Yemekhane Atýklarýndan Fermantasyonla Laktik Asit Üretimi

Ekoloji 20, 80, 42-50 (2011) doi: 10.5053/ekoloji.2011.806 Yemekhane Atýklarýndan Fermantasyonla Laktik Asit Üretimi Didem OMAY 1*, Yüksel GÜVENÝLÝR 2 1Yalova Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Kimya ve Süreç Mühendisliði Bölümü, 77100, Yalova-TÜRKÝYE 2Ýstanbul Teknik Üniversitesi, Kimya Metalurji Fakültesi, Kimya Mühendisliði Bölümü, 34769, Maslak, Ýstanbul-TÜRKÝYE *Corresponding author: domay@yalova.edu.tr Özet Biyoteknolojinin geliþimine paralel olarak fermantasyon ile organik ve biyokimyasal maddelerin üretimi çaðýmýz teknolojisinin en güncel konularý arasýnda yer almaktadýr. Çeþitli sanayi dallarýnda geniþ kullaným alanlarý bulunan organik çözücüler, antibiyotikler, enzimler gibi pekçok kimyasal madde ve sitrik asit, laktik asit, fumarik asit, malik asit ve salisilik asit gibi besin, ilaç, kimya, tekstil, plastik, kozmetik ve kaðýt endüstrilerinde kullanýlan birçok organik asit de fermantasyon yolu ile üretilebilmektedir. Bu çalýþmada yemekhane atýklarýndan fermantasyon yoluyla L(+) laktik asit üretilmiþ ve üretim prosesi için en yüksek konsantrasyonda laktik asit üretimine imkan veren koþullar tespit edilmiþtir. Sunulan çalýþmada yemekhane atýðý olarak seçilen makarna-süt ve pilav-bezelye-salata karýþýmýndan Lactobacillus casei bakterisi ile laktik asit üretiminde kesikli sistem için bazý proses deðiþkenleri tespit edilmiþtir. L. casei kültürü ile yapýlan laktik asit fermantasyon çalýþmalarý verilerinden, ph deðeri 6.0, fermantasyon sýcaklýðý 45 C, karýþtýrma hýzý 160 rpm olduðu durumda, makarna-süt ve pilav-bezelye-salata olarak belirlenen besiyerlerinden sýrasýyla 42,16 g/l ve 41,56 g/l miktarýnda laktik asit %80 ve %83 dönüþüm verimleri ile elde edilmiþtir. Anahtar Kelimeler: Fermantasyon, laktik asit, L. casei, yemekhane atýðý. Lactic Acid Fermantation from Refectory Waste Abstract In parallel with the development of biotechnology, the production of organic and biochemical substances by fermentation process is one of the most current issue of our age's technology. Many chemical substances widely used in various industrial fields, such as organic solvents, antibiotics and enzymes that are produced by microorganisms in fermentation processes. Many common organic acids such as citric acid, lactic acid, fumaric acid, malic acid and salicylic acid used in food, pharmaceutical, chemical, textile, plastics, cosmetics and paper industries can be produced by fermentation. In the present study, L(+) lactic acid was produced from refectory wastes through fermentation process and fermentation process was optimized for the maximum lactic acid yield. Process variables for batch system were optimized for the production of lactic acid from pretreated macaroni-milk and rice-green pea-salad broths by L. casei culture. For the fermentation of the macaroni-milk and rice-green pea-salad broths with L. casei culture, 42.16 g/l and 41.56 g/l lactic acid were obtained with 80% and 83% conversion efficiency when medium ph was set to 6.0, temperature was held at 45 C, agitated at 160 rpm. Keywords: Fermantation, lactic acid, L. casei, refectory waste. Omay D, Güvenilir Y (2011) Yemekhane Atýklarýndan Fermantasyonla Laktik Asit Üretimi. Ekoloji 20 (80): 42-50. GÝRÝÞ Günümüzde biyoteknolojinin sürekli yeni arayýþlar ve mevcut prosesleri geliþtirme çabasý içersinde olmasý nedeniyle, fermantasyon yoluyla yapýlan üretimler hýzlanmýþtýr. Endüstriyel üretimde, fermantasyonda seçilecek besiyeri ve bileþenleri, üretimi önemli ölçüde etkilemektedir. Melas, pirinç kabuðu, buðday kepeði, sebze ve meyve atýklarý gibi ekonomik deðeri düþük ancak mikroorganizmalar için karbon kaynaðý bakýmýndan zengin olan maddeler fermantasyon prosesleri için oldukça avantajlýdýr (Karovicova ve ark. 2002, Yakupoglu ve Peksen 2011). Bunlarýn yanýnda, karbon kaynaðý olarak kullanýlan birçok ham ve atýk madde mikroorganizmalarýn yaþamalarý için gerekli enerji ve besini saðlarken, çeþitli kentsel, tarýmsal ve endüstriyel atýklarýn bu amaçla kullanýlmasý çevre kirliliðinin önlenmesine de yardýmcý olmaktadýr (Güvenç ve Harsa 1986, Goren ve Esen 2010). Dünyadaki toplam laktik asit üretiminin %90'ý Geliþ: 24.08.2010 / Kabul: 20.07.2011 42

