GENOMİKS & PROTEOMİKS

Transkript

1 GENOMİKS & PROTEOMİKS VĠZE SONRASI EK NOTLAR Yrd. Doç. Dr. NaĢit ĠĞCĠ GEN İFADE ANALİZLERİ 1

2 Gen Ġfade Analizleri mrna seviyesinde gen ifade analizleri: Northern blot (Tek gen analizi) qrt-pcr (Tek gen analizi) SAGE (Serial analysis of gene expression) (Birçok gen) Microarray (Mikrodizi) (Birçok genin aynı anda analizi, genom ebadında ifade analizi, transkriptom analizi) Northern Blot 1977 de geliģtirilen northern blot tekniği, 1975 te Edwin Southern tarafından geliģtirilen southern blot tekniğine çok benzemektedir. Southern Blotta DNA tespit edilirken, northern blotta ise RNA tespit edilmektedir. 2

3 3

4 DNA Mikrodizi (Microarray) Tek bir deney ile binlerce genin ifade profilinin aynı anda incelenmesi Mikrodizi sistemleri üç gruba ayrılabilir: cam üzerine sentezlenen cdna mikrodizileri, membran üzerine (ör: naylon membran) sentezlenen cdna mikrodizileri ve oligonükleotit mikrodizileri (DNA çipleri) Mikrodizi ile sadece mrna (ifade) analizi değil, DNA (mutasyon, dizi) analizi yapılabilir. Tipik bir DNA mikrodizi çalıģmasında yüzey üzerine sabitlenmiģ DNA dizileri, örnekten izole edilen mrna ile hibridize edilir. DNA Mikrodizi (Microarray) Bir mikrodizi çalışmasının temel aşamaları: 1. Prob: Oligonükleotit, cdna 2. Çip üretimi: Probların çipe (cam, naylon membran, silikon, kuvarz yüzeyler) yerleģtirilmesi. Fotolitografi, pipet, dokundurma, püskürtme 3. Hedef: Floresan iģaretli örnek, RNA (mrna), cdna 4. Deney: Hibridizayson, yıkama, tarama 5. Sonuç: Floresan ıģıma 6. Analiz: Görüntü iģleme, Ġstatistik, Biyoinformatik analiz 4

5 cdna Mikrodizi Sistemleri cdna array: bç probların cam yüzeylere basılması Ġlk mikrodizi çalıģmaları cdna ların uygun yüzeylere basılmasıyla gerçekleģtirilmiģtir. Her biri tek bir geni temsil eden özgün ve farklı DNA hibridizasyon hedeflerini içeren yüksek yoğunlukta noktalama iģlemi bir mikrodizi halinde cam (veya naylon) yüzeye basılır. Ġki farklı deney grubunun mrna ları farklı floresan boyalarla boyanarak ters yazılımları gerçekleģtirilir. Daha sonra bu örnekler birleģtirilerek hedef cdna lar ile hibridize edilir ve floresan ıģımalar kaydedilir. > Analiz Bir cdna mikrodizi çalıģmasının temel basamakları 5

6 Oligonükleotit Mikrodizi Sistemleri Oligo array: bç uzunluğundaki oligonükleotitlerin önce sentezlenip sonra çip yüzeyine sabitlenmesi veya doğrudan çip üzerinde sentezlenmesi (fotolitografi) ile üretilir. 6

7 7

8 Mikrodizi (Microarray) Hücre metabolizmasına bütüncül bakıģ Tıbbi teģhis Mutasyon analizi (ör: SNP array) 8

9 Yaşam, proteinler ve protein etkileşimleri üzerine kuruludur Bütünü görmeye çalıģmak 9

10 Proteomiks Ekspresyon proteomiks: Farklı koģullarda veya dokularda protein ifadeleri karģılaģtırılır. Proteom madenciliği: Ġlaç hedefi tanımlama, ilaç keģfi Fonksiyonel proteomiks: Proteinlerin iģlevleri Yapısal proteomiks: Proteinlerin ve diğer protein veya farklı moleküllerle oluģturdukları komplekslerin 3 boyutlu yapılarının açığa çıkarılması Post-translasyonel modifikasyonlar Protein-protein etkileşimleri Proteomiks Translasyon sonrası modifikasyonlar proteinlerin nihai fizyolojik aktivitelerini etkiler. Bu nedenle bir proteinin aktivitesinin fonksiyonel olarak belirlenebilmesi için amino asit dizisinin yanında modifikasyonlarının da belirlenmesi çok önemlidir. Proteomik tekniklerin geliģmesi ve özellikle kütle spektrometrelerinin kullanımı ile proteinlere özgü translasyon sonrası modifikasyonlar da tanımlanabilmektedir ve proteomiks alanında önemli bilgiler sağlamaktadır. 10

11 Proteomiks Proteomik yöntemlerin kullanım alanının büyük kısmını "klinik proteomiks" olarak da adlandırılan tıpta kullanım oluģturmaktadır ve klinik proteomiks alanındaki çalıģmaların da çoğu hastalıklara özgü yeni biyo-belirteç tanımlanmasıyla ilgilidir. Bunun haricinde prognoz takibinden öngörülebilir (prediktif) seçilime, ilaç geliģtirmeden toksikolojiye kadar birçok farklı alanda da proteomik yöntemler kullanılmaktadır. Ayrıca günümüzde özellikle epilepsi gibi nörodejeneratif hastalıkların bir kısmında, obezite gibi kompleks metabolik hastalıklarda ve kanserde tedavi yöntemlerinin seçiminde bireysel farklılıkların kullanılması bir gereklilik olarak görülmektedir. Proteomiks, kiģiye özgü tedavi yaklaģımlarının geliģtirilmesinde ön plana çıkan temel moleküler stratejiler içerisinde de yer almaktadır. Standart Bir Etiketsiz Proteomiks Çalışmasının Genel Basamakları Protein eldesi Protein miktar tayini Proteinlerin ayrıģtırılması KarĢılaĢtırmalı ifade analizleri Kütle spektrometresi analizleri Biyoinformatik analiz Yapı ve etki analizleri Dokudan Vücut sıvılarından vs. Bradford Lowry, BCA gibi spektrofotometrik ölçümler ile Elektroforetik (ör: SDS-PAGE, 2D-PAGE) Kromatografik Jel analizleri Kromatogram analizleri Örnek hazırlama (ör: tripsinizasyon) MS, MS/MS, de novo dizileme Peptit kütle parmak izi (PMF), peptit fragment fingerprint (PFF) De novo dizi belirleme X-Ray, NMR Etkinlik analizleri 11

12 Protein Eldesi ve Örnek Hazırlama Tüm çalıģmalar için öncelikle proteinlerin izole edilmesi gerekiyor. Basit gibi görünmesine rağmen en önemli basamak Proteinler uygun Ģekilde elde edilmeli Örnek tipine göre uygun yöntemler belirlenmeli ve optimizasyon yapılmalı Örnekler tuzluysa uygun yöntemlerle tuz giderilmeli Örnekte çok bol proteinlerin uzaklaģtırılması gerekebilir (ör: serumda albümin, bitki örneklerinde RubisCo) ĠYĠ ÖRNEK HAZIRLAMA > RAHAT ÇALIġMA Protein Eldesi ve Örnek Hazırlama Protein eldesi, hücrenin hangi bölgesindeki proteinlerin izole edilmesi isteniyorsa ona göre yöntemsel farklılık gösterir. Ayrıca doku/hücreden veya vücut sıvısından protein izole etmek için de yine farklı yöntemler vardır. Örneğin proteinler sitozolik, membrana bağlı ya da organellerde bulunabilir. Organlarda ve dokularda hücre içerisinde bulunan proteinlerin elde edilmesi için hücre membranının parçalanması ve proteinlerin hücre dıģına çıkarılması gerekir. Burada kullanılan çözelti genellikle proteinlerin fizyolojik koģullarda kalabileceği bir tampon içerisine eklenmiģ ajanlardan oluģur. Bunlar genellikle hücre zarını parçalayan ajanlar (ör: deterjanlar), protein çözünürlüğünü arttıran maddeler ve proteaz inhibitörleridir. 12

13 Protein Eldesi ve Örnek Hazırlama Genellikle bir ön iģlem olarak mekanik parçalama gerçekleģtirilir. Sonikatör, blender, bisturi, sıvı azot Daha sonra lizis tampon ile muamele edilen hücreler yüksek hızda santrifüj edilir proteinler üst sıvı fazda elde edilir. Membran ve diğer hücre kalıntıları da dibe çöker. Bu üst sıvı cell free lysate olarak da adlandırılır. Örnek olarak verilebilecek bir lizis tamponda değiģen oranlarda NaCl, EDTA, Tris-HCl, NP40, proteaz inhibitörü bulunabilir. 13

14 Protein Eldesi ve Örnek Hazırlama Eğer idrar, serebrospinal sıvı gibi vücut sıvılarından protein eldesi yapılacaksa çöktürme iģlemi uygulanabilir. Bu amaçla çeģitli tuzlar veya TCA gibi asitler kullanılabilir. Protein izolasyonu ve sonrasında proteinlerle çalıģırken buz üzerinde çalıģmak önemlidir. Yapılan santrifüj iģlemlerinde mümkünse soğutmalı santrifüjde 3-5 C de yapılması iyi olur. Protein Miktar Tayini Uygun bir yöntemle protein konsantrasyonu belirlenir KarĢılaĢtırma çalıģmalarında miktar standardizasyonu için kesinlikle protein konsantrasyonu belirlenmelidir. 14

15 Protein Miktar Tayini Kolorimetrik yöntemler yaygın olarak kullanılır. Burada bir kromoforun renk değiģimleri spektrofotometrik olarak ölçülür. Standart kullanılması gerekir. ÇeĢitli yöntemler vardır. Ör: Bradford, BCA Protein Miktar Tayini Bradford yönteminde Coomassie Brilliant Blue G-250 maddesi kullanılır. Bu boya bazı amino asitlere bağlanır. Örnek-boya oranı genellikle 49:1 olarak ayarlanır. Bu yöntemde katyonik CBB kullanılır ve proteine bağlanmadığında kırmızımsı-kahverengidir ve 470 nm de maksimum soğurma verir. Proteine bağlandığında rengi maviye dönüģür ve maksimum soğurma 595 nm ye kayar. OluĢan rengin miktarı ile protein miktarı arasında doğru bir orantı vardır. 15

16 Protein Miktar Tayini Proteinlerin AyrıĢtırılması Farklı yaklaģımlar ve yöntemler mevcut. Ancak hepsindeki temel amaç proteinleri olabildiğince en az basamak ve en yüksek çözünürlükle birbirinden ayırmaktır. Farklı yöntemlerin birlikte kullanılmasıyla çözünürlük arttırılabilir, ancak zamanın da önemli bir faktör olduğu unutulmamalıdır. Proteomik çalışmalarda elektroforetik (SDS-PAGE ve 2D-PAGE) ve kromatografik ayrım tekniklerinden faydalanılır. 16

17 Poliakrilamit Jel Elektroforezi (PAGE) Poliakrilamit Jel Elektroforezi (PAGE) % T : Total akrilamit yüzdesi > Por çapı Genellikle iki fazlı jel hazırlanır: Yığma (stacking) jel (%T: %4-5) Ayırma (separating) jel (%T: %10-15) PAGE yönteminde iki tip jel kullanılabilir: Denatüre edici Denatüre edici olmayan (doğal, native) 17

18 Poliakrilamit Jel Elektroforezi (PAGE) Genellikle birçok uygulamada denatüre edici jel kullanılır. Denatüre edici jelde sodyum dodesil sülfat (SDS) deterjanı kullanılır. Denatüre edici jelde proteinler sadece büyüklüklerine göre ayrılmıģ olur. SDS hem proteinleri denatüre eder, hem de onlara negatif yük kazandırır. Poliakrilamit Jel Elektroforezi (PAGE) Protein örnekleri jele bir tampon içerisinde yüklenir. Bu tamponun içinde de yine SDS yer alır. Bunun yanında, proteinlerde sisteinler arasındaki disülfit bağlarını kıran bir indirgeyici ajan da bu tampon içinde bulunur. Bu amaçla yaygın olarak kullanılan kimyasallar DTT (dithiothreitol) ve beta-merkaptoetanoldür. 18

19 Poliakrilamit Jel Elektroforezi (PAGE) 19

20 Poliakrilamit Jel Elektroforezi (PAGE) Jel boyama Jelde ayrılan proteinlerin görüntülenebilmesi için boyanmaları gerekir. Gözle görülebilen boyalar: Coomassie, gümüģ boyama UV altında görülebilen floresan boyalar 20

21 Western Blot DNA neyin mümkün olabileceğini, RNA neyin olası olduğunu, Proteinler ise gerçekte ne olduğunu ifade eder. 21