Bazı Biyoaktif Bileşiklerin Kanser Hücrelerinde Farklı Ölüm Mekanizmalarını İndükleyici Etkilerinde Hücre İçi Kalsiyumun Rolü Yrd. Doç. Dr. Seval KORKMAZ FARGEM (Farmasötik( Araştırma Geliştirme Merkezi) A.Ş. Düzce Giriş Hücresel Ölüm Mekanizmaları Hücre içi kalsiyumun hücre ölümünde rolü Çalışmalarda Kullanılan test maddeleri Çalışmalarda kullanılan hücreler Plan Çalışmaların amacı Materyal Metod Sonuçlar Tartışma Yapılması planlanan çalışmalar 1

Giriş Hücre ölümü, kanser tedavisinde hedef mekanizmayı oluşturmaktadır. Özellikle hücreleri çeşitli antineoplastik ilaçlar kullanarak programlanmış bir şekilde ölüme götürmek, tedavinin kemoterapötik tedavinin temel prensibini oluşturmaktadır. Programlanmış hücre ölümü denildiğinde özellikle apoptoz anlaşılmaktadır. Apoptoz, embriyonik gelişim, kanser, doku homeostazı, yaşlanma ve Alzheimer, Parkinson gibi nörolojik hastalıklarda temel mekanizmayı oluşturur. Antikarsinojenik kemoterapide; genellikle hücre siklusunun belli basamakları üzerine etkili olan ilaçlar ya da apoptotik etki gösteren sitotoksik ilaçlar kullanılır. Hücresel Ölüm Mekanizmaları Doğal Hücre Ölümü Nekroz Programlanmış Hücre Ölümü Apoptotik Hücre Ölümü Apoptoz Apoptotik Olmayan Hücre Ölümleri Otofaji Mitotik Hücre Ölümü Kaspazlardan Bağımsız Hücre Ölümü 2

Apoptoz Nekroz 3

Mitotik Hücre Ölümü Mitotik (yıkım) hücre ölümünde hücrelerde prometafazik görüntüler oluşur ve G2 kontrol noktasında durma gerçekleşir. Kaspazlardan Bağımsız Hücre Ölümü 4

Hücre Ölümü Biçimlerinin Özellikleri 5

Hücre içi kalsiyum Hücre içi kalsiyum- Araşidonik Asit Metabolizması Eikozanoidler,, hücrenin yaşaması ve ölmesi kararlarında önemli rol oynarlar. Araşidonik asit metabolizmasında eikozanoidlerin sentezinde kullanılan başlıca iki yolak fosfolipaz A2 (PLA2) ve fosfolipaz C (PLC) yolaklarıdır ve her iki yolağın düzenlenmesinde Ca 2+ stimülatör olarak görev yapar. 6

Çalışmalarda Kullanılan Test Maddeleri: Aspirin Aspirin COX-1 1 ve COX-2 2 enzimlerinin non- selektif inhibitörü olan bir NSAID dur. COX enzimlerini asetilleyerek irreversible inhibe eder. Analjezik, antiinflamatuar, antipiretik ve antiagregan etkinlik gösterir. Düşük doz aspirin kolorektal ve akciğer kanserlerinde protektif bulunmuştur. Çalışmalarda Kullanılan Test Maddeleri: Kersetin COX-1 1 spesifik inhibitörü olan ve çiğ yenebilir hemen hemen bütün meyve ve sebzelerde bulunan bir biflavonoiddir. Antiöstrojenik çalışan bir fitoöstrojen olduğundan, östrojen reseptörü pozitif meme ve rahim kanserleri ile postmenapozal semptomların tedavisinde OTC ilaç olarak kullanılmaktadır. Kersetinin oksidatif streste fosfolipaz A2 (PLA2) ve lipoksijenaz yolaklarını inhibe ettiği gösterilmiştir. 7