Yemekhane Atýklarýndan Fermantasyonla Laktik Asit Üretimi bakteriyel fermantasyonla, geri kalan %10'luk oraný ise sentetik olarak laktonitrilin hidrolizinden üretilmektedir. Fermantatif üretimde, izomerlerden sadece birini üreten laktik asit bakteri nesli seçildiðinde, optikçe saf ürün elde edilebilirken, sentetik üretimde ise her zaman laktik asidin rasemik karýþýmýnýn elde edilmesi önemli bir dezavantajdýr. Fermantasyon kaynaðý olarak ucuz karbonhidratlarýn seçilmesi, fermantasyon proseslerinin kimyasal sentez prosesleriyle rekabetinde bir adým daha öne geçmesini saðlamaktadýr (Zhang ve ark. 2007). Laktik asit üretimi için çok sayýda karbonhidrat ve azotlu maddeler substrat olarak seçilebilir. Araþtýrmalar, yüksek laktik asit verimi, optimum biyokütle üretimi, ihmal edilebilir yan ürün oluþumu, yüksek fermantasyon hýzý, daha az ön muamele, düþük maliyet, kolay elde edilebilirlik gibi özellikler temel alýnarak substrat seçiminin yapýldýðýný bildirmektedir. Buna göre, laktik asit fermantasyonunda substrat seçimi; substratýn fiyatýna, ön iþlem gerektirip gerektirmediðine, kolay fermente olup olamayacaðýna, kullanýlacak mikroorganizmaya ve istenilen ürüne baðlý olarak yapýlmaktadýr (Narayanan ve ark. 2004). Günümüzde ticari laktik asit üretiminde en çok rafine sakkaroz içeren sentetik ortam, hidrolize niþastadan elde edilen maltoz ve dekstroz, laktoz içeren peynir altý suyu, sakkaroz içeren pancar ve kamýþ melasý kullanýlmaktadýr (Vick Roy 1985). Süt ürünleri ve yaðlý tohumlar, alkollü ve alkolsüz içecekler, sebze ve meyveler, et ve balýk ürünleri, hububat bazlý ürünler fermantasyon substratlarý olarak kullanýlabilirler (Vaidya ve ark. 2005). Bu çalýþmada, Ýstanbul Teknik Üniversitesi Saðlýk, Kültür ve Spor Daire Baþkanlýðý Yemek Ýþletmeleri'nden temin edilen yemekhane atýklarýndan L. casei kullanýlarak fermantasyonla L-laktik asit üretimi gerçekleþtirilmiþtir. Literatür çalýþmalarý incelendiðinde, yemekhane atýklarýndan laktik asit üretimine ait bir çalýþmanýn varlýðý tespit edilemediðinden çalýþma bilimsel açýdan bir özgünlük taþýmaktadýr. Ayrýca, yemek atýklarýnýn doðrudan atýk muamelesi görmesi dýþýnda, bu sistemle geri dönüþüme katkýda bulunmasý hem endüstriyel hem de çevresel ve ekonomik açýlardan bir yenilik teþkil etmektedir. MATERYAL VE METOT Materyal Çalýþmada yemekhane atýklarý, Ýstanbul Teknik Ekoloji Üniversitesi Saðlýk, Kültür ve Spor Daire Baþkanlýðý Yemek Ýþletmeleri'nden, deneylerde kullanýlan L. casei Alman DSMZ firmasýndan, MRS broth ve MRS agar Merck firmasýndan, Bovine serum albumin, maya ekstratý, CH 3 COONa.3H 2 O ve CaCO 3 Sigma'dan temin edildi. Çalýþmada kullanýlan tüm kimyasallar analitik saflýktadýr. Metot Laktik asit bakterilerinin hazýrlanmasý Çalýþmada kullanýlan mikroorganizmalar MRS besiyerinde geliþtirildi. Steril koþullarda, liyofilize suþ sývý besiyeriyle seyreltilerek katý besiyerlerine azaltma yöntemiyle ekildi ve 37 C'de anaerobik koþullarda 72 saat süreyle inkübe edildi. Petriler incelenerek tek olarak düþen koloni belirlendi, saf olan bu koloni eðri besiyerlerine tekrar ekim yapýlarak çoðaltýldý. Yemekhane atýklarýnýn sakkaroz miktarlarýnýn belirlenmesi Yemekhane atýklarýnýn indirgen þeker miktarlarý DNS (dinitrosalisilik asit) yöntemine göre, toplam þeker oraný ise Fenol- Sülfirik Asit yöntemine göre tayin edildi (Göksungur 1998). Laktik asit fermantasyonu Çalýþmada kullanýlan mikroorganizmalar MRS besiyerinde geliþtirildi. ÝTÜ Yemek Ýþletmeleri'nden elde edilen yemekhane atýklarý belirli sakkaroz oranlarýna seyreltildikten sonra maya ekstratý ilave edilerek otoklavda 1,02 atm basýnçta, 121 C'de 15 dakika boyunca steril edildi. Laktik asit üretiminde kullanýlan mineral maddeler ve CaCO 3 ayrý olarak steril edilip fermantasyon iþlemi esnasýnda sisteme ilave edildi. Kesikli sistemde gerçekleþtirilen fermantasyon iþleminde, içlerinde fermantasyon ortamlarý bulunan ve anaerobik þartlar saðlanmýþ olan erlenler çalkalamalý su banyosunda 37 C'ye gelinceye kadar bekletildi. Sývý besiyerinde homojen þekilde üremiþ bakteri kültüründen, içersinde sývý atýk besiyeri bulunan erlenlere farklý aþý konsantrasyon oranlarýnda olacak þekilde bakteri inoküle edildi. En yüksek deðerdeki laktik asit miktarýnýn elde edilebilmesi amacýyla, fermantasyon iþlemi farklý sýcaklýk deðerlerinde, deðiþik çalkalama hýzlarýnda gerçekleþtirildi. 2-36 saat arasýnda belirli aralýklarla alýnan numuneler 5000 rpm'de, 10 dakika santrifüj edildikten sonra süpernatant alýnarak laktik asit tayini yapýldý (Tan ve Ding 2006). Fermantasyon deneylerinin tümü üç tekrarlý olacak þekilde yapýlmýþtýr ve elde edilen sonuçlar deðerlendirilirken elde edilen sonuçlarýn ortala- 43

