ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ KOORDİNATÖRLÜĞÜNE

ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ KOORDİNATÖRLÜĞÜNE Proje Türü Proje No Proje Yöneticisi : Bağımsız Proje (BP) : 12B4343007 : Yrd. Doç. Dr. Aslı İŞCİ YAKAN Proje Konusu : ALTERNATİF BİYO-YAKIT OLARAK LİGNO-SELÜLOZİK ETANOL ÜRETİMİ İÇİN ORGANİK ASİTLER İLE ÖN-İŞLEME YÖNTEMİ Yukarıda bilgileri yazılı olan projemin sonuç raporunun e-kütüphanede yayınlanmasını; İSTİYORUM İSTEMİYORUM / /20.. Proje Yöneticisi İmza

ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ SONUÇ RAPORU ALTERNATİF BİYO-YAKIT OLARAK LİGNO-SELÜLOZİK ETANOL ÜRETİMİ İÇİN ORGANİK ASİTLER İLE ÖN-İŞLEME YÖNTEMİ Yrd. Doç. Dr. Aslı İŞCİ YAKAN Prof. Dr. Bülent AKAY Yrd. Doç. Dr. Özge ŞAKIYAN DEMİRKOL Arş. Gör. Naciye KUTLU Arş. Gör. Simel BAĞDER ELMACI 12B4343007 02/01/2012 02/07/2014 15/09/2014 Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - " 2014 "

İÇİNDEKİLER I. Projenin Türkçe - İngilizce Adı ve Özetleri II. III. IV. Amaç ve Kapsam Materyal ve Yöntem Analiz ve Bulgular V. Sonuç ve Öneriler VI. VII. VIII. IX. Geleceğe İlişkin Öngörülen Katkılar Sağlanan Altyapı Olanakları ile Varsa Gerçekleştirilen Projeler Sağlanan Altyapı Olanaklarının Varsa Bilim/Hizmet ve Eğitim Alanlarındaki Katkıları Kaynaklar X. Ekler a. Mali Bilanço ve Açıklamaları b. Makine ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar c. Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar (varsa Kesim III'de yer almayan analiz ayrıntıları) d. Sunumlar (bildiriler ve teknik raporlar) e. Yayınlar (hakemli bilimsel dergiler) ve tezler

I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri ALTERNATİF BİYO-YAKIT OLARAK LİGNO-SELÜLOZİK ETANOL ÜRETİMİ İÇİN ORGANİK ASİTLER İLE ÖN-İŞLEME YÖNTEMİ Özet Enerji güvenliği ve enerji bağımsızlığı, günümüzde ülkelerin ekonomik istikrarını belirleyen en önemli faktörlerdendir. Enerji politikası petrole bağlı ülkeler, petrol üreten ülkelere her zaman bağımlı kalmak zorundadır. Bu durum ulusal güvenlik sorunlarına neden olmakla beraber, yenilenemeyen fosil yakıtlarının her geçen gün daha fazla tüketilmesi çevresel sorunlara da sebep olmaktadır. Günümüzde en yaygın olarak kullanılan ve en çok araştırılan alternatif yakıtlardan birisi, selülozik biyokütleden elde edilen etanoldür. Bu projede farklı organik asitlerle (maleik, süksinik, okzalik asit) ön-işlem görmüş samanın, enzimatik hidroliz ve etanol verimliliği üzerindeki etkinliğinin belirlenmesi hedeflenmiştir. Ek olarak, projede proses koşullarının (sıcaklık, asit konsantrasyonu ve ön-işlem süresi), glukoz ve ksiloz verimliliği açısından, yanıt yüzey yöntemiyle (RSM) optimizasyonu da amaçlanmıştır. Bu hedef doğrultusunda, saman örnekleri, 3 farklı sıcaklık (170, 190, 210 C), asit konsantrasyonu (%1, %3, %5) ve süre ile (10, 20, 30 dakika) muamele edilmiş, öncelikli olarak ön-işlemin samanın kompozisyonu üzerine etkileri araştırılmıştır. Elde edilen bulgular, ekstrem ön-işlem koşullarında ksilozun sıvı fazda hidrolize olduğunu ve biyokütleden uzaklaştırıldığını, bu sebeple örneklerdeki selüloz ve lignin içeriğinin arttığını göstermiştir. Örneklerdeki lignin içeriği, sıcaklığın, asit konsantrasyonunun ve sürenin artması ile artmıştır. Enzimatik hidroliz deneyleri incelendiğinde, maleik ve okzalik asit önişlemleri, yüksek miktarda şeker verimi (>%90) eldesi için, etkili bir yöntem olarak bulunmuştur. Buna karşın, süksinik asitle işlenmiş örneklerden en fazla %50-60 oranında şeker verimi elde edilmiştir. Bu da süksinik asitin etkili bir ön-işlem kimyasalı olmadığı sonucuna varmamıza sebep olmuştur. Her asit için ayrı ayrı optimum proses koşulları RSM ile glukoz ve ksiloz verimlilikleri maksimize edilmeye çalışılarak belirlenmiştir. Buna göre maleik asit için optimum koşullar, 210 C sıcaklık, %1,08 maleik asit konsantrasyonu ve 19,8 dakika ön-işlem süresi; süksinik asit için optimum koşullar, 210 C sıcaklık, %5 süksinik asit konsantrasyonu ve 30 dakika ön-işlem süresi; okzalik asit için optimum koşullar ise, 210 C sıcaklık, %3,6 okzalik asit konsantrasyonu ve 16,3 dakika ön-işlem süresi olarak bulunmuştur. Bu optimum koşullarda gerçekleştirilen fermentasyon deneylerinden elde edilen etanol konsantrasyonları ise maleik, süksinik ve okzalik asit için sırasıyla 12,9, 10,3 ve 12,9 g/l olarak tespit edilmiştir. Bu veriler doğrultusunda organik asitlerin lignoselülozik yapıyı etkin bir şekilde parçalamakta olduğu, ancak maleik ve okzalik asitin, süksinik asite kıyasla daha etkili olduğu sonucuna varılmıştır. 1

PRETREATMENT WITH ORGANIC ACIDS FOR THE PRODUCTION OF LIGNO-CELLULOSIC ETHANOL AS AN ALTERNATIVE BIOFUEL Abstract Energy security and energy independency are the most important factors defining the economic stability. Countries, whose energy policy depends on petroleum, will always depend on oil-producing countries. This causes issues in national security. In addition, consumption of non-renewable fossil fuels brings environmental problems. Currently, the most widely used and one of the most investigated alternative fuels is ethanol, produced from cellulosic biomass. The objective of this project was to determine the effectiveness of different organic acids (maleic, succinic and oxalic acid) on enzymatic hydrolysis and fermentation yields of wheat straw. It was also aimed to optimize the process conditions (temperature, acid concentration and pretreatment time) by using response surface methodology (RSM). In line with this objective, the wheat straw samples were pretreated at three different temperatures (170, 190, 210 C), acid concentrations (1%, 3%, 5%) and pretreatment time (10, 20, 30 min). The effect of pretreatment on the composition of wheat straw was investigated. The findings have indicated that at extreme pretreatment conditions xylose was solubilized in liquid phase, causing an increase in cellulose and lignin content of biomass. The lignin content was increased by an increase in temperature, acid concentration and pretreatment time. Enzymatic hydrolysis experiments revealed that maleic and oxalic acids were quite effective on achieving high sugar yields (>90%) from wheat straw. In contrast, the sugar yields were 50-60% in maximum, when the samples were pretreated with succinic acid, indicating that succinic acid was not as effective. The optimum process conditions were determined by RSM to maximize glucose and xylose yields. The optimum process conditions for maleic acid were, 210 C, 1.08% acid concentration and 19.8 min; for succinic acid 210 C, 5% acid concentration and 30 min; for oxalic acid 210 C, 3.6% acid concentration and 16.3 min. The ethanol concentrations obtained at optimum conditions were 12.9, 10.3 and 12.9 g/l for maleic, succinic and oxalic acid pretreatments, respectively. In light of these findings, it can be concluded that organic acids destructs the lignocellulosic structure effectively. However, maleic and oxalic acids were found to be more effective compared to succinic acid. 2

II. Amaç ve Kapsam Tüm dünya ekonomik bir dar boğazdan geçmektedir. Önümüzdeki on yıl hem kendi ülkemizin ekonomisi hem de küresel ekonomi açısından son derece önemlidir. Ülkemizde de olduğu gibi küresel ekonomiyi etkileyen en büyük sektörlerden biri enerji sektörüdür. Dünya nın enerji ihtiyacı ekonomik gelişme, endüstrileşme, refah ve nüfus artışına paralel olarak artmaktadır. Buna bağlı olarak sürdürülebilir ekonomik gelişmeyi sağlamak, yüzyılın en büyük sorunlarından biri haline gelmiştir. Dünyada kullanılan enerjinin büyük bir bölümü fosil yakıtlardan üretilmektedir. Türk ekonomisi de diğer Avrupa ülkeleri gibi büyük ölçüde petrole bağımlıdır. Türkiye de günde yaklaşık olarak 700 bin varil petrol tüketilmekte ve bunun yaklaşık % 90 nı ithal edilmektedir. Bu durum ekonomimizin petrol ihraç eden ülkelerin manipülasyonlarından ne kadar çabuk etkilenebileceğinin göstergesidir. Petrol tüketiminin çevresel sorunlara da sebep olduğu bir gerçektir. Petrol rezervlerinin de yaklaşık 35 yıl (Shafiee ve Topal 2009) gibi çok yakın bir gelecekte tükeneceği göz önünde bulundurulursa, yenilenebilir, çevreyle dost, yerli ve alternatif enerji kaynaklarının günümüz toplumu için ne kadar önemli olduğu anlaşılabilir. Günümüzde yaygın olarak kullanılan ve en çok araştırılan alternatif yakıtlardan birisi biyo-etanoldür. Türkiye de günümüzde melas, mısır, buğday ve şeker pancarından biyo-etanol üretimi az miktarda da olsa yapılmaktadır. Bu ürünler Türkiye de biyo-yakıtların gelişmesine yardımcı olmasına karşın, gıda maddelerinin yakıt üretimi için kullanılması gıda fiyatlarında artışa sebep olabilmektedir. Lignoselülozik biyokütleden üretilecek olan biyo-yakıtların, gıdalardan üretilen nişasta bazlı etanole oranla daha fazla avantajı bulunmaktadır. Amerikan Çevre Koruma Ajansının 2007 yılında yayınladığı raporda, selülozdan üretilen etanolün sera gazı emisyonlarını benzine oranla %90 oranında azalttığı, ancak mısırdan üretilen etanolün emisyonları sadece %10-20 arasında azaltabildiği belirtilmektedir. Ek olarak lignoselülozik bitkisel atıkların alternatif yakıt üretiminde kullanılması atıkların değerlendirilmesi 3

açısından da büyük önem taşımaktadır. Bu sebeplerden dolayı, ligno-selülozik etanol dünyada daha çok ilgi uyandırmaya başlamış ve selülozdan üretilen etanol, ikinci kuşak biyo-yakıt olarak adlandırılmıştır. Bir tarım ülkesi olan Türkiye, tarımsal atıklarının fazlalığı sebebiyle ligno-selülozik etanol üretimi konusunda çok büyük bir potansiyele sahiptir. Türkiye de en çok üretimi yapılan tarımsal ürünlerin atıkları dikkate alındığında yılda yaklaşık 46 milyon ton lignoselülozik biyokütlenin oluştuğu tahmin edilmektedir. Sadece buğday ve arpa samanının %40`ı Türkiye nin yıllık benzin tüketiminin % 96 sını karşılamaya yetebilecek orandadır (İşci 2010). Türkiye selülozik etanol konusuna halen yabancı olmasına karşın Amerika ve bazı Avrupa ülkeleri (örneğin Fransa, İtalya) bu konuya milyonlarca dolar yatırım yaparak biyo-etanol ve biyo-benzin teknolojisinde gelişme sağlamaya çalışmaktadır. Buna rağmen biyo-etanolün ticari olarak üretilmesi için özellikle ön-işlem konusundaki çalışmalara ağırlık verilmesi gerekmektedir. Lignoselülozik etanol üretimi, ön-işlem, enzimatik hidroliz, fermantasyon ve distilasyon aşamalarından oluşmaktadır. Önişlem, selülozik etanol üretiminin en önemli basamaklarından birisi olmasının yanı sıra üretim maliyetini de etkilemektedir (Wyman vd. 2007). Ligno-selülozik biyokütlenin işlenmesi, etanol fermantasyonundan önce, yapıdaki lignini kısmi olarak parçalayıp ayırmak için gereklidir. Ön-işlem ile biyokütlenin yapısı parçalanarak fermantasyon veriminin artması sağlanmaktadır. En yeni ön-işlem teknolojileri Alvira ve arkadaşları tarafından 2010 yılında özetlenmiştir (Alvira vd. 2010). Literatürde birçok biyolojik, kimyasal ve fiziksel ön-işleme yöntemleri denenmiş olmasına rağmen, şeker ve etanol verimliliğinin arttırılması için bu konuda daha fazla gelişmenin sağlanması gerekmektedir. En çok araştırılan ön-işleme yöntemlerinin arasında buhar patlatması, amonyak fiber patlatması (AFEX), seyreltik asit uygulaması, yüksek basınç ve sıcaklıkta su ekstraksiyonu sayılabilir. Bu yöntemler ikinci nesil biyo-yakıt araştırmacıları için öncü olmalarına rağmen, istenilen özellikler dikkate alındığında halen yeterince tatminkâr bir yöntem bulunamamıştır. 4

Son yıllarda, organik asitler kullanılarak yapılan ön-işlemler, geleneksel sülfirik asit ön-işlem yöntemine alternatif olarak literatürde yer almıştır (Lu ve Mosier 2007, Kootstra vd. 2009a, Kootstra vd. 2009b, Kootstra vd. 2009c, Lee ve Jeffries 2011; Guo vd. 2012). Bu asitlerin, yüksek sıcaklıklarda şekerlerin degredasyona uğramasını engellediği ve daha az korozif olduğu bildirilmiştir (Lu ve Mosier 2007, Kootstra vd. 2009b). Bu sebeple, bu projenin temel amacı farklı organik asitlerin (maleik, süksinik, okzalik asit) samanın enzimatik hidroliz ve etanol verimliliği üzerindeki etkinliğinin belirlenmesidir. Ek olarak, projede proses koşullarının (sıcaklık, asit konsantrasyonu ve ön-işlem süresi) glukoz ve ksiloz verimliliği açısından yanıt yüzey yöntemiyle (RSM) optimizasyonu da hedeflenmiştir. III. Materyal ve Yöntem i. Hammaddenin Karakterizasyonu ve Hazırlanması Çalışmamızda kullandığımız buğday samanı Ankara Üniversitesi, Kenan Evren Araştırma ve Uygulama Çiftliği nden tedarik edilmiştir. Saman, gözenek büyüklüğü 2 mm olan değirmende (Şimşek Laborteknik TD701, Ankara, Türkiye) öğütülüp, kullanılıncaya kadar oda sıcaklığında sızdırmaz poşetlerde saklanmıştır. Samanın kompozisyon analizi NREL Laboratuvar Prosedürü NREL/TP-510-42618 e (Sluiter vd. 2008) göre belirlenmiş ve Tablo 1 de verilmiştir. Samandaki kuru madde miktarı 105 C de 1 gün bekletilerek %89,78 olarak belirlenmiştir. Tablo 1. Samanın kompozisyonu (kuru madde bazında) Samanın kompozisyonu (%) Selüloz 34,11 ± 1,47 Ksilan 15,93 ± 1,07 Diğer şekerler <3,00 ± 0,03 Klason Lignin 20,84 ± 0,05 Kül 7,16 ± 0,04 ii. Ön-İşlem Ön-işlem için kullanılan organik asitler (maleik, süksinik, okzalik asit) Merck firmasından temin edilmiştir (>%99 saflıkta). Öğütülmüş saman örnekleri, 3 farklı sıcaklık (170, 190, 210 C), asit 5

konsantrasyonu (%1, %3, %5) ve sürede (10, 20, 30 dakika), projeden temin edilmiş olan reaktörde (Parr Reaktörü, Model 4525, Parr, USA) işlenmiştir. Ön-işlem sonrasında biyokütle sıvı kısımdan filtre yardımı ile ayrıştırılmış ve kompozisyon analizlerine (Sluiter vd. 2008) tabi tutulmuştur. iii. Enzimatik Hidroliz Değişik koşullarda işlenmiş saman örnekleri, enzimatik olarak hidrolize edilmiştir. Enzimatik hidroliz deneyleri NREL laboratuvar prosedürlerine (Selig vd. 2008) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Enzimatik hidroliz, 50 C sıcaklıkta 150 rpm çalkalama hızında 72 saat boyunca sürdürülmüş ve hesaplamalarda bu süre sonunda oluşan glukoz ve ksiloz miktarları dikkate alınmıştır. Enzimatik hidroliz için kullanılan selülaz enziminin (Accelerase 1500, Genencor Int., Palo Alto, CA) aktivitesi 44 FPU/ ml olarak belirlenmiştir (Adney vd. 1996). Deneyler sırasında enzim dozu 30 FPU/g kuru saman olacak şekilde ayarlanmıştır. Enzimatik hidroliz sırasında alınan örneklerdeki glukoz ve ksiloz miktarları HPLC (Agilent 1260 Infinity, Bio-Rad Aminex HPX-87P kolon) ile belirlenmiştir. Hidroliz sonrasında elde edilen şeker miktarları işlenmiş samanın içerisindeki şeker miktarlarına oranlanarak hidroliz verimliği aşağıdaki gibi hesaplanmıştır. Glikoz verimi Ksiloz verimi Enzimatik hidroliz ile elde edilen glukoz miktarı (g) 0,9 Biyokütledeki glukan miktarı (g) Enzimatik hidroliz ile elde edilen ksiloz miktarı (g) 0,88 Biyokütledeki ksilan miktarı (g) (Not: Formüllerdeki 0,9 ve 0,88, glukoz ve ksilozu, glukan ve ksilan eşdeğeri olarak yazabilmek için gerekli olan dönüşüm çarpanlarıdır.) iv. Optimizasyon Proses parametrelerinden, sıcaklık, asit konsantrasyonu ve ön-işlem süresi bağımsız değişken; glukoz verimi ve ksiloz verimi ise bağımlı değişken olarak seçilmiştir. Proses parametreleri yanıt yüzey metodu (RSM) kullanılarak her asit için ayrı ayrı optimize edilmiştir. Optimizasyonda Box-Behnken tasarımı 6

kullanılmış ve deney matriksi Tablo 2 de verilmiştir. Tüm istatistiksel analizler ve optimizasyon Minitab 15.0 (Minitab, State College, PA) kullanılarak geçekleştirilmiştir. Tablo 1. Yanıt Yüzey Yöntemi ile optimizasyonda kullanılan değişkenler Deney Numarası Sıcaklık Kodlar Asit Konsantrasyonu Süre Sıcaklık ( C) Değişkenler Asit Konsantrasyonu (%) Süre (dak) 1 0-1 -1 190 1 10 2 0 1 1 190 5 30 3 0 0 0 190 3 20 4-1 0-1 170 3 10 5 1-1 0 210 1 20 6 1 1 0 210 5 20 7-1 -1 1 170 1 30 8 1 0-1 210 3 10 9 0 1-1 190 5 10 10-1 -1 0 170 1 20 11 1 0 1 210 3 30 12-1 1 0 170 5 20 13 0 0 0 190 3 20 14-1 0 1 170 3 30 15 0 0 0 190 3 20 v. Fermantasyon Enzimatik hidroliz deneylerinde elde edilen sonuçlar ışığında maksimum şeker verimliliği sağlayacak olan proses koşulları RSM metodu ile optimize edilmiştir. Bu optimum koşullarda her asit için ayrı ayrı fermentasyon deneyleri yapılarak farklı asitlerin etanol verimlilikleri üzerine etkisi incelenmiştir. Eş zamanlı sakkarifikasyon ve fermantasyon (SSF) deneyleri NREL laboratuvar prosedürlerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir (Dowe vd. 2001). SSF deneyleri için ksilozu da fermente ederek etanole çevirebilen mutant bir maya olan Saccharomyces cerevisiae ATCC 20618 kullanılmıştır. Fermantasyon deneyleri 35 ºC de, 150 rpm de, 96 saat boyunca gerçekleştirilmiş ve deney sırasında alınan örneklerde etil alkol tayini yapılmıştır (Templeton 1994). Etanol verimliliği, işlenmiş örneklerdeki toplam şeker miktarı göz önünde bulundurularak aşağıdaki gibi hesaplanmıştır. Etanol verimi Üretilen etanol miktarı (g) Fermentasyondaki toplam şeker miktarı (g) 0,511 7

(Not: Fermentasyona giren toplam şeker miktarının hesaplanmasında işlenmiş biyokütledeki hem glukoz hem de ksiloz miktarları göz önünde bulundurulmuştur. Bunun sebebi kullanılan mayanın ikisini de fermente edebilme özelliğinin olmasıdır.) IV. Analiz ve Bulgular Günümüzde yaygın olarak kullanılan ve en çok araştırılan alternatif yakıtlardan birisi selülozik biyokütleden elde edilen etanoldür. Selülozik etanol üretimi, ön-işlem, enzimatik hidroliz, fermentasyon ve distilasyon aşamalarından oluşmaktadır. Ön-işlem sırasında lignoselülozik yapı kısmi olarak parçalanır ve hidroliz sırasında enzimlerin yapıya daha kolay nüfuz etmesi sağlanır. Bu da enzimatik hidroliz ve fermentasyon verimini arttırmaktadır. Literatürde birçok ön-işlem metodu araştırılmıştır (Alvira vd. 2010). Bu yöntemlerin çoğu katalizör eşliğinde (asit veya baz) yüksek sıcaklıkta biyokütlenin yapısının parçalanmasını hedefleyen işlemlerdir. Literatürde en çok kullanılan yöntem seyreltik sülfürik asitle (50 300 mm), yüksek sıcaklıklarda yapılan ön-işlemdir (Mosier vd. 2005, Lawford vd. 2003, Wyman vd. 2005, Lyod ve Wyman 2005, Yang ve Wyman 2008; Zhu vd. 2009). Ancak, sülfürik asitle yapılan ön-işlemlerde hemiselülozun ve selülozun furfural ve HMF gibi moleküllere parçalandığı rapor edilmiştir. İnorganik asitlerle yapılan önişlemler, şeker kayıplarına sebep olmasının yanı sıra bozulma sonunda oluşan bileşikler fermentasyonu inhibe etme özelliğine de sahiptirler (Palmqvist ve Hahn-Hagerdal 2000, Cantarella vd. 2004, Klinke vd. 2004). Bu sebepler, araştırmacıları farklı ön-işlemlere yönlendirmiştir. Son yıllarda, dikarboksilik organik asitlerin, inorganik asitlere oranla daha avantajlı olduğu sıklıkla rapor edilmeye başlanmıştır. Örneğin, Kootstra vd. (2009b ve 2009c), fumarik, maleik ve sülfürik asitin buğday samanı üzerindeki etkinliklerini incelemiş ve organik asitlerin mineral asitlere alternatif olabileceğini belirtilmiştir. Buna ek olarak, organik asitlerle ön-işlem; akçaağaç (Zhang vd. 2013), sert ağaçlar (Kim vd. 2013), karışık sert ağaçlar (Lim ve Lee 2013a), mısır atıkları (Lu ve Mosier 2007) gibi bazı ligno-selülozik materyaller 8

üzerinde denenmiş ve organik asitlerin lignoselülozik yapıyı parçalamada etkili bir ön-işlem olduğu rapor edilmiştir. Organik asitlerin daha az korozif olmaları ve sülfürik asite oranla daha yüksek pka değerine sahip olmaları en önemli avantajlarındandır. Bunlara ek olarak, organik asitlerle ön-işlem şeker degredasyonu ürünlerinin miktarını azalttığı rapor edilmiştir (Lu ve Mosier 2007). Bu bilgiler doğrultusunda bu projede farklı organik asitlerin (maleik, süksinik, okzalik asit) samanın enzimatik hidroliz ve etanol verimliliği üzerindeki etkinliğinin belirlenmesi hedeflenmiştir ve aşağıda her asitle yapılan ön-işlem sonrasında elde edilen bulgular raporlanmıştır. i. Maleik Asit Sonuçları Saman örnekleri maleik asitle farklı sıcaklık (170, 190, 210 C), asit konsantrasyonu (%1, %3, %5) ve farklı sürelerde (10, 20, 30 dakika) işlenmiş ve kompozisyonundaki değişimler tespit edilmiştir (Şekil 1). Dikarboksilik asitlerin selülozu parçalamadığı bilinmektedir (Kootstra vd. 2009b, Lee vd. 2010 ). Bu sebeple, hemiselüloz ve lignin içeriğinin değişimi bizim için daha çok önem taşımaktadır. Ön-işlem görmemiş samandaki ksilan ve lignin miktarının sırasıyla %15,93 ve %20,84 tür (Tablo 1). Maleik asitle farklı koşullarda işlenmiş saman örneklerindeki ksilan miktarının %0,88-10,29 arasında olduğu bulunmuştur. Bu sonuçlar, ksilanın ön-işlem sırasında hidrolize olarak sıvı fazda çözündüğünü göstermektedir. Ksiloz gibi pentozların, sıcaklık ve asite karşı duyarlı olduğu ve kolaylıkla hidrolize olduğu bilinmektedir (Dunlop 1948). Örneklerdeki lignin içeriğinin ise ön-işlem sonrasında %31 ile %39 arasında değerler aldığı bulunmuştur. Hammaddeye oranla lignin içeriğindeki bu artış, örneklerden ksilanın ayrıştırılmasından kaynaklanmaktadır. Bir başka deyişle, ksilan biyokütleden uzaklaştırıldığı için (hidrolize olarak sıvı faza geçtiği için) lignin miktarı artmış gibi gözükmektedir. Bu eğilim literatürde diğer araştırmacılar tarafından da bildirilmiştir. Organik asitler ile farklı koşullarda işlenmiş yumuşak ağaçların kompozisyonlarındaki değişim araştırıldığında lignin içeriklerinin %32,36 dan %46,61 e kadar karbonhidrat degradasyonuna bağlı ve eş zamanlı olarak arttığı rapor edilmiştir (Lim ve 9

Lee 2013b). Başka bir çalışmada okzalik asitle muamele edilmiş biyokütlenin lignin içeriği %42,10-43,19 arasında tespit edilirken, hammaddede % 28,8 olarak saptanmıştır. Bu çalışmada da ön-işleme bağlı olarak lignin içeriği artmış gibi gözükmektedir (Lee vd. 2013). Yukarıda bahsi geçen sebeplerden, örneklerdeki selüloz miktarında da artış olduğu tespit edilmiştir. Örneklerdeki ksilan miktarındaki azalışın, selüloz ve lignin miktarında artışa sebep olduğu Şekil 2 de de açıkça gözükmektedir. Sonuçlar istatistiksel olarak incelendiğinde, ön-işlem sıcaklığının ve asit konsantrasyonunun samanın selüloz içeriğinde önemli değişimlere sebep olduğu (p<0,05) bulunmuştur. Ön-işlem süresi ise istatistiksel açıdan anlamlı değişimlere sebep olmamıştır. Buna ek olarak, tüm proses parametrelerinin, örneklerdeki ksilan ve lignin miktarları açısından istatistiksel olarak önemli olduğu tespit edilmiştir. Şekil 1. Farklı ön-işlem koşullarında maleik asitle işlenmiş saman örneklerinin kompozisyonu (her deney numarası farklı proses koşulunu göstermektedir ve bu koşullar Tablo 2 de belirtilmiştir) 10

Selüloz / Lignin Miktarı 12B4343007 Sonuç Raporu 70% 60% 50% 40% 30% Lignin Selüloz 20% 10% 0% 0% 2% 4% 6% 8% 10% 12% Ksilan Miktarı Şekil 2. Farklı ön-işlem koşullarında maleik asitle işlenmiş saman örneklerinin selüloz ve lignin içeriklerinin (%), örnekteki ksilan miktarı ile değişimi Bağımsız proses parametreleri olarak seçilen, ön-işlem sıcaklığı, süresi ve asit konsantrasyonunun, samanın selüloz, ksilan ve lignin içeriğine etkileri Minitab kullanılarak kontur grafikleri şeklinde Şekil 3, 4 ve 5 de gösterilmiştir. Şekil 3 (a, b, c) incelendiğinde sıcaklık artışının her koşulda, örneklerde daha yüksek selüloz miktarına sebep olduğu anlaşılmaktadır. Bu da yüksek sıcaklıklarda, ksilanın örneklerden daha çok ayrıştırıldığının bir göstergesidir. Sabit sıcaklık ve ön-işlem süresinde, maleik asit konsantrasyonunun %1 den %3 e çıkarılması selüloz miktarında önemli bir artışa sebep olurken, %3 den %5 e çıkarılması büyük bir fark yaratmamıştır. Ksilan konsantrasyonları incelendiğinde, sıcaklık, asit konsantrasyonu ve ön-işlem süresindeki artışının örneklerdeki ksilanı önemli ölçüde azalttığı bulunmuştur. Ekstrem ön-işlem koşullarında ksilanın neredeyse tamamının sıvı fazda çözündüğü gözlemlenmiştir. Bu sonuca paralel olarak, ön-işlem koşullarının şiddetinin artması lignin konsantrasyonunun artmasına sebep olmuştur. 11

(a) (b) (c) Şekil 3a,b,c. Farklı ön-işlem koşullarının (sıcaklık, maleik asit konsantrasyonu ve süre) samanın selüloz içeriğine (g selüloz/g kuru saman) etkisi 12

(a) (b) (c) Şekil 4a,b,c. Farklı ön-işlem koşullarının (sıcaklık, maleik asit konsantrasyonu ve süre) samanın ksilan içeriğine (g ksilan/g kuru saman) etkisi 13

(a) (b) (c) Şekil 5a,b,c. Farklı ön-işlem koşullarının (sıcaklık, maleik asit konsantrasyonu ve süre) samanın lignin içeriğine (g lignin/g kuru saman) etkisi 14

Ön-işlem sonrasında, saman örnekleri enzimatik hidroliz deneylerine tabi tutulmuş ve proses parametreleri olarak seçilen, ön-işlem sıcaklığının, asit konsantrasyonunun ve ön-işlem süresinin, samanın glukoz ve ksiloz verimlilikleri üzerine etkisi yanıt yüzey metodu kullanılarak belirlenmiştir. Minitab programı ile yapılan regresyon analizinden elde edilen ikinci derece denklemler Tablo 3 de verilmiştir. Denklemlerde X ile gösterilenler bağımsız değişkenleri, Y ile tanımlananlar ise bağımlı değişkenleri göstermektedir. Buna göre, projemizde sıcaklık (X 1, C), asit konsantrasyonu (X 2, %) ve ön-işlem süresi (X 3, dak) bağımsız değişken; glukoz verimi (Y 1 ) ve ksiloz verimi (Y 2 ) bağımlı değişkendir. Elde edilen denklemlerin belirleme katsayıları (r 2 ) da aynı tabloda belirtilmiştir. RSM modellerinde r 2 nin en az %80 olması beklenir. Buna göre, projede yanıt değişkenleri için bulunan modellerin iyi uyum sağladığı söylenebilir (Tablo 3). Buna ek olarak, modelin uyum eksikliği testi de tüm bağımlı değişkenler için önemsiz bulunmuştur. Tablo 2. Maleik asit için regresyon eşitlikleri Bağımlı Değişkenler Regresyon denklemleri r 2 Glukoz verimi Y 1 =0,946575+ 0,198397*X 1 0,0510193X 2 + 0,151121*X 3-2 0,193213*X 1 0,00275283X 2 2 2 0,0568594X 3 0,0968188*X 1 X 2-0,118721*X 1 X 3-0,122226*X 2 X 3 0,9694 Ksiloz verimi Y 2 = 0,837401+ 0,171667*X 1 + 0,0560775X 2 + 0,131795*X 3 2 0,166370 *X 1 + 0,0177302X 2 2 2-0,0967737X 3-0,153888*X 1 X 2-0,244863*X 1 X 3-0,168237 *X 2 X 3 Üzerinde işaret bulunmayan bağımsız değişkenler istatistiksel olarak önemsizdir. * istatistiksel olarak farkı belirtir (p 0,05) 0,9566 Sıcaklık, maleik asit konsantrasyonu ve ön-işlem süresinin, samanın glukoz ve ksiloz verimine etkileri Şekil 6 ve 7 de gösterilmiştir. Regresyon eşitlikleri incelendiğinde, glukoz verimi üzerine istatistiksel olarak en önemli parametrelerin ön-işlem sıcaklığı ve süresinin olduğu bulunmuştur (Tablo 3). Maleik asit konsantrasyonunun ise glukoz verimi üzerine istatiskisel açıdan önemli bir etkisi olmadığı anlaşılmıştır. Regresyon denkleminde, sıcaklık ve sürenin glukoz verimine etkisinin pozitif olduğu gözükmektedir. Bu da ön-işlem sıcaklığının ve ön-işlem süresinin artması ile glukoz veriminin artacağını belirtmektedir. Bu sonuç, şekillerde de açıkça gözükmektedir. Şekil 6 dan da anlaşılabileceği 15

üzere, maleik asit konsantrasyonu sabit tutulduğunda, sıcaklıktaki veya ön-işlem süresindeki bir artış glukoz veriminde bir artışa sebep olmuştur. Örneğin %1 maleik asitle reaktörde 20 dakika boyunca işlenen samanın ön-işlem sıcaklığı 170 C den 210 C ye arttırılması glukoz veriminde 2,4 kat bir artışa neden olmuştur. En yüksek glukoz verimleri, 190 C ve 20 dakika üzerindeki koşullarda işlenmiş saman örneklerinden (> %90) elde edilmiştir. Bulguların literatürde elde edilmiş çalışmalarla benzer olduğu gözlemlenmiştir. Koostra vd. (2009b) samanı 170 C de 30 dakika boyunca maleik asitle muamele ettiklerinde %96 glukoz verimi elde ettiklerini bildirmişlerdir. Bu çalışmadaki verimin, bizim projemizde benzer koşullarda elde edilen glukoz veriminden daha yüksek olmasının sebebi, adı geçen çalışmada daha yüksek dozda (46 FPU/ g saman) enzim kullanılması olabileceği düşünülmektedir. Glukoz verimindeki sonuçlara benzer şekilde, istatistiksel analizler incelendiğinde ksiloz verimi üzerine en önemli parametrelerin ön-işlem sıcaklığı ve ön-işlem süresinin olduğu tespit edilmiştir (Tablo 3). Maleik asit konsantrasyonunun ise ksiloz verimi üzerine istatistiksel açıdan önemli bir etkisi olmadığı anlaşılmıştır. Regresyon denkleminde, sıcaklık ve sürenin ksiloz verimine etkisinin pozitif olduğu gözükmektedir. Bu da ön-işlem sıcaklığının ve ön-işlem süresinin artması ile ksiloz veriminin artacağını belirtmektedir. Bu sonuçlar grafiklerde de açıkça gözükmektedir. Sabit ön-işlem süresi ve asit konsantrasyonunda, ön-işlem sıcaklığının arttırılması ksiloz veriminin artmasına sebep olmuştur. Benzer sonuçlar Koostra vd. (2009b) tarafından da rapor edilmiştir. Özellikle 170 ve 190 C sıcaklıklar arasında bu verim artışının çok belirgin ve hızlı olduğu (Şekil 7a) söylenebilir. Bununla birlikte, sabit ön-işlem süresinde, 190 C ve üzerindeki sıcaklıklarda asit konsantrasyonunun verimin arttırılmasında çok etkili olmadığı bulunmuştur (Şekil 7a). Düşük sıcaklıklarda (170-190 C), ön-işlem süresindeki çok küçük artışların dahi ksiloz verimini olumlu etkilerken, yüksek sıcaklıklarda sürenin önemli bir fark yaratmadığı tespit edilmiştir (Şekil 7b). Ancak, 210 C de sabit maleik asit konsantrasyonunda uzun önişlem sürelerinin verimde bir düşüşe neden olduğu anlaşılmıştır. Bu da ksilozun, ekstrem ön-işlem koşullarında bozunmasının bir göstergesi olabilir. Bunlara ek olarak, her ne kadar istatistiksel olarak önemli olmasa da grafiklerde, sabit sıcaklıkta ve düşük ön-işlem sürelerinde (<20dak), asit 16

konsantrasyonundaki artışın ksiloz verimine pozitif etkide bulunduğu saptanmıştır (Şekil 7c). Bu pozitif etki regresyon denkleminde de açıkça gözükmektedir (Tablo 3). Ek olarak, bağımsız değişkenler arasında istatistiksel açıdan önemli interaksiyon olduğu anlaşılmıştır (Tablo 3). Bu sonuç bize sıcaklık, asit konsantrasyonu ve süre arasında bir etkileşim olduğunu göstermektedir. Bir başka değişle her bir ön-işlem parametresinin glukoz ve ksiloz verimi üzerindeki etkisinin kendisi dışındaki parametrelere de bağımlı olduğunu gösterir. Genel olarak bakıldığında maleik asitin, samandan yüksek miktarda şeker verimi (>%90) elde etmekte çok etkili bir yöntem olduğu bulunmuştur. Bu sonuçlar bize maleik asitle ön-işlenmiş saman örneklerinden yüksek verimlerde etanol elde edebileceğimizi göstermektedir. Maleik asit deneyleri için optimum proses koşulları RSM ile glukoz ve ksiloz verimlilikleri maksimize edilmeye çalışılarak belirlenmiştir. Buna göre optimum noktalar X 1 için 1, X 2 için -0,96 ve X 3 için -0,02 olarak bulunmuştur. Bu noktalar, 210 C sıcaklık, %1,08 maleik asit konsantrasyonu ve 19,8 dakika önişlem süresine denk gelmektedir. Bu noktalarda elde edilecek olan verimlilikler ise RSM ile glukoz ve ksiloz için sırasıyla %99 ve %95 olarak hesaplanmıştır. Bu verilerin doğruluğu deneylerle de desteklenmiştir. Bu optimum koşullarda gerçekleştirilen fermentasyon deneylerinden elde edilen etanol konsantrasyonunun zamanla değişimi Şekil 8 de gösterilmiştir. Görüldüğü üzere, etanol konsantrasyonu ilk 24 saat içinde hızlıca artmış ve yaklaşık 12,9 g/l de sabitlenmiştir. Etanol verimi ise materyal ve metot bölümünde belirtildiği gibi hesaplanmış ve %79,9 olarak bulunmuştur. Literatürdeki bir çalışmada mısır koçanı %0,91 maleik asit içeren solüsyonda 170 C sıcaklıkta 18 dakika bekletildikten sonra Scheffersomyces (Pichia) sitipitis CBS 6054 kullanılarak fermente edilmiş ve yaklaşık %58 etanol verimi elde edilmiştir (Lee ve Jeffries 2011). Bu çalışmadaki etanol veriminin bizim sonuçlarımıza 17

kıyasla düşük olmasının, ön-işlem sıcaklığındaki farktan ve kullanılan farklı mayadan kaynaklandığı düşünülmektedir. 18

(a) (b) (c) Şekil 6a,b,c. Farklı ön-işlem koşullarının (sıcaklık, maleik asit konsantrasyonu ve süre) glukoz verimine (g/g) etkisi 19

(a) (b) (c) Şekil 7a,b,c. Farklı ön-işlem koşullarının (sıcaklık, maleik asit konsantrasyonu ve süre) ksiloz verimine (g/g) etkisi 20

Etanol Miktarı (g/l) 12B4343007 Sonuç Raporu 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 20 40 60 80 100 120 Süre (sa) Şekil 8. Optimum koşullarda maleik asitle işlenmiş samandan üretilen etanol miktarının (g/l) fermantasyon süresi boyunca değişimi ii. Süksinik Asit Sonuçları Saman örnekleri, maleik asitte olduğu gibi, süksinik asitle de farklı sıcaklık (170, 190, 210 C), asit konsantrasyonu (%1, %3, %5) ve farklı sürelerde (10, 20, 30 dakika) işlenmiş ve kompozisyonundaki değişimler tespit edilmiştir (Şekil 9). Süksinik asitle farklı koşullarda işlenmiş saman örneklerindeki ksilan miktarının %6,60-20,33 arasında olduğu bulunmuştur. Bu sonuçlar, ksilanın bazı ön-işlem koşullarında hidrolize olarak sıvı fazda çözündüğünü göstermektedir. Ancak ksilan kayıplarının, maleik asite oranla daha az olduğu açıktır. Maleik asit, süksinik asite kıyasla daha düşük pka 1 değerine sahiptir (Tablo 4) ve bu sebeple süksinik asite oranla daha kuvvetli bir dikarboksilik asit olduğu söylenebilir. Buna ek olarak, iki karboksil grubunun ortasında bulunan çift bağ, maleik asitin daha reaktif olmasına sebep olmaktadır. Örneklerdeki lignin miktarının ise ön-işlem sonrasında %25 ile %32 arasında değerler aldığı bulunmuştur. Maleik asit sonuçlarına benzer şekilde örneklerdeki selüloz ve lignin miktarındaki artışın, ksilan miktarındaki azalış ile ilgili olduğu gözlenmiştir (Şekil 10). Lignin konsantrasyonundaki 21

artışın maleik asitle işlenmiş örneklere kıyasla düşük olması, ksilanın süksinik asitle sıvı fazda daha az çözündüğünün bir kanıtıdır. Sonuçlar istatistiksel olarak incelendiğinde, tüm ön-işlem parametelerinin (sıcaklık, süksinik asit konsantrasyonu ve süre) samanın selüloz, ksilan ve lignin içeriğinde önemli değişimlere sebep olduğu (p<0,05) bulunmuştur. Tablo 4. Ön-işlemde kullanılan organik asitlerin formülleri ve pka değerleri Asit Adı Kapalı Formül Açık Formül pka 1 pka 2 Maleik Asit C 4 H 4 O 4 1,84 6,07 Süksinik Asit C 4 H 6 O 4 4,21 5,64 Okzalik Asit C 2 H 2 O 4 1,23 4,19 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Deney numarası lignin ksilan selüloz Şekil 9. Farklı ön-işlem koşullarında süksinik asitle işlenmiş saman örneklerinin kompozisyonu (her deney numarası farklı proses koşulunu göstermektedir ve bu koşullar Tablo 2 de belirtilmiştir) 22

Selüloz / Lignin Miktarı 12B4343007 Sonuç Raporu 60% 50% 40% 30% 20% Lignin Selüloz 10% 0% 0% 5% 10% 15% 20% 25% Ksilan Miktarı Şekil 10. Farklı ön-işlem koşullarında süksinik asitle işlenmiş saman örneklerinin selüloz ve lignin içeriklerinin (%), örnekteki ksilan miktarı ile değişimi Ön-işlem sıcaklığının, süksinik asit konsantrasyonunun ve ön-işlem süresinin, samanın selüloz, ksilan ve lignin içeriğine etkileri Şekil 11, 12 ve 13 de gösterilmiştir. Şekil 11 (a, b, c) incelendiğinde sıcaklık artışının maleik asitte olduğu gibi her koşulda, örneklerde daha yüksek selüloz miktarına sebep olduğu anlaşılmaktadır. Örneklerdeki selüluloz içerikleri %37 ile %53 arasında değişmektedir. Sabit sıcaklık ve ön-işlem süresinde, süksinik asit konsantrasyonunu arttırmak, her ne kadar selüloz içeriğinde çok büyük bir artışa sebep olmuyor gibi gözükse de, selüloz miktarındaki artış istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0,05). Ön-işlem süresi de, sıcaklık gibi selüloz miktarında önemli bir artışa sebep olmuştur. Ksilan konsantrasyonları incelendiğinde (Şekil 12), sabit süksinik asit konsantrasyonunda ve sabit önişlem süresinde, sıcaklığın arttırılması örnekteki ksilan miktarını önemli ölçüde azaltmıştır. Ön-işlem süresi sabit tutulduğunda, 170 ile 190 C arasındaki sıcaklıklarda, asit konsantrasyonunun arttırılmasının 23

ksilan miktarı üzerine çok etkili olmadığı gözükmektedir. Bununla birlikte sıcaklık artışı ile asit konsantrasyonunun ksilan miktarı üzerinde daha önemli hale geldiği söylenebilir. Ön-işlem süresinin de çok benzer bir etkisi olduğu bulunmuştur. Ek olarak ön-işlem sıcaklığı sabit tutulduğunda, yüksek asit konsantrasyonunda (%5), ön-işlem süresinin ksilan miktarı üzerinde çok büyük değişimlere sebep olmadığı gözlemlenmiştir. Örneklerdeki lignin miktarı (Şekil 13) tüm proses parametrelerinden pozitif etkilenmiştir. Sıcaklığın, asit konsantrasyonunun ve sürenin artması ile lignin içeriği artmıştır. Parametreler karşılaştırılırsa sıcaklığın etkisinin diğerlerine göre daha fazla olduğu söylenebilir. Literatürde süksinik asit kullanılarak yapılmış bir ön-işlem çalışması bulunamamıştır. Bu sebeple karşılaştırma yapılamamıştır. 24

(a) (b) (c) Şekil 11a,b,c. Farklı ön-işlem koşullarının (sıcaklık, süksinik asit konsantrasyonu ve süre) samanın selüloz içeriğine (g selüloz/g kuru saman) etkisi 25

(a) (b) (c) Şekil 12a,b,c. Farklı ön-işlem koşullarının (sıcaklık, süksinik asit konsantrasyonu ve süre) samanın ksilan içeriğine (g ksilan/g kuru saman) etkisi 26

(a) (b) (c) Şekil 13a,b,c. Farklı ön-işlem koşullarının (sıcaklık, süksinik asit konsantrasyonu ve süre) samanın lignin içeriğine (g lignin/g kuru saman) etkisi 27

Ön-işlem sonrasında, maleik asit örneklerinde olduğu gibi saman örnekleri enzimatik hidroliz deneylerine tabi tutulmuş ve proses parametreleri olarak seçilen, ön-işlem sıcaklığının, süksinik asit konsantrasyonunun ve ön-işlem süresinin, samanın glukoz ve ksiloz verimlilikleri üzerine etkisi yanıt yüzey metodu kullanılarak belirlenmiştir. Minitab programı ile yapılan regresyon analizinden elde edilen ikinci derece denklemler Tablo 5 de verilmiştir. Denklemlerde X ile gösterilenler bağımsız değişkenleri, Y ile tanımlananlar ise bağımlı değişkenleri göstermektedir. Buna göre maleik asitte olduğu gibi, sıcaklık (X 1, C), asit konsantrasyonu (X 2, %) ve ön-işlem süresi (X 3, dak) bağımsız değişken; glukoz verimi (Y 1 ) ve ksiloz verimi (Y 2 ) bağımlı değişkendir. Elde edilen r 2 değerlerine göre, süksinik asit için elde edilen modellerin iyi uyum sağladığı söylenebilir (Tablo 5). Buna ek olarak, modelin uyum eksikliği testi de tüm bağımlı değişkenler için önemsiz bulunmuştur. Tablo 5. Süksinik asit için regresyon eşitlikleri Bağımlı Değişkenler Regresyon denklemleri r 2 Glukoz verimi Y 1 =0,312266+0,151536*X 1 + 0,0535659*X 2 + 0,0576278*X 3 2 +0,0562768*X 1 +0,0125033X 2 2 2 + 0,0109520X 3 + 0,0474941*X 1 X 2 +0,0176370X 1 X 3-0,0214462X 2 X 3 0,9839 Ksiloz verimi Y 2 = 0,241259+ 0,126149*X 1 + 0,0200836X 2 + 0,0497221 2 *X 3 +0,0325094 X 1-0,00126998X 2 2 2 +0,0113461X 3 +0,00316253X 1 X 2-0,00147945X 1 X 3-0,0557139*X 2 X 3 Üzerinde işaret bulunmayan bağımsız değişkenler istatistiksel olarak önemsizdir. * istatistiksel olarak farkı belirtir (p 0,05) 0,9750 Proses parametrelerinin (sıcaklık, süksinik asit konsantrasyonu ve ön-işlem süresi) samanın glukoz ve ksiloz verimine etkileri Şekil 14 ve 15 de gösterilmiştir. İstatistiksel analizler sonucu incelendiğinde, glukoz verimi üzerine tüm bağımsız değişkenlerin etkili olduğu bulunmuştur (Tablo 5). Regresyon denkleminde, proses parametrelerinin glukoz verimine etkisinin pozitif olduğu gözükmektedir. Bu da sıcaklığın, sürenin ve asit konsantrasyonunun artması ile glukoz veriminin artacağını belirtmektedir. Proses parametrelerinin glukoz verimine olan olumlu etkisi Şekil 14 de de açıkça gözükmektedir. Sabit asit konsantrasyonu ve ön-işlem süresinde, sıcaklığın 170 C den, 210 C ye arttırılması glukoz veriminde yaklaşık 2 kat bir artışa neden olmuştur. Sabit sıcaklık ve ön-işlem süresinde asit konsantrasyonunun %1 den %5 e çıkarılması, glukoz veriminde yaklaşık 1,5 kat bir artışa sebep 28

