MANTARLARIN EPİDEMİYOLOJİK TİPLENDİRİLMESİ Dr. Ayşe Kalkancı Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara
Taksonomik terimler Alem (Kingdom) Bölüm veya şube (divisio, filum) Sınıf Takım Aile Cins Seksiyon Tür
Kwon-Chung K J Clin Infect Dis. 2012;54:S8-S15
İzolat ve köken (strain) nedir? İzolat: tek bir mikroorganizmanın tek kolonisinden elde edilen saf kültürdür. Burada bir tiplendirme yöntemi yoktur. Sadece saf kültür vardır. Köken (strain): tiplendirildiği zaman birbirinden ayrılamayan izolat setidir.
İzolat ve köken (strain) nedir? İzolat: tek bir mikroorganizmanın tek kolonisinden elde edilen saf kültürdür. Burada bir tiplendirme yöntemi yoktur. Sadece saf kültür vardır. Köken (strain): tiplendirildiği zaman birbirinden ayrılamayan izolat setidir. Köken 1 Köken 2 Köken 3 Köken 4
Tiplendirme nedir? Tiplendirme sonucunda basit bir soruya cevap ararız; İzolatlar aynı mıdır? Farklı mıdır? Epidemiyolojik olarak ilişkili izolatlar tek bir atadan klonal olarak gelişirler Klonal izolatlar aynı tiptir ve ilişkisiz izolatlardan farklı bir tip gösterirler
Terimler Epidemi: Bir etkenin hızla salgın yapması Pandemi: Aynı hastalığın deniz aşırı ülkelerde, uzak coğrafyalarda görülmesi Epidemiyoloji: Çevresel, mikrobiyolojik ve klinik bilgilerin bir arada değerlendirilmesi Moleküler epidemiyoloji: Mikroorganizmaların DNA bilgisinin çevresel, mikrobiyolojik ve klinik bilgiler ile birlikte karşılaştırılarak değerlendirilmesi
Epidemiyoloji Fenotipik analizler organizmanın biyolojik özelliklerini değerlendirir Moleküler epidemiyoloji genomik DNA veya plazmid DNA sının genotipik analizidir Tür, köken (strain), veya tipe özgül DNA dizileri genotipik analizin temelini oluşturur
Tiplendirme sisteminin değerlendirilmesi KRİTER Tiplendirebilirlik Tekrarlanabilirlik Ayırım gücü TANIMI Mikroorganizma türlerinin çoğu ile net olarak karşılaştırılabilir sonuçlar verebilme kapasitesi Tekrarlandığında aynı mikroorganizma türü ile aynı profil tipinin elde edilmesi kapasitesi Aynı mikroorganizma türünün farklı kökenlerini (strain) birbirinden ayırabilmeye yetecek sonuçlar verebilme Diğer kriterler Yöntem hızlı, kolay, ucuz, ve teknik olarak basit olmalıdır. Laboratory Training for Field Epidemiologists Laboratory Training for Epidemiologists
Tiplendirme Fenotipik tiplendirme Koloni tipi, antifungal duyarlılık profili, serotip, Genotipik tiplendirme DNA temelli yöntemler, protein temelli yöntemler ve dizi analizi yöntemleri
Yöntem DNA temelli yöntemler Bölgeye özgül PCR-RFLP Genomik DNA nın restriksiyon endonükleaz analizi Pulsed-field jel elektroforezi (Elektroforetik karyotipleme) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) AFLP (Aplified Fragment Length Polymorphism) Mikrosatellit analizi Multilokus sekans ile tiplendirme (MLST) Dizi analizi Protein temelli yöntemler İmmünblot parmak izi Poliakrilamid jel elektroforezi Multilokus enzim elektroforezi
Birinci kuşak yöntemler Plazmid analizi Restriksiyon enzim analizi İkinci kuşak yöntemler Genomik DNA izolasyonu restriksiyon ve Southern Blotting Mantar hücresi Dördüncü kuşak yöntemler MLST Mikro satellit analizi Üçüncü kuşak yöntemler RAPD PFGE
Amplifikasyon (çoğaltma) olmadan genotiplendirme
Yöntem DNA temelli yöntemler Bölgeye özgül PCR-RFLP Genomik DNA nın restriksiyon endonükleaz analizi Pulsed-field jel elektroforezi (Elektroforetik karyotipleme) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) AFLP (Aplified Fragment Length Polymorphism) Mikrosatellit analizi Multilokus sekans ile tiplendirme (MLST) Dizi analizi Protein temelli yöntemler İmmünblot parmak izi Poliakrilamid jel elektroforezi Multilokus enzim elektroforezi
PFGE Mikroorganizma süspansiyonu Agaroz içinde DNA eldesi Enzim ile restriksiyon Değişen açılardan elektroforez Karyotip analizi
Amplifikasyon sonrası genotiplendirme EcoRI
Yöntem DNA temelli yöntemler Bölgeye özgül PCR-RFLP Genomik DNA nın restriksiyon endonükleaz analizi Pulsed-field jel elektroforezi (Elektroforetik karyotipleme) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) AFLP (Aplified Fragment Length Polymorphism) Mikrosatellit analizi Multilokus sekans ile tiplendirme (MLST) Dizi analizi Protein temelli yöntemler İmmünblot parmak izi Poliakrilamid jel elektroforezi Multilokus enzim elektroforezi
DNA dizi analizi PCR Saflaştırma Cycle Sequencing (ddntp) Presipitasyon Kapiller jel elektroforezi ve okuma
Cycle Sequencing (ddntp) 5 G C A T G C 3 Kalıp 5 Primer datp dctp dgtp dttp ddctp datp dctp dgtp dttp ddatp datp dctp dgtp dttp ddttp datp dctp dgtp dttp ddctp GddC GCATGddC GCddA GCAddT ddg GCATddG
rdna gen bölgesi 5.8S D1/2 5S 18S ITS1 ITS2 28S IGS1 IGS2 18S ITS : Internal Transcribed Spacer IGS : Intergenic Spacer 8,188 bp
Hangi bölgeyi dizileyelim? 18S 28S ITS IGS Sınıf Aile Cins Tür Köken
Yöntem DNA temelli yöntemler Bölgeye özgül PCR-RFLP Genomik DNA nın restriksiyon endonükleaz analizi Pulsed-field jel elektroforezi (Elektroforetik karyotipleme) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) AFLP (Aplified Fragment Length Polymorphism) Mikrosatellit analizi Multilokus sekans ile tiplendirme (MLST) Dizi analizi Protein temelli yöntemler İmmünblot parmak izi Poliakrilamid jel elektroforezi Multilokus enzim elektroforezi
Mikro satellit analizi nedir? Rasgele tekrar eden DNA dizilerine mikro satellit nedir. Kısa tekrar bölgeleri (Short tandem repeats) Çoğaltılarak karşılaştırılmaları ile kökenler tiplendirilir
35 C. glabrata kökeni RPMI2, MT1, Cg6 CgERG11 geni, CgPDR1, NTM1, URA3 bölgeleri dizilendi. GENOTİP ile DİRENÇ arasında ilişki yok Mikrosatellit analizi uygulanabilir Ayırt etme gücü var, ancak ideal değil.
Mikoloji alanında kullanımı açısından karşılaştırılmaları Yöntem Tiplendirebilirlik Tekrarlanabilirlik Ayırım gücü Karşılaştırma kolaylığı Teknik kolaylık PCR-RFLP Mükemmel İyi Orta Mükemmel Kolay REA İyi İyi İyi Zayıf Mükemmel PFGE Mükemmel İyi Mükemmel Mükemmel Orta RAPD Mükemmel İyi İyi Kötü Kolay Mikrosatellit analizi Mükemmel iyi Mükemmel İyi Kolay Dizi analizi İyi Mükemmel İyi Mükemmel Zor
Moleküler tiplendirme ile şu basit sorulara cevap ararız; İzolatlar aynı mı? İzolatlar farklı mı? Salgın var mı? Hastadan hastaya nasıl bulaştı? Re-enfeksiyon mu? Breakthough yani tedavi altında alevlenme var mı?
35 kandidemi episodu C. parapislosis ve C. albicans C.metapsilosis veya C. orthopsilosis yok Anestezi ve Nöroloji YBÜ de genotip kümelenmesi Nozokomiyal bulaş!!!
4 yenidoğan, kandidemi C. pelliculosa (anamorfu Pichia anomala) Tür tanımı için ITS bölgesi dizi analizi Genotiplendirme için RAPD TEK GENOTİP Nozokomiyal bulaş!!!
6 ayrı genotip 7 ayrı karyotip
6 merkez, 107 izolat IGS bölgesi dizi analizi Bilinen 8 T. asahii genotipi, 1 adet yeni genotip Genotip 1 (% 79)
Nosokomiyal kandidemi analizi İzlanda 1991-2006 Retrospektif 217 izolat Olgulara ait bilgiler DNA parmak izi ( fingerprinting ) M13 (GACA) primeri ile RAPD veya AP-PCR Asmundsdottir LR, Erlendsdottir H, Haraldsson G, Guo H, Xu J, Gottfredsson M. Molecular Epidemiology of Candidemia: Evidence of Clusters of Smoldering Nosocomial Infections. Clinical Infectious Diseases 2008; 47:e17 24.
Asmundsdottir LR, Erlendsdottir H, Haraldsson G, Guo H, Xu J, Gottfredsson M. Molecular Epidemiology of Candidemia: Evidence of Clusters of Smoldering Nosocomial Infections. Clinical Infectious Diseases 2008; 47:e17 24.
Barkot nedir? Sitokrom oksidaz 1 (CO1) hayvanlarda barkodlama için kullanılmıştır Mantarlarda CO1, ITS denenmiştir Protein kodlayan genler!!! Ortak bir primer dizisi yok (Schoch, 2012) Intronların varlığı kısıtlayıcı. http://www.fungalbarcoding.org/
MLST ayırım gücü düşük Mikrosatellit daha iyi bir tiplendirme yöntemi MLST tür tanımı için ideal
Sık yapılan hatalar Kültür ortamındaki üremenin tek köken olmaması Çoklu köken taşıyıcılığı hasta yaşı ile birlikte artar İnceleme süresinin geniş olması İncelenecek topluluk büyük olması
Öneriler Çalışmaya başlamadan önce Hasta kimlik bilgileri İsim, adres, telefon, yaş, cinsiyet, ırk, meslek Klinik bilgiler Uygulanan invaziv girişimler, altta yatan hastalıklar, antibiyotik tedavisi Klasik epidemiyolojik bilgiler Hastanın doğduğu ve hastalığın ortaya çıktığı yer, yatış ve çıkış bilgileri, yattığı birimler
Öneriler Çalışma sırasında ve sonrasında Tek koloni üzerinden çalışılmalıdır Hiçbir yöntem altın standart değildir Birden fazla yöntem bir arada kullanılabilir Sonuçlar bilgisayar destekli incelenmelidir Jel fotoğrafları çekilmelidir Veri bankalarında saklanmalıdır
TEŞEKKÜR EDERİM