Ekoloji Omay ve Güvenilir malarý alýnmýþtýr. Laktik asit tayini Örneklerdeki laktik asit miktarlarý HPLC ile ölçüldü. Numuneler analiz edilmeden önce santrifüjlenerek mikrofiltreden geçirildi ve Agilent 1100 Series HPLC'de incelendi (Hujanan ve ark. 2001). BULGULAR Yemekhane atýklarýnýn sakkaroz miktarlarýnýn belirlenmesi Çalýþmalarda kullanýlan yemekhane atýklarýnýn kimyasal bileþimi Tablo 1'de verilmiþtir. Fermantasyon iþleminde kullanýlan makarna-süt ortamýnýn kuru madde içeriði %85,48, pilav-bezelye-salata içerikli fermantasyon ortamýnýn kuru madde içeriði ise %88,29 olarak bulunmuþtur. Fermantasyon ortamlarýnýn ph deðerleri laktik asit bakterilerinin çalýþmasýna imkan verecek düzeye getirilmiþ ve baþlangýç aþamasýnda 6,0 olarak ayarlanmýþtýr. Toplam þeker miktarlarý ise sýrasýyla %56,37 ve %61,38 olarak tespit edilmiþtir. Denemelerde kullanýlan yemekhane atýklarýnýn indirgen þeker miktarlarý makarna-süt ve pilav-bezelye-salata fermantasyon ortamlarý için sýrasýyla 0,33 ve 0,47 olarak saptanmýþtýr. Toplam þeker (invert þeker + sakkaroz) miktarlarýndan numunelerdeki sakkaroz miktarlarýna geçilirken, 1,0 mol sakkarozun inversiyon sýrasýnda 1,0 mol su almasý ve 95 g sakkarozdan 100 g invert þeker oluþmasýndan dolayý, toplam þeker miktarý ile indirgen þeker miktarý arasýndaki fark 0,95 ile çarpýlmýþtýr. Makarna süt ortamýna ait sakkaroz miktarý 53 g/l ve pilavbezelye-salata ortamýna ait sakkaroz miktarý ise, 58 g/l olarak hesaplanmýþtýr. L. casei ile fermantasyonla laktik asit üretimi boyunca ph deðiþiminin incelenmesi L. casei ile makarna-süt karýþýmýndan oluþan fermantasyon ortamýnda 37 C'de 120 rpm karýþtýrma hýzýnda, laktik asit üretiminde baþlangýç sakkaroz miktarý 53 g/l (makarna-süt) olduðu durumda ortam ph'sýndaki deðiþim Þekil 1'de gösterilmiþtir. Makarna- süt besiyeri kullanýlarak gerçekleþtirilen fermantasyon iþlemi boyunca ph deðiþimi incelendiðinde, ilk 24 saatlik süre boyunca ph deðerinin 5.0'in altýna inmediði saptanmýþtýr. L. casei ile pilav-bezelye-salata (58 g/l) ile yapýlan fermantasyonda, ortam ph'sýnýn deðiþimi incelendiðinde ise diðer besiyeri ile çalýþýldýðýnda alýnan sonuçlara paralel olarak, ilk 24 saatte ortam ph'sýnýn 4'ün altýna düþmediði tespit edilmiþtir (Þekil 1). 44 Tablo 1. Selevir Baraj Gölü su kalitesi parametrelerinin yýllýk ortalama deðerleri. Þekil 1. Lactobacillus casei ile makarna-süt ve pilav-bezelyesalata karýþýmýndan laktik asit eldesinde ortam ph'sýnýn deðiþimi. L. casei ile fermantasyonla laktik asit üretimine CaCO 3 miktarýnýn etkisi Ortam ph'sýnýn tamponlanmasý için sisteme ilave edilecek olan CaCO 3 oranýnýn bulunmasý için, sýcaklýk kontrollü çalkalamalý inkübatörde, 53 ve 58 g/l sakkaroz içeren besiyerlerinde 37ºC'de, ph 6,0'da, 24 saat boyunca, %4 aþý konsantrasyonu kullanýlarak ortamdaki toplam substrat miktarýnýn %0.5, %1, %2, %3, %5 ve %10 (aðýrlýk/hacim) oranlarýnda CaCO 3 ilavesiyle laktik asit üretimi gerçekleþtirilmiþtir. Fermantasyon ortamlarýna tampon vazifesi görmesi amacýyla yapýlan CaCO 3 ilavesi ile en yüksek konsantrasyonda laktik asit üretimine imkan verecek olan miktarýnýn tespiti Þekil 2'de gösterilmektedir. Her iki besiyeri için de %5 ve %10 (aðýrlýk/hacim) oranlarýnda CaCO 3 ilavesi ile yapýlan fermantasyonla laktik asit eldesi deneylerinde makarna-süt ve pilav-bezelye-salata ortamlarý için sýrasýyla 42 g/l ve 44 g/l; 43 g/l ve 46 g/l deðerlerinde laktik asit elde edilmiþtir. L. casei ile fermantasyonla laktik asit üretiminde ph deðerinin etkisinin incelenmesi L. casei ile makarna-süt içerikli olarak hazýrlanmýþ fermantasyon ortamýnda, en yüksek konsantrasyonda laktik asit üretimi için uygun ph'nýn bulunmasý amacýyla, 45 C'de, 53 g/l substrat konsantrasyonunda, 4,0, 5,0, 6,0 ve 7,0 ph deðerlerinde fermantasyon deneyleri yapýlmýþtýr.

