE MORULA G M (%28.5) 5 (%10.2) 3 (%6.1) - HECM (%25.9) 7 (%12.9) - - M16- R1ECM.BSA 35 23(%65.7) 12 (%34.2) 8 (%22.8) 1 (%2.8) Etüv ve Cam Kavanozda (JAR) Yapılan Embriyo Kültür Çalışmaları Etüv ve cam kavanoz olmak üzere iki farklı gaz kompozisyonunun embriyo gelişimleri üzerindeki etkilerinin denenmesi için yapılan çalışmada, 114 adet PN embriyo kullanılmıştır. M16, G1 ve R1ECM-BSA olmak üzere üç farklı kültür ortamı kullanılmış ve kültür sırasında herhangi farklı bir ortama transfer gerçekleşmemiştir. En yüksek iki hücreli safhaya ulaşma oranı cam kavanozda R1ECM-BSA ortamında görülmesine karşılık (%59); 4 hücreli safhaya ulaşmış embriyo cam kavanozda M16 kültür ortamında %4 oranında gözlemlenmiştir. G1 kültür ortamının kullanıldığı her iki gaz kompozisyonunda iki hücreli embriyo gözlemlenmiştir. Fakat etüvde gerçekleşen kültür çalışmasında cam kavanoz ortamına göre (%12) daha fazla oranda bölünme gerçekleşmiştir (%40). Etüv ve cam kavanozda kullanılan R1ECM-BSA ortamında kültüre alınan embriyolardaki iki hücreli safhaya geçiş oranında çok fazla bir fark gözlemlenmemiştir. Sonuçlar aşağıdaki Tablo-6.5 te özetlenmiştir. 41

42 Tablo-6.5. Etüv ve cam Kavanozda Kullanılan Kültür Ortamlarındaki Hücre Bölünme Sayıları DENEY GRUPLARI ORTAM(MEDYUM) ZİGOT 2 HÜCRE 4 HÜCRE CAM KAVANOZ M (%56) 1 (%4) ETÜV M (%18) - CAMKAVANOZ G (%12) - ETÜV G1 5 2 (%40) - CAMKAVANOZ R1ECM.BSA 18 7 (%59) - ETÜV R1ECM.BSA 19 6 (%51) Katı Yüzey Camsı Dondurma (SSV) Yöntemi ile Camsı Dondurulmuş (Vitrifiye Edilmiş) Embriyoların Çözündürme Sonrasındaki Embriyo Kültürlerinin Karşılaştırılması Embriyoların dondurulup hemen çözündürülerek kültüre alınması ve embriyoların dondurulduktan 15 gün sonra çözündürülüp kültüre alınması olmak üzere iki farklı yöntem üzerinde çalışılmıştır. Bütün kültürler etüvde gerçekleştirilmiştir. Cam kavanozu kullanılmamıştır. Embriyoların SSV camsı dondurma yöntemiyle dondurulmasında toplam 106 adet PN embriyo kullanılmıştır. Kontrol grubu olarak kullanılan olası PN embriyo sayısı 80 adettir. İlk iki çalışmada, PN embriyolar dondurulduktan hemen sonra çözündürülmüştür. Çözündürme sonunda PN embriyolarda herhangi bir dejenerasyona rastlanılmamıştır. İlk çalışmada, KSOM ve R1ECM-BSA ortamları kullanılmıştır. KSOM ortamında 19 PN embriyo dondurulduktan sonra çözündürülmüş; bunların %68 i 2 hücreli aşamaya ve %23 ü 4 hücreli aşamaya gelmiştir. Bununla birlikte, KSOM ortamındaki kontrol grubununda yapılan kültür çalışmasında 15 PN embriyonun %60 ı 2 hücreli, %13 ü 4 hücreli safhaya ulaşmıştır. Buna karşılık R1ECM-BSA ortamındaki dondurma ve çözündürme işlemlerinde 35 PN embriyodan %43 ü 2 hücre, 42

43 %14 ü 4 hücreli safhaya ulaşırken, aynı ortamın kontrol grubunda 45 PN embriyodan %71 i 2 hücreli safhaya ulaşırken %11 i 4 hücreli safhaya gelmiştir. Sonuçlar aşağıdaki tablo 6.6. da özetlenmiştir. Tablo-6.6. KSOM ve R1ECM-BSA Ortamlarında, Kontrol ve Dondurma-Çözündürme Sonrasındaki Hücre Bölünme Sayıları. DENEY ORTAM PN 2 HÜCRE 4 HÜCRE GRUPLARI (MEDYUM) EMBRİYO DONDURMA KSOM (%68) 5 (%23) a b KONTROL KSOM 15 9 (%60) 2 (%13) a DONDURMA R1ECM.BSA (%43) 4 (%14) b c KONTROL R1ECM.BSA (%71) 5 (%11) c a Dondurma KSOM & Kontrol KSOM P<0.024 b Dondurma KSOM & Dondurma R1ECM.BSA P=0.11 c Dondurma R1ECM.BSA & Kontrol R1ECM.BSA P=0.08 (Paired t-test) İkinci çalışmada 40 adet PN embriyo zigot kullanılmıştır. M16 ve R1ECM-BSA olmak üzere iki farklı ortam üzerinde araştırma yapılmıştr. Dondurma ve kontrol gruplarında kullanılan PN embriyolar M16 ortamına aktarıldılar ve 20 saat sonra R1ECM-BSA ortamına transfer edildiler. M16, R1ECM-BSA ortamlarının 2 ve 3 hücreli safhalarında fark yoktur. Bununla birlikte sadece kontrol grubunda 20 adet PN embriyonun %10 u 4 hücreli safhaya ulaşmıştır. Sonuçlar aşağıdaki Tablo-6.7 de özetlenmiştir. 43

