Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir. ULUSAL MİKROBİYOLOJİ STANDARTLARI (UMS) Mikroskop Kalibrasyonu (Oküler ölçek ile) Hazırlayan Birim Klinik Parazitoloji Tanı Standartları Çalışma Grubu Onaylayan Birim Türkiye Halk Sağlığı Kurumu Kategori Parazitoloji Bölüm Test prosedürleri Standart No P-TP-01 Sürüm No 1.1 Onay tarihi 01.01.2015 Geçerlilik tarihi 01.01.2018 Sürüm no Tarih Değişiklik
İÇİNDEKİLER KAPSAM VE AMAÇ... 3 GENEL BİLGİ... 3 TEKNİK BİLGİLER... 4 1 Asgari laboratuvar koşulları... 4 2 Mikroskop kalibrasyonunun yapılması... 5 3 Sonuçların hesaplanması... 7 4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar... 7 EKLER... 8 Ek-1 Mikroskop bakımı ve temizliği... 8 Ek-2 Köhler aydınlatması... 9 KAYNAKLAR... 11 Sayfa 2 / 11 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-01 / Test Prosedürleri / Parazitoloji
Kapsam ve Amaç Organizmaların tanım ve sınıflandırmasında pek çok kriter kullanılır; bunlardan biri de ölçü/büyüklüktür. Ölçümler mikroskobun okülerine yerleştirilmiş ölçekli bir disk (oküler ölçek / oküler mikrometre) ve üzerinde hassas ölçümlerle çizilmiş cetvel bulunan özel bir lam kullanılarak yapılır. Parazitolojide (ve genel olarak mikrobiyolojide) tanı koyma işi yapan her laboratuvarın hassas ölçümler için kalibre edilmiş en az bir mikroskoba sahip olması ve mikroskoplarını yılda en az bir kez kalibre etmesi önerilmektedir. Bu UMS'nin amacı mikroskoptaki cisimlerin boyutlarının doğru ölçümü için, laboratuvarlara, oküler ölçek ve mikrometreli lam kullanılarak mikroskop kalibrasyonunun nasıl yapılacağına yönelik bir prosedür vermektir. Genel Bilgi Parazitler için alınan numunelerin incelenmesinde iyi bir mikroskop ve ışık kaynağı şarttır. Organizma tanımlamaları morfolojik özelliklerine göre yapılır ve çoğunda da normal ışık mikroskopları kullanılır (1,2). Mikroskop kullanırken zaman zaman incelenen numunelerde ölçüm yapılması gerekebilir. Bu kadar küçük organizmaların boyutlarını ölçmek yani mikroskopla ölçüm yapmak için okülere yerleştirilen oküler ölçeği kullanılmaktadır. Oküler ölçeği; yuvarlak, ince ve üzerinde birden yüze kadar sayılarla belirlenmiş bölüntüleri bulunan okülerin içerisindeki sabit halka diyaframına yerleştirilebilen bir cam ya da plastik bir disktir. Ölçekteki aralıkların ne kadar olduğunu bulabilmek için kalibrasyon işlemi yapılması amacıyla üzerinde hassas ölçümlerle çizilmiş bir cetvel bulunan "mikrometreli lam" kullanılır (2,3,4). Kalibrasyon işlemi, kullanılacak objektife göre yapılmalıdır. Çünkü kalibrasyon işlemi, oküler ölçeğindeki bir aralığın, o anda kullanılan objektifin büyütme derecesine göre kaç mikrona karşılık olduğunun bulunmasıdır (4). Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 3 / 11 Parazitoloji / Test Prosedürleri / P-TP-01 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Teknik Bilgiler 1 Asgari laboratuvar koşulları 1.1. Laboratuvar güvenliği Ulusal Laboratuvar Güvenliği Rehberi nde belirtilen evrensel güvenlik önlemleri uygulanmalıdır. Mikroskop ile çalışırken elektrik kaynaklı tehlikelere dikkat edilmelidir. 1.