Yemekhane Atýklarýndan Fermantasyonla Laktik Asit Üretimi Ekoloji L. casei kültürünün yapýsýndaki aminopeptidaz tipi enzimin, ph stabilitesi 4,0 ile 7,0 aralýðýnda ve kültürün içersinde bulunduðu ortamýn ph deðeri 6,5 ile 7,0 arasýndayken maksimum substrat dönüþümü yapabildiðinden daha yüksek ph deðerleri ile çalýþma yapýlmamýþtýr. Þekil 3'de görüldüðü gibi, ph 4,0'de gerçekleþtirilen fermantasyonda, laktik asit miktarý son derece düþüktür (8 g/l -15 g/l aralýðýndadýr). L. casei'nin optimum çalýþma koþullarý ph 5,0-6,5 arasýnda olduðundan ph 4.0'deki asitlik mikroorganizmayý inhibe etmiþ ve mikroorganizmanýn yapýsýnda bulunan L-laktaz dehidrojenaz enzimi düþük ph deðerlerinde aktivite gösterememiþtir. ph arttýrýldýðýnda özellikle 6,0 ve 7,0'ye çýkarýldýðýnda, fermantasyonun son 10 saati boyunca laktik asit üretim miktarýnýn sabit kaldýðý gözlenmiþtir. ph 6,0 için, 36 saatlik fermantasyon sonunda, 45,12 g/l laktik asit, %85 dönüþüm verimi ve 1,25 g/l.saat hacimsel verimlilik deðeri ile oluþurken, ph 7.0 için, 44,27 g/l laktik asit, %83,5 dönüþüm verimi ile ve 1,23 g/l.saat hýzla elde edilmiþtir. ph 6,0 ve 7,0 için elde edilen bu sonuçlar, çalýþýlan fermantasyon koþullarýnda mikroorganizmanýn baþlangýç ortamýnda bulunan substratý tamamen kullanmýþ olmasý ile açýklanabilir. Pilav-bezelye-salata besiyeri için de benzer durum söz konusudur (Þekil 4). ph 4,0'de laktik asit miktarý düþükken, ph'ýn 7,0'ye çýkarýlmasý ile 36 saat sonunda ürün miktarýnda 16,49 g/l'den 54,16 g/l deðerine bir artýþ saptanmýþtýr. ph 7,0'de laktik asit dönüþüm verimi %93, hacimsel verimlilik deðeri ise, 1,5 g/l.saat olarak hesaplanmýþtýr. ph'nýn 6,0 olduðu durumda 36 saat sonunda 51,77 g/l laktik asit, %89 dönüþüm verimi ile sentezlenmiþtir. L. casei ile fermantasyonla laktik asit üretiminde sýcaklýk etkisinin incelenmesi Makarna-süt ve pilav-bezelye-salata besiyerlerinden fermantasyonla laktik asit üretiminde optimum sýcaklýðýn bulunmasý için çalkalamalý inkübatörde 30, 40, 45 ve 50 C'de, ph 6,0'da ve 36 saat süresince laktik asit sentezlenmiþtir. Makarna-süt besiyeri ile yapýlan fermantasyon prosesine sýcaklýðýn etkisinin belirlenmesine ait deneysel sonuçlar Þekil 5'de gösterilmiþtir. Þekil 5'den de görüldüðü gibi, 53 g/l deðerinde sakkaroz içeren besiyerinde, farklý sýcaklýklarda yapýlan fermantasyon deneylerinde, en yüksek miktarda laktik asidin oluþtuðu sýcaklýk 45 C olarak tespit edilmiþtir. 45 C'de, 49,54 g/l laktik asit, Þekil 2. Lactobacillus casei ile farklý ortamlarda fermantasyonla laktik asit üretimine CaCO 3 miktarýnýn etkisi. Þekil 3. Farklý ph deðerlerinde Lactobacillus casei ile makarna-süt fermantasyon ortamýnda laktik asit üretimi. Þekil 4. Farklý ph deðerlerinde Lactobacillus casei ile pilavbezelye- salata fermantasyon ortamýnda laktik asit üretimi. Þekil 5. Farklý sýcaklýklarda Lactobacillus casei ile makanasüt fermantasyon ortamýnda laktik asit üretimi. 45

Ekoloji Omay ve Güvenilir %93,47 dönüþüm verimi ve 1,37 g/l.saat hacimsel verimlilik deðeri ile elde edilmiþtir. 50 C'de de paralel sonuçlar bulunmuþtur. 36 saat sonunda 42,18 g/l laktik asit, %79,5 dönüþüm verimi ile fermente edilmiþtir. Makarna-süt besiyeri için yapýlan deneysel çalýþmalara benzer iþlemler pilav-bezelyesalata fermantasyon ortamý için de tekrarlanmýþtýr. 58 g/l sakkaroz içeren fermantasyon ortamýndan laktik asit üretiminde, maksimum verimle laktik asidin sentezlendiði sýcaklýk 45 C'dir. Bu sýcaklýk deðerinde 36 saatlik fermantasyon sonucunda, 51 g/l laktik asit elde edilmiþtir. Bu deðere tekabül eden, üretim verimi %88 ve hacimsel verimlilik deðeri ise 1,41 g/l.saat olarak hesaplanmýþtýr (Þekil 6). L. casei ile fermantasyonla laktik asit üretimine karýþtýrma hýzýnýn etkisi L. casei ile iki farklý ortamdan laktik asit fermantasyonunda, karýþtýrma hýzýnýn etkisinin saptanmasý için sýcaklýk kontrollü çalkalamalý inkübatörde 45 C sýcaklýkta, 53 g/l (makarna-süt) ve 58 g/l (pilav- bezelye- salata) sakkaroz içeren besiyerleri ile ph 6,0'da, 30 saat süreyle 80, 100, 120, 160 ve 200 rpm karýþtýrma hýzlarýnda deneyler yapýlmýþtýr. Þekil 7'de görüldüðü gibi 53 g/l sakkaroz içeren fermantasyon ortamý için 80, 100, 120, 160 ve 200 rpm'de elde edilen laktik asit miktarlarý sýrasýyla 24,88, 32,82, 38,75, 42,16 ve 44,78 g/l olup, en yüksek laktik asit üretimi 160 ve 200 rpm karýþtýrma hýzlarýnda elde edilmiþtir. 