44 Tablo-6.7. M16-R1ECM.BSA Transfer, Kontrol ve Dondurma Çözündürme Sonrasındaki Hücre Bölünme Sayıları. DENEY GRUPLARI MEDYUM ZİGOT 2 HÜCRE 4 HÜCRE DONDURMA KONTROL M16- R1ECM.BSA M16- R1ECM.BSA (%50) 3 (%15) a (%70) 3 (%15) a a- Dondurma M16-R1ECM.BSA & Kontrol M16-R1ECM.BSA P>0.05 (Paired t-test) PN embriyoların dondurulup, sıvı azot içerisinde 15 gün bekletilip çözündürme sonucundaki kültür koşullarını arşatırmak amacıyla yapılan denemelerde 52 adet PN embriyo kullanılmıştır. Çözündürme sonucunda iki farkı kültür ortamı kullanılmış ve hücrelerin bölünme oranları araştırılmıştır. Otuz adet PN embriyo KSOM ortamına aktarılmış ve 6 saat sonra R1ECM-PVA ortamına transfer edilmiştir. Yirmiiki adet PN embriyo ise R1ECM-PVA ortamına aktarılmış ve kültür boyunca aynı ortamda sabit bırakılmıştır. Elde edilen sonuçlar KSOM - R1ECM-PVA transfer kültüründe R1ECM- PVA sabit kültürüne göre 2-4 hücreli faza geçme oranları yüksek bulunmuştur. Bunlara ek olarak, 30 PN embriyonun %3 ü KSOM-R1ECM-PVA transfer kültür koşullarında 8 hücreye ulaşmıştır. Sonuçlar Tablo-6.8 de özetlenmiştir. Tablo-6.8. KSOM-R1ECM.PVA, Dondurma ve 15 Gün Sonra Çözündürme Sonrasındaki Hücre Bölünme Sayıları ile ilgili sonuçlar. DENEY PN EMBRİYO 2 HÜCRE 4 HÜCRE 8 HÜCRE GRUPLARI SAYISI KSOM R1ECM.PVA (%50) 7 (%23) a 1 (%3) R1ECM.PVA 22 7 (%32) 1 (%5) a - a- KSOM-R1ECM.PVA & R1ECM.PVA P<0.029 (Paired t-test) 44

45 7. TARTIŞMA Sunulan araştırmada, sıçanlardan embriyo eldesi için farklı dozlarda PMSG ve hcg hormonları kullanılarak PN embriyolar elde edildi. Bu PN embriyolar; embriyo kültürü ve embriyo dondurma çalışmalarında kullanıldı. Embriyo kültür çalışmalarında farklı ortamlarının ve farklı gaz karışımlarının embriyo gelişimi üzerine etkileri incelendi. En iyi embriyo kültür koşulları belirlendikten sonra, Katı Yüzey Camsı Dondurma (SSV) tekniği ile dondurulup çözündürülen PN embriyoların kültürleri yapıldı. Dişilerin eş zamanlı uyarımlarında sıklıkla kulanılan hormonlar; PMSG, hcg, hmg, ecg olarak sıralanabilir. Pregnant Mare s Serum Gonadotropin (PMSG), gebe kısrakların endometriumlarında fetal trophoblast hücreleri tarafından üretilmektedir. Diğer adıyla gebe kısrak serum hormonu olarak tanımlanır. PMSG, az miktarda Luteinleştirici Hormon (LH) etkili olsa da ağırlıkta Folikül Uyarıcı Hormon (Folikül Stimulating Hormon FSH) etkilidir. PMSG nin yarılanma ömrünün diğer hormonlara göre daha uzun olması; folikül gelişimini ve süperovulasyonu sağlamak amacıyla tek enjeksiyonun yeterli olmasına olanak sağlamaktadır (Bağış 1994). FSH nın tek doz kullanılması süperovulasyonda etkili olmamaktadır. FSH ın yarılanma ömrü saat kadar olmaktadır. Dolayısıyla tek dozun uygulanması uygun değildir. Dozların belirli aralıklarla tekrarlı olarak uygulanması maliyet ve işçilik arttıracağından PMSG nin tek başına kullanılması FSH kullanımına göre daha avantajlıdır (Bağış 1994, Bağış vd 2000). İnsan Embriyo Gonadotrropin, (Human Chorionic Gonadotropin (hcg), ağırlıkta LH etkilidir. Foliküllerde olgunlaşmış yumurtaların ovulasyonunu sağlamaktadır (Bağış 1994, Bağış vd 2000). İnek, domuz, koyun, keçi gibi çiftlik hayvanlarında FSH uygulamasında PMSG ile karşılaştırıldığında daha kuvvetli süperovulasyon sağlanmaktadır. Aynı şekilde, FSH uygulaması sıçan, tavşan ve fare (Popova vd 2002) gibi laboratuar hayvanlarında PMSG kullanımından daha fazla oranda ovulasyona neden olmaktadır. Bununla beraber, süperovulasyon için uygulanan PMSG protokolü farelerde tekrarlı ve etkili bir şekilde kullanılmaktadır (Popova vd 2002). 45

