17.12.2014/Çarşamba Laboratuvar 10 KONU: MOLEKÜLER BİYOLOJİDE TEMEL TEKNİKLER: Kromotografi ve Spektrofotometri AMAÇ: Moleküler biyolojide kullanılan temel tekniklerler olan kromotografi ve spektrofotometrinin çalışma prensibini anlamak. KAZANIMLAR: Bitkilerde fotosentezde yer alan pigmentleri ve ekstraksiyon ve tayin yöntemlerini öğrenir. Kromatografi ile klorofil ve karotoneidlerin ayrılmasını öğrenir. Spektrofotometre kullanabilmeyi öğrenir. GENEL BİLGİ: Kromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin, biri sabit diğeri hareketli faz olmak üzere birbirleriyle karışmayan iki fazlı bir sistemde ayrılması ve saflaştırılması yöntemidir. İlk kez Rus botanikçi Mikhail Tsvett (1903) tarafından geliştirilen bir yöntemdir. Tsvett bu yöntemi bitki pigmentlerinin renkli bileşenlerini ayırmakta kullanmıştır. Kullandığı kolonda renkli bantlar oluştuğundan, bu ayırma yöntemine kromatografi adını vermiştir. Kromotografinin kolon, kağıt, sıvı, gaz ve ince tabaka gibi çeşitleri vardır. Spektrofotometri, ışık kaynağı ile prizma arasına yerleştirilen renkli maddenin ışık spektrumunun bazı renklerini absorplaması ve konsantrasyona göre spektrumda zayıf veya kuvvetli bant göstermesi özelliğine dayanan miktar tayin yöntemidir. Analiz edilen örnek üzerine ışık demetinin bir kısmını filtreler kullanarak ayıran ve gönderen aletler kolorimetre veya fotometre olarak adlandırılırken, yarıklar ya da prizmalar aracılığı ile bu seçiciliği yapan aletler spektrofotometre olarak adlandırılırlar. Spektrofotometreler, madde renginin yoğunluğunun ölçülmesiyle madde miktarının veya konsantrasyonunun bulunmasını sağlayan cihazlardır. Spektrofotometrelerde konsantrasyonu bilinen bir standart çözeltinin absorpladığı ışık miktarı (absorbans, optik dansite) ile konsantrasyonu bilinmeyen çözeltinin absorpladığı ışık miktarı karşılaştırılır. Spektrofotometrelerde kullanılacak ışık, çözeltinin kuvvetli absorpladığı dalga boyunda seçilir; örneğin kırmızı renkli sıvı için yeşil dalga boyunda (yeşil renkli sıvı için kırmızı dalga boyunda), mavi renkli sıvı için sarı dalga boyunda (sarı renkli sıvı için mavi dalga boyunda) ışık seçilir. Spektrofotometrelerde çözeltideki madde için uygun seçilen dalga boyundaki ışığın örneğe ve standarda (bilinen konsantrasyondaki çözelti) ait absorbansları veya optik densiteleri (A, OD) karşılaştırılıp matematiksel işlemler yapılarak örnekteki maddenin konsantrasyonu bulunur. Bir spektrofotometre düzeneği; başlıca ışık kaynağı, dalga boyu seçicisi (monokromatör), dedektörden oluşur; dedektörde elektrik sinyaline çevrilen optik sinyal bir kaydedici veya bir galvanometre ile ölçülür (Şekil 1). 1
Şekil 1: Spektrometre kısımları. Spektrofotometrede doğru bir ölçüm yapabilmek için; Dalga boyuna uygun, birbiriyle uyumlu, iyi kalite küvetler kullanılmalı, Küvetlerin temiz ve çizilmemiş olmasına dikkat edilmeli, Aşınma ve eskimeden gelebilecek farklılıkları belirlemek için küvetler düzenli olarak birbirlerine karşı kalibre edilmeli, Küvetler cihaza yerleştirilirken ışık giriş ve çıkış yönlerine küvetlerin cilalı kısımlar gelmeli, Kullanım esnasında cilalı olan kısımlardan tutulmamalı, Küvetler kurutma veya başka amaçlarla ısıtılmamalıdır. Spektrofotometrelerin Çalışma Prensibi Spektrofotometrelerin temel çalışma prensibi, hazırlanan çözeltiden belirli dalga boyunda ışık geçirilmesi ve bu ışının ne kadarının çözelti tarafından tutulduğunun bulunması esasına dayanır. Çözeltinin içerisindeki madde miktarı ne kadar fazla ise çözelti tarafından tutulan ışın miktarı da o oranda fazla olur. Çözelti içerisindeki bütün maddeler, ışının bir dalga boyunu tutarken diğerlerini yansıtır veya geçirir. Maddenin belli bir dalga boyundaki bir ışını tutması, onun diğer fiziksel ve kimyasal özellikleri (yoğunluk, erime, kaynama noktası, donma noktası vb.) gibi sabit bir özelliğidir. Spektrofotometrik Ölçümün Yapılışı Spektrofotometrede ölçüm yapılırken numuneye belirli bir dalga boyundaki ışın gönderilerek numunenin absorbe ettiği ışın miktarı ölçülür. Yapılan analize göre ölçümde hangi dalga boyundaki ışının kullanılacağı analiz metodunda belirtilmektedir. Kullanılacak ışın dalga boyu bilinmiyorsa miktarı tespit edilecek maddenin 1 molar çözeltisi hazırlanıp çeşitli dalga boylarındaki absorbans değerleri ölçülür. En yüksek değerin ölçüldüğü dalga boyu belirlenerek kullanılır. Spektrofotometre bu dalga boyuna ayarlanarak çözeltilerin ölçümüne geçilir. Spektrofotometrik ölçüm için üç tip çözelti hazırlanır. Bunlar: Kör, numune ve standart çözeltileridir. 1- Kör (tanık, şahit) Çözelti: Spektrofotometrede okuma yapmadan önce absorbansı sıfıra veya % transmittansı 100 e ayarlamak için kullanılan çözeltidir. Bu amaçla yapılan işleme kör ayarı veya 0 ve 100 ayarı denir. 2
2- Standart Çözelti: Miktarı bulunmak istenen maddenin bilinen konsantrasyonlardaki çözeltisidir. Bir veya birden fazla olabilir. Birden fazla olduğunda grafik çizilir. 3- Numune Çözeltisi: İçindeki madde miktarını tespit etmek istediğimiz çözeltidir. Spektrofotometrik ölçüm yapılırken şu aşamalar takip edilir: Ölçümden yeterli süre önce cihaz çalıştırılarak ısınması sağlanır. Cihaz ölçümün yapılacağı dalga boyuna ayarlanır. Küvete kör çözelti konularak cihaza yerleştirilir. Kör çözelti ile cihazın 0 ve 100 ayarı yapılır. Küvete standart çözeltilerden konularak cihaza yerleştirilip okumaları yapılır. Küvete numune çözeltisi konularak cihaza yerleştirilip okuması yapılır. Kalibrasyon (absorbans) eğrisi çizilerek, numunenin konsantrasyonu hesaplanır. Hesaplamalar Milimetrik kâğıt üzerinde hazırlanan kalibrasyon grafiğinde, numuneye ait absorbans değerinin grafikle kesiştiği nokta işaretlenip bu noktanın x ekseni (apsis) ile kesiştiği noktadaki konsantrasyon tespit edilir. Bulunan bu değer numune çözeltisinin konsantrasyonudur. Bu metotla konsantrasyon hesaplanmasında; Öncelikle standartlara ait kalibrasyon eğrisi hazırlanıp y eksenine (ordinat) numunenin absorbans değeri (cihaz okuması) işaretlenir. İşaretlenen noktadan kalibrasyon eğrisine dik bir doğru çizilip kesişme noktası tespit edilir. Çakışma noktasından x eksenine (apsis) dik bir doğru çizilir. Çizilen dik doğrunun apsisle kesişme noktası