160 ve 200 rpm karýþtýrma hýzlarýnda elde edilen dönüþüm verimi deðerleri, baþlangýç substrat miktarýnýn tamamýnýn tüketilmiþ olmasýndan dolayý sýrasýyla %80 ve %83 olarak tespit edilmiþtir. 58 g/l sakkaroz içerikli ortam için 160 ve 200 rpm'de elde edilen laktik asit miktarlarý sýrasýyla, 41,56 ve 42,82 g/l deðerinde olup, bu üretim hýzlarýna tekabül eden efektif hacimsel verimlilik deðerleri sýrasýyla, 1,38 g/l.saat ve 1,42 g/l.saat olarak hesaplanmýþtýr. 160 ve 200 rpm'de elde edilen üretim miktarlarý 41,56 ve 42,82 g/l olduðu için, diðer ön denemelerin gerçekleþtirildiði 160 rpm karýþtýrma hýzýnda çalýþýlmaya devam edilmiþ ve fermantasyon çalýþmalarý bu karýþtýrma hýzýnda gerçekleþtirilmiþtir. L. casei ile fermantasyonla laktik asit üretiminde substrat konsantrasyonunun etkisi Makarna-süt ve pilav-bezelye-salata karýþýmýndan oluþan iki farklý besiyerinden laktik asit fermantasyonunda, substrat konsantrasyonunun etkisini incelemek amacýyla, 10, 25, 42, 60 ve 100 g/l 46 Þekil 6. Farklý sýcaklýklarda Lactobacillus casei ile pilavbezelye- salata fermantasyon ortamýnda laktik asit üretimi. Þekil 7. Farklý karýþtýrma hýzlarýnda Lactobacillus casei ile makarna süt ve pilav- bezelye- salata fermantasyon ortamýnda laktik asit üretimi. sakkaroz içeren besiyerleri hazýrlanarak, 45 C'de, 160 rpm'de ve ph 6.0'da 20 saat fermantasyon yapýlmýþtýr. Yapýlan deneyler sonucunda, makarnasüt besiyerinde, substrat konsantrasyonu arttýkça elde edilen laktik asit miktarýnýn arttýðý, belli bir deðerden sonra ise azaldýðý görülmüþtür. 10, 25, 42, 60 ve 100 g/l sakkaroz içeren üretim ortamlarýnda sýrasýyla 12,3; 26,99; 38,46; 17,9 ve 19,1 g/l laktik asit elde edilmiþtir (Þekil 8). Bu deðerlere tekabül eden efektif verim deðerleri ise sýrasýyla %23, %51, %72,5, %33,7 ve %36,0'dýr. En yüksek efektif verim deðerleri olan %51 ve %72,5, 25 g/l ve 42 g/l baþlangýç substrat konsantrasyonlarýnda elde edilirken en yüksek laktik asit üretimi 42 g/l substrat konsantrasyonunda elde edilmiþtir. Sakkaroz konsantrasyonu 53 g/l olan makarna-süt besiyerinin doðrudan kullanýlmasý ile yapýlan fermantasyon sonucunda oluþan laktik asit miktarý 42,16 g/l olarak tespit edilmiþtir ve bu durum göstermektedir ki, orijinal substrat konsantrasyonundan daha yüksek konsantrasyon deðerlerinde, belirgin bir inhibitör etki bulunmaktadýr. Pilav-bezelye-salata besiyeriyle yapýlan fermantasyonda substrat konsantrasyonunun etkisinin

Yemekhane Atýklarýndan Fermantasyonla Laktik Asit Üretimi Ekoloji incelenmesi amacýyla diðer besiyerinde uygulanan iþlemler tekrarlanmýþtýr. Optimum substrat konsantrasyonunun tespitine iliþkin deneysel sonuçlar Þekil 9'da sunulmuþtur. Yapýlan deneysel çalýþmalar sonucunda, baþlangýç substrat konsantrasyonu arttýkça oluþan laktik asit miktarýnýn da arttýðý ancak yüksek baþlangýç konsantrasyonu deðerlerinde (100 g/l sakkaroz oranýnda) ürün oluþumunun belirgin bir þekilde azaldýðý saptanmýþtýr. 20 saatlik fermantasyon süresinde, 42 g/l sakkaroz içeren pilav-bezelya-salata besiyerinde, maksimum laktik oluþumu 38,12 g/l deðerinde olup, bu noktada efektif verim %90,1, hacimsel verimlilik ise 1,908 g/l.saat olarak hesaplanmýþtýr. Pilav-bezelye-salata ortamý için de doðrudan 58 g/l konsantrasyonunda sakkaroz içeren atýk substrat olarak kullanýldýðýnda, elde edilen laktik asit miktarý 41,56 g/l olup, makarna-süt ortamý ile tespit edilen fermantatif geliþime paralellik olduðu görülmüþtür. Daha yüksek konsantrasyonlarda inhibisyon etkisi tespit edilmiþtir. TARTIÞMA Fermantasyon iþlemi boyunca ph deðiþiminin etkisi Makarna-süt ve pilav-bezelye-salata fermantasyon ortamlarý kullanýlarak yapýlan laktik asit üretim prosesinde, iþlem boyunca ph deðiþimi incelendiðinde, her iki besiyeri için de, ilk 24 saatlik süre boyunca ph deðerinin 4,0'in altýna inmediði saptanmýþtýr. ph'nýn bu seviyesi, belirtilen süre içersinde kültürün iþlevini yerine getirmesine imkan verdiðinden, laktik asit üretiminin devamýnýn söz konusu olduðu düþünülmektedir. L. casei ile fermantasyonla laktik asit