46 PMSG nin ilk olarak sıçanlarda süperovulasyon amacıyla uygulanmasında başarılı olunamamıştır (Popova vd 2002). Olgunlaşmamış (immatür) Spraque Dawley Soyuna ait sıçanlarda düşük oranda PSMG (10 IU) verilmesi ile az miktarda yumurta elde edilmiştir. Fakat PMSG dozunun yüksek oranda verilmesi sonucunda ise anormal embriyo gelişimleri gözlemlenmiştir (Popova vd 2002). Süperovulasyon için uygulanan FSH protokolünün sıçan yumurtalarının çok fazla sayıda ve normal bir şekilde gelişimlerini sağladığı belirtilmiştir (Popova vd 2002). Sıçanlarda, süperovulasyon yöntemiyle olgun yumurta ve embriyoların eldesi; Equine Chorionic Gonadotropin (ecg) ve hcg hormonlarının enjeksiyonu ile yapılmaktadır (Ishigame vd 2005). Mature olmuş sıçanların farklı kızgınlık döngüsü dönemlerinde bulunacağından dolayı gonadotropin uygulamalarına karşı farklı reaksiyon göstereceklerdir. Bu da olgunlaşmamış sıçanları süperovulasyon prosedürü için daha elverişli kılmaktadır. Diğer taraftan yüksek dozda ecg kullanımı yumurta kalitesinde düşüşe ve hatta hasara neden olmaktadır. Bu da döllenme bozukluğunu ve implantasyon öncesi gelişimi olumsuz yönde etkilemektedir. Bu ters etkilerin dışarıdan sağlanan follikül uyarımı sonucunda kullanılan ecg nin kalıtımsal uzun biyolojik yarı ömründen dolayı olduğu düşünülmektedir (Ishigame vd 2005). Son yıllarda geliştirilen protokollerde uygulanan yeni tekniklerle birlikte, farelerden ve sıçanlardan daha fazla ve kaliteli yumurta elde edildiği görülmektedir. Hormon kombinasyonu olarak PMSG ve 48 saat sonra hcg hormonlarının karın zarı içi yolla farklı oranlarda verilimi yaygın olarak kullanılmaktadır (Bağış vd 2004, Bağış 1994, Sağırkaya 2001, Bağış 2000). Süperovulasyon yönteminde kullanılacak hormon ve kompozisyonu sıçanlarda zigot eldesini birinci derecede etkileyen faktördür. Yapılan araştırmalarda hayvanının yaşı, ağırlığı ve ışık döngüsü, uygulanan süperovulasyon protokolünü olumlu ya da olumsuz yönde etkilemektedir. Her zaman aynı yaş ve ağırlıkta hayvan kullanımı olanaksızdır. Bu durum farklı yaş ve ağırlıktaki hayvanlara uygulanan aynı süperovulasyon protokollerinde yumurta ve PN embriyo sayılarında istemeden değişiklikler meydana getirmektedir (Mukumoto vd 1995). Bu çalışmada,10-12 haftalık yaşlarda olgun (mature) sıçanlar kullanılmışıtır PMSG ve hcg hormonlarının doğru dozlarda kullanılması amacıyla, hormon miktarları hayvanın ağırlığına göre 46