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri Bu UMS yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) uygulamadan önce, amaçlanan kullanım ile ilgili eğitim almış olmalı; (ii) yapılan işe tüm yönleriyle aşina olmalı, ve (iii) daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır. 1.3. Örnek, Donanım Donanım Mikroskop - 10, 40 ve 100 objektiflere sahip binoküler normal ışık mikroskobu (diğer objektif büyütme oranları da kullanılabilir) (2). (a) Stereo mikroskoplar (total büyütme oranı 50) veya (b) Normal ışık mikroskopları (kuru olanlar; düşük, 100 ve yüksek 400, yağlı olan; 1000) Oküler 10 - Parazitolojik incelemede 10 oküler kullanılmalıdır. Bazıları 5 oküler tercih ediyorsa da, 5 oküler daha az büyütme sağlar ve inceleme duyarlılığını düşürür (2). NOT: Bir adet 10 oküler laboratuvardaki bütün mikroskopların kalibrasyonunu yapmak için kullanılabilir (herhangi bir organizma ölçüleceği zaman kullanılmak üzere). Diğer gereçler, standart örnek Oküler ölçek (Oküler mikrometresi) - Yuvarlak ince ve üzerinde birden yüze kadar sayılarla belirlenmiş bölüntüleri bulunan okülerin içerisindeki sabit halka diyaframına yerleştirilebilen bir cam veya plastik ölçek (çizgi 50 üniteye bölünmüş olarak) (herhangi bir laboratuvar tedarik distribütöründen; Fisher, Baxter, Scientific Products, VWR, vb. gibi) Mikrometreli lam (Objektif/Stage mikrometresi), 0.1-0.01 mm bölümlü (herhangi bir laboratuvar tedarik distribütöründen; Fisher, Baxter, Scientific Products, VWR, vb. gibi) Mercek veya lens kağıdı İmmersiyon yağı Lateks veya polistren boncuklar veya Giemsa boyalı periferik yayma Sayfa 4 / 11 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-01 / Test Prosedürleri / Parazitoloji
1.4. Kalite kontrol Mikroskobunuzu periyodik olarak kalibre edin. Yoğun kullanımda yılda bir kez önerilir. Üç büyütmenin ( 100, 400, 1000) kalibrasyonunda da en sık eritrosit ölçümü ( 7.5 µm) kullanılır. Lateks veya polistren boncuklar da kalibrasyonda kullanılabilir. 10 µm ve 90 µm boncuklar önerilir. Nihai çarpım katsayısı ancak ve ancak sizin oküler 0 ve mikrometreli lam 0 çizgisini kesiştirmedeki görsel kabiliyetiniz kadar iyi olacaktır. Hesaplamalarda aşağıdaki kurallar geçerlidir: (a) Yüksek büyütmeli kuru objektif (40 ) katsayısı, yağlı (100 ) objektif katsayısının 2.5 katı olmalıdır. (b) Düşük büyütmeli objektif (10 ) katsayısı ise, yağlı objektif (100 ) katsayısının yaklaşık 10 katı olmalıdır. Tüm hesaplamalar kalite kontrol raporlarına işlenmelidir. 2 Mikroskop kalibrasyonunun yapılması Oküler ölçeğinizi hazırlayın. Mikrometreli lamınızı hazırlayın. Okülerin göz lensinin vidasını çıkarın ve oküler ölçeğini (kazınmış/işaretli kısım aşağıda kalacak şekilde) okülere yerleştirin. Diski tutmak için birkaç katlı lens kağıdı kullanın; tüm yüzeyleri toz ve pamuk / bezparçalarından koruyun. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 5 / 11 Parazitoloji / Test Prosedürleri / P-TP-01 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Kalibre edilmiş mikrometreli lamı mikroskobun tablasına koyun ve odaklayın. 