üretiminde, fermantasyonun baþlangýç sürelerinde laktik asidin üretilmeye baþlamasýyla beraber, eþit oluþum hýzýyla formik asit de oluþmaya baþlar. Laktik asit oluþumu fermantasyon süresince arttýðýnda, ph deðeri 5,0 ve altýna düþerse uçucu asitlerin varlýðý belirginleþir. Yapýlan bu çalýþmada, kullanýlan besiyerlerinin içeriði ve bu besiyerlerinin kullanýlan kültür ile uyumu iyi olduðundan fermantasyon iþlemi esnasýnda uçucu asitlerin oluþmadýðý ya da eser miktarda oluþtuðu izlenmiþtir. Literatür çalýþmalarý incelendiðine, meyve suyundan L. casei ile laktik asit üretiminde, sunulan çalýþmadaki verilerin tersine, ph deðeri baþlangýçta 6,0-6,5 iken fermantasyon süresince 3,8-4,5 deðerlerine kadar düþmektedir. Fermantasyonun baþýndan itibaren meydana gelen bu asitlik artýþý, ürün oluþumuna olumsuz etki yapmaktadýr. Asit Þekil 8. Lactobacillus casei ile makana- süt fermantasyon ortamýnda laktik asit üretimine baþlangýç konsantrasyonunun etkisi. Þekil 9. Lactobacillus casei pilav-bezelye-salata fermantasyon ortamýnda laktik asit üretimine substrat konsantrasyonunun etkisi. deðerinin çok ani artýþý fermantasyonda kullanýlan bakterinin yapýsýnýn bozulmasýna sebep olduðundan kullanýlan kültür ürün oluþturamamaktadýr (Karovicova ve ark. 2002). Güvenç ve Harsa (1986) peynir suyundan, L. bulgaricus, L. casei, L. delbrueckii ve L. leichmannii'yi karþýlaþtýrmýþ ve mikroorganizmalarýn tümünde ilk 12 saatte ortam ph'sýnýn 5.0'in altýna düþtüðünü saptamýþ ve daha sonraki sürelerde ph deðeri 4,0'ün altýna düþtüðünde laktik asit üretiminin tamamen durduðunu belirtmiþlerdir. Organik asitlerin mikroorganizmalar üzerine inhibitor ajan olarak etki etmeleri, asitlerin sahip olduklarý farklý iki önemli potansiyel etkiye baðlanmaktadýr. Kuvvetli asitler düþük eksternal ph deðerlerine sahiptirler. Fakat kendi kendilerine hücre membranlarýndan geçememektedirler. Bu asitler düþük ph'larý nedeniyle hücre yüzeyindeki enzimleri denatürasyona uðratarak inhibitör etkisi gösterebilirler. Ayrýca hücre içi ve hücre dýþý ph gradyeni çok yüksek olduðunda hücre zarýnýn proton geçirgenliðinin artmasýyla sitoplazmik ph'nýn düþüþüne sebep olabilirler. Zayýf asitler ise hücre membran duvarýndan kolaylýkla geçebil- 47

Ekoloji Omay ve Güvenilir mektedirler. Bu asitlerin ilk etkisi sitoplazmik ph'sý düþürmeleridir. Fakat doðrudan disosiye olamamýþ formlarý da metabolizma üzerine spesifik inhibitör etkisindedir. Laktik asidin zayýf bir asit olmasý ve fermantasyon esnasýnda yan ürün olarak açýða çýkan farklý zayýf asitlerin (fumarik asit, malik asit vb.), kültürün metabolik yapýsýný bozmasý nedeniyle inhibisyon etkisi görülür. Bu nedenlerden dolayý, ph kontrolü fermantasyon iþlemlerinde büyük önem taþýmaktadýr (Guoqiang ve ark. 1991). L. casei ile laktik asit fermantasyonunda ph kontrolünün yapýlmadan ya da sisteme tamponlayýcý ilave etmeden belirtilen sürede yeterli miktarda laktik asit üremesi, kullanýlan besiyeri ile kültürün iyi çalýþmasýndan kaynaklanmaktadýr. Dolayýsýyla, hem makarna-süt, hem de pilav-bezelye-salata ortamlarý için, L. casei ile laktik asit fermantasyonu yüksek verimde laktik asit oluþumuna imkan vermiþtir. Fermantasyon iþlemi boyunca CaCO 3 etkisinin incelenmesi Her iki ortam için de farklý konsantrasyonlarda CaCO 3 miktarlarýnda yapýlan fermantasyon iþlemlerinde, üretilen laktik asit miktarlarý ölçülmüþtür. %5 ve %10 CaCO 3 'ün her iki ortamda da yüksek konsantrasyonda laktik asit üretimine imkan saðlamýþtýr. Bu durum fermantasyon boyunca ortam ph deðerinin ani olarak deðiþmemesi ile baðlantýlýdýr. Lactobasillus türü bakterilerin pek çoðu ortam asitliðini tolere edemediklerinden fermantasyon iþlemleri boyunca ürün oluþum hýzý azalmaktadýr. Ancak L. casei ile yapýlan çalýþmalarda ph deðerindeki stabil durum, bakterinin log fazýný olumlu yönde etkilemekte ve mikroorganizma durgun faza geçene kadar yüksek ürün verimi ile çalýþmasýna imkan saðlamaktadýr. Literatüre göre, kullanýlan substratýn cinsine ve kültürün çeþidine baðlý olarak deðiþen ph deðerlerini tamponlamak amacýyla miktar olarak geniþ bir aralýkta CaCO 3 'ýn, farklý sürelerde fermantasyon ortamlarýna ilave edildiði görülmüþtür. Lactobasillus türleri için kullanýlan CaCO 3 miktarý %1-10 (aðýrlýk/hacim) aralýðýndadýr (Göksungur 1998). %5 (aðýrlýk/hacim) CaCO 3 konsantrasyonunda üretilen laktik asit miktarlarý, makarna-süt ve pilav-bezelye-salata besiyerleri için sýrasýyla 42 ve 44 g/l deðerlerinde olup bu veriler ait dönüþüm verimleri, %79 ve %76 olarak hesaplanmýþtýr. Bu nedenle CaCO 3 tüm fermantasyon çalýþmalarýnda, %5 (aðýrlýk/hacim) olarak 6. saatten itibaren fermantasyon sistemine ilave edilmiþtir. 