Proteomiğe Genel Bakış Genomun tüm protein komplementlerini (proteom) çalışan bilim dalı Proteomiks olarak adlandırılmaktadır. Proteomiks ve proteom terimleri Marc Wilkins ve arkadaşlarınca 1990 larda türetilmiştir. Bu kelimeler tüm bir organizmadaki tüm genlerin kolleksiyonlarını ifade eden genomiks ve genom kelimelerinin yansımalarıdır. Omiks omics terimi biyoloji ve yaşayan sistemler hakkında nasıl düşündüğümüzün yeniden tanımlanmasını sembolize eder (Şekil 1). Şekil1: Genomiks ve proteomiksin biyokimyasal konteksti Genom, bir organizmanın bütün DNA sı, bir başka deyişle, genetik yapısı olarak da ifade edilebilir. Değişik organizmaların büyüklükleri önemli farklılıklar gösterirler. Örneğin E.coli bakterisinde genom 4,5x106 baz çiftinden oluşmuşken, insanda 3,2x109 baz çiftine ulaşır. Bitki, hayvan gibi çok hücreli canlılarda hemen her hücre tam genomu içerir (insanda olgun alyuvarlar genom içermezler). İnsan genomu, 50-250 milyon baz çifti içeren 24 kromozom halinde düzenlenmiştir. Bu kromozomlara dağılmış olan genlerin sayısı, yaklaşık 35 bin kadardır. Genler, organizmadaki işlevsel moleküller olan proteinleri kodlarlar. Bütün genomun ancak y a k l a şı k %2 sini oluşturan genlerin içerdiği dizim hataları (mutasyonlar), organizmalarda yapı ya da işlev bozukluklarına, bir başka deyişle hastalıklara neden
olabilirler. 1945 te ABD Kongresi,Enerji Bakanlığının yeni enerji kaynakları ve teknolojileri geliştirmekle, bu yeni enerjilerin üretim ve kullanımının sağlık ve çevre açısından sakıncaları olup olmadığının derinlemesine araştırılmasıyla görevlendirdi. 1986 da Enerji Bakanlğı, belirtilen görevinin çerçevesinde insan genomu dizisinin belirlenerek bir referans oluşturması için insan Genomu girişimini başlattı ve Ulusal Sağlık Enstitülerinin de işbirliğiyle 1990 da İnsan Genom Projesi" başlatıldı. İnsan Genomu Projesinin temel amacı, tüm insan genomunun dizisini ve bütün genlerini belirleyerek bir kaynak oluşturmaktı. Bunun yanı s ra diğer organizmalarn da genom dizilerini belirleyerek insanınkiyle karşılaştırmak, bunun gerçekleştirilmesi için yeni teknikler geliştirmek ve elde edilecek bilgileri tarım,sağlık, çevre, enerji gibi alanlarda değerlendirmektir. Genomiks ve açılımı genom projesi görevini gerçekleştirirken bu fikirden doğan proteomiks kavramı hızla gelişmeye başladı. 1990 ları ortalarına kadar, biyokimyacılar, moleküler biyologlar ve hücre biyologları belirli genler, proteinler ya da spesifik biyokimyasal yollorla ilişkili unsurların küçük gruplarını çalışıyordu. Northern blot (gen ekspresyonu için) ve Westhern blot (protein düzeyleri için) yerlerine kullanılanılabilecek yeni teknikler az miktardaki gen ya da proteinin zor analitik işlerinden daha fazlasını yapabilmeyi sağlayacaktı. Üç gelişim biyolojik peyzajı tamamiyle değiştirdi ve yeni biyolojinin temelini oluşturdu. Bunlardan ilki 1990lar boyunca genlerin (EST, ve protein sekans databazları) gelişimi üzerineydi. Bu çalışmalar bir takım organizmaların eksprese ( ifade ) genlerinin kismi katologlanmasından daima daha fafdalı hale dönüştü. 1990 ların sonlarındaki genom sekanslama projeleri bakteri, maya, nematod, drosophila ve yakınlarda sonlanan insan genomuyla ürnlerini verdi. Bitki genomları veya hayvanlar üzerindeki genom çalışmalarının bir kısmıda tamamlandı. Bu genom databazları düzgün bir şekilde katologlanarak yaşayan sistemler üzerinde bilgilerimizin çok daha fazlasını anlayabilmek için kullanılacaktır. İkinci kilit gelişme; bu veri tabanlarından çıkarılacak bilgi için kullanımı kolay olan, depolama temelli yöntemler üzerinde olmuştur. Bu web temelli ücretsiz yöntemler biyologlara probe yapımı, genlerin fonksiyonu, gen ürünleri gibi pekçok veriye ulaşmasını sağlamaktadır.