0.1 ve 0.01 mm dilimlerin farkını ayırt edebilmelisiniz. Tabla üzerindeki mikrometreli lam ile oküler ölçekteki 0 çizgisi objektif mikrometresindeki 0 çizgisinin üstüne tam hizalanacak şekilde konumlandırın. Bu iki 0 çizgisi hizalandıktan sonra, objektif mikrometresini asla hareket ettirmeyin. Oküler ölçek Mikrometreli lam 0 çizgilerinin sağını kontrol ederek bir sonraki çizgi çakışmasının nerede olduğunu bulun; bu çakışma noktası mümkün mertebe 0 noktasından uzakta olmalıdır (mesafe, kullanılan objektife göre değişmektedir). 0 çizgisi ile bulduğunuz ikinci çakışan çizginin olduğu yer arasındaki oküler ölçekteki dilimlerin sayısını sayın. Mikrometreli lam üzerindeki 0 çizgisi ile ikinci çakışma noktası arasındaki 0.1 mm lik dilimleri sayın. Tek bir küçük oküler ölçek ünitesinin milimetrenin kaçta birine denk geldiğini yandaki formüle göre hesaplayın. Mikrometreli lamda okunan (mm) Oküler ölçeğinde okunan ünite x 1000 µm 1 mm = oküler ünite (µm) Sayfa 6 / 11 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-01 / Test Prosedürleri / Parazitoloji
3 Sonuçların hesaplanması Bu formül ile her objektif büyütme oranı için bir katsayı (faktör) hesaplanır (1 oküler ünite = µm, şeklinde). Örneğin; Düşük objektif (10 ) için: 0.8 mm x 1000 µm = 8.0 µm (faktör) 100 Unite 1 mm Yüksek kuru objektif (40 ) için: 0.1 mm x 1000 µm = 2.0 µm (faktör) 50 Unite 1 mm İmmersiyon objektifi (100 ) için: 0.05 mm x 1000 µm = 0.8 µm (faktör) 62 Unite 1 mm Organizmanın boyu ve eni oküler ölçekteki ünite sayısı ile belirlendikten sonra bakılan objektifin büyütme oranı katsayısı kullanılarak organizmanın gerçek boyutları hesaplanır. Bu boyutlar referans ölçümlerle karşılaştırılarak organizmanın tanımlanması doğrulanmalıdır. Örneğin; eğer bir helmint yumurtası 40 objektif ile 15 oküler ünite (boy) ve 7 oküler ünite (en) ölçülmüş ise, o objektif için bulunan faktör olan 2.0 µm ile çarpılarak boy ve en sırasıyla 30 ve 14 hesaplanır ve muhtemelen Chlonorchis sinensis olduğu söylenebilir. Standart bir nesne (lateks veya polistren boncuklar, eritrositler) farklı objektiflerle ölçülse de, nesnenin boyutları (bakılan objektifin büyütmesinden bağımsız olarak) aynı veya birbirine çok yakın olmalıdır. Her objektif için hesaplanan büyütme oranı katsayısı, diğer kullanıcıların da bilmesi için, mikroskobun tabanına veya yakın bir duvar/pano gibi bir yere yazılmalıdır. 4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar Kalibre edilen mikroskop bir bütün olarak düşünülmelidir. Oküler ölçeğin kullanılacağı her bir objektif için kalibrasyonun ayrı ayrı yapılması çok önemlidir. Oküler ölçek içeren okülerler ve/veya objektifler başka bir mikroskoptaki karşılık gelen objektif veya okülerlerle değiştirilmemeli, dönüşümlü kullanılmamalıdır. Mikroskopların bakımı ve temizliği (bkz. Ek-1) ile Köhler aydınlatması kontrolü (bkz. Ek-2) düzenli olarak yapılmalıdır. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 7 / 11 Parazitoloji / Test Prosedürleri / P-TP-01 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Ekler Ek-1 Mikroskop bakımı ve temizliği 5 Tozdan koruyun Mikroskoplar sıcak ve kuru iklimlerde tozdan, nemli iklimlerde ise mantar üremesinden etkilenirler. Rutin bakım sayesinde her iki durumun yol açabileceği hasar azaltılabilir. Mikroskobun kullanılmadığı zamanlarda plastik örtü altında tutulması tozlanmasını önleyecektir. Hava geçirmez bir kutu içinde, silika jel (kurutucu, nem alıcı) ile birlikte saklanması da mantar kolonizasyonunu azaltacaktır. Optik yüzeyler (kondansatör, objektifler, oküler) yumuşak bir deve tüyü fırçayla ya da hava üfleyici yardımıyla tozdan temizlenmelidir. Okülerin içine toz girmişse üst merceği çevirerek açın ve yumuşak bir fırça ya da üfleyici ile iç kısmı temizleyin. Yağlı bırakmayın Mikroskop asla objektiflerin üzerinde yağ ile terk edilmemeli; günün sonunda mercekler mutlaka temizlenmelidir. Merceklerin üzerindeki yağ mercek temizleme kağıdı ya da tıbbi pamuk ile giderilmelidir. Normal kağıt peçete ve mendilleri kullanmayın! Merceklerin temizlenmesinde asla etanol (%70 ve üzeri) ya da ksilen kullanılmamalıdır. Çünkü bunlar merceğin yapıştırıcı maddesini eritebilir. Optik parçalar, hazır optik temizlik solüsyonu ya da %40 petrol eteri, %40 etanol ve %20 eter ile temizlenebilir. Ancak bu solüsyon son derece yanıcıdır; kullanımı sırasında aşırı dikkat gösterilmelidir! Optik olmayan parçalar hafif deterjan ya da sabunlu su kullanarak temizlenebilir. Gres ve yağ, petrol eteri ile giderildikten sonra 50/50 distile su ve etanol karışımı ile temizlenmelidir (optik parçalar hariç). Merceklerin yüzeyinde ve vida oyuklarının düzenli şekilde kontrol edilip temizlenmesi mantar kolonizasyonunu önler. Mekanik parçalar (kaba ayar, ince ayar, kondansatör odaklama, mekanik raf) makine yağıyla yağlanmalıdır. Sayfa 8 / 11 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-01 / Test Prosedürleri / Parazitoloji
Ek-2 Köhler aydınlatması 6 Genel Bilgi August Köhler tarafından 1893 te geliştirilmiş optik mikroskopide, açıklık diyaframının ayarı ne olursa olsun, nesneyi düzgün biçimde aydınlatmaya yarayan bir sistemdir. Mikroskopta en kaliteli görüntünün elde edilebilmesi için ışığın düzgün ayarlanması tekniği olan bu işlem kullanıcının mikroskop başına her oturuşunda yapılmalıdır. a. Işık kaynağı b. Açıklık diyaframı c. Açıklık lensi d. Kondansatör diyaframı e. Kondansatör odaklama f. Şaryo g. X-Y eksen kontrolü h. Objektifler i. Oküler j. Makro ve mikro ayar Işık ayarında mikroskobun bazı bölümleri özel önem arz etmektedir. Kondansatör, tablanın altında yer alır. Işık kaynağından gelen ışınları kırarak cisim üzerinde odaklayan merceklerden oluşur. Aşağı yukarı hareket ettirilerek ışığın istenilen yere odaklanması ve ortamın yeterince aydınlanmasını sağlar. Objektifin büyütme gücü ile ilişkili olarak ışığın şiddetini ayarlar. Diyafram, ışık kaynağından gelen ışık demetinin çapını kontrol etmek için kullanılır. Işık kaynağının üstüne veya kondansatörün altına yerleşir. Işık çapı aracılığı ile en iyi kontrast ve rezolüsyonu elde etmeyi sağlar. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 9 / 11 Parazitoloji / Test Prosedürleri / P-TP-01 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Ayarlanabilir bir kondansatör merceği bulunmayan mikroskoplarda ve 1, 5 gibi düşük büyütmeli lensler kullanıldığında uygulanamaz. Bu durumda kondansatör diyaframı tam olarak açılır ve aydınlatma, açıklık diyaframı ile yapılır. Uygulama Tablaya preparat yerleştirilir. 