48 L. casei ile fermantasyon boyunca yan ürün (malik asit, fumarik asit vb.) oluþum reaksiyon hýzlarýnýn düþük olduðu düþünülmektedir. Ortamdaki tampon miktarýnýn az oluþu, üretilen laktik asidin tamamýnýn kalsiyum laktata dönüþümünün saðlanamamasýna ve böylece fermantasyon ortamýndaki laktik asit üretiminden kaynaklý asitliðin artmasýna neden olmaktadýr. Ortama fazla miktarda CaCO 3 konulduðunda ise besiyerinin ph'sý mikroorganizma için uygun olan ph deðerinin üzerine çýkmaktadýr. Ayrýca, laktik asit fermantasyon çalýþmalarýnda, proses boyunca laktik asidin yaný sýra malik asit ve fumarik asit gibi yan ürünlerin de oluþumu sözkonusudur. Artan CaCO 3 miktarlarýnda malik asit üretiminin de arttýðý literatür çalýþmalarýnda tespit edilmiþtir. Bunun nedeni ise malik asit ve fumarik asit oluþumunu saðlayan enzim piruvat karboksilazýn aktivitesinin CaCO 3 varlýðýnda artýþ göstermesidir (Tkacz ve Lange 2004). Fermantasyon iþlemi boyunca ph etkisinin incelenmesi 53 g/lve 58 g/l sakkaroz içeren besiyerleri için en yüksek konsantrasyonda laktik asit üretimine imkan veren ph deðerleri sýrasýyla 6,0 ve 7,0 olarak tespit edilmiþtir. Öte yandan pilav-bezelye-salata besiyeri için ph 7,0 ve ph 6,0 deðerlerinde sentezlenen laktik asit miktarlarýnýn eþit olduðu görülmüþtür. Gunsalus ve ark. (2009) yaptýklarý çalýþmada, 5,0, 7,0 ve 9,0 ph deðerleri için 24 saatlik fermantasyon iþleminde, artan ph deðerlerinde laktik asit miktarýnýn azaldýðýný tespit etmiþlerdir. Bu durumun artan ph'larda, özellikle 7,0'nin üzerindeki deðerlerde, laktik asitle beraber formik asit, asetik asit ve etil alkol oluþumuna baðlý olarak fermantasyon ortamýnda gözlenen uçucu asitler ve alkollerden kaynaklý olduðunu belirtmiþlerdir. Laktik asit fermantasyonu ile ilgili benzer çalýþmalar incelendiðinde, tüm Lactobacillus türleri için ortam ph'sýnýn yaklaþýk 6,0 civarýnda iken en yüksek laktik asit oluþumuna imkan verdiði saptanmýþtýr. Bu durum kültürlerin yapýlarýnda bulunan enzimlerin maksimum substrat dönüþümüne imkan verdikleri ph deðerlerinin bu aralýklarda olmasýndan kaynaklanmaktadýr. Optimum ph dýþýnda, enzimin ve kültürün inhibisyonunun meydana gelmesinden dolayý, ürün oluþumu azalmaktadýr. Yapýlan fermantasyon çalýþmalarý sonucunda, L. casei ile laktik asit üretiminde en yüksek ürün dönüþümüne imkan veren ph deðeri 6,0 olarak saptanmýþtýr ve bu deðer literatür verileri ile uyumludur. Laktoferment

Yemekhane Atýklarýndan Fermantasyonla Laktik Asit Üretimi Ekoloji prosesini etkileyen diðer parametrelerin incelenmesi esnasýnda besiyerlerinin baþlangýç ph deðerleri 6,0 olarak sabitlenerek fermantasyon iþlemlerine devam edilmiþtir. Fermantasyon iþlemi boyunca sýcaklýk etkisinin incelenmesi Yapýlan fermantasyon çalýþmalarý sonucunda, her iki besiyeri için de yüksek konsantrasyonda laktik asit üretimine imkan saðlayan sýcaklýk deðeri 45 C olarak saptanmýþtýr. Choronopoulos ve ark. (2008) þekerden L. casei ile serbest kültür ve immobilize kültür kullanarak fermantasyonla laktik asit üretimi yapmýþlardýr. Bu çalýþmada 18-36 saatlik fermantasyon sürelerinde her iki kültür için de, 43 C'nin en yüksek konsantrasyonda laktik asit üretimine imkan verdiðini belirtmiþlerdir. Büyükkileci ve Harsa (2004) mayadan L. casei ile laktik asit üretiminde maksimum laktik asit miktarýnýn 37 C ve ph 5,5'da olduðunu saptamýþlardýr. Belirtilen koþullarda laktik asit üretim verimini, 3.97 g/l.saat olarak tespit etmiþlerdir. Hujanan ve ark. (2001) L. casei NRRL B-441 ve L. casei subsp. rhamnosus NRRL B-445 kültürleriyle, farklý azot kaynaklarýndan laktik asit fermantasyonu ile ilgili çalýþmalarýnda, her iki kültür için de 37 C'de gerçekleþtirilen fermantasyon iþlemlerinde, en yüksek verimle laktik asidin elde edildiðini belirtmiþlerdir. Genel