Üçüncü kilit gelişme ise oligonükleotid mikroarraylerdir. Bu yöntem bir cip üzerindeki gen spesifik oligonükleotid veya cdna sekanslarınının bir serisini içerir. Array e çalışılmak istenilen örneğin floresan işaretli DNA sının karışımı eklenir ve bir seferde binlerce genin ekspresyonu incelenebilir. Bir array binlerce Northern-blot analizinin yerine geçebilir ve bir Northern in alacağı zaman kadar bir sürede tamamlanacaktır. Bunun ötesinde iki renkli floresans prob işaretlenerek iki farklı örneğin genlerinin ekspresyonu bir slide veya cip üzerinden direk olarak karşılaştırılabilir. Şekil2: Cip üzerinde mayanın genomu vardır. Bu maya cdna microarray i Stanford Üniversitesinde Dr. Patrict Brown nın labratuvarında üretilmiştir. (http://cmgm.stanford.edu.pbbrown/) Sacchromyces cerevisiea genomunun 6000 geninin herbiri için özgün sekansları içeren bir array slid şekil 2 de gösterilmektedir. Bu tek bir arrayden maya genomundaki tüm genlerin ekspresyonları değerlendirilebilir. Böyle resimler yeni biyolojinin meydan okumasıyla bizi yüzyüze getirir. Tüm sistemi görebiliriz ancak dataların gösterdiği bu binlerce birleştirilmiş bilginin sezgilerle yorumlanması bizim kabiliyetlerimizin dışındadır. Yeni sınıfladırma algoritmaları, serbest organizasyon haritaları ve benzer araçlar biyologların başarıya ulaşabilmeleri için datalara en son yaklaşımları sunmalarını sağlayan araçlardır.
Array yönteminin en önemli özelliği büyük düşünebilme kavramına sahip olmasıdır. Bir hücre farklı durumlarda binlerce hatta onbinlerce geni ekspresse edebilmektedir. Hücrenin yaşam ve ölümü bu genlerin ekspresyonu ve protein ürünlerinin aktivitelerince belirlenmektedir. Herbir protein transmembran reseptör, transkripsiyon faktörü bir protein kinaz ya da şaperon aynı hücrede ekspresse olanlarda dahil bütün diğer fonksiyonların ve aktivitelerin dışında önemli olan bir fonksiyonu gösterebilir. Şimdi biyologlar yalnızca kompenentlerin ve komleksliğin duyarlılığından ziyade sistemi anlamaya çalışarak büyük düşünmeye çabalıyorlar. Protein Kimyası ve Proteomiks Arasındaki Farklar: Yeni bir fikre terime ve yaklaşıma yaygın olarak verilen cevap şüpheyle yaklaşmaktır. Bu nedenle proteomiks ve protein biyokimyası arasındaki farkların iyi bir şekilde açıklanması önemlidir. Hem proteomiks hemde protein kimyası protein tanımlanmasını kapsamaktadır. Peki farklılık nerededir? Tablo 1 Protein Kimyası ve Proteomiks Arasındaki Farklılıklar Protein Kimyası Proteomiks Yalnızca Proteinler Tüm sekans analizi Yapı ve fonksiyon üzerinde önem Yapısal biyoloji Kompleks karışımlar Kısmi sekans analizi Databaz eşleştirmeleri üzerinde önem Sistemlerin biyolojisi Tablo 1 de, dikkate alınan kilit özellikler kısaca özetlenmektedir. Protein kimyası, protein yapısı ve fonksiyonunun çalışmalarını kapsar ve yaygın olarak fiziksel biyokimya ya da mekhanistik enzimolojinin alanıdır. Çalışma genelde yapının fonksiyonu nasıl yönettiğini araştırmak için komple sekans analizi,yapısal belirleme ve modelleme çalışmalarını gerektirir. Fiziksel biyokimyacılar ve enzimolojistler tipik olarak bir protein ya da bir zamanda çok altüniteli protein kompleksini çalışırlar.