10 büyütme ile preparat objektife yaklaştırılır. Sadece tek bir gözle okülerden bakılarak makro/mikro vidalarla preparat odaklanır. Kondansatör (iris) diyaframı tamamen açılır, açıklık diyaframı tamamen kapatılır. Tam ortada çok küçük bir ışık halkası görülmelidir. Dikey kondansatör ayar vidası ile aşağı yukarı hareket ettirilerek ışık halkasının mümkün olduğunca küçük olması sağlanır. Işık halkasının kenara itilmemesi için çok dikkatli yapılmalıdır. Açıklık diyaframı, alanın bir kenarına ışık gelene kadar açılır. Işık mükemmel şekilde merkezde toplanmışsa alanda tam bir halka şeklinde görülür. Işık halkasının merkezi, kondansatörün önündeki iki küçük vida ile ayarlanır. Yeterli bulduğunuzda alan genişletilerek ışığın tamamen dolması sağlanır. Ancak açıklık diyaframı tamamen açılmaz. Bu işlem 20 ve 40 objektifle tekrarlanır. 100 ile yapmak zordur. 20-100 objektifle çalışırken kondansatör diyaframının ayarlanması çok önemlidir (özellikle yarı saydam yapılarda). Diyaframın kapatılması kontrastı artırır. Okülerlerden biri çıkarılarak tüpün içerisindeki ışık alanına çıplak gözle bakılır. Kondansatör diyaframı, alanın 1/4-1/3 ünü kapatacak şekilde kapatılır. Bu şekilde en iyi kontrast sağlanır. Kondansatör diyaframının ayarlanmasından önce ve sonra preparat incelenir. Bu işlemin her bir objektif için tekrarlanması önemlidir. Pratikte preparatın incelenmesi sırasında oküler çıkarılmadan da ayarlama yapılabilir. Sayfa 10 / 11 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-01 / Test Prosedürleri / Parazitoloji
Üstte- Diyafram tam açıkken detaylar çok az seçilmekte. Ortada- Diyafram tam olarak kapatıldığında kontrast artmakta, ancak küçük delikler olduğundan daha geniş görülmekte. Altta- Diyafram %25-30 oranında kapatıldığında kontrast artar ve ışık sapması daha az görülür En iyi görüntü kalitesini elde ettiğinizi düşündüğünüz kondansatör diyaframında oküler çıkarılarak ne kadarlık bir alanın kapalı olduğuna bakılabilir. Taze kesit preparatlar büyük büyütmeler için kalın olmakla birlikte kondansatör diyaframının ayarlanmasında çok yararlıdır. Kaynaklar 1 Basic Laboratory Methods in Medical Parasitology. Geneva: World Health Organization (WHO), 1991. 2 Garcia LS. Calibration of microscope with an ocular micrometer. In: Garcia LS, Isenberg HD (eds). Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2007, p. 9.3.2.1-4 3 Çulha G, Miman Ö. Mikroskop. In: Korkmaz M, Ok UZ (eds). Parazitolojide Laboratuvar. 1. baskı. Parazitoloji Derneği Yayınları, 2011. 4 Garcia LS. Equipment, supplies, safety and quality system recommendations for a diagnostic parasitology. Laboratory: Factors influencing future laboratory practice. In: Garcia LS (ed). Diagnostic Medical Parasitology. 4th ed., ASM Press, Washington D.C. 2001, p.894-897 5 Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı. Temel Laboratuvar Yönetimi Eğitimi, Modül 5 Ekipman Yönetimi Eğitim Notları (Türkiye de Bulaşıcı Hastalıkların Epidemiyolojik Sürveyansı ve Kontrolünün Güçlendirilmesi Projesi; TR 0403.06). 2007 6 http://www.microscopyu.com/tutorials/java/kohler/index.html (son erişim tarihi: 06.01.2014) Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 11 / 11 Parazitoloji / Test Prosedürleri / P-TP-01 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015