- 1-1. GİRİŞ Geleneksel gıda ürünlerimizden biri olan yufka yakın tarihe kadar, evlerde ve küçük işletmelerde üretilmekteydi. Gerek iş, gerekse sosyal hayattaki değişimler insanların yaşam tarzını etkilemiş ve pek çok geleneksel gıdanın, gıda sanayinde, endüstriyel anlamda üretilen birer ürün olmasını sağlamıştır. Yufka da bu gıdalardan biridir. Yufka besin değeri yüksek bir gıda olmasının yanı sıra, kullanım açısından son derece pratik bir gıdadır. Bu nedenle, özellikle büyük şehirlerde de insanların yemek yapmaya ve yemeye daha az zaman ayırmaları nedeniyle sık tüketilen bir gıda halini almıştır. Sulama yapılarak üretilen yufka çok kısa sürede bozulabilen bir gıdadır. Raf ömrü, üretim çeşidine ve şartlarına göre değişmektedir. Paketleme aşamasında ambalaj içersine gıda gazı uygulanması ürün raf ömrünün uzamasında etkilidir. Paketlemede kullanılan gıda gazı %60 azot %40 karbondioksit bileşimine sahiptir. Bir diğer yöntem olan vakumlama ile ambalaj içersindeki havanın alınması; gerek kimyasal, gerekse mikrobiyolojik açıdan ürün kalitesini, buna bağlı olarakta raf ömrünün uzaması konusunda etkili olmaktadır. Paketleme esnasında; personel hijyeni ve paketleme yöntemi de ürünün raf ömrünü doğrudan etkileyen faktörlerdir. Çok uzun yıllardır bilinmekte ve tüketilmekte olan yufkanın, evlerde üretilen yöresel bir gıda olmaktan çıkıp, gıda sanayinde üretilen bir ürün olmaya başlamasıyla birlikte; üretim ve satış aşamasında karşılaşılan kalite problemleri, artan maliyetler, müşteri telep ve şikayetleri nedeniyle; yufka üretimi gerek ürün, gerekse üretim metodları açısından sürekli gelişen bir sanayi dalı olmaya başlamıştır. Üretimin her aşamasında meydana gelebilecek kontaminasyonlar ve kullanılan hammaddenin kalitesi, doğrudan ürünün raf ömrünü etkilemektedir. Öncelikle kaliteli bir ürün için, kaliteli hammadde kullanılmalıdır. Üretimin her aşamasında; personel ve kullanılan ekipmanın hijyeni ve sanitasyonun üretim kurallarına uygun olması gerekmektedir. Ayrıca, paketleme yöntemleri de son derece önemlidir. Yufkanın açılmasından sonra gerçekleşen kısa süreli ısıl işlem riskleri en aza indirmekte; bu nedenle de sulama ve paketleme aşamalarında meydana gelebilecek kontaminasyonlar daha çok dikkat edilmesi gereken riskler olarak karşımıza çıkmaktadır. Sulamada genellikle şehir şebeke suyu kullanılmakta ve şehir şebeke suyu dezenfekte edildiği için sudan kaynaklanan bir
- 2 - kontaminasyon oluşması ihtimali azalmaktadır. Özellikle bezle sulama yapılması durumunda; kullanılan bezlerin dezenfeksiyonunun çok iyi sağlanması gerekmektedir. Makine ile yapılan sulamada, hattan geçen yufkaların kurutma işlemi fanlar aracılığıyla yapılmaktadır. Bu fanlarda; ortam havasının sirkülasyonunu sağlaması nedeniyle, ortam havasında bulunabilecek mikroorganizmaları yufka üzerine bırakabilmektedir (Hançer, 2006). Ülkemizde çok sayıda yufka imalathanesi bulunmasına karşın; üretimini TS10443 e göre yapıp, bunu belgelendiren firma sayısı ülke genelinde son derece sınırlıdır. Bunlar; İstanbul, Şanlıurfa, Kırklareli ve Gaziantep illerinde bulunan firmalardır. Özellikle İstanbul ilinde yufka imalatı yapan çok sayıda firma olmasına rağmen; sadece bir firmanın TSE standardına uygun üretim yaptığını belgelendirmesi, üretim şartları ve ürün kalitesi hakkında ciddi endişelerin oluşmasına neden olmaktadır. Bu durum; gerek halk sağlığı ve gerekse kaliteli ürünlerin insanlara ulaşması konusunda ciddi problemlerin meydana gelebileceği ihtimalini ortaya çıkarmaktadır. Bu araştırmadaki amaç; yufka üretiminde uygulanan proses çeşitlerinin ürün kalitesine etkisinin belirlenmesi; böylece yufka sanayinde, proses anlamında çeşitli teknik değişiklikler ve modernizasyonlarla, üretimin kalite ve maliyet açısından iyileştirilmesine yönelik olarak, elde edilecek bulgular doğrultusunda somut önerilerde bulunmaktır. Zira; ülkemizin bütün yörelerinde yaygın olarak üretilip, tüketilmesine karşın; bu geleneksel ürünümüzle ilgili yeterli düzeyde araştırmaya rastlanmamıştır.
- 3-2.LİTERATÜR BİLGİSİ Genel olarak yufka ince açılmış hamur yaprağı olarak veya pideden daha ince açılmış, sacda pişen bir tür ekmek olarak tanımlanmaktadır (Özön, 2000; Anonim 1992). Yufka ile ilgili olarak pek çok kaynakta genel olarak benzer ifadeler kullanılmakta ve çok detaylı bilgiye rastlanmamaktadır. Ayrıca yufka; buğday ununun baklava ve böreklik çeşidine, içme suyu, yemeklik tuz ve gerektiğinde katkı maddeleri ilave edilip, tekniğine uygun olarak hazırlanan hamurun açılarak kısmen pişirilmesi ile elde edilen yarı mamuldür olarakta ifade edilmektedir (Anon, 1992). Yufka; ekstra-ekstra olarak nitelendirilen, bir santimetre karede 900 deliği bulunan 6 nolu elek üstünde bıraktığı kepek ve irmikten ibaret elek kalıntısı %1 den, kül miktarı kuru maddede %0,65 ten, külün %10 luk HCl de erimeyen kısmı % 0,10 dan, serbest asiditesi %0,04 ten fazla, kuru gluten miktarı %9 dan az olmamalıdır, gluteni yaş iken açık renkte ve tamamen elastiki olmalıdır.ayrıca; Gıda maddelerinin ve umumi sağlığı ilgilendiren eşya ve levazımın hususi vasıflarıni gösteren tüzüğünde; su miktarı yufkada; %43 ü, yassı kadayıfta; %45 i, tel kadayıfta; %26 yı geçmemelidir. Yufkalarda tuz miktarı kuru maddede; % 2 yi, diğerlerinde; %1,5 i ve tuzsuz kül miktarı yapıldığı unun nevindeki kül miktarını geçemez. Külün %10 luk asit klorhidrikte erimeyen kısmı % 0,10 u geçmemelidir. Suya geçen asiditesinin tadili için 100 grama 7,5 cm 3 ten fazla normal kalevi solüsyonu sarf edilmemelidir. Ayrıca bu mamüllerin ilkel maddelerden başka bunlara zararsızda olsa herhangi bir yabancı madde katılması veya boyanması yasaktır. Bu mamüllere teknoloji icabı, ilavesi gereği sağlığa zararsız maddelerin katılması Sağlık ve Sosyal Yardım Bakanlığı nın iznine bağlıdır (OĞAN, 1996). Yufka; kullanım alanlarına göre çok çeşitli özelliklerde olabilir, ancak böreklik yufkaların Türk Standartları Enstitüsünce belirlenen böreklik yufka standartında; renk ve görünüş açısından kendine has renkte ve yaklaşık daire veya dikdörtgen veya kare şeklinde olmalı, parçalanmış ve küflenmiş olmamalıdır şeklinde tanımlanmaktadır. Kenarından içeriye doğru 3 cm den fazla olmamak şartıyla en çok 3 yırtık olabilir. Tat ve koku açısından, kendine has tat ve kokuda olmalı, acılaşmış, ekşimiş, kokuşmuş olmamalı, küf kokusu ve tadı hissedilmemelidir. Gözle görülen yabancı madde
- 4 - bulunmamalıdır. Çapı veya kenar uzunluğu en az 40 en fazla 70 cm olmalı, kalınlığı en fazla 1,2 mm olmalı, ayrıca aynı partideki yufkanın en büyük çaplı veya kenar uzunluğunda olanı ile en küçüğünün arasındaki fark en fazla 5 cm olmalıdır. Rutubet değeri en yüksek % 43; Tuz değerinin en yüksek (Kurumaddede) % 2; Kül değerinin (tuz hariç kurumaddede) en yüksek % 0,65; Kum (% 10 luk HCl de çözünmeyen kül kurumaddede) değerinin en yüksek % 0,1; Asitlik değerinin en yüksek 6 ml; Toplam Mezofilik Aerobik Bakteri Sayısı en yüksek 10 5 kob/g, küf Sayısı en yüksek 10 2 kob/g olmalı, Salmonella, Staphylococcus aureus, Escherichia coli bulunmamalıdır (Anon, 1992). Yufka kalitesi ve raf ömrü mevsim şartlarından da etkilenmektedir. Çeşitli bozulmalar nedeniyle, üreticiye iade edilen ürünlerin yıllık ortalaması %2-3 oranlarındayken, yaz aylarında bu oran %5 i bulmaktadır (Hançer, 2006). Paketleme yöntemleri ürünün raf ömrünü önemli ölçüde etkilemektedir. Vakumlanmadan ambalajlanan yufkaların raf ömrü 2-3 gün iken vakumlanarak ambalajlanan yufkaların raf ömrü 21 güne kadar çıkmaktadır (Hançer, 2006). Geleneksel yufka yapımı dışında, Dünya da strudel ve phyllo adıyla bilinen yufka çeşitleri de vardır. Strudel yufkası; tek parça büyük, parmakların ucuyla esnetilerek açılan eski usul Türk yufkası olarak tarif edilmektedir. Hem tatlı ve hem de tuzlularda, baklavalar dahil her türlü şekilde kullanabilmektedir. Eller üstünde esnetilerek açılan eski ev yufkaları, kağıt gibi, zar gibi, öteki tarafı görülecek şekilde şeffaf ve incedir. Un ve su ile yapılır; önce yoğurulur ve 1-2 saat dinlendirilen hamur ya tek parça veya istenilen sayıda parçalara bölünür ve sonrada temiz masa örtüsü yayılmış masada yumruk yapılmış ellerin üstünde çok dikkatle esnetilerek büyütülür. Farklı bir tekniktir ve Avusturyalılar da bunu yıllar önce Osmanlı dan öğrenmişlerdir ve Dünya ya tanıtmışlardır; fakat şimdi, Dünya da Avusturya strudel hamuru diye bilinmektedir. ABD de ince yufkalar phyllo (fillo) adıyla her yerde, donmuş olarak rulo paketlerde satışa sunulmaktadır. Ancak restoranlarda, gurme dünyasında ve evlerde hala elle açılan hamurdan yufkalar kullanılmaktadır. Phyllo tabakaları dikdörtgen yapıda ve küçüktürler ve birçok adette üst üste konmuş olarak dondurulmuş paketlerde satılırlar ve bazı yerlerde 1 den 7 numaraya kadar farklı inceliktedirler.
- 5 - Eller üzerinde esnetilerek açılan klasik baklava yani eski geleneksel Türk yufkası (strudel yufkası) ile klasik öteki ev yufkası ve ABD de satılan dondurulmuş phyllo birçok tarifte birbirinin yerine kullanılmaktadırlar. Bu yufkalarla hazırlanmış baklava dahil, çok fazla çeşitte ürün yapılmaktadır (www.ruki.org/yufka/htm, 2003).
- 6-3. MATERYAL VE METOD 3.1. Materyal Araştırma materyali olarak 4 farklı proses kullanılarak 3 tekerrürde üretilmiş toplam 12 adet yufka kullanılmıştır. Bunlar: 1. Bezle sulama yapılarak üretilen yufkalar 2. Bezle sulama yapılarak modifiye atmosferde vakumlanmış yufkalar 3. Makineyle sulama yapılarak üretilen yufkalar 4. Makineyle sulama yapılarak modifiye atmosferde vakumlanmış yufkalar 3.2. Metod 3.2.1. Geleneksel Yufka Yapım Metodu Geleneksel yufka yapımında; özel amaçlı un olarak bilinen ve baklava, börek, bisküvi, kek, pasta, yufka, pizza, hamburger, tahıllı ekmek gibi direkt tüketilen ürünlerin yapımında kullanılan unların yanı sıra, katkılı unlar, özel işlem görmüş unlar ve irmik altı unu gibi pek çok amaca yönelik mamüllerin yapımına uygun buğday unu kullanılır. Ayrıca şehir şebeke suyu ve yemeklik tuz aşağıdaki oranlarda kullanılır (Anon, 1999). 100 kg una 65 lt su, kış mevsiminde 5, yaz mevsiminde 6 kg tuz ilave edilip hamur makinesinde yaklaşık 15 dakika yoğurulmuştur. Tuz miktarındaki değişiklik hamurun yazın daha yumuşak, kışın ise daha sert oluşundan kaynaklanır. Yazın daha fazla tuz katılarak hamurun kendini bırakması önlenir. Hamur yoğrulduktan sonra, kendine gelmesi için 10 dk. dinlenmeye bırakılmıştır. Dinlenen hamur, isteğe göre farklı büyüklükte, ortalama 130 g ağırlığında kesilmiştir. Bu şekilde kesildiğinde; yufka ağırlığı, açma esnasında kullanılan uğralık unu bünyesine alarak en son 200 g ağırlığına ulaşmıştır. Hamur kesimi makineyle, bıçak veya elle kopartılarak yapılır. Makine ile kesilen hamurların arasındaki gramaj farkı azalmaktadır. Kesilen hamur makineyle veya
- 7 - elle yuvarlanmıştır. Hamurlar yuvarlandıktan sonra elle bastırılarak düzleştirilmiştir. Un içinde yarım saat dinlendirilmiştir. Dinlenmiş hamur, oklava ile istenilen kalınlık ve büyüklükte açılmıştır. Sac üzerinde 30 saniye pişirilmiştir. Deste haline gelen yufkalar, tek tek birbirinden ayrılmış ve yeniden istiflenerek soğuması sağlanmıştır. Soğutulan yufkaların yüzeyleri ıslatılmıştır. Islatılan yufkaların birbirine yapışmasının engellenmesi amacıyla yufkalar üç kez havalandırılmıştır. İstif yapılan yufkalar 2 saat dinlendirilmiştir. Dinlenen yufkalar paketlemeye hazır hale gelmiştir. Geleneksel yufka yapım aşamaları Çizelge 1 de gösterilmiştir. Çizelge 1 :Geleneksel Yufka Yapımı Un Su Tuz Yoğurma Dinlendirme Hamur kesme Yuvarlak yapma Hamur basma Açma Pişirme Soğutma Sulama Deste havalandırma Dinlendirme Paketleme
- 8-3.2.2. Araştırmada Kullanılan Yufka Yapım Metodları Araştırma materyali yufka örneklerinin yapımında 4 farklı proses tekniği kullanılmıştır. Proses 1: Yufkaların bezle sulama yapılıp gazlı vakumlanmadan ambalajlanması ile yapılan üretimdir. Yufkalar bir yüzleri suya değdirilerek ıslatılmış, ıslatılan yufkalar aralarına bez konarak destelenmiştir. Sonrada bezden ayrılarak yufkalar tekrar destelenmiş ve vakumlanmadan ambalajlanmıştır. Proses 2: Yufkaların bezle sulama yapılıp gazlı vakumlanarak ambalajlanması ile yapılan üretimdir. Yufkalar bir yüzleri suya değdirilerek ıslatılmış, ıslatılan yufkalar aralarına bez konarak destelenmiştir. Daha sonra bezden ayrılarak yufkalar tekrar destelenmiş ve vakumlanma sırasında ambalaj içerisine gıda gazı verilerek ambalajlanmıştır. Proses 3: Yufkaların makine ile sulanması yapılarak gazlı vakumlanmadan ambalajlanması ile yapılan üretimdir. Sulama tünel tipi bir makineyle yapılmış, belirli aralıklarla fanlar içeren makine girişinden tek yüzeyi ıslatılmış yufkalar verilmiştir. Hat ilerledikçe, hareketli bant üzerine konan yufkaların suyu uçurulmuştur. Makineden çıkan yufkalar destelenmiş ve vakumlanmadan ambalajlanmıştır. Proses 4: Yufkaların makine ile sulanması yapılarak gazlı vakumlanarak ambalajlanması ile yapılan üretimdir. Sulama proses 3 teki gibi yapılmıştır. Vakumlanma esnasında ambalaj içine gıda gazı verilmiştir. 3.2.3.Kimyasal Analiz Metodları 3.2.3.1. Rutubet Tayini (%) 130-133 C de kurutulup desikatörde soğutularak darası alınmış olan kuru madde kaplarına 5g örnek tartılır. Daha sonra 130-133 C deki ayarlı kurutma dolabında 2 saat süreyle kurutulur. Paraleller arasındaki fark %0,1 i geçmemelidir (Elgün, vd., 1999). 3.2.3.2. Kül Tayini (%Tuz hariç, kuru maddede) Yakma kapları kullanılmadan önce kül fırınında 900 C de sabit ağırlığa kadar kurutulup bırakılır. Desikatörde soğutulup darası alınır. Kaplar içine 2g örnek tartılıp
- 9 - üzerine 1-2 ml etil alkol ilave edilip 900 C deki kül fırınının kapağı üzerinde yakılır. Alev bittikten sonra fırına yerleştirilip hiç siyah leke kalmayıncaya kadar 2 saat süreyle yakılır. Yakma sonunda desikatörde soğutulup tartılır. Paraleller arasındaki fark %0,002 den fazla olmamalıdır. Tuz hariç kül değeri için %tuz miktarı kül değerinden çıkartılır (Elgün, vd., 1999). 3.2.3.3. Tuz Tayini (% Kuru maddede) Bu amaçla 5 g analizi yapılacak numune alınır. Sıcak su ile eritilir. Hacmi 500 ml olacak şekilde sıcak su ile birkaç kez yıkanır. Daha sonra hacim tamamlaması yapılır. Bu toplanan çözeltiden belirli miktarda alınarak potasyum kromat indikatörlüğü eşliğinde AgNO 3 sarfiyatı formülde yerine konularak numunedeki tuz miktarı % olarak hesaplanır (Anon, 1987). 3.2.3.4. Kum Tayini (%10 luk HCl de çözünmeyen kül, kuru maddede) 5 g numune alınarak külü tayin edilir. Kül üzerine %10 luk HCl den 10 ml konur, kaynar su banyosu üzerinde hafif sarı renk oluşuncaya kadar kaynatılır. Kumdan ayrı olan diğer maddeler asitte çözünür. Asit kül karışımı külsüz filtre kağıdından süzülür. Kapsülden ve süzgeç kağıdından asit giderilinceye kadar sıcak su ile yıkanır. Tamamen yıkanıp yıkanmadığı AgNO 3 çözeltisi ile kontrol edilir. Süzüntüde AgNO 3 çözeltisi ile beyaz bulanıklık meydana gelmeyinceye kadar işleme devam edilir. Yıkama bitince süzgeç kağıdı kapsüle konur ve kurutulur. Kül tayininde olduğu gibi yakılır. Desikatörde soğutulur ve tartılır. İki tartım arasındaki fark 1 mg dan az oluncaya kadar bu işleme devam edilir (Anon, 1987). 3.2.3.5. Asitlik Tayini (%) 10 g numune bir erlene alınır. 100 ml su ile karıştırılmak suretiyle 30 dakika kaynar su banyosu içinde bekletilir. 30 dakika sonunda soğutulmuş çözelti fenolftaleyn indikatörü kullanılarak, 0,1 N ayarlı sodyum hidroksit çözeltisi ile kalıcı pembe renk oluşuncaya kadar titre edilir. Titrasyona 5 dakika ara verilir. Bu süre içinde renk açılır, 5 dakika sonunda karıştırılır ve titrasyona yine kalıcı pembe renk oluşuncaya kadar devam
- 10 - edilir. Titrasyonda sarf edilen 0,1 N ayarlı sodyum hidroksit (NaOH) in ml sayısı asit değeridir. (100 g madde için sarf edilen normal kalevi miktarı) (Anon, 1987). 3.2.4. Mikrobiyolojik Analiz Metodları 3.2.4.1. Toplam Mezofilik Aerobik Bakteri Sayısının Belirlenmesi Dilüsyon hazırlanması: 100 ml damıtık suya 0,85 g NaCl ilave edilir. 9 ar ml tüplere dağıtılıp, 121 C de 15 dakika sterilize edilir. 1/10 luk dilüsyon hazırlamada kavanozda hazırlanmış 225 ml fizyolojik su kullanılır. Karıştırılarak homojen hale getirilen numuneden dilüsyon sıvısı (1/10 luk) pipetle 1 ml çekilerek 9 ml dilüsyon sıvısı bulunan tüpe aktarılır. Tüp karıştırıcıda karıştırılır. Böylece 1/100 lük dilüsyon hazırlanmış olur. Bu dilüsyondan 1 ml alınarak 9 ml dilüsyon sıvısına ilave edilir. Tüp karıştırıcıda karıştırılır. Aynı şekilde diğer dilüsyonlar hazırlanır. Besiyeri hazırlanması: Plate Count Agar destile su içersinde sık sık karıştırılarak eritilir. 121 C de 15 dakika sterilize edilir. Besiyerine ekim: Son dilüsyondan başlayıp ilk dilüsyona doğru gitmek şartı ile aynı pipetle her bir dilüsyondan 2 steril petri kutusuna 1 er ml konur. 45±1 C de tutulan erimiş PCA, dilüsyon konmuş petri kutularına aseptik şartlarda dökülür. Dilüsyonların hazırlanmasından sonra 15 dakika içerisinde besiyeri dökme işleminin tamamlanması gerekmektedir. Besi yerleri döküldükten ve petri kutusunun kapağı kapatıldıktan sonra petri kutusu 8 rakamı çizilecek şekilde hareket ettirilerek besiyeri ile dilüsyonun homojen bir şekilde karışması sağlanır. Ekim yapılmış ve soğumuş plakalar ters çevrilerek 35 C deki inkübatörde 48±3 saat bekletilir. Daha sonra sayım yapılır (Anon,1987).
- 11-3.2.4.2. Küf Sayımı Besiyeri hazırlanması: Potato Dextrose Agar (PDA) destile su içinde eritilir. 121 C de 15 dakika sterilize edilir. Kullanılmadan önce eritildikten sonra 45±1 C ye getirilen besiyerinin ph sı %10 luk tartarik asit ile 3,5 e ayarlanır. Besiyerine ekim: Numunenin ve dilüsyonların hazırlanması besiyerine ekim Toplam Aerobik Mezofilik Bakteri ekimindeki gibi PDA besiyeri kullanılarak yapılır. Ekim yapılmış plakalar 30 C de 5 gün inkübasyona bırakılır. Daha sonra küfler sayılır (Anon,1987). 3.2.4.3. Koliform Grubu Bakteri Sayımı Besiyeri hazırlanması: LST(Lauryl Sulphate Tryptose) Sıvı Besiyeri: ph sı 6,8 e ayarlanarak içerisinde durham tüpleri olan tüplere 10 ar ml konarak 121 C de 10 dakika sterilize edilir. LS(Laktoz Sıvı) Besiyeri: ph sı 7-7,2 ye ayarlanır. 5 g laktoz ilave edilir. İçerisinde durham tüpleri bulunan tüplere 10 ar ml konularak 121 C de 15 dakika sterilize edilir. BGLB(Brillant Gren Laktose Bile) Sıvı Besiyeri: Pepton ve laktoz 500 ml destile suda eritilir ve üzerine 200 ml destile suda eritilmiş olan Ox-bile ilave edilir, karıştırılır ve 950 ml ye tamamlanır. ph 7,4 e ayarlanır.%1 lik brillant-green çözeltisinden 13,3 ml ilave edilir. İçinde durham tüpleri bulunan tüplere ml konularak 121 C de 15 dk sterilize edilir. EC Sıvı Besiyeri: ph 6,9 a ayarlanarak 121 C de 15 dakika sterilize edilir.
- 12 - Besiyerine ekim: Numunenin ve dilüsyonların hazırlanması besiyerine ekim Aerobik Mezofilik bakteri ekimindeki gibidir. Ancak 1/10, 1/100, 1/1000 lik dilüsyonlardan ekim yapılır. Tahmin testi: Her dilüsyondan içerisinde ters çevrilmiş durham tüpleri ve LST sıvı besiyeri veya LS besiyeri bulunan üç tüpe 1 er ml aşılanarak, 35 C de 24-48 saat inkübe edilir. İnkübasyon sonucunda gaz oluşturan tüpler belirlenir. Doğrulama testi: LST veya LS de gaz oluşan tüplerden durham tüplü BG %2 bile laktoz sıvı besiyerine öze ile aşılama yapılır. 35 C de 48 saat inkübasyon sonucunda gaz oluşan tüpler kaydedilir. Fekal koliformların sayısının belirlenmesi için öncelikle BGLB sıvı besiyerinde gaz oluşturan tüplerden LST veya LS besiyerine üç özegözü aşılama yapılır ve gaz oluşana kadar 48 saat veya daha az inkübasyona bırakılır. Buradan üç özegözü, durham tüplü EC sıvı besiyerine aşılama yapılır. 44,5 C de 24 saat inkübasyon sonucunda gaz oluşturan tüpler kaydedilir. E.Coli nin belirlenmesi için EC de gaz oluşturan tüplerden EMB agar üzerine sürme yapılır. 35 C de 18-24 saat inkübe edilir. Metalik parlaklık gösteren tipik koloniler E.Coli şüphesi ile yatık PCA besiyerine ekim yapılır, 35 C de 18-24 saat inkübe edilir. İnkübasyon sonucunda gram boyama yapılır ve IMVIC testine geçilir. (İndol,Methyl-red,Voger-Proskaver,Sitrat) (Anonim, 1987). İMVİC TESTİ: İndol testi: İndol besiyerine yatık PCA da üremiş kültürden aşılama yapılır. 35 C de 24 saat inkübasyona bırakılır.1ml indol ayracı ilave edilir. Kırmızı halkanın oluşumu pozitif reaksiyonu gösterir. VP testi: VP besiyerine PCA da üremiş kültürden aşılama yapılır. 35 C de 24 saat inkübasyona bırakılır. Üremiş kültürden 1ml aseptik şartlarda bir başka tüpe aktarılır. Bunun üzerine, 0,6 ml α-naphthol un alkoldeki %5 lik çözeltisinden 0,2 ml %40 KOH
- 13 - çözeltisinden ilave edilir, sallanır ve 15 dakika içinde reaksiyon değerlendirilir. Pembeden parlak kırmızıya doğru oluşan renk pozitif reaksiyonu gösterir. Reaksiyon hızlandırılmak isteniyorsa çok az creatin kristalleri ilave edilir. MR Testi: VP testinden geriye kalan kültür 48 saat inkübasyona bırakılır ve Metil Red solüsyonundan 5 damla ilave edilir. Test pozitif ise kültür kırmızı renge dönüşür. Sitrat testi: Koser s sitrat sıvı besiyerine aşılanan kültür 35 C de 96 saat inkübe edilir. Üreme varsa test pozitif yoksa negatiftir. Simon s sitrat agar besiyeri kullanıldı ise bu besiyerine aşılanan kültür 35 C de 7 gün inkübasyona bırakılır. Üreme sonucunda besiyerinin yeşil olan renginin maviye dönüşmesi halinde test pozitif, renkte herhangi bir değişiklik meydana gelmemesi halinde ise test negatif kabul edilir. a-) Tahmin testinde gaz oluşan tüplerin sayısına göre g da tahmini koliform sayısı bulunur. b-) Doğrulama testinde gaz oluşturan tüplerin sayısına göre EMS cetvelinden bulunan değer g daki koliform sayısını verir. Üç tüp yöntemine göre EMS cetveli Çizelge 3 te görüldüğü gibidir. c-) Fekal koliformların sayısı, EC besiyerinde gaz oluşturmuş tüplerin sayısının EMS cetveline göre değerlendirilmesi sonucunda bulunur. d-) EMB Agar üzerinde gelişen şüpheli E.Coli kolonileri metalik parlaklık gösterir. e-)imvic testlerinden elde edilen sonuçlar Çizelge 2 e göre değerlendirilir (Anon, 1987). Çizelge 2. İMVIC testi değerlendirme tablosu İndol MR VP Sitrat Tip + + - - Typical E.Coli - + - - Atypical E.Coli + + - + Typical İntermediate - + - + Atypical İntermediate - - + + Typical E.Aerogenes + - + + Atypical E.Aerogenes
- 14 - Çizelge 3. Örneklerden 0,1ml,0,01 ml ve 0,001 ml inokuleler kullanılarak Üç Tüp metoduna göre her g'daki En Muhtemel Sayı (EMS) cetveli Pozitif Tüpler EMS Pozitif Tüpler EMS Pozitif Tüpler EMS 10ml 1ml 0,1ml 10ml 1ml 0,1ml 10ml 1ml 0,1ml 0 0 1 3 1 2 0 11 2 3 3 53 0 0 2 6 1 2 1 15 3 0 0 23 0 0 3 9 1 2 2 20 3 0 1 39 0 1 0 3 1 2 3 24 3 0 2 64 0 1 1 6 1 3 0 16 3 0 3 95 0 1 2 9 1 3 1 20 3 1 0 43 0 1 3 12 1 3 2 24 3 1 1 75 0 2 0 6 1 3 3 29 3 1 2 120 0 2 1 9 1 0 0 9 3 1 3 160 0 2 2 12 2 0 1 14 3 2 0 93 0 2 3 16 2 0 2 20 3 2 1 150 0 3 0 9 2 0 3 26 3 2 2 210 0 3 1 13 2 1 0 15 3 2 3 290 0 3 2 16 2 1 1 20 3 3 0 240 0 3 3 19 2 1 2 27 3 3 1 460 1 0 0 4 2 1 3 34 3 3 2 1100 1 0 1 7 2 2 0 21 3 3 3 1100 1 0 2 11 2 2 1 28 1 0 3 15 2 2 2 35 1 1 0 7 2 2 3 42 1 1 1 11 2 3 0 29 1 1 2 15 2 3 1 36 1 1 3 19 2 3 2 44 3.2.4.4. Salmonella Sayımı İşlem: a.) Seçici olmayan ön zenginleştirme b.) Seçici zenginleştirme c.) Seçici ayırt edici besiyerine çizim d.) Biyokimyasal testler e.) Serolojik testler Polivalant O antiserumu ile yapılan test Polivalant H antiserumu ile yapılan test
- 15 - Seçici olmayan ön zenginleştirme: Aseptik şekilde 25 g numune tartılarak 225 ml Lactose Broth a transfer edilir. Stomacher yada blendırda parçalanarak hazırlanan gıda homojenatı 37 C de 18-24 saat inkübe edilir. Seçici ön zenginleştirme: Ön zenginleştirme kültüründen 1 er ml alınarak 10 ar ml steril Selenite Cystine Broth (SCB) ve Tetrathionate Brilliant Gren Broth(TTBG) içeren tüplere transfer edilir ve 43 C de 24 saat inkübe edilir. Seçici ayırd edici besiyerine çizim: İnkübasyon sonucunda her bir seçici zenginleştirici besiyerinden (SCB ve TTBG) Briliant Gren Agar (BGA) ve Bismuth Sulphite Agar a (BS) tek koloni düşürme yöntemiyle çizim yapılır. 37 C de 24-48 saat inkübe edilen petrilerde inkübasyon süresi sonunda tipik Salmonella kolonilerinin varlığı gözlenir. Salmonella BGA da yarı geçirgen veya opak pembe koloniler oluşturur ve besiyerinin rengi ise parlak kırmızıya dönüşür. BSA da ise bazen metalik refle veren etrafı kahverengi-siyah zonla çevrili kahverengi-gri-siyah koloniler tipik Salmonella kolonileri olarak kabul edilir. (Koloni çevresinde besiyerinin rengi başlangıçta kahverengidir inkübasyon süresinin uzaması ile siyaha dönüşür.) Biyokimyasal testler : BGA VE BSA da tipik Salmonella görüntüsü veren şüpheli koloniler işaretlenerek her bir koloniden iğne özeyle yatık Triple Sugar Iron Agar (TSI) ve Lysine Iron Agar a (LIA) çizme ve daldırma yöntemiyle inokülasyon yapılır. 37 C de 18 saat inkübe edilen tüplerde reaksiyonlar gözlenir. TSI ve LIA da değişik cins bakterilerin verdiği reaksiyonlar Çizelge 4 ve Çizelge 5 tedir.
- 16 - Çizelge 4. Değişik bakterilerin Triple Sugar Iron Agar da oluşturduğu reaksiyonlar Mikroorganizma Dip Yüzey H 2 S Aerobacter aerogenes AG A - Aerobacter cloacae AG A - Escherichia coli AG A - Proteus vulgaris AG A + Proteus morganii A veya AG DY veya ALK - Shigella dysenteriae A DY veya ALK - Shigella sonnei A DY veya ALK - Salmonella typhosa A DY veya ALK + Salmonella paratyphi AG DY veya ALK - Salmonella schottmuelleri AG DY veya ALK + Salmonella cholerasuis AG DY veya ALK - Salmonella enteridis AG DY veya ALK + Salmonella typhimurium AG DY veya ALK + AG : Asit reaksiyon (sarı renk) ve gaz oluşumu A : Asit reaksiyon (sarı renk) DY : Değişme yok ALK : Alkali reaksiyon (kırmızı renk) + : Hidrojen sülfür üretilmiş (siyah renk) - : Hidrojen sülfür üretilmemiş (siyah renk gözlenmez) Çizelge 5. Değişik bakterilerin Lysine Iron Agar da oluşturduğu reaksiyonlar Mikroorganizma Dip Yüzey H 2 S Arizona Alkali Alkali + Salmonella Alkali Alkali + Proteus Asit Kırmızı - Providence Asit Kırmızı - Citrobacter Asit Alkali + Escherichia Asit veya nötral Alkali - Shigella Asit Alkali - Klebsiella Alkali Alkali - Alkali : Alkali reaksiyon (mor renk) Lisini dekarboksile eden kültürler besiyerinin tümünde alkali reaksiyon meydana getirerek mor renk oluştururlar. Asit : Asit reaksiyon (sarı renk) Kırmızı : Lisin deaminasyonu sonucunda yüzeyde kırmızı renk gözlenir. + : H2S üretilmiş (siyah renk) - : H2S üretilmemiş (siyah renk gözlenmez)
- 17 - Serolojik testler: Polivalant O serumu ile yapılan test: TSI ve LIA da pozitif sonuç veren şüpheli Salmonella kültürü Nutrient Agar a (NA) transfer edilerek 37 C de 18-24 saat inkübe edilir. Temiz bir lamın her iki ucuna damlatılan birer damla %0,85 lik NaCl (fizyolojik su) üzerine öze ile NA da hazırlanan taze Salmonella kültürü transfer edilerek, süspanse edilir. Daha sonra süspanse edilen kültürlerden birinin üzerine polivalant o antiserumu damlatılır, lam ileri geri hareket ettirilerek kültür ve antiserumun karışması sağlanır. Bir dakika sonra lam siyah bir fon üzerinde gözlenir. Antiserum ilave edilmiş kısımda aglütinasyon gözlenmesi sonucun pozitif olduğunu ortaya koyar. Polivalant H serumu ile yapılan test: Polivalant O antiserumu ile yapılan antijenik test sonucun pozitif çıkması durumunda şüpheli mikroorganizmanın Salmonella olduğuna karar verir. Ancak Polivalant O antiserumu ile yapılan testin sonucu negatifse bu durumda H testine geçilmesi gerekir.na da hazırlanan şüpheli Salmonella kültürü öze ile H Broth a (Buyyon) transfer edilerek 37 C de 24 saat inkübe edilir. Bu kültürün 5 mililitresine, 5 mililitre formalinli fizyolojik su (%0,6 lık) ilave edilerek 1 saat bekletilir (Formalinize edilmiş kültür). Daha sonra Polivalant H antiserumundan 0,5 ml alınarak steril bir serolojik test tüpüne (75x10mm veya 100x13mm lik) aktarılır ve üzerine 0,5 ml formalinize edilmiş kültür ilave edilir. Kontrol olarak ise aynı şekilde steril serolojik bir test tüpüne 0,5 ml formalinli fizyolojik su ve 0,5 ml formalinize edilmiş kültür ilave edilir. Her iki tüp 50 C de 1 saat süreyle inkübasyona bırakılır. Tüpler inkübasyon süresince her 15 dakikada bir kontrol edilerek aglütinasyon olup olmadığı gözlenir. Formalize edilmiş kültürde aglütinasyon gözlenmesi ancak kontrolda gözlenmemesi durumunda test kültürü Salmonella olarak tanımlanır (Ünlütürk ve Turantaş, 1996).
- 18-3.2.4.5.Staphylococcus aureus Sayımı İşlem: a.) Baird Parker Agar da S.aureus sayımı b.) Koagülaz testi Lam yöntemi Tüp yöntemi Baird Parker Agar da S. aureus sayımı: 10 gram numune aseptik olarak tartılır ve içerisine 90 ml ringer çözeltisi bulunan erlene aktarılarak 1/10 luk dilüsyon hazırlanır. Hazırlanan bu ilk dilüsyondan aynı dilüsyon sıvıları kullanılarak diğer desimal dilüsyonlar hazrlanır. Her bir dilüsyondan daha önceden petri kaplarına dökülerek dondurulmuş ve yüzeyi kurutulmuş Baird Parker Agar besiyerine çift paralelli olarak yayma plak yöntemiyle (0,1 er ml) ekim yapılır. Steril L çubukla inokülüm besiyeri yüzeyine yayılır. Besiyeri yüzeyi inokülümü absorbe ettikten sonra petriler ters çevrilerek 35-37 C de 30-48 saat inkübe edilir. İnkübasyonun 30 uncu saatinde petrilerdeki koloni sayısı saptanarak 30-300 arasında koloni içeren petriler ayrılır. Bu süre sonunda genellikle temiz zonlu ve zon kenarlarında ince beyaz presipitasyon halkası oluşturan parlak siyah koloniler büyük olasılıkla Staphylococcus aureus kolonileridir. Tipik S. aureus kolonileri 30 saatlik inkübasyondan sonra işaretlenerek petriler 18 saatlik bir ikinci inkübasyona bırakılır. 48 saatlik inkübasyon süresi sonunda yukarıda tanımlanan özelliklere uyan olası S.aureus kolonileri ile birlikte temiz zon ve presipitasyon halkası oluşturmayan parlak siyah koloniler de sayılır.sayılmış olan bu kolonilerden en az 5 tanesi koagülaz testine tabi tutulur ve koagülaz pozitif koloni sayısı saptanır. Daha sonrada petrilerdeki tipik koloni sayısı ile koagülaz pozitif S. aureus yüzdesi ve dilüsyon faktörü çarpılarak örneğin gramdaki koagülaz pozitif S. aureus sayısı hesaplanır.
- 19 - Koagülaz testi: Lam yöntemi: Koagülaz testi yapılması amacıyla seçilmiş tipik koloniler Nutrient Agar katı besiyerlerine inoküle edilerek 35-37 C de 18-24 saat inkübasyona bırakılır. İnkübasyon süresi sonunda temiz bir lam alınarak her iki ucu cam kalemi ile işaretlenir ve bu noktalara birer damla fizyolojik su (%0,85 lik NaCl) damlatılır. Her iki noktadaki fizyolojik su üzerine iğne öze ile 18-24 saatlik taze kültür transfer edilerek homojen hale gelinceye kadar damlacık içinde süspanse edilir. Lam üzerindeki kültürlerden birine bir damla tavşan plazması damlatılır.diğer noktadaki fizyolojik su ve kültür karışımı ise kontrol olarak kullanılır. Lam yavaşça hareket ettirilerek 5 saniye kadar solüsyonların karışması sağlanır. Tavşan plazmasının ilave edildiği noktada bir çökelme gözlendiğinde kültür koagülaz pozitif olarak kabul edilir (Ünlütürk ve Turantaş, 1996). Tüp yöntemi: Koagülaz testi için seçilmiş tipik koloniler Nutrient Broth (NB) veya Brain Heart Infusion Broth (BHI) sıvı besiyerine inoküle edilerek 35-37 C de 18-24 saat inkübasyona bırakılır. İki adet küçük test tüpüne (10x75mm) 0,5 er ml tavşan plazması hazırlanmış 18-24 saatlik taze kültür ilave edilerek her iki tüpte 35-37 C de 4 saat inkübe edilir. Kültür ilave edilmeyen tüp kontrol olarak kullanılır. Koagülasyon genellikle 1-4 saat içerisinde meydana gelir. Ancak bu süre sonunda kültür koagülaz negatif reaksiyon verirse inkübasyona 24 saat devam edilir. Belirgin bir koagülüm oluşması kültürün koagülaz pozitif olduğunu gösterir (Ünlütürk ve Turantaş, 1996). 3.2.4.6. İstatistiksel Analiz Metodları Araştırmanın analizleri, üç tekerrürlü olarak yapılmış ve analiz sonuçlarının istatistiki değerlendirmesi, varyans analizleri SPSS statistic paket programında yapılmıştır.önemli bulunan varyasyon kaynakları DUNCAN testine tabi tutularak karşılaştırmaları yapılmıştır (Düzgüneş vd., 1983).
- 20-4. ARAŞTIRMA SONUÇLARI VE TARTIŞMA 4.1. Kimyasal Analiz Sonuçları Araştırılan dört farklı yöntem ve her bir yöntemin üçer tekerrürüne ilişkin örneklerin ortalama rutubet, kül, tuz, kum, asitlik analizlerine ilişkin parametreler Çizelge 6 da gösterilmektedir. Çizelge 6. Kimyasal Analiz Sonuçları (1) % Rutubet %Kül %Tuz %Kum %Asitlik Analizler Bez vakumsuz Bez vakumlu Prosesler Makine Vakumsuz Makine Vakumlu Ortalama 44,33 46,66 42,00 40,66 en düşük 43,75 44,35 40,26 40,08 en yüksek 44,91 48,97 43,73 41,24 ortalama 1,11 1,44 0,95 0,59 en düşük 0,65 0,98 0,49 0,13 en yüksek 1,57 1,9 1,41 1,05 ortalama 1,48 1,38 2,39 2,51 en düşük 1,34 1,24 2,25 2,37 en yüksek 1,61 1,51 2,53 2,65 ortalama 0,096 0,0833 0,137 0,163 en düşük 0,055 0,042 0,095 0,122 en yüksek 0,138 0,125 0,178 0,205 ortalama 6,66 8,33 4,66 5,66 en düşük 5,45 7,11 3,45 4,45 en yüksek 7,88 9,54 5,88 6,88 (1) : Sonuçlar, 3 tekerrürün ortalamasıdır. 4.1.1. Rutubet Değerleri (%) Yufka üretimi sırasında uygulanan aşamalar nedeniyle rutubet değerlerinde farklılıklar görülmektedir. Rutubet değerlerindeki farklılık sulama aşamasından kaynaklanmaktadır. Rutubet değerindeki farklılıklar, ürünün kimyasal ve mikrobiyolojik olarak bozulmasında önemli rol oynamaktadır. Rutubet değerleri değişimi Grafik 1 de gösterilmiştir.