Proteomiks çoklu protein sistemlerini inceler. Çoklu sistemlerin karşılıklı etkileşimlerini, geniş sistem veya networklerin bir parçası olarak bunların rollerindeki farklı proteinleri inceler. Analiz direk olarak kompleks karışımdır fakat komple sekans analizi değildir. Bunun yerine databazın eşleştirme araçlarının yardımıyla kısmi sekans analizleriyle analizler yapılır. Proteomiks kavramı yapısal biyoloji yerine sistemlerin biyolojisidir. Diğer bir deyişle proteomiksin gösterdiği herhangi tek bir komponentin davranışı yerine sistemin davranışını karakterize etmektir. Gen Ekspresyon Düzeyini Ölçebilirken Neden Proteomiksle Uğraşarak Kendimize Acı Çektiriyoruz? Gen microarrayleri bir hücredeki genlerin bir kısmı ya da hepsinin ekspresyonunu hızlı bir şekilde eldesini sağlamaktadır. Şübhesizki mrnanın düzeyi bir hücrede yerine geçen proteinin düzeyini tahminde yeterli değildir. mrna stabilitesindeki farklılıklar ve translasyon etkinliğindeki farklılıklar yeni proteinlerin üretimini etkilemektedir. Bir yapılanmada proteinler stabilite ve turn over oranlarında önemli ölçüde farklılık gösterir. Sinyal transdüksiyonu, transkripsiyonal faktör düzenlemesi ve hücre döngüsünde gerekli birtakım proteinlerin aktivitelerini düzenleme manasında çevrimleri hızlıdır. mrna düzeyleri; aktiviteleri ve fonsiyonları birtakım iç posttranslasyonel modifikasyonlara ve çevresel ajanlar tarafından diğer modifikasyonlara belirlenen yerlerine geçen proteinlerin düzenleyici durumu hakkında hiçbirşey söylemez. Proteomiks : Analitik bir Meydan Okuma Bir organizmadaki genlerin bir kısmının ya da tümünün ekspresyonlarının nasıl ölçüleceği problemi cdna veya oligonükleotid mikroarray tekniklerinin kullanımı ile çözülmüştür. Gen ekspresyonunun mikroarrayler ve bağıntılı metodlarla analizleri PCR ve komplementer sekansların oligonükleotidlerle hibridizasyonu tekniklerine bağlıdır. Şübhesizki protein analizleri için buna anolog bir araç yoktur. İlk olarak PCR ın protein için bir eş anlamlısı yoktur. Yani PCR ile polipeptid moleküllerinin kendilerini çoğaltmaları diye bir şey söz konusu değildir. İkinci olarak komplementer aminoasid sekanslarının spesifik olarak hibridizasyonu yoktur. Nükleotid sekanslarının bu komplementer hibridizasyon karekterleri microarray teknolojisinin
kullanımını olasıkılmaktadır. Antibady ve oligonükleotid aptamerleri (Şekil 3) spesifik peptid veya proteinleri tanıyabilsede tanıma oligonükleotidlerde olduğu gibi sekans temelinde basitce bir tanıma değildir. Şekil 3: a) Fonksiyonel protein mikroaray b) Fonksiyonel protein mikroaray Proteomikte karşılaşılan diğer bir problemde her bir protein gen ürününün hücre içinde yalnızca bir molekül girişiyle kaçınılmaz olarak yükselme vermemesidir. Çünkü proteinler posttranslasyonel modifiyedirler. Geniş ve değişik modifikasyon çeşitleri belirli proteinler için, hücredeki düzenleyici mekanizmalar için ve çevresel faktörlere göre farklılık gösterir. Sonuç olarak bazı proteinler çoklu formda bulunur. Özel bir genin çoklu protein ürünleri arasındaki farklılıklarının belirlenmesinin gereksinimi proteomikin analitik meydan okumasına bir ilavedir.
Proteom analizleri gen ekspresyon analizlerine göre daha fazla farklı grupta yöntem gerektirir. Proteomun karakterizasyon işi modifiye ve modifiye olmamış formların tesbiti ve miktarının tayini için analitik metodlara gereksinim duyar. Proteomiks Araçları : Analitik proteomiksin daha önce tanımlanmış dezavantajlarına karşın proteom ve onun kompenetlerinin karakterizasyonu işi pratikte yapılabilinmektedir. Bu; dört temel yöntemin araştırmacılar tarafından geliştirilmesi ile başarılmıştır. İlk yöntem organizmanın eksprese olan proteinlerinin tümünün tam kataloğunu sağlayan protein, EST ve komple genom databazlarıdır. Drosophilanın tüm kodlayıcı sekansları temel alındığında ; EGF benzeri domainli proteinleri kodlayan 110 geni biliyoruz. Buna göre Drosophila da proteomiks yaparken geniş fakat olası proteinleri bildiğimiz bir indeksi tarıyor olacağız. İkinci yöntem kütle spektrofotometrisidir (mass spectrometry:ms). Son yıllarda MS ölçümleri köklü değişiklikler geçirdi. Yüksek duyarlılıkta ve robotlaşmaşmada son noktaya ulaşmış bu yöntem; özellikle protein ve peptidlerin analizinde oldukça güvenilir bir yöntemdir. Bu yöntem 100kDa veya daha üstü intak proteinlerin moleküler kütle ölçümlerini doğru olarak sağlayabilmektedir. Böylece protein kütlelerini belirlemek için SDS page de yürütmek yerine tercih edilmektedir. Yüksek doğrulukta protein kütle ölçümlerinin genellikle faydaları limitlidir. Çünkü bunlar sıklıkla yeterince duyarlı değildir ve net kütle sıklıkla protein tanımlanmasında istenmeyen eksikliktedir. MS aynı zamanda proteolitik olarak parçalanmış polipeptidlerin ölçümünde de kullanılır. Tüm protein kütle ölçümünün aksine peptid kütle ölçümleri daha duyarlı ve kütle daha doğrudur. MS analizi kullanılarak proteolitik kesime uğratılmış peptidlerin kesin sekans analizleri elde edilebilmektedir.
Şekil 4: Proteomikste kullanılan yöntemler ve fonksiyonal genomiksle etkileşimleri Üçüncü yöntem databazdaki spesifik protein sekansları ile MS datalarını eşleştirebilen yazılımları ortaya çıkarmaktır. Daha önce belirtildiği gibi MS datalarından bir peptidin sekansının belirlenebilmesi mümkündür. Bununla birlikte bu de nova sekans yorumu kısman zahmetli bir iştir. Bu software töntemi yorumlanmış datayı alır ve protein sekansları, EST ve özelleşmiş algritmaları ekleyerek genom sekan databazı ile eşleştirir. Bu yöntemin en büyük kullanışlığı çok fazla MS datasını protein sekansları ile eşleştirirken otomasyonu getirmesidir. Proteomik için dördüncü yöntem analitik protein ayrım teknolojisidir. Protein ayrımı proteomikste iki amaca hizmet eder. İlki kompleks protein karışımlarımlarını belli proteinlere ya da proteinlerin küçük gruplarına çözerek onları basitleştirir. İkincisi bu aynı zamanda iki örnek arasında karşılaştırma yaparak protein düzeylerindeki açık farklılığıda gösterir. Protein analitik ayrımı araştırıcıya analizi için spesifik proteinleri hedeflemesini sağlar. 2D SDS page proteomiksle ilişkilendirilmiş en yaygın yöntemdir. İki boyutlu jel kompleks örneklerin proteinlerinin çözümü için muhtemelen en iyi yötem olarak taktim edilebilir. Bununla birlikte diğer protein ayırma teknikleri 1D- SDS- PAGE, HPLC, kapiler elektroforez, izoelektrik fokuslama ve affinite kromotografisi analitik proteomiks için kullanışlı yöntemlerdir.
Bu dört yöntemin birbirleri ile etkileşimleri proteomiksin günümüzdeki teknoşojisini meydana getirmiştir. Şekil 5 : Maya data setlerinin geniş ölçekte etkileşimleri biraraya getirilerek canlandırma yapılmıştır. GRID databazından sağlanan 14.000 fiziksel etkileşim Osprey network gösterim sistemiyle (bak http://biodata.mshri.on.ca/grid) gösterildi. Grafikteki herbir kenar Gen ontoloji (GO) fonksiyonel kurallarına göre renklendirilmiş nodlar arasındaki ilişkiyi simgelemektedir. Data setleri içindeki komplekslerin fazlalığı, merkezi kütlenin çevresinde görünen, diğer kompleks üyeler içerisinde en az üçünü paylaşan nodlardan kaynaklıdır. Tüm grafik 4.543 nodu bu da maya genomundan kodlanan yaklaşık 6000 proteini göstermektedir. 20 yüksek etkileşimli kompleks 340 geni, 1,835 bağlantı ve 5.39 ortalama bağlanabilirliği içermektedir.
Proteomiksin Uygulama Alanları Proteomiks teknolojisi gerçekten etkileyicidir. Günümüzde pratikte dört temel uygulamayı kapsamaktadır. Bunlar 1) mining (örnekteki proteinlerin tümü) 2) protein ekspresyon profili, 3) protein network haritalaması ve 4) protein modifikasyon haritalamasıdır. 1) Mining bir örnekteki proteinlerinin tümünün (olabildiğince) tanımlanabilmesi çabasıdır. Miningte işaret edilen ; genlerin ekspresyon datalarından (mikroaraylar gibi) çıkarılan proteom dataları yerine direk olarak proteomu katologlamaktır. Mining proteomiksteki kaba kuvvet çalışmalarının en sonudur. Basitce çözümlenmiş proteinler için geniş boyutta olasılıklar vardır. MS kullanımı ve ilişkili databazlar ve softwarelerle ne bulunduğu tanımlanabilir. Mining için çeşitli yaklaşımlar ve herbirinin avantajları mevcuttur. 2) Protein ekspresyon profilinde; organizmanın ya da hücrenin belirli bir durumdaki (diferensiyasyon, gelişme durumu veya hastalık durumu gibi) ya da bir ilaç, kimyasal veya fiziksel stimüle edici ile karşılaşmadaki fonksiyonu gibi belirli örneklerdeki proteinlerin tanımlanmasıdır. Şekil6 : Kütle spektrofotometre görüntüleri; rat beyninin enine kesitleri üzerinde ortalama protein profilini çıkarmak için kullanılmıştır 15 lazer çekimi ve atomatik imajlama computer
algoritmaları kullanılarak tarama işlemi tamamlanmıştır. Beklendiği gibi bazı proteinlerin çalışılan beyin bölgesine oldukça spesifik olduğu bulundu. Ekspresyon profili aslında miningin özelleşmiş formudur. Yaygın olarak belirli bir sistemin iki durumunun karşılaştırılmasında farklı analizler olarak uygulanabilir. Örneğin normal ve hastalıklı hücre veya dokular bir durum diğeriyle karşılaştırılarak proteinlerin farklı ekspresyonları belirlenebilir. Bu bilgiler hastalıklarda ilaç terapilerinin potansiyellerinin tespiti anlamında müthiş bir çekiciliğe sahiptir. Protein network, haritaları yaşayan sistemelerde hangi proteinlerin birbirleriyle etkileşimde olduklarını belirleyen proteomiks yaklaşımlarıdır. Bir çok protein fonksiyonlarını diğer proteinler ile etkileşimleriyle ortaya çıkarırlar. Bu etkileşimler, sinyal transdüksiyon yolu ve kompleks biyosentetik veya degredasyon yolları gibi proteinlerin fonksiyonal networklerinin fonksiyonlarını belirleyen etkileşimlerdir. Birçoğu bireylerle, pürifiye proteinlerle ve yeast two hyprid sistemleri ile yapılan in vitro çalışmalarla elde edilen protein protein etkileşimlerinden öğrenilmiştir. Bununla birlikte proteomiks yaklaşımları analitik proteomiks metodlarıyla birleşmiş afinite capture teknolojisinin yaratıcı çiftlerinin sayesinde daha kompleks networklerin kurulmasının fırsatlarını sunmuştur. Proteomiks yaklaşımları çoklu protein komplekslerinin kompenentlerinin tanımlanmasında kullanılmaktadır. Çoklu kompleksler hücrede noktadan noktaya sinyal transdüksiyon yolunda devreye girmektedir. Protein network profili bu yoldaki katılımcıların tümünün bir durumlarını hesap edebilmeyi sağlar. Bunun gibi, protein network profillemesi proteomiksin gelecekteki uygulamalarında potansiyel olarak bir güç sunmaktadır. Protein modifikasyonlarının haritalanması, proteinlerin nasıl ve nerde modifiye olduklarının belirlenmesi işidir. Birçok yaygın posttranslasyonel modifikasyon proteinlerin hedefleme, yapı, fonksiyon ve turoverını yönetir. Buna ilaveten birçok çevresel kimyasal, ilaçlar endojen kimyasallar reaktif elektrofillere yol açarak proteinleri modifiye ederler. Analitik yöntemlerin çeşitliliği modifiye proteinler ve modifikasyonların doğasının tanımlanmasını geliştirdi. Modifiye proteinler antibadiler ile (spesifik fosforlanmış aminoasid reziduoları için) tespit edilebilir fakat spesifik modifikasyonun kesin sekans bölgesi sıklıkla bilinemez. Proteomiks yaklaşımları posttranslasyonel modifikasyonların hem dağal hemde sekans spesifitelerini sağlama anlamında en iyiyi sunar. Bir networkdeki regule olmuş proteinlerin modifikasyon
durumlarının simultene olarak karakterize edilmeleri için bu yaklaşımdaki genişleme yine proteomiks teknolojisindeki kuvvetli bir gelişme ile sunulur. Bu yaklaşımlar proteomun kimyasal modifikasyonlarının yaşayan sistemleri nası etkilediği sorusuna yaklaşımda yeni yollar sunacaktır.