47 hesaplanmış ve ona göre protokol uygulanmıştır. Böylece elde edilecek PN embriyo sayılarında çok büyük farklılıklar gözlemlenmemiştir. Ishigane ve ark. (2004) yapmış olduğu bir çalışmada eşit dozda PMSG ve hcg (150 UI/kg) kullanmış ve denek başına 58 ±12.1 adet yumurta elde etmiştir. Fakat elde edilen yumurtaların kalitesi ve kültür koşullarında gelişimleri oldukça düşük bulunmuştur. Popova ve ark. (Popova vd 2002) yapmış oldukları bir çalışmada, PMSG/hCG hormonlarını sıçan başına 15UI/30UI, 15UI/20UI dozlarda ayrı ayrı uygulamış ve yaklaşık 35 adet PN embriyo elde etmiştir. Fakat bu PN embriyoların kalitesi düşük bulunmuştur. Sunulan çalışmada 15 UI PMSG-30 UI hcg ve 30 UI PMSG- 15UI hcg olmak üzere iki farklı süperovulasyon protokolü uygulandı. Sonuç olarak 30 UI PMSG - 15 UI hcg uygulamasında diğer uygulamaya göre daha yüksek sayıda PN embriyo elde edilmiştir (Akkoç vd 2006). Çalışmada, elde edilen PN embriyoların kültürleri etüvde, etüvde ve camkavanozda olmak üzere iki ayrı grupta ve farklı gaz kompozisyonu içeren ortamlarda yapılmıştır. Cam kavanozu; %5 CO 2, %5 O 2 ve %90 N 2, etüv; %5 CO 2 ve %95 hava içermektedir. Popova ve ark. (2002) tarafından yapılmış çalışmada embriyo kültürü için %5 lik CO 2 ve %90 hava 37 0 C lik ortam kullanılmıştır. Kasai ve ark.(1996) PN embriyoları düşük oksijen (%5 O 2, %5 CO 2 ve %90 N 2 ) veya yüksek oksijen (%20 O 2, %5 CO 2 ) ortamlarında HECM-1 ortamı ile kültüre almışlardır. 120 saat sonra yapılan karşılaştırmada blastosist oranlarının düşük oksijen konsantrasyonunda yüksek oksijenli kültür ortamına göre daha iyi geliştiğini göstermişlerdir. Ayrıca Mastroiami ve Jones yapmış oldukları çalışmada, intraoviduktal oksijen konsantrasyonunun memeli türlerinde atmosferdeki %5 oksijene denk gelen mmhg. olduğunu göstermişlerdir. Yapmış olduğumuz çalışmada M16 otamında %5 O 2 li cam kavanozu ortamında etüvde (%20 O 2 ) yapılan çalışmaya göre daha fazla sayıda 2 hücreli evreye ulaşmış embriyo elde edilmiştir ayrıca 4 hücreli evreye de ulaşılmıştır. Kaynaklarda, sıçan embriyo kültürlerinde G1 ortamı ile ilgili bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Yaptığımız çalışmada, G1 kültür ortamının embriyo gelişimi üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Embriyolar, G1 ortamında R1ECM-BSA ve M16 ortamına göre daha düşük oranda gelişme göstermiştir. 47

48 Zhou Y. ve ark. (2003) tarafından yapılan çalışmada PN embriyoları KSOM ye aktarılmış ve kültürün 18. saatinde embriyolar mr1ecm ortamına aktarılmışlardır. Yedinci günün sonunda kültüre alınan 57 PN embriyodan 69 unda (%83) blastosist gelişimi gözlenmiştir. Yapmış olduğumuz çalışmada blastosist elde edilememiştir. Bunun nedenlerinden en önemlisi hazırlamış olduğumuz mr1ecm kültür ortamının ozmolaritesinin istenilen değerden çok düşük değerde elde etmemizdir. Yapmış olduğumuz başka bir çalışmada mr1ecm kültür ortamının NaCl molaritesini 76.4 mm dan 100 mm a çıkardık. Yapılan kültür çalışmasında %19 blastosist elde edildi. Sıçan embriyo dondan korunmaları, genetik teknolojinin avantajları sebebiyle oldukça büyük önem taşımaktadır. En önemlisi; hastalıkların genetik bakımdan etkileri üzerindeki çalışmalarda model sıçanların kullanılmasıyla daha hızlı bir şekilde ilerleme sağlanacağı düşünülmektedir (Reinhold vd 2000). Sıçan modellerinin artması ile yetiştirme koşullarında zorlukların çıkabileceği, bunlara ek olarak oluşturulan yeni hayvan modellerinin zamanla doğal afetlerle ve mutant etkenlerle oluşabilecek kayıplar nedeniyle kaybolma tehlikesi olması, yeni dondan koruma tekniklerine daha çok gereksinim duyulduğunu açıkça gözler önüne sermektedir (Pfaff vd 2000). Bunun için çalışmamızda embriyoların dondan korunmaları da değerlendirilmiştir. Camsı yüzey dondurma yöntemiyle embriyo dondurma çalışmalarında, embriyoların hücre içi sıvıları dondan koruyucu maddeler ile yer değiştirdiği için dondurma sırasında hücreler soğuk etkilerden korunmaktadır (Sağırkaya 2001, Kasai 1996). Özellikle hücre içerisine nüfuz edebilen Gliserol, EG ve DMSO gibi düşük molekül ağırlıklı dondan koruyucu maddelerin kullanılması ile hücre içi sıvının bu dondan koruyucu maddeler ile yer değiştirmesi sonucu hücreler dehidre olur (Bağış vd 2005, Bağış vd 2004, Bağış vd 2002, Sağırkaya ve Bağış 2003). Hücre içerisine nüfuz eden düşük molekül ağırlıklı dondan koruyucu maddelerin hücrede zehirlenme oluşturma riski, hücre içerisine giremeyen dondan koruyucu maddelere göre daha fazla olmaktadır. Özellikle EG ile dondurulan embriyolar için EG nin zehirli etkiye sahip olmasından dolayı hücrelerin EG içeren solüsyonlar içerisinde fazla süre bekletilmemesi gerektiği bildirilmektedir (Sağırkaya ve Bağış 2003, Sağırkaya 2001). Camsı bir biçimde donmuş hücrelerin çözündürülmesinde hücre içerisine nüfuz edemeyen maddeler kullanılmalıdır. Böylelikle hücre içine nüfuz etmiş dondan koruyucu madde, ozmotik basınç oluşturularak hücre dışına çıkarılmış olunur. 48