olarak Lactobacillus türleri 37 C ile 45 C aralýðýndaki fermantasyon sýcaklýklarýnda maksimum laktik asit üretimini gerçekleþtirebilmektedirler. Sunulan çalýþmada kullanýlan L. casei kültürünün yapýsýndaki l-laktaz dehidrojenaz enziminin optimum çalýþma sýcaklýðý 45 C olduðundan, yapýlan fermantasyon iþlemleri sonucunda da en yüksek verimle laktik asit oluþumunun saðlandýðý fermantasyon sýcaklýðý ayný deðerde bulunmuþtur. Fermantasyon iþlemi boyunca karýþtýrma hýzýnýn etkisinin incelenmesi Her iki ortam için de farklý karýþtýrma hýzlarýnda yapýlan fermantasyon iþlemlerinde 160 ve 200 rpm'de sentezlenen laktik asit miktarlarý birbirine eþittir. Bu sonuca göre 160 rpm seçilerek deneylerde optimum karýþtýrma hýzý olarak alýnmýþtýr. Literatür çalýþmalarý da incelendiðinde bu tespit desteklenmiþtir. Liu ve ark. (2005) çürük patateslerden R. oryzae ile laktik asit fermantasyonunu optimize etmiþler ve bu amaçla karýþtýrma hýzýnýn laktik asit üretimine etkisini incelemiþlerdir. Yapýlan denemeler sonucunda, artan karýþtýrma hýzlarýnda (60 rpm, 110 rpm, 170 rpm) laktik asit (14 g/l, 26 g/l, 32 g/l) üretiminin arttýðýný saptamýþlardýr. Tan ve Ding (2006) laktik asit fermantasyonu ile yaptýklarý çalýþmada, 200 rpm'de, 38 saat sonunda, maksimum laktik asidin 37,4 g/l miktarý ve %76 dönüþüm verimi ile elde edildiðini belirtmiþlerdir. Liu (2005) çürük patateslerden anaerobik ortamda Lactobacillus amylophilus kültürü ile laktik asit fermantasyonunda, 24 saatlik fermantasyon iþlemi boyunca, ph 6,2 ve sýcaklýk 40 C olarak optimize edildiðinde, 170 rpm karýþtýrma hýzýnda 35,5 g/l laktik asidin %70 verimle elde edildiðini belirtmiþtir. Fermantasyon iþlemi boyunca substrat konsantrasyonun etkisinin incelenmesi Yapýlan fermantasyon çalýþmalarý sonucunda, her iki besiyeri için, substrat konsantrasyonu arttýkça elde edilen laktik asit miktarýnýn arttýðý, belli bir deðerden sonra ise azaldýðý tespit edilmiþtir. Hem makarna-süt hem de pilav-salata-bezelye ortamlarýyla yapýlan fermantasyon iþleminde, en düþük verimle laktik asit üretimi 10 g/l ve 60 g/l substrat konsantrasyonlarýnda elde edildiði görülmüþtür. Düþük substrat konsantrasyonlarýnda, kullanýlan kültür yeterince besin tüketemediðinden laktik asit dönüþümünü istenen oranda gerçekleþ-tiremezken, yüksek substrat konsantrasyonlarý için de yoðun besin ortamý mikroorganizmanýn stabilitesini bozmuþ ve gerekli elementleri düzgün tüketememesine sebep olmuþtur. 100 g/l sakkaroz içeren fermantasyon ortamý ile fermantasyon denemeleri yapýldýðýnda, laktik asit oluþum miktarýnýn çok az olduðu ve fermantasyonun baþlamasýndan itibaren oluþan ürün konsantrasyonunda belirgin bir deðiþim olmadýðý gözlenmiþtir. Bu durum yüksek sakkaroz konsantrasyonunun bastýrýcý etki yaptýðýný göstermektedir. Diðer yandan ortam yoðunluðunun ve viskozitesinin artmasý ile mikroorganizmanýn kullanacaðý oksijen sirkülasyonu olumsuz etkilenmekte ve kültür verimli bir çalýþma gerçekleþtirememektedir. SONUÇ Bu çalýþmada, Ýstanbul Teknik Üniversitesi Saðlýk, Kültür ve Spor Daire Baþkanlýðý Yemek Ýþletmeleri'nden temin edilen yemekhane atýklarýndan L. casei kullanýlarak fermantasyonla L-laktik asit üretimi gerçekleþtirilmiþtir. Yemek atýklarýnýn fermantasyon yöntemiyle, katma deðeri yüksek, gýda, tekstil, ilaç, kozmetik gibi sektörlerde yaygýn kullanýlan bir ürüne dönüþtürülmesi, yapýlan çalýþmalarýn endüstriyel boyuta taþýnmasý halinde ekonomik ve çevresel anlamda bir yenilik oluþturmaktadýr. 49

Ekoloji Omay ve Güvenilir REFERENCES Büyükkileci A, Harsa Þ (2004) Batch production of L(+) lactic acid from whey by L. casei (NRRL B- 441). Journal of Chemical Technology & Biotechnology 79: 1036-1040. Choronopoulos G, Bekarotou A, Bezirtzoglou E, Kaliafas A, Koutinas A, Marchant R, Banati M, (2008) Simultaneous saccharification and fermentation of cassava bagasse for L(+) lactic acid production using Lactobacilli. Applied Biochemistry and Biotechnology 134: 1233-1236. Gunsalus IC, Niven C (2009) The effect of ph on the lactic acid fermentatation. Journal of Biological Chemistry 145: 131-137. Göksungur Y (1998) Melastan laktik asit üretiminde farklý üretim tekniklerinin kullanýlabilirliði ve ortam þartlarýnýn optimