Týp Araþtýrmalarý Dergisi 2004: 2 (3): 1-6 ARAÞTIRMA Enzimatik kanalostomi* (Glokom Tedavisinde Enzim: Deneysel Tavþan Modeli) Ahmet Demirok 1, Adnan Çinal 1, Serdar Uðraþ 2, Atilla Yazýcýoðlu 1, Gürkan Öztürk 3 1 Yüzüncü Yýl Üniversitesi Týp Fakültesi Göz Hastalýklarý Anabilim Dalý 2 Yüzüncü Yýl Üniversitesi Týp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalý 3 Yüzüncü Yýl Üniversitesi Týp Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalý, Van Özet Amaç: Enzimler oftalmolojide deðiþik amaçlarla kullanýlmaktadýr. Bu çalýþmada ise enzimlerle aközün dýþa akým yollarýnýn etkilenmesi ve böylece göz içi basýncýnýn düþüþünün saðlanmasý amaçlanmýþtýr. Gereç ve Yöntem: Çalýþmada 5mg pankreatin 0.2 ml çözelti olarak 5 adet tavþanýn sað göz ön kamaralarýna topikal anestezi ve sedasyon altýnda verildi. Enjeksiyonlar 26 gauge lik insülin enjektörleri ile korneadan yapýldý. Sol gözler kontrol grubu olarak alýndý. Sol gözlerede ayný yolla ve ayný miktar ringer laktat çözeltisi verildi. Daha sonra tüm tavþanlar hem klinik olarak hemde göz içi basýncý yönünden günlük olarak takip edildi. Göz içi basýnçlarý Perkins aplanasyon tonometresi ile ölçüldü. 2 hafta sonra gözlerden histolojik kesitler alýnarak enzim ile kontrol grubu gözler karþýlaþtýrýldý. Bulgular: Enjeksiyon sonrasý hem enzim, hemde ringer laktat verilen gözlerde göz içi basýncý arttý. Ancak enzim grubu gözlerde göz içi basýncý artýþý hem daha þiddetli (41.5 mmhg) hemde daha uzun * Bu çalýþma Yüzüncü Yýl Üniversitesi Bilimsel Araþtýrma Projeleri Baþkanlýðý tarafýndan 2000-TF-054 nolu münferit proje olarak desteklenmiþtir. Yazýþma Adresi: Doç. Dr.Ahmet Demirok YYÜ Týp Fakültesi Göz Hastalýklarý AD Van acinal@yyu.edu.tr süreli oldu. Bu ilk günlerdeki göz içi basýncý artýþýndan sonra enzim uygulanan gözlerdeki basýnç kontrol grubu gözlerden daha alt seviyelere indi ve bu düþüþ 2. haftaya kadar devam etti. Klinik olarak enzim grubu gözlerde ilk birkaç gün devam eden yoðun inflamatuvar reaksiyonlar geliþti ve daha sonra düzeldi. Yapýlan histolojik çalýþmalarda enzim uygulanan gözler ile kontrol grubu gözler arasýnda herhangi bir farklýlýk tespit edilemedi. Sonuç: Ýntrakameral enzim uygulamasý, normal göz içi tansiyonlu tavþalarda, göz içi dokularda çok önemli bir yan etkiye ve histolojik deðiþikliðe neden olmaksýzýn göz içi tansiyonunu düþürebilmektedir. Anahtar kelimeler: Tavþan, pankreatin, glokom Enzymatic canalostomy (Enzyme In Glaucoma Treatment: An Experimental Rabbit Study) Abstract Objective: The enzymes are used in ophthalmology for many years. The aim of this study was to determine the effects of enzymes on intraocular pressure in rabbit with normal intraocular tension. Methods: 0.2 ml pancreatin (5mg) solution was injected in to anterior camera in right eyes of 5 rabbits in the study. 26 Gauge insulin injectors were used for injections. 0.2 ml ringer lactate was injected also in to anterior camera in left eyes of rabbits and left eyes were assumed as controls. Intraocular pressures were measured daily with Perkins applanation tonometer. After 2 weeks postoperatively,
2 Enzimatik kanalostomi histological examinations were performed in eyes of enzyme and control groups. Results: After injections, intraocular pressures were increased in enzyme and control eyes. Intraocular pressure spikes were higher (41.5mmHg) in enzyme group than control group. After spikes, intraocular pressures in enzyme group were lower than controls up to 2 weeks. Severe inflammatory reaction was developed and regressed without any sequela in a few days in enzyme group after injections. There was no any histological difference between the enzyme and control groups. Conslusion: The application of intracameral pancreatin enzyme may decrease intraocular pressure in rabbit with normal intraocular tension without any permanent clinical and histological changes. Key words: Rabbit, pancreatin, glaucoma Primer açýk açýlý glokom toplumda %1-2 sýklýkta görülen ve görülme sýklýðý yaþla birlikte artan bir hastalýktýr. Glokom uygun ve yeterli tedavi edilmediði takdirde ciddi görme azlýðýna hatta körlüðe yol açabilmektedir. Bu gün yeni yeni antiglokomatöz ilaçlar ve yeni cerrahi metodlar kullanýlmasýna karþýlýk halen glokomun kolaylýkla tedavi edilebilen, her hastada istenilen sonucun alýnabildiði bir hastalýk konumunda olduðunu söylemek mümkün deðildir. Hastalarýn büyük bir kýsmýnda progresyonu kontrol altýna almak mümkünse de bazý olgularda hastalýk uygulanan tedavi yöntemlerine raðmen ilerlemektedir. Bu durum glokom tedavisinde yeni arayýþlarý beraberinde getirmektedir. Viskokanalostomi günümüzde glokom cerrahisinde gittikçe taraftar toplayan popüler yöntemlerden birisidir. Bu teknikle oldukça iyi sonuçlarýn alýndýðýný bildiren çalýþmalar mevcuttur. Ancak bu yöntemde de baþarý %100 deðildir. Gözde aközün dýþa akýmýna direnç en fazla Schlemm kanalýna komþu olan juxta-trabeküler bölgede olmaktadýr. Burada endotel hücreleri ile çevrili porlar ve kollajenden zengin bir ara madde bulunmaktadýr. Bilindiði gibi enzimler spesifik bir substrata, sonderece seçici ve oldukça hýzlý etki eden protein yapýsýnda maddelerdir. Enzimlerle belli dokularý eritip sývýlaþtýrmak ve göz içi sývýsýnýn çýkýþ kanallarýný etkilemek mümkündür. Bu çalýþmada enzimlerle aközün dýþa akým yollarýnýn etkilenmesi ve böylece göz içi basýncýnýn düþüþünün saðlanmasý amaçlanmýþdýr. Gereç ve Yöntem Çalýþma için önce enzimin viskokanalostomi yapýlarak Schlemm kanalýndan verilmesi planlandý. Bunun için öncelikle mikroskop altýnda tavþan gözü diseksiyonlarý yapýldý. Bunda amaç tavþan gözünde iridokorneal açýyý incelemek, insan ile tavþan arasýndaki benzerlik ve farklýlýklarý deðerlendirmekti. Üç adet tavþanýn ikiþer gözü enüklee edilerek ameliyat mikroskopu altýnda sabitlenerek incelendi. Bu incelemelerin hepsinde adi tavþan kullanýldý. Yapýlan incelemelerde tavþan iridokornean açýsýnýn insandan farklý olduðu izlendi. Buradaki en önemli ve çalýþmayý etkileyecek farklýlýk olarakta tavþanda insandaki gibi geniþ tek bir Schlemm kanalýnýn tespit edilemeyiþi oldu. Tavþanda tek ve geniþ bir kanal yerine çok sayýda küçük kanalcýklar mevcuttu. Tavþanda viskokanalostomi için tek büyük, belirgin bir kanalýn bulunamamasý üzerine metod olarak enzimin Schlemm kanalýndan verilmesi yerine ön kamaraya verilmesi planlandý. Enzim olarakta spesifik tek bir enzim yerine bir enzimler kompozisyonu olan Pankreatin (amilaz, tripsin, lipaz, ribonükleaz, proteaz gibi pankreatik enzimler içeren bir ekstrakt, Sigma Chemical Company) tercih edildi. Ancak enzim çözeltisi, enzim domuzdan ekstrakte edildiðinden dolayý tamamen eritildiðinde bile bazý organik partiküller içermekteydi. Enzim çözeltisi 100 ml PBS (fosfat buffer salin) çözeltisine 2.5 gr pankreatin enzimi eklenerek 25 mg/ml lik olarak hazýrlandý. Tüm cerrahi iþlemler ameliyat mikroskopu ile topikal damla anestezisi (proparakain hidroklorür %0.5) + sedasyon (4mg/kg Midazolam, intraperitoneal) saðlanarak gerçekleþtirildi. Enzim solüsyonu tavþanlarýn sað gözünün ön kamarasýna korneadan girilerek 26 gauge insülin enjektörüyle verildi. Enjeksiyon için limbustan 1 mm uzaktan girilerek kornea içinde tünel þeklinde ilerlendi, böylece enjeksiyon sonrasý dýþarýya sývý sýzýntýsýnýn minimal olmasý saðlandý. Tavþanlara 0.2 ml (5 mg enzim) enzim solüsyonu verildi. Tavþanlarýn sol gözlerine ise verilen enzim solüsyonu miktarý kadar ringer laktat çözeltisi verildi ve bu gözler kontrol grubu olarak kullanýldý. Tavþanlarýn enjeksiyon sonrasý rutin olarak her iki gözüne 1x1/gün %0.1 deksametazonlu pomat uygulandý. Göz içi basýncý ölçümünde Perkins aplanasyon tonometresi kullanýldý. Ölçümler enzim verilmeden ve verildikten sonra düzenli aralýklarla ayný kiþi tarafýndan yapýldý. Gözler göz içi tansiyonu, postoperatif inflamasyon, ön segment yapýlarýnýn durumu yönünden klinik olarak takip edildi. Sonuçta tavþanlar öldürülüp, ön segment yapýlarýndan kesitler alýnarak ýþýk mikroskopunda histolojik incelemeler yapýldý. Elde edilen veriler bilgisayara kaydedilerek deðerlendirildi. Bulgular Beþ tavþanýn 10 gözünün göz içi basýnçlarý ve diðer ön segment bulgularý enjeksiyon öncesi kaydedildi ve enjeksiyondan sonra takibe alýndý. Üç numaralý tavþanýn enzim uygulanan gözünde korneadan devamlý sýzýntý olmasý nedeniyle hipotoni geliþti. Bu nedenle bu
Enzimatik kanalostomi 3 Resim 1. Tavþan 1 in sað gözünün postoperatif enjeksiyondan hemen sonraki midriyatik görünümü. Resim 3. Tavþan 2 nin sað gözünün postoperatif 3. gün görünümü. Ön kamaradaki yoðun membran paartiküllerinin karýþýmý dikkati çekiyor. Postoperatif membran geliþimi en yoðun olarak bu gözde izlendi. Resim 2. Tavþan 1 in sað gözünün postoperatif 3. günü ön kamaradaki membran dikkati çekiyor. tavþana ait veriler çalýþma dýþý býrakýldý. Enjeksiyon sonrasý her iki gözlerdede göz içi basýncýnda artýþ ve midriyazis meydana geldi (Resim 1). Kontrol grubundaki göz içi basýnç artýþlarý hýzla düzelirken, enzim verilen gözlerdeki basýnç artýþlarý nispeten biraz daha uzun süre devam etti (Grafik 1-4). Enzim verilen gözlerde kontrol grubundan farklý olarak yoðun bir inflamasyon ve inflamatuvar membran geliþti (Resim 2,3). Ancak bu membranda verilen steroidin etkisiyle kýsa sürede ortadan kalktý. Kontrol grubu gözlerde enjeksiyon sonrasý göz içi basýncý 24.4 mmhg ye kadar yükselirken ayný deðer enzim verilen gözlerde 41.5mm Hg ye kadar yükseldi. Göz içi basýncý takibinde 1., 2., 5. tavþanlarýn göz içi basýnçlarý enzimli gözlerde, akut yükselme sonrasýnda, sürekli olarak kontrol göz içi basýnçlarýndan daha düþük deðerlerde kaldý. Göz içi basýncýndaki maksimum düþüþler 1.tavþanda 4.7mmHg (%30), 2.tavþanda 12mmHg (%69), 4.tavþanda 4.3mmHg (%23), 5.tavþan- Resim 4-5. Ýki farklý gözde enzim uygulanmýþ iridokorneal açý ve diðer ön segment yapýlarý normal olarak izleniyor. (Hematoksilen - Eozin sað X 10, sol X 20).
4 Enzimatik kanalostomi Grafik 1. Birinci tavþana ait göz içi basýncý deðiþimleri. Grafik 2. Ýkinci tavþana ait göz içi basýncý deðiþimleri. da ise 4.7mmHg (%23) olmak üzere ortalama 6.4mmHg (%36) idi. Ýkinci haftanýn sonuna doðru kontrol ve enzim gözlerinin basýnç deðerleri birbirine yaklaþtý. Göz içi basýncý takiplerinde genel olarak 2. hafta sonunda enzim ve kontrol gözlerinin göz içi basýnçlarý bir birine yakýn deðerlere geldiðinde, her tavþanýn iki gözünün kornea, iris ve iridokornean açýlarýnýn histolojik incelemeleri yapýldý. Yapýlan histolojik incelemelerde enzim ve kontrol gözleri çift-kör olarak deðerlendirildi. Enzim ve kontrol gözleri arasýnda kornea, iris ve iridokornean açý yapýlarý yönünden histolojik olarak bir farklýlýk tespit edilmedi (Resim 4,5). Tartýþma Biyoteknoloji ve gen mühendisliðinin geliþmesi ile týpta bir çok madde teþhis ve tedavi amaçlý olarak kullanýma girmiþtir. Enzimler bu amaçla kullanýlan maddelerin baþýnda gelmektedir. Týbbýn en hýzlý geliþen dallarýndan birisi olan oftalmolojide de enzimler kullaným alaný bulmuþtur. Alfa kimotripsin uzun yýllar katarakt cerrahisinde göz içinde kullanýlmýþ bir enzimdir. Hyaluronidaz ve kollajenaz ise vitrektomide ve vitre içi hemorajilerin tedavisinde kullanýmý son aþamaya gelmiþ bir enzimlerdir (1). Yine plazmin ve bu amaçla denenmiþ olan enzimlerdendir (2). Bunlarýn dýþýnda arka arka kapsül kesifliðini önlemek amacýyla da tripsin+ etilen diamintetraasetikasit kombinasyonu (3) ve proteaz gibi enzimler ve farklý konsantrasyonlarý kullanýlmýþtýr (4,5). Ýneklerde yapýlan çalýþmalarda trabeküler hücre membranýndaki sülfidril gruplarýnýn aköz dýþa akýmýna dirençte önemli rol oynadýðý ileri sürülmüþtür. Bununla baðlantýlý olarak yapýlan çalýþmalarda ön kamaraya iodoasetamid ve Nmalaimid verildiðinde bunlarýn sülfidril gruplarý ile kimyasal reaksiyona girerek aközün
Enzimatik kanalostomi 5 Grafik 3. Dördüncü tavþana ait göz içi basýncý deðiþimleri. Grafik 4. Beþinci tavþana ait göz içi basýncý deðiþimleri. dýþa çýkýþýný artýrdýðý gösterilmiþtir (6,7). Maymunlarda ön kamaraya mikrogram mertebesindeki dozlarda Sitoþalazin B veya D verildiðinde bunlarýn aktin flamentlerini parçalayarak dýþa çýkýþ kolaylýðýnýn 6 kata kadar arttýðý saptanmýþtýr (8,9). EDTA ve EGTA gibi þelatör ajanlarýnda sitoþalazinler gibi etki ederek dýþa çýkýþ kolaylýðýný artýrmaktadýrlar (10). Hem sitoþalazinlerin hemde þelatör ajanlarýn etkileri bu ajanlar ön kamaradan alýndýklarýnda normale dönmektedir. Morfolojik düzelme ise saatlar içinde baþlamakta ve bir hafta içinde tamamlanmaktadýr. Bu ajanlarýn kullanýlan dozlarda fizyolojik, biyomikroskopik ve histolojik, uzun süreli bir etkileri gösterilememiþtir (11). Ýnek gözünde intrakameral verilen hyaluronidaz ile yapýlan çalýþmalarda da aköz çýkýþýnýn arttýðý tespit edilmiþtir. Bu durum iridokornean açýdaki mukopolisakkaritlerin yýkýlmasýna baðlanmýþtýr (12). Maymunlarda ön kamaranýn 50 unite/ml lik alfakimotripsin ile infizyonu dýþa çýkýþ kolaylýðýný çok artýrmakta ve bu etki enzim ön kamaradan alýndýktan sonra saatlerce sürmektedir. Çýkýþ kolaylýðý EDTA ile artýrýlmakta, alfa-kimotripsin ile ise bu etki uzatýlmaktadýr (13). Öncelikle bu çalýþmada elde edilen en önemli sonuç, verilen pankreatin enzimi ile göz içi dokularda kalýcý herhangi bir istenmeyen hasar oluþmamýþtýr. Kornea, iris ve lenste kontrol grubuna göre farklý bir bulguya rastlanmamýþtýr. Bu da enzimlerin en azýndan tavþanlarda kullandýðýmýz dozlarda güvenli olabileceðini göstermiþtir. Pankreatin enzimi göz içi basýncýnda terapötik seviyelerde önemli düþüþler saðlamýþtýr. Çalýþmanýn önemli verilerinden birisi de enzim ile saðlanan göz içi basýncý düþüþünün süresidir. Verilen enzim ile 12 günü aþan bir süre ile göz içi basýncý düþüklüðü saðlanmýþtýr. Pancreatin enzimi verilmesi sonrasýnda gözlerde yoðun inflamatuvar reaksiyon görülmüþtür. Bunun en önemli sebebinin enzim çözeltisinde bulunan partiküller olduðunu düþünüyoruz. Çözelti içinde bulunan organik
6 Enzimatik kanalostomi partiküller gözlerde izlenen reaksiyona yol açmýþ olabilirler. Daha saf enzim materyallerinin kullanýlmasý inflamatuvar reaksiyonlarý çok aza indirebilecektir. Çalýþmamýzýn bir zayýf noktasý normal yani glokomu olmayan gözlerde yapýlmýþ olmasýdýr. Ancak normal gözlerde bile göz içi basýncý düþüþü saðlayabilen bir ilaç glokomlu gözlerde daha belirgin olarak etki edebilecektir. Bizim çalýþmamýzdada ýþýk mikroskopu düzeyinde yapýlan histolojik çalýþmalarda büyük büyütme (200 büyütme) alanlarýnda bile kontrol grubu gözlere göre bir farklýlýk tespit edemedik. Bu durumda meydana gelen göz içi basýncý düþüþünü iki þekilde açýklayabiliriz. Ya oluþan mikroskopik doku deðiþiklikleri (doku lifleri arasýndaki mesafenin artmasý, porlarýn geniþlemesi vb) kesitlerin histolojik incelenesi için gereken rutin hazýrlýk iþlemleri sýrasýnda deðiþikliðe uðramaktadýr. Yani dokunun formolde uzun süreli bekletilmesi, dokudan çok ince kesit alýnmasý gibi dokuyu kimyasal ve mekanik olarak travmatize eden iþlemler, enzimin oluþturduðu mikroskopik deðiþiklikleri maskelemektedir. Çünkü daha önce yapýlan çalýþmalarda formol uygulamasýnýn doku kalýnlýðýný deðiþtirdiði gösterilmiþtir. Yada ikinci açýklama olarak enzimin göz içi basýncýný düþürme etkisi sub-selüler düzeydedir ve bu nedenle ýþýk mikroskopu ile herhangi bir farklýlýk saptanamamaktadýr. Bununla birlikte bu ajanlarýn, açý yapýlarýnda hücre iskeletini deðiþtirdiði, hücre birleþimlerini, kontraktil proteinleri, veya ekstrasellüler matriksi etkileyerek enzimatik kanalostomiye, farmakolojik trabekülektomiye veya trabekülumda temizlenmeye yol açtýklarýný düþünmekteyiz. Bu nedenle bu deðiþikliklerin deðerlendirilebilmesi için doku yapýsýný travmatize etmeyen preparat hazýrlýk yöntemleri ile hücresel ve hücre-altý deðiþikliklerin incelenebildiði elektron mikroskopisi çalýþmalarýna ihtiyaç vardýr. Kaynaklar 1. Boyer DS, Thomas EL, Novack RL. Intravitreal injection of ACS-005 Hyaluronidase produces clearing of vitreus hemorrhage. Invest Ophthalmol Vis Sci 39:971, S208, 1998. 2. Hesse L, Chofflet J, Kroll P. Tissue plasminogen activator as a biochemical adjuvant in vitrectomy for proliferative diabetic vitreoretinopathy. German Journal of Ophthalmol. 4:323-327, 1995. 3. Humphry RC, Davies EG, Jacob TJ, Thompson GM. The human anterior lens capsule-an attempted chemical debridement of epithelial cells by ethylenediaminetetracetic acid (EDTA) and trypsin. Br J Ophthalmol. Jun;72(6):406-8, 1988. 4. Nishi O, Nishi K, Hikida M. Removal of lens epithelial cells following loosening of the junctional complex. J Cataract Refract Surg. Jan;19(1):56-61, 1993. 5. Nishi O, Nishi K, Hikida M. Removal of lens epithelial cells by dispersion with enzymatic treatment followed by aspiration. Ophthalmic Surg. Aug;22(8):444-50, 1991. 6. Epstein DL, Hashimoto JM, Anderson PJ, Grant WM. Effect of iodoacetamide perfusion on outflow facility and metabolism of the trabecular meshwork, Invest Ophthalmol Vis Sci 20:625, 1981. 7. Epstein DL, Patterson MM, Rivers SC, Anderson PJ. Netylmaleimide increases the facility of aqueous outflow of excised monkey and calf eyes, Invest Ophthalmol Vis Sci 22:752, 1982. 8. Johnstone M, Tanner D, Chau B, Kopecky K. Concentration dependent morphologic effects of cytochalasin B in the aqueous outflow system, Invest Ophthalmol Vis Sci 19:835, 1980. 9. Kaufman PL. Non-additivity of maximal pilicarpine and cytochalasin effects on outflow facility, Exp Eye Res 44:283, 1987. 10. Bill A, Lütjen-Drecoll E, Svedbergh B. Effects of intracameral Na2 EDTA and EGTA on aqueous outflow routes in the monkey eye, Invest Ophthalmol Vis Sci 19: 462, 1980. 11. Svedbergh B, Lütjen-Drecoll E, Ober M, Kaufman PL. Cytochalasin B-induced structural changes in the anterior ocular segment of the cynomolgus monkey, Invest Ophthalmol Vis Sci 17:718, 1978. 12. Barany EH, Scotchbrook S. Influence on testicular hyaluronidase on the resistance to flowthrough the angle of the anterior chamber, Acta Physiol Scand 30: 240, 1954. 13. Bill A. Effects of Na2 EDTA and alpha-chymotypsin on aqueous humor outflow conductance in monkey eyes, Ups J Med Sci 85: 311, 1980.