Çalışmalarda Kullanılan Test Maddeleri: Epigallokateşin gallat (EGCG) Yeşil çayda en bol bulunan polifenoliktir. COX-2 nin spesifik inhibitörüdür. Fosfolipaz-C C (PLC) aktivasyonu ve inozitol trifosfat yolağı ile depolardan sitoplazmaya kalsiyum akışını arttırır. Çalışmalarda Kullanılan Test Maddeleri: Kalsiyum Fosfat Calcarea phosphorica, Ca 3 (PO4) 2, CP Homeopatik tedavilerde kullanılmaktadır. Ca +2 un hücre içinde çalışması için fosfat iyonunun önemlidir. Yüksek konsantrasyonlarda Ca2+ un apoptosis ve nekroz ile ölümde direkt olarak ölüm sinyallerini başlattığı düşünülmemekle beraber, direkt olarak proteazlar, fosfolipazlar ve nükleazlar gibi katabolik enzimleri aktive ederek hücre ölümüne ve doku hasarına sebep olduğu gösterilmiştir 8

Çalışmalarda Kullanılan Test Maddeleri: Tapsigargin Thapsia garganica dan elde edilen ve intraselüler Ca +2 transport ATPazların spesifik inhibitörü olan bir tetrasiklik seskiterpen laktondur. Tapsigargin,, SERCA olarak bilinen sarko/endoplazmik retikulum Ca 2+ ATPaz enzimlerinin spesifik inhibitörü olup bu enzimlere sıkıca bağlanır. Endoplazmik retikulumdan (ER), sitoplazmaya kalsiyum pompalayan sistemi bloke ederek inozitol trifosfat (IP3)a bağımlı çalışan ER kalsiyum kanallarını ve plazma membranı kalsiyum kanallarını açarak sitosole kalsiyum influksunu arttırır. Çalışmalarda Kullanılan Hücreler A549 Küçük Hücreli dışı insan akciğer adenokarsinoma hücre dizisi COX-2 2 aşırı salınımı var. C6 fare Glioblastoma multiforme hücre dizisi 9

Materyal Metod Test Maddelerinin Hazırlanması Aspirin 1,6-8- 4- - 1 μm, Kersetin 1-1-25 25-55 ve 1 μm Epigallokateşin Gallat,1-1-1 1-25 ve 5 μm Kalsiyum fosfat 25 μm Tapsigargin 1 μm Aspirin etanolde,, kalsiyum fosfat suda, epigallokateşin, kersetin ve tapsigargin DMSO da çözünmüştür. Materyal Metod Hücrelerin Deneylere Hazırlanması A549 hücreleri %1 FBS içeren Ham s F12 besiyerinde, C6 hücreleri %1 FBS içeren 1:1 DMEM:Ham s F12 besiyerinde yetiştirildi. Tripsinlenerek toplanan hücreler, 5 hücre /ml olacak şekilde hazırlanarak, 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 1 μl l ekildi (5 hücre). 1

Materyal Metod Hücrelerin Deneylere Hazırlanması MTT, nötral kırmızısı, kristal viyole ve sulforodamin B ölçümleri için hücreler 24, 48, 72 ve 96. saatler sonunda boyamalara alındı. Boyamaları yapılan hücrelerin ölçümleri mikroplaka okuyucuda 54 nm dalga boyunda kolorimetrik olarak yapıldı. Sonuçlar SPSS yazılım programında One-way Anova testi ve post-hoc olarak da Tukey ile, kontrol grubu %1 kabul edilerek değerlendirildi. Akridin oranj sonuçları, 24 saat sonunda alınmıştır. Yöntemler MTT NR (Nötral( Kırmızısı) CV (Kristal viyole) SRB (Sülforodamin( B) AO (Akridin( oranj) 11

Aspirinin A549 Hücrelerindeki Sonuçları MTT Aspirin'in A549 Hücrelerindeki MTT Sonuçları Nötral kırmızısı Aspirinin A549 Hücrelerinde NR Sonuçları Kristal Viyole Aspirinin A549 Hücrelerinde CV Ölçüm Sonuçları 1 14 14 Mitokondriyal Aktivite (%) 1 8 6 4 A549 DMSO ASA 1,6 microm ASA 8 microm ASA 4 microm ASA microm ASA 1 microm Lizozomal Aktivite (%) 1 1 8 6 4 + DMSO ASA 1,6 microm ASA 8 microm ASA 4 microm ASA microm ASA 1 microm DNA Miktarı (%) 1 1 8 6 4 + + + DMSO ASA 1,6 microm ASA 8 microm ASA 4 microm ASA microm ASA 1 microm + + Zaman (Gün) Zaman (Gün) Zaman (Gün) Aspirinin A549 Hücrelerinde Akridin Kontrol Aspirin 1,6 um Aspirin 4 um 12

Kersetinin A549 Hücrelerindeki Sonuçları MTT Nötral Kırmızısı Kristal viyole A549 A549 A549 14 14 14 (%) Metabolizma 1 1 8 6 4 + DMSO Que 1 mikrom Que 1 mikrom Que 5 mikrom Que 1 mikrom Que 25 mikrom DNA Miktarı (%) 1 1 8 6 4 1 DMSO 1 Que 1 mikrom 8 Que 1 mikrom Que 5 mikrom 6 Que 1 mikrom Que 25 mikrom 4 Lizozomal Aktivite (%) DMSO Que 1 mikrogr/ml Que 1 mikrogr/ml Que 5 mikrogr/ml Que 1 mikrogr/ml Que 25 mikrogr/ml Kersetinin A549 Hücrelerinde Akridin Kontrol 1 μm Kersetin 25 μm Kersetin 13

Kersetinin C6 Hücrelerindeki MTT Sonuçları Kersetin Kersetin + CP Kersetin + TG a. Kersetinin MTT Sonuçları b. Kersetinin CP ile Kombinasyonlarının MTT Sonuçları c. Kersetinin TG ile Kombinasyonlarının MTT Sonuçları % Mitokondriyal Aktivite 14 1 1 8 6 4 DMSO 1ul/ml Que 1uM Que 1 um Que 25 um Que 5 um Que 1 um % Mitokondriyal Aktivite 14 1 1 8 6 4 DMSO 1ul/ml CP 25 um Que 1 um + CP 25 um Que 1 um + CP 25 um Que 25 um + CP 25 um Que 5 um + CP 25 um Que 1 um + CP 25 um % Mitokondriyal Aktivite 14 1 1 8 6 4 DMSO 1 ul/ml DMSO 2 ul/ml TG 1 um Que 1uM + TG Que 1 um + TG Que 25 um + TG Que 5 um + TG Que 1 um + TG Kersetinin C6 Hücrelerindeki NR Sonuçları Kersetin Kersetin + CP Kersetin + TG a. Kersetinin NR Sonuçları b. Kersetinin CP ile Kombinasyonlarının NR Sonuçları c. Kersetinin TG ile Kombinasyonlarının NR Sonuçları 14 16 1 1 14 1 % Lizozomal Enzim 1 8 6 4 DMSO 1ul/ml Que 1uM Que 1uM Que 25uM Que 5uM Que 1uM % Lizozomal Enzim 1 1 8 6 4 DMSO 1ul/ml CP 25uM Que 1uM + CP 25uM Que 1uM + CP 25uM Que 25uM + CP 25uM Que 5uM + CP 25uM Que 1uM + CP 25uM % Total Protein 8 6 4 DMSO 1ul/ml DMSO 2ul/ml TG 1uM Que,1uM + TG 1uM Que 1uM + TG 1uM Que 1uM + TG 1uM Que 25uM + TG 1uM Que 5uM + TG 1uM 14

Kersetinin C6 Hücrelerindeki CV Sonuçları Kersetin Kersetin + CP Kersetin + TG a. Kersetinin SRB Sonuçları b. Kersetinin CP kombinasyonlarının SRB Sonuçları c. Kersetinin TG ile Kombinasyonlarının NR Sonuçları 14 14 1 1 1 1 % Total Protein Miktarı 1 8 6 4 DMSO 1uM Que 1uM Que 1uM Que 25uM Que 5uM Que 1uM % Total Protein Miktarı 1 8 6 4 DMSO 1uM CP 25uM Que 1uM + CP 25uM Que 1uM + CP 25uM Que 25uM + CP 25uM Que 5uM + CP 25uM Que 1uM + CP 25uM % Total Protein 8 6 4 DMSO 1ul/ml DMSO 2ul/ml TG 1uM Que,1uM + TG 1uM Que 1uM + TG 1uM Que 1uM + TG 1uM Que 25uM + TG 1uM Que 5uM + TG 1uM Kersetinin C6 Hücrelerinde Akridin Kontrol 15

Kersetinin C6 Hücrelerinde Akridin 1 μm Kersetin Kersetinin C6 Hücrelerinde Akridin 5 μm Kersetin 16

Kersetinin C6 Hücrelerinde Akridin CP Kersetinin C6 Hücrelerinde Akridin 1 μm Kersetin + 25 μm M CP 17

Kersetinin C6 Hücrelerinde Akridin 1 μm Kersetin + 25 μm M CP Kersetinin C6 Hücrelerinde Akridin TG 18

Kersetinin C6 Hücrelerinde Akridin 1 μm Kersetin + 1 μm M TG Kersetinin C6 Hücrelerinde Akridin 5 μm Kersetin + 1 μm M TG 19

EGCG ın C6 Hücrelerindeki MTT Sonuçları EGCG EGCG + CP EGCG + TG a. EGCG'ın MTT Sonuçları b. EGCG'ın CP ile Kombinasyonlarının MTT Sonuçları c. EGCG'ın TG ile Kombinasyonlarının MTT Sonuçları 14 14 1 1 1 1 % Mitokondriyal Aktivite 1 8 6 4 EtOH 1ul/ml EGCG,1 um EGCG 1uM EGCG 1uM EGCG 25uM EGCG 5uM % Mitokondriyal Aktivite 1 8 6 4 EtOH 1ul/ml CP 25uM EGCG,1uM + CP 25uM EGCG 1uM + CP 25uM EGCG 1uM + CP 25uM EGCG 25uM + CP 25uM EGCG 5uM + CP 25uM % Mitokondriyal Aktivite 8 6 4 EtOH 1ul/ml EtOH 1ul/ml + DMSO 1uM/ml TG 1uM EGCG,1uM + TG 1uM EGCG 1uM + TG 1uM EGCG 1uM + TG 1uM EGCG 25uM + TG 1uM EGCG 5uM + TG 1uM EGCG ın C6 Hücrelerindeki NR Sonuçları EGCG EGCG + CP EGCG + TG a. EGCG'ın NR Sonuçları b. EGCG'ın CP ile Kombinasyonlarının NR Sonuçları c. EGCG'ın TG Kombinasyonlarının NR Sonuçları 16 16 14 14 14 1 % Lizozomal Enzim 1 1 8 6 4 EtOH 1ul/ml EGCG,1uM EGCG 1uM EGCG 1uM EGCG 25uM EGCG 5uM % Lizozomal Enzim 1 1 8 6 4 EtOH 1ul/ml CP 25uM EGCG,1uM + CP 25uM EGCG 1uM + CP 25uM EGCG 1uM + CP 25uM EGCG 25uM + CP 25uM EGCG 5uM + CP 25uM % Lizozomal Aktivite 1 8 6 4 EtOH 1ul/ml DMSO 1ul/ml EtOH 1ul/ml + DMSO 1ul/ml TG 1uM EGCG,1uM + TG 1uM EGCG 1uM + TG 1uM EGCG 1uM + TG 1uM EGCG 25uM + TG 1uM EGCG 5uM + TG 1uM

EGCG ın C6 Hücrelerindeki SRB Sonuçları EGCG EGCG + CP EGCG + TG a. EGCG'ın SRB Sonuçları b. EGCG'ın CP ile Kombinasyonlarının Sonuçları c. EGCG'ın TG ile Kombinasyonlarının SRB Sonuçları 18 18 18 16 16 16 14 14 14 EtOH 1ul/ml % Total Protein 1 1 8 6 4 EtOH 1ul/ml EGCG,1uM EGCG 1uM EGCG 1uM EGCG 25uM EGCG 5uM % Total Protein 1 1 8 6 4 EtOH 1ul/ml CP 25uM EGCG,1uM + CP 25uM EGCG 1uM + CP 25uM EGCG 1uM + CP 25uM EGCG 25uM + CP 25uM EGCG 5uM + CP 25uM % Total Protein Miktarı 1 1 8 6 4 DMSO 1ul/ml EtOH 1ul/ml + DMSO 1ul/ml TG 1uM EGCG,1uM + TG 1uM EGCG 1uM + TG 1uM EGCG 1uM + TG 1uM EGCG 25uM + TG 1uM EGCG 5uM + TG 1uM EGCG ın C6 Hücrelerindeki Akridin 1 μm M EGCG 21

EGCG ın C6 Hücrelerindeki Akridin 1 μm M EGCG EGCG ın C6 Hücrelerindeki Akridin 1 μm M EGCG + 25 μm M CP 22

EGCG ın C6 Hücrelerindeki Akridin 1 μm M EGCG + 25 μm M CP EGCG ın C6 Hücrelerindeki Akridin 1 μm M EGCG + 1 μm M TG 23

EGCG ın C6 Hücrelerindeki Akridin 1 μm M EGCG + 1 μm M TG Tartışma A549 Hücrelerinden elde edilen sonuçlar Aspirin A549 hücrelerinde düşük dozlarda vital boyalar olan MTT ve CV yi ilk gün absorbe etmemiştir. Bu nedenle plateletlerde olduğu gibi hücre membran stabilizasyonu yaptığı düşünülmektedir. AO sonuçlarında elde edilen görüntülerde hücrelerde prometafazik görüntüler ve CV sonuçlarında DNA miktarındaki artış aspirinin A549 hücrelerinde mitotik yıkım/ hücre ölümüne sebep olduğunu göstermektedir. Bu mekanizmada aspirinin antiagregan etkisindeki mekanizmalar etkili olabilir. Dördüncü günde lizozomal enzim artışı, hücrelerin lizozomal enzimler tarafından sindirildiğini göstermektedir. 24

Tartışma Kersetinin Sonuçları A549 hücrelerinde mikronükleusa sebep olması genotoksik olduğunu göstermektedir. C6 hücrelerinde kersetin tek başına zamana ve doza bağımlı apoptotik etkiler göstermiştir. Tartışma Kersetinin CP kombinasyonları C6 hücrelerinde mitotik hücre ölümüne sebep olmaktadır. Mitotik hücre ölümünde COX-1 1 enzimi ve PLA2 yolağının etkili olduğunu göstermektedir. Kersetinin TG kombinasyonlarında apoptotik mekanizmaya benzemeyen görüntüler elde edilmiştir. Kaspazlardan bağımsız hücre ölümü olabileceği düşünülmektedir (???). 25

Tartışma EGCG Sonuçları C6 hücrelerinde doza ve zamana bağımlı apoptotik etkiler göstermiştir. EGCG ın CP kombinasyonlarında apoptotik etki değişmemiştir. Bu olay mitotik hücre ölümünde COX-2 2 ve PLC nin atkisinin olmadığını göstermektedir. EGCG ın TG kombinasyonlarında hücre ölüm biçimi değişmektedir. Kaspazlardan bağımsız hücre ölümü (???). 26

Otofaji Yapılması Planlanan Çalışmalar PLA2 ve PLC enzimleri ve PGE2 nin western blot analizleri, Hücre içi kalsiyum Ölçümleri (Kalsein( Kalsein), Farklı hücrelerde COX-1 1 ve COX-2 2 spesifik biyoaktif maddelerin CP ve TG kombinasyonlarının HTS analizleri, DNA fragmentasyonu,, LDH, lusiferaz aktivitesinin tayinleri, Flow sitometri ile hücre siklus analizleri Kaspaz 3 ve 8 aktivasyonu 27

Bu çalışmalar, Anadolu Üniversitesi Araştırma Fonu /332, 2/124 ve 4315 nolu projeleri ile desteklenmiştir. TEŞEKKÜRLER Sayın Hocam Prof. Dr. Yusuf Öztürk e, Sayın Hocam Prof. Dr. Ayhan Bilir e, Sayın Hocam Prof. Dr. Pallu Reddanna ya, Anadolu Üniversitesi Eczacılık Fakültesi ndeki mesai arkadaşlarıma, Master öğrencilerim Uzm.. Ecz. Qasem Abdallah ve Uzm.. Ecz. Cavid Memmedov a,, Doktora öğrencimiz Uzm. Ezc.. Nisa Kocaoğlu na Ve hücre ölümü konusunda emeği geçen tüm araştırmacılara. 28

Sizlere. Sabrınız, ilginiz ve dinlediğiniz için teşekkürler. 29