numunenin konsantrasyonunu verir. Numune çözeltisine seyreltme uygulanmışsa analiz numunesine ait konsantrasyon tespit edildikten sonra bu değer seyreltme faktörü ile çarpılarak numuneye ait gerçek konsantrasyon tespit edilir. Milimetrik Kâğıtta Kalibrasyon Eğrisi Çizme Milimetrik kâğıtta kalibrasyon eğrisi şu şekilde çizilir: Öncelikle milimetrik kâğıt üzerine koordinat düzlemi çizilir. Konsantrasyonlar x eksenine (apsis), konsantrasyonlara ait absorbans değerleri y eksenine (ordinat) işaretlenir. Her bir konsantrasyonun absorbans değerleri ile birleşme noktaları işaretlenir. İşaretlenen noktalar birleştirilerek kalibrasyon eğrisi elde edilmiş olur. Konsantrasyonlar ve absorbans değerleri koordinat düzlemine yerleştirilirken 0 noktasından başlanarak küçükten büyüğe doğru ve büyüklüklerine uygun aralıklarla yerleştirilmelidir. İki değer arasındaki aralık değerlerin büyüklüğü ile doğru orantılı olmalıdır. En küçük değer yerleştirildikten sonra takip eden değerler bununla orantılı olarak yerleştirilmelidir. Örnek: Konsantrasyonları ve bu konsantrasyonlara ait absorbans değerleri aşağıda verilen standart çözelti serisine ait kalibrasyon eğrisinin çizilmesi ile Şekil 2 deki grafik elde edilir. Konsantrasyonlar (mg/l) Absorbans Değerleri 0,0 0,0 0.5 0.2 1.0 0.4 1.5 0.6 2.0 0.8 3
Şekil 2. Kalibrasyon grafiği. UYGULAMA 1: Bitkilerde fotosentezde yer alan pigmentlerinin ekstraksiyonu ve klorofilin bazı özelliklerinin belirlenmesi Fotosentezde rol alan pigmentlerin en önemli görevi güneş ışınlarını absorbe etmektir. Bu pigmentlerin cinsi, organizmadan organizmaya değişebilir. Bunlar klorofiller, karatenoidler, ve fikobilinlerdir. Klorofiller yeşil renkli pigmentler olup fotosentezde esas rolü üstlenmişlerdir. Klorofil a, klorofil b, klorofil c ve klorofil d olmak üzere dört ayrı tipi vardır. Karotenoid pigmentleri renkleri sarıdan mora kadar değişen lipid yapısındaki bileşiklerdir. Fotosentezde rollerine ilave olarak, başka görevlerde yaparlar. Fikobilinler ise fikobilin adı verilen pigment maddesi ve proteinlerin oluşturdukları komplekslerdir. Fikoeritrin ve fikosiyanin gibi fikobilin çeşitleri fotosentez olayında ışık absorbe ederek klorofil moleküllerine yardımcı olurlar ve yüksek bitkilerde bulunmazlar. MATERYAL: Yeşil bitki yaprağı (ıspanak) Santrifüj Havan ve havan eli Spektrofotometre Pipet %80 lik aseton Santrifüj tüpü Eppendorf tüpü Tülbent YÖNTEM: a) Fotosentezde Rol Alan Pigmentlerin Ekstraksiyonu Bitkilerin yeşil yapraklarından (örn. Ispanak) 0,1 g tartarak, bir havanda 5 ml, %80 aseton içerisinde iyice ezilir. Elde edilen pigment ekstraktı 3000 rpm de 5 dakika santrifüj edilir. Süpernatant (üstte kalan kısım) kısmı bir tüpe aktarılır. Spektrofotometre küvetine %80 lik aseton konularak alet sıfırlanır. 4
Başka bir küvete aynı miktarda aseton ve 6 damla ekstrakt ilave edilerek karıştırılır. Küvet spektrofotometreye yerleştirilir; 380 nm dalga boyundan başlanarak 700 nm e kadar 20 birimlik aralıklarla değişik dalga boylarında absorbans değerleri kaydedilir. Grafiğin apsisine dalga boyları, ordinatına ise absorbans değerleri yazılır ve elde edilen noktalar birleştirilerek bir grafik çizilir ve maksimum absorbans gözlenen pik yerleri belirlenir (Şekil 3). Şekil 3. Klorofil a, b ve karotenoidlerin absorbsiyon apektrumu ile fotosentez hızı arasındaki ilişki Not: Aletin her defasında sıfırlanması gerekir. b) Klorofil ve Karotenoid Pigmentlerinin Kantitatif Tayini Elde edilen pigment ekstraktının 645 ve 663 nm lerdeki absorbans değerleri aşağıdaki formüllerde yerine konarak; kla, klb ve toplam klorofil miktarları mg/1000 ml cinsinden hesaplanır. Klorofil a = 12,7 x A 663 2,69 x A 645 Klorofil b = 22,9 x A 645 4,68 x A 663 Toplam Klorofil = 20,2 x A 645 + 8,02 x A 663 Aynı zamanda ekstraktın 450 nm deki absorbans değeri ölçülerek, ve yukarıda hesaplanan kla ve klb miktarları aşağıdaki formülde yerine konularak karotenoid miktarı mg/1000 ml cinsinden hesaplanır. Toplam karotenoid (mg/1000 ml) = 4,07 x A 450 (0,0435 x kla miktarı + 0,3367 x klb miktarı) Not: Kalan pigment ekstraktları bir tüpe konarak ağzı sıkıca kapatılır ve bir sonraki uygulamada kullanılmak üzere buzdolabında muhafaza edilir. 5
UYGULAMA 2: Fotosentezde Yer Alan Bitki Pigmentlerinin Kromotografi Yöntemiyle Ayrılması Burada kullanacağımız ince tabaka yönteminin esası, tabakalar üzerine yayılmış silikajel destek ortamında, yürütücü (etanol) kullanarak pigmentleri ayırmaktır. Pigmentler, etanolde çözünme durumlarına ve molekül büyüklüklerine göre birbirinden ayrılırlar. Etanolde iyi çözünen ve molekül boyutu küçük olanlar daha hızlı yürür. MATERYAL: 4 adet pasteur pipeti Cetvel 4 adet beher Alüminyum folye Silikajel veya Whatmann Kağıdı (No1,3) Pigment ekstresi 200 ml etanol YÖNTEM: Silikajelli yürütme plakları dikkatlice alınarak masanın üzerine konur. Alt kısmından 1,5 cm olacak şekilde işaretlenerek; daha önceki deneyde hazırlanan pigment ekstraktından pasteur pipetiyle 5-6 damla damlatılır. Damlatma işlemi esnasında bir önceki damlanın kuruması beklendikten sonra diğeri damlatılmalıdır (Şekil 4) Şekil 4. Destek ortamlar ve numune uygulaması Kromatografi tankına veya bir behere 1 cm yüksekliğinde etanol konarak ağzı sıkıca kapatılır (Şekil 5). Şekil 5. Pigmentlerin yürütülmesi 6
Ekstrakt damlatılan plaklar işaretli kısmı aşağıya gelecek şekilde tanka yerleştirilir. Etanol yukarıdan 2 cm yüksekliğe ulaştığında plaklar tanktan çıkarılır ve pigmentlerin yerleri (renklerine bakılarak) ile etanolün en son vardığı yer işaretlenir (Şekil 6). Şekil 6. Kromotogram Damlatma noktasından itibaren etanolün ve her pigmentin yürüdüğü mesafe cetvelle ölçülerek kaydedilir ve aşağıdaki formül kullanılarak her pigment için Rf değerleri hesaplanır ve tabloya yazılır (Tablo 1). Rf = Pigmentin aldığı yol / etanolün aldığı yol Bu şekilde çok sayıda ayrım yapıldıktan sonra pigmentlerin bulundukları yerlerdeki silikajel bir kap içerisine kazınarak, biraz etanol veya aseton ilave edildikten sonra santrifüjlenerek üstteki sıvı kısmı alarak her pigmenti ayrı olarak elde etmek ve ayrı ayrı absorbsiyon spektrumlarını tayin etmek mümkündür. Tablo 1: Kromatogram bulguları Pigmentin adı Rf Değeri 7