49 Bağış ve ark (2002) yapmış olduğu camsı yüzey dondurma çalışmasında, hücre içerisine nüfuz eden 2 farklı dondan koruyucu madde (DMSO ve EG) karışımları ile birlikte hücre içerisine nüfuz edemeyen 3 dondan koruyucu maddeden (Sucrose, Trehalose ve Raffinose) en az birinin birlikte kullanılması sonucu, fare embriyolarının dondan korunmalarında olumlu sonuçların alındığı bildirilmiştir. Bununla beraber camsı yüzey dondurmanın başarısı, dondan koruyucu maddelerin hücre içinde ve dışındaki konsantrasyonlarına ve ozmotik dengelenmeleri bakımından düşük konsantrasyonlarda hücre içerisine nüfuz eden dondan koruyucu maddelerin kullanılmasına bağlı olduğu belirtilmiştir (Bağış vd 2002). Dinnyes vd. (2000) inek yumurtlarının dondurulmasında geliştirilen SSV yöntemi ile camsı yüzey dondurma, sıvı azot içerisine kısmen batırılmış ve metal yüzeyin aluminyum folyo ile kaplanmış alana yumurtalar; 1-2 µl.lik camsı yüzey dondurma çözeltisi içeren damlalar halinde bırakılmıştır. Sıvı azotun buharı ile embriyolar çok kısa süre içerisinde vitröz ve camsı bir faza geçmiş ve vitrifiye olmuşlardır. Bağış vd. (2004) PN safhadaki fare embriyoları Katı Yüzey Camsı Dondurma (SSV) yöntemiyle dondurulup çözündürülmüş ve sağlam görünen embriyolara mikroenjeksiyon yöntemiyle gen tranferi yapılmış ve transfer sonunda transgenik fare yavruları elde edilmiştir (Sağırkaya ve Bağış 2003). Bağış ve arkadaşlarınca yapılan başka bir çalışmada SSV vitrifikasyon metodu kullanılmış, pronükleer fare embriyolarının camsı yüzey dondurma çözeltilerinin farklı ozmotik dengeleme zamanlarında oluşabilecek zehirliliği test edilmiştir. Yapılan bu çalışmada 0, 5, 10, 15 ve 20 dakika olmak üzere 5 farklı ozmotik dengeleme süresi araştırılmıştır. Kullanılan ozmotik dengeleme çözeltisi %4 (v:v) EG içeren M2 ortamıdır. En iyi sonuç, 15 dakikalık ozmotik dengelemenin ugulandığı PN embriyolarının kültürlerinde elde edilen 2 hücreli embriyo oranı % 87 bulunmuştur. (Bağış vd 2005). Sunulan çalışmada aynı ozmotik dengeleme yöntemi sıçan embriyoları üzerinde uygulanmış, dondurma ve çözündürme sonucunda PN embriyolarında herhangi bir morfolojik dejenerasyona rastlanılmamıştır ve çözündürme sonunda PN embriyo canlılık oranları %100 e yakın bir sonuç vermiştir. Yapılan bu çalışmada, çözündürüme sonrasındaki embriyolar KSOM, M16, mr1ecm-bsa ve mr1ecm-pva ortamlarında kültür edildi. Embriyoların 4 hücreli 49

50 faza gelme oranları KSOM (sabit) ve KSOM-mR1ECM/PVA (20 saat sonra aktarım) kültür medyumlarında gözlemlenmiştir. Elde edilen bölünme oranları sırasıyla %23 ve %23 olmuştur (Akkoc vd 2006). Bununla beraber KSOM R1ECM/PVA (20 saat sonra transfer) kültür medyumunda %3 oranında 8 hücreli embriyo görülmüştür. Dondurma ve çözündürme sonrası sağlam görünen PN embriyolar R1ECM-BSA sabit ve M16 - R1ECM-BSA (20 saat sonra aktarım) kültürlerinde gelişimleri gözlenmiş ve en iyi bölünme R1ECM-BSA (sabit) kültür koşulunda % 14 oranında 4 hücreli enbriyo eldesiyle gerçekleşmiştir. M16 R1ECM/BSA ortamlarının kullanılarak yapılan kültürlerde 4 hücreli embriyoya rastlanılmamıştır. Sonuç olarak sunulan çalışmadan süperovulasyon ile sıçan embriyolarının elde edilmesi, sıçan embriyolarının kriyoprezervasyonun mekanizması, dondurmada kullanılan ve dondan koruyucu maddeler ve dondan korumaya (kriyoprezervasyona) etki eden faktörler hakkında bazı önemli bilgiler elde edilmiştir. Ayrıca, sunulan çalışma ile ilk defa Katı Yüzey Camsı Dondurma (SSV) tekniği ile sıçan PN embriyolarının dondurulabildiği, çözündürülme sonucunda %100 e yakın canlılık oranlarına sahip olduğu ve hücre kültürü ile 2-4 hücreli aşamaya geldikleri gösterilmiştir. Elde edilen bu teknik bilgiler ileride yapılacak transgenik sıçan üretim çalışmalarında kullanılacak bilgi birikiminin oluşmasına önemli katkı sağlayacaktır. 50

51 EKLER Ek-1 Oviduktun Ampulla Bölgesi 51

52 Ek-2: Kumulus Hücreleriyle Kaplı Zigotlar Ek-3: Pronükleer Safhadaki Embriyo 52

53 Ek-4: İki Hücreli Embriyo Ek-5: Dört Hücreli Embriyo 53

54 Ek-6: Sekiz Hücreli Embriyo Ek-7: Blastosist Aşamasına Gelmiş Embriyolar 54

55 KAYNAKLAR: Ahmad M, Özkoca A, İleri K, Papuççuoğlu S, Usta S,1992,Effect of Variable Concentration of Bovine Serum or Rabbit Embryo Development. Pakistan Vet. Journal. 12 (4): Akkoc T, Bagıs H, Soysal M.I, 2006, The Effect of KSOM and R1ECM-BSA Culture Medium in SSV Vitrification in Spraque Dawley Rat Pronuclear-Stage Embryos. (kabul edildi, basımda). Akkoç T, Soysal M.İ, Bağış H, 2006, Spraque Dawley Sıçanlarında Zigot Eldesi ve Farklı Kültür Medyumlarının Embriyo Gelişimi Üzerine Etkisi. 18. Ulusal Biyoloji Kongresi, Haziran 2006, Kuşadası/Aydın. Bagis H, Odaman H, Sagirkaya H, Dinnyes A, 2002, Production on Transgenic Mice from Vitrified Pronuclear-Stage Embryos, Molecular Reproduction and Development, 61: Bagis H, Odaman H, Sagirkaya H, Dinnyes A, 2004, Vitrification of Pronuclear-Stage Embryos on Solid Surface (SSV) Versus in Cryotube: Comparasion of the Effect of Equilibration Time and Different Sugars in the Vitrification Solution, Molecular Reproduction and Development, 67: Bağış H, Arat S, Akkoc T, 2006, Deney Hayvanları Pratik Kullanım Kurs Kitabı, TÜBİTAK- Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Araştırma Enstitüsü, Transgen ve Deney Hayvanları Laboratuarı. Bağış H, Arat S, Keskintepe L, Odaman H, Sağırkaya H, 2000, Fare Embriyolarında Uygulamalı Mikroenjeksiyon ve Trangenic Manupilasyonlar Uygulamalı Eğitim Kurs Kitabı, TÜBİTAK-Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Araştırma Enstitüsü, Transgen ve Deney Hayvanları Laboratuarı. Bagis H, Mercan HO, Cetin S, Sekmen S, 2005, The Effect of Equilibration Time on Survival and Development Rates of Mouse Pronuclear-Stage Embryos Vitrified in Solid Surface (SSV) and Convential Straws: in Vitro and in Vivo Evaluations, Molecular Reproduction and Development, 72: Bagis H, Aktoprakligil D, Odaman Mercan H, Turgut G, Yurdusev N,, Sekmen S, Cetin S, Arat S, Cirakoglu B: Stable Transmission and Transcription of Newfounland Ocean Pout Type III Fish Antifreeze Protein Gene (AFP) in Transgenic Mice and Hypothermic Storage of Transgenic Ovary and Testis. Mol. Reprod. Dev (Basımda) Bağış H Transgenik Fare Eldesine Yönelik Çalışmalar, Doktora tezi, İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Döelrme ve Sun'i Tohumlama Anabilim Dalı. 55

56 Charreau B, Tesson L, Soulillou J-P,Puorcel C, Anegon I, 1996, Transgenesis in Rats: Technical Aspects and Models, Transgenic Res,5: Dinnyes A, Bağış H, Ji W, Kikuchi K, Lee J.W, Li X, Presicce GA, Somfai T, Si W, Yang X, 2003, Gene Banking in Rare Breeds and Species whose Gametes are Difficult to Cryopreserve, Animal Husbandry and Nutrition, 52: Dinnyes A, Dai Y, Jiang S and Yang X, 2000, High Developmental Rates of Vitrified Bovine Oocytes Following Parthenogenetic Activation, In Vitro Fertilization and Somatic Cell Nuclear Transfer, Biology of Reproduction, 63, Gordon J.W, Ruddle F.H, 1983, Gene Transfer into Mouse Embryos Production of Transgenic Mice by Pronuclear Injection. Methods Enzymology, 101: Gökçen H, 1989, Reprodüktif Fizyoloji Alanındaki Son Gelişmelerin Pratikteki Yansımaları, Bursa Vet. Hek. Odası 2. Mesleki Eğitim Semineri (Tebliğ Özetleri), Mayıs. Hammer RE, Maika SD, Richardson JA, Tang J, Taurog J, 1990, Spontaneous Inflammation disease in Transgenic Rats Expressing HLA-B27 and Human β2m: an Animal Model of HLA-B27-Associated Human Disorders. Cell, 63: Han MS, Niwa K, Kasai M, 2003, Vitrificaiton of rat Embryos at Various Development Stages, Theriogenology, 59: Hogan B, Constantini F, Lacy E, 1986, Manipulating the Mouse Embryp, A laboratory Manuel, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Ishigame H, Medan MS, Kawaguchi M, Fukuda J, Watanabe G, Araı KY and Taya K, 2005, Induction of Superovulation by Immuneutralization of Endogenous Inhibin in Immature Rats, Journal of Reproduction and Development. Ishigame H, Medan MS, Watanabe G, Shi Z, Kishi H, Arai KY, Taya K, 2004, A New Alternative Method for Superovulation Using Passive Immunization Against Inhibin in Adult rats, 71, İleri K, Sayın T, 1986, Sığırlarda Embriyo Transfer Çalışmaları, İst. Ünv. Vet. Fak. Derg.12 (1): Jones R, 1965, Oxygen Tension in the Oviduct of the Rhesus monkey, Fertil, Steril, 27,