olmuştur. Benzer şekilde sabit koşullarda sürenin 10 dakikadan 30 dakikaya arttırılması, verimde 1,3 kat yükselmeye neden olmuştur. En yüksek glukoz verimi, 210 C de, %5 süksinik asitle 20 dakika işlenmiş saman örneklerinde (%63) elde edilmiştir. Ek olarak, sıcaklık ve süksinik asit konsantrasyonunu arasında istatistiksel olarak önemli bir interaksiyon olduğu bulunmuştur (Tablo 5). Bu interaksiyonun pozitif olması glukoz verimini artırıcı yönde bir etkileşim olduğunun göstergesidir. Glukoz veriminden farklı olarak, sadece sıcaklık ve sürenin ksiloz verimini istatistiksel olarak önemli ölçüde etkilediği tespit edilmiştir (Tablo 5). Maleik asitte olduğu gibi, süksinik asit konsantrasyonunun da ksiloz verimi üzerine istatistiksel açıdan önemli bir etkisi olmadığı anlaşılmıştır. Regresyon denkleminde, sıcaklık ve sürenin ksiloz verimine etkisinin pozitif olduğu gözükmektedir. Bu da önişlem sıcaklığının ve ön-işlem süresinin artması ile ksiloz veriminin artacağını belirtmektedir. Ön-işlem sıcaklığının ve süresinin ksiloz üzerindeki etkisi Şekil 15 de de gözükmektedir. Ön-işlem sıcaklığının süreye oranla verimi daha çok etkilediği açıktır. Bunlara ek olarak, her ne kadar tek başına ksiloz verimi üzerinde istatistiksel olarak önemli bir etkisi olmasa da, süksinik asit konsantrasyonunun ön-işlem süresiyle etkileşiminin anlamlı olduğu Tablo 5 de gözükmektedir. Bu da ön-işlem süresinin ksiloz verimi üzerindeki etkisinin asit konsantrasyonuna da bağlı olduğunu göstermektedir. Genel olarak bakıldığında süksinik asitle muamele edilmiş samandan yüksek miktarda şeker verimi elde edilemediği ve verimlerin maleik asit sonuçlarına göre oldukça düşük olduğu gözlemlenmiştir. Bu da süksinik asitin etkili bir ön-işlem kimyasalı olmadığı sonucuna varmamıza sebep olmuştur. Önceden de değinildiği üzere süksinik asit, maleik asite oranla daha zayıf bir dikarboksilik asittir ve lignoselülozik yapıda yeterli seviyede bir parçalanma sağlayamadığı anlaşılmıştır. Her ne kadar sıcaklık, süre ve asit konsantrasyonunun arttırılması ile verim artışı sağlanmış olsa da, en ekstrem koşullarda dahi verim %50-60 ı geçememiştir. 29

Maleik asit deneylerinde olduğu gibi, optimum proses koşulları RSM ile glukoz ve ksiloz verimlilikleri maksimize edilmeye çalışılarak belirlenmiştir. Buna göre optimum noktalar tüm proses parametreleri (X 1, X 2, ve X 3 ) için 1 olarak bulunmuştur. Bu noktalar, 210 C sıcaklık, %5 süksinik asit konsantrasyonu ve 30 dakika ön-işlem süresine denk gelmektedir. Bu noktalarda elde edilecek olan verimlilikler ise RSM ile glukoz ve ksiloz için sırasıyla %70 ve %43 olarak hesaplanmıştır. Bu verilerin doğruluğu deneylerle de desteklenmiştir. Bu optimum koşullarda gerçekleştirilen fermentasyon deneylerinden elde edilen etanol konsantrasyonunun zamanla değişimi Şekil 16 da gösterilmiştir. Görüldüğü üzere, etanol konsantrasyonu fermentasyon süresi boyunca artmış ve 96. saatte 10,3g/L değerini almıştır. Etanol verimi ise materyal ve metot kısmında belirtildiği üzere hesaplanmış ve yaklaşık %59,2 olarak bulunmuştur. Beklenildiği üzere, şeker verimlerinin düşük olması etanol miktarında da azalmaya sebep olmuştur. Maleik asitle kıyaslandığı zaman etanol miktarında %20 oranında bir azalma olmuştur. Bu da süksinik asitin diğer asitlerle kıyaslandığında etkili bir ön-işlem kimyasalı olmadığını bir kez daha göstermiştir. Literatürde süksinik asit kullanılarak yapılmış bir ön-işlem çalışması bulunamamıştır. Bu sebeple karşılaştırma yapılamamıştır. 30

(a) (b) (c) Şekil 14a,b,c. Farklı ön-işlem koşullarının (sıcaklık, süksinik asit konsantrasyonu ve süre) glukoz verimine (g/g) etkisi 31

(a) (b) (c) Şekil 15a,b,c. Farklı ön-işlem koşullarının (sıcaklık, süksinik asit konsantrasyonu ve süre) ksiloz verimine (g/g) etkisi 32

Etanol Miktarı (g/l) 12B4343007 Sonuç Raporu 14 12 10 8 6 4 2 0 0 20 40 60 80 100 120 Süre (sa) Şekil 16. Optimum koşullarda süksinik asitle işlenmiş samandan üretilen etanol miktarının (g/l) fermantasyon süresi boyunca değişimi iii. Okzalik Asit Sonuçları Saman örnekleri diğer asitlere benzer şekilde, farklı sıcaklık (170, 190, 210 C), asit konsantrasyonu (%1, %3, %5) ve farklı sürelerde (10, 20, 30 dakika) işlenmiş ve kompozisyonundaki değişimler tespit edilmiştir (Şekil 17). Okzalik asitle farklı koşullarda işlenmiş saman örneklerindeki ksilan miktarının %0,07-7,13 arasında olduğu bulunmuştur. Bu sonuçlar, ksilanın okzalik asitle büyük ölçüde hidrolize olarak sıvı fazda çözündüğünü göstermektedir. Maleik ve süksinik asite kıyasla, ksilanın en fazla okzalik asitle hidrolize olduğu söylenebilir. Okzalik asitin pka değerlerinin daha düşük olması (Tablo 4), diğer organik asitlere oranla daha kuvvetli bir asit olduğunun göstergesidir. Bu sebeple asite karşı duyarlı olan pentozların okzalik asitle daha kolay hidrolize olması beklenen bir sonuçtur. Örneklerdeki lignin miktarının ön-işlem sonrasında %33 ile %40 arasında değerler aldığı bulunmuştur. Diğer sonuçlara benzer şekilde örneklerdeki selüloz ve lignin miktarındaki artışın, ksilan miktarındaki azalış 33

ile ilgili olduğu gözlenmiştir (Şekil 18). Benzer sonuçlar okzalik asitle işlenmiş mısır koçanında da elde edilmiştir (Lee vd. 2010). Mısır koçanının lignin içeriği, hemiselüloz kaybıyla orantılı olarak %13,9 oranında artmıştır. Lignin konsantrasyonundaki artışın maleik asitle işlenmiş örneklerle benzerlik göstermesi, okzalik ve maleik asitin, ksilanı yaklaşık aynı oranlarda sıvı fazda çözdüğünün göstergesidir. Sonuçlar istatistiksel olarak incelendiğinde, samanın selüloz içeriğinde ön-işlem sıcaklığının ve sürenin önemli değişimlere sebep olduğu, ancak okzalik asit konsantrasyonun anlamlı bir fark yaratmadığı bulunmuştur. Sıcaklık ve asit konsantrasyonu ksilan üzerinde istatistiksel olarak önemli bir etki yaratmıştır. Bunun yanı sıra, lignin üzerinde tüm ön-işlem parametelerinin (sıcaklık, süksinik asit konsantrasyonu ve süre) önemli değişimlere sebep olduğu (p<0,05) bulunmuştur. 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Deney numarası lignin ksilan selüloz Şekil 17. Farklı ön-işlem koşullarında okzalik asitle işlenmiş saman örneklerinin kompozisyonu (her deney numarası farklı proses koşulunu göstermektedir ve bu koşullar Tablo 2 de belirtilmiştir) 34

Selüloz / Lignin Miktarı 12B4343007 Sonuç Raporu 70% 60% 50% 40% 30% Lignin Selüloz 20% 10% 0% 0% 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8% Ksilan Miktarı Şekil 18. Farklı ön-işlem koşullarında okzalik asitle işlenmiş saman örneklerinin selüloz ve lignin içeriklerinin (%), örnekteki ksilan miktarı ile değişimi Ön-işlem sıcaklığının, okzalik asit konsantrasyonunun ve ön-işlem süresinin, samanın selüloz, ksilan ve lignin içeriğine etkileri Şekil 19, 20 ve 21 de gösterilmiştir. Şekil 19 (a, b) incelendiğinde selüloz konsantrasyonunun sıcaklık hızlı bir şekilde arttığı, ancak bu artışının 190 C den sonra kısmen sabitlendiği ve çok değişmediği söylenebilir. Örneklerdeki selüloz içerikleri %39 ile %58 arasında değişmektedir. Benzer şekilde ön-işlem süresinin uzatılması, selüloz konsantrasyonunun artmasına sebep olmuştur. Her ne kadar okzalik konsantrasyonundaki artış, selüloz içeriğinde azalmaya neden oluyormuş gibi gözükse de (Şekil 19 a, c), bu azalma istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p>0,05). Ksilan konsantrasyonları incelendiğinde (Şekil 20 a, b, c) sıcaklık ve okzalik asit konsantrasyonundaki artışın örneklerdeki ksilanı önemli ölçüde azalttığı bulunmuştur. Maleik asit örneklerinde olduğu gibi ekstrem ön-işlem koşullarında ksilanın neredeyse tamamının sıvı fazda çözündüğü gözlemlenmiştir. 35

Benzer bir sonuç Scordia vd. (2013) tarafından da rapor edilmiştir. Bu çalışmada, fil otu 190 C de %5 okzalik asit ile 25 dakika boyunca bekletilmiş ve ksilan miktarının büyük ölçüde suda çözündüğü ve suda çözünmeyen fraksiyonda sadece %0,48 oranında olduğu tespit edilmiştir. Düşük sıcaklık ve düşük okzalik asit konsantrasyonlarında, ön-işlem süresindeki artış örneklerdeki ksilan miktarında azalmaya sebep oluyor gibi gözükse de (Şekil 20 b ve c), bu azalma istatistiksel olarak önemli bulunmamıştır (p>0,05). Maleik ve süksinik asit sonuçlarına benzer şekilde örneklerdeki lignin miktarı (Şekil 21) tüm proses parametrelerinden pozitif etkilenmiştir. Sıcaklığın, okzalik asit konsantrasyonunun ve sürenin artması ile lignin içeriği artmıştır. 36

(a) (b) (c) Şekil 19a,b,c. Farklı ön-işlem koşullarının (sıcaklık, okzalik asit konsantrasyonu ve süre) samanın selüloz içeriğine (g selüloz/g kuru saman) etkisi 37

(a) (b) (c) Şekil 20a,b,c. Farklı ön-işlem koşullarının (sıcaklık, okzalik asit konsantrasyonu ve süre) samanın ksiloz içeriğine (g ksiloz/g kuru saman) etkisi 38

(a) (b) (c) Şekil 21a,b,c. Farklı ön-işlem koşullarının (sıcaklık, okzalik asit konsantrasyonu ve süre) samanın lignin içeriğine (g ksiloz/g kuru saman) etkisi 39

Önceki iki asitte olduğu gibi, ön-işlem sonrasında saman örnekleri enzimatik hidroliz deneylerine tabi tutulmuş ve proses parametreleri olarak seçilen, ön-işlem sıcaklığının, okzalik asit konsantrasyonunun ve ön-işlem süresinin, samanın glukoz ve ksiloz verimlilikleri üzerine etkisi yanıt yüzey metodu kullanılarak belirlenmiştir. Regresyon analizinden elde edilen ikinci derece denklemler Tablo 6 da verilmiştir. Denklemlerde X ile gösterilenler bağımsız değişkenleri, Y ile tanımlananlar ise bağımlı değişkenleri göstermektedir. Sıcaklık (X 1, C), asit konsantrasyonu (X 2, %) ve ön-işlem süresi (X 3, dak) bağımsız değişken; glukoz verimi (Y 1 ) ve ksiloz verimi (Y 2 ) bağımlı değişkendir. Elde edilen r 2 değerlerine göre, okzalik asit için elde edilen modellerin iyi uyum sağladığı söylenebilir (Tablo 6). Buna ek olarak, modelin uyum eksikliği testi de tüm bağımlı değişkenler için önemsiz bulunmuştur. Tablo 6. Okzalik asit için regresyon eşitlikleri Bağımlı Değişkenler Regresyon denklemleri r 2 Glukoz verimi Y 1 =0,873616+0,113635*X 1 + 0,0917742*X 2 + 0,0449875X 3-2 0,00891910X 1 +0,0194805X 2 2 2 + 0,0188540X 3-0,0879617*X 1 X 2-0,0185618X 1 X 3-0,0914886X 2 X 3 0,9196 Ksiloz verimi Y 2 = 0,872731+ 0,0989984*X 1 + 0,157021*X 2 + 0,0347123 2 X 3-0,0165779X 1-0,0771032X 2 2 2 +0,0137067X 3-0,0220790X 1 X 2-0,0177518X 1 X 3-0,133580*X 2 X 3 Üzerinde işaret bulunmayan bağımsız değişkenler istatistiksel olarak önemsizdir. * istatistiksel olarak farkı belirtir (p 0,05) 0,9121 Proses parametrelerinin (sıcaklık, okzalik asit konsantrasyonu ve ön-işlem süresi) samanın glukoz ve ksiloz verimine etkileri Şekil 22 ve 23 de gösterilmiştir. İstatistiksel analiz incelendiğinde, glukoz verimi üzerine ön-işlem sıcaklığı ve asit konsantrasyonunun etkili olduğu bulunmuştur (Tablo 6). Regresyon denkleminde, sıcaklığın ve asitin glukoz verimine etkisinin pozitif olduğu gözükmektedir. Bu da yüksek sıcaklık ve asit konsantrasyonlarında glukoz veriminin artacağını göstermektedir. Proses parametrelerinin glukoz verimine olan olumlu etkisi Şekil 22 de de açıkça gözükmektedir. Sabit okzalik asit konsantrasyonu ve ön-işlem süresinde, sıcaklıktaki artış glukoz verimde önemli bir artışa sebep olmuştur (Şekil 22 a ve b). Ancak verimin sıcaklıkla artışı, asit konsantrasyonuna bağlı olarak değişmektedir. Tablo 6 da da görüleceği üzere sıcaklık ve asit konsantrasyonu arasındaki interaksiyon (X 1 X 2 ) istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Bu bulgu bize bu iki proses parametresi arasında 40

etkileşim olduğunu göstermektedir. Bu etkileşim Şekil 22a da da gözükmektedir. Düşük okzalik asit konsantrasyonlarında (%1), ön-işlem sıcaklığının 170 C den, 210 C ye arttırılması glukoz veriminin yaklaşık %60 seviyelerin %90 seviyelerine yükselmesini sağlarken, yüksek asit konsantrasyonlarındaki (%5) sıcaklık artışı verimin sadece %90 seviyelerinde değişmesine sebep olmuştur. Benzer şekilde düşük sıcaklıklarda asit konsantrasyonundaki artış, glukoz verimi üzerinde daha etkili olduğu gözlemlenmiştir. En yüksek glukoz verimi (>%90) 210 C de işlenmiş saman örneklerinde elde edilmiştir. Literatürdeki diğer çalışmalar incelendiğinde, mısır koçanının okzalik asitle muamele edilmesiyle %26 ile %76,2 oranında glukoz verimi elde edildiği bulunmuştur (Lee vd. 2010). Karma sert ağaç örnekleri ile yapılan diğer bir okzalik asit çalışmasında, glukoz veriminin %72,70-88,64 arasında olduğu tespit edilmiştir (Lim ve Lee 2013a). Belirtilen verimlerin çalışmamızda elde edilen rakamlara oranla daha düşük olması hammaddenin yapısındaki, ön-işlem ve enzimatik hidroliz koşullarındaki farklılıklardan kaynaklandığı düşünülmektedir. Glukoz verimine benzer şekilde, sadece sıcaklık ve okzalik asit konsantrasyonunun ksiloz verimini istatistiksel olarak önemli ölçüde etkilediği tespit edilmiştir (Tablo 6). Diğer iki asitten farklı olarak, önişlem süresinin ksiloz verimi üzerinde istatistiksel açıdan önemli bir etki yaratmadığı anlaşılmıştır. Regresyon denkleminde, sıcaklık ve konsantrasyonun ksiloz verimine etkisinin pozitif olduğu gözükmektedir. Bu da ön-işlem sıcaklığının ve okzalik asit konsantrasyonunun artmasıyla, ksiloz veriminin artacağını belirtmektedir. Proses parametrelerinin ksiloz verimi üzerindeki etkisi Şekil 23 de de gözükmektedir. Bunlara ek olarak, her ne kadar tek başına ksiloz verimi üzerinde istatistiksel olarak önemli bir etkisi olmasa da, ön-işlem süresinin okzalik asit konsantrasyonu ile etkileşiminin (X 2 X 3 ) anlamlı olduğu Tablo 6 da gözükmektedir. Bu da asit konsantrasyonunun ksiloz verimi üzerindeki etkisinin ön-işlem süresine bağlı olduğunu göstermektedir. Okzalik asit sonuçlarına genel olarak bakıldığında samandan yüksek miktarda şeker verimi elde edildiği ve ön-işlem için çok uygun bir kimyasal olduğu açıktır. Önceden de değinildiği üzere okzalik asit, diğer 41