57 Kasai M, 1996, Siple and Efficient Methods for vitrification of Mammalian Embryos, Animal Reproduction Science, 42, Mukumoto S, Mori K and Ishikawa H, 1995, Efficient Induction of Superovulation in Adult Rats by PMSA and hcg, Experimental Animal, 44(2), Okamoto K, 1969, Spontaneous Hypertension in Rats, Int Rev Exp pathol, 7: Özkoca A, İleri K, sayın T, 1984, Tavşanlarda Oviduct Yıkaması Yöntemiyle Embriyo Kazanımı ve Transplantasyon Üzerinde Araştırmalar. İst Ünv. Vet. Fak. Derg. 10 (1):1-25. Palasz AT, Alkemade S, Mapletoft RJ, 1993, Sodium Hyaluronate as a Substitute for Biological Protein in Bovine and mose Freezing, Criyobiology, 30: Palazt A.T, Mapletoft R.J, 1996, Cryopreservation of Mammalian Embryos and Oocytes, Biotechnology Advances, 14: Papuççuoğlu S, İleri K, 1994, PMSG'nin iki Farklı Uygulaması ile Kazanılan Tavşan Embryolarının Değişik Vasatlarda Kültürleri ve Transferi. Türk Vet. Hayv. Derg. 18(2):53-58 Pfaff RT, Agca Y, Liu J, Woods EJ, Peter AT, Critser JK, 2000, Cryobilology of Rat Embryos I: Determination of Zygote Membrane Permeability Coefficients for Water and Cryoprotectants, Their Activation Energies, and the Development of Improved Cryopreservaiton Methods, Biology of Reproduction 63: Polge C, Smith AU, Parkers AS, 1949, Revival of Spermatozoa After Vitrification and Dehidration at Low Temperatures, Nature, 164:666 Popova E, Krivokharchenko A, Ganten D, and Bader M, 2002, Comparison Between PMSG-and FSH- Induced Superovulation for the Generation of Transgenic Rats, Molecular Reproduction and Development, 63: Rall W.F, 1992, Criyopreservation of Oocytes and Embryos: Methods and Applications, Animal Reproduction Science, 28: Sağırkaya H, 2001, Değişik Gelişim Dönemlerinde Bulunan Hibrit Fare Embriyolarının Vitrifikasyon Yöntemiyle Dondurulması, Doktora Tezi, Uludağ Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Dölerme ve Sun'i Tohumlama Anabilim Dalı. 57

58 Sağırkaya H, Bağış H, 2003, Memeli Embriyoların Kriyoprezervasyonu, Uludag Univ. J. Fac. Vet. Med, 22, Sharp E P, La Regina MC, 1998, The Laboratory Rat, CRC Press Whittingham DG, 1971, Survival of Mouse Embryos After Freezing and Thawing, Nature, 233: Whittingham DG, 1974, Embryo Banks in the Future of Developmental Genetics, Symposium on Developmental Genetics: XIII International Congress of Genetics, 78: Whittingham DG, Leibo SP, Mazur P, 1972, Survival of Mouse Embryos Frozen to -196 C and -269 C, Science, 187: Yue Zhou, Vasiliy Galat, Ray Garton, Greg Taborn, Koji Niva and Philip Iannaccone, 2003, Two-Phase Cemically Defined Culture System for Preimplantation Rat Embryos, Genesis, 36:

59 TEŞEKKÜR Yüksek lisans tez çalışmalarımın her aşamasında değerli bilgi, görgü, yardım ve desteklerini benden esirgemeyen danışmanlarım Ana Bilim Başkanımız Sayın Prof. Dr. M. İhsan SOYSAL ve TÜBİTAK Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Araştırma Enstitüsü (GMBAE) Transgen ve Deney Hayvanları Laboratuarı Sorumlusu Sayın Doç.Dr.Haydar BAĞIŞ a sonsuz teşekkürlerimi sunmayı borç bilirim. Tez çalışmamı yürütmemdeki katkı ve desteklerinden dolayı TÜBİTAK- GMBAE Müdür Vekili Sayın Doç.Dr. Kemal BAYSAL a ve Prof. Dr. Beyazıt ÇIRAKOĞLU na deneyleri yaptığım Transgen ve Deney Hayvanları Laboratuarında her türlü yardım ve desteklerini hiç bir zaman esirgemeyen ve deneylerin gerçekleştirilmesindeki önemli katkılarından dolayı uzman araştırmacı Sayın Doç. Dr. Sezen ARAT a, Dr. Didem AKTOPRAKLIGİL e ve Başteknisyenler Şakir SEKMEN e, Gazi TURGUT a ve Seyfettin ÇETİN e, Çalışma arkadaşlarım Arzu TAŞ, Aygül EKİCİ, Gaye ÇETİNKAYA ya ve çalışmamda doktora tezinden yararlandığım Doç. Dr. Hakan SAĞIRKAYA ya teşekkürlerimi içtenlikle sunarım. Son olarak bana yaşam boyu her zaman güç veren, çalışmalarımda her türlü desteklerini hiç bir zaman eksiltmeyen ve iyi bir eğitim almamda en önemli etken olan anneme, babama ve ağabeyim Tunç AKKOÇ a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. 59

60 ÖZGEÇMİŞ Adı ve Soyadı : Tolga AKKOÇ Ünvanı : Ziraat Mühendisi Zooteknist Doğum Yeri ve Yılı : Şişli Eğitim Durumu : Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi Zootekni Bölümü- Bursa. Lisans : Trakya Üniversitesi Ziraat Fakültesi Zootekni Bölümü-Tekirdağ. Yüksek Lisans. Çalıştığı Kurum ve Kuruluşlar 2002 Tem-Ağus : Lisans Stajı, Boğaziçi Hayvanat Bah.esi ve Kuş Cenneti- Darıca 2004 Mart- : Gönüllü Araştırmacı, TÜBİTAK- Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Araştırma Enstitüsü (GMBAE ), Transgen ve Deney Hayvanları Laboratuarı Katıldığı Kurslar: 1- Yardımcı Üreme Teknikleri ve Transgenik Hayvan Üretiminde Kullanılan Yöntemler Uygulamalı Eğitim Kursu. TÜBİTAK-Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Araştırma Enstitüsü. 28 Haziran - 02 Temmuz 2004 ve Temmuz Yardımcı Üreme Teknikleri ve Transgenik Hayvan Üretiminde Kullanılan Yöntemler Uygulamalı Eğitim Kursu. TÜBİTAK-Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Araştırma Enstitüsü Ekim 2005 ve Ekim Deney Hayvanları Kullanım ve Etik Kursu TÜBİTAK-Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Araştırma Enstitüsü Şubat Yardımcı Üreme Teknikleri ve Trangenik Hayvan Üretiminde Kullanılan Yöntemler Uygulamalı Eğitim Kursu. TÜBİTAK Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Araştırma Enstitüsü. 3-7 Temmuz

61 Katıldığı Kongreler: 1-4th. Balkan Congres of Immunology September 2004 Istanbul-TURKEY 2- XII. Ulusal Alerji ve Klinik İmmünoloji Kongresi06-10 Ekim 2004 Antalya 3- Yerli Gen Kaynaklarımızın Koruması Sürecinde Proteomik ve Genomik Teknikler Haziran 2005 Tekirdağ Ulusal Biyoloji Kongresi Haziran 2006, Kuşadası/AYDIN. Bilimsel Yayınlar: 1- Arat S, Bagıs H, Tas A, Akkoc T. Effect of Several Parameters on Parthogenetic Bovine Embriyo Development in vitro. Reproduction, Fertility and Development. Vol:18 (1,2) Page:119. Abs: Akkoç T, Bağış H, Soysal İ, Spraque Dawley Sıçanlarında Zigot Eldesi ve Farklı Kültür Medyumlarının Embriyo Gelişimi Üzerine Etkisi. 18. Ulusal Biyoloji Kongresi, Kuşadası-Aydın. (Poster) Haziran Ekici A, Timur M, Aktopraklıgil D, Akkoç T, Bağış H. Mikroenjeksiyon Tekniği ile EGFP Geninin Zebra Balık Yumurtalarına Aktarımı ve Canlılık Oranları Üzerine Etkisi. 18. Ulusal Biyoloji Kongresi, Haziran 2006, Kuşadası-Aydın. 4- Akkoc T, Soysal İ, Bagıs H. The Effect of KSOM and R1ECM-BSA Culture Medium in SSV Vitrification in Spraque Dawley Rat Pronuclear-Stage Embryos. 57 th Annual Meeting of the European Association for Animal Production. Antalya. (Sözlü Sunum- Basımda) Eylül Kurs Kitabı: 1- Deney Hayvanları Pratik Kullanım Kurs Kitabı. TÜBİTAK-GMBAE, Transgen ve Deney Hayvanları Laboratuarı. Şubat Yazarlar: Doç.Dr. Haydar BAĞIŞ, Doç. Dr. Sezen ARAT, Tolga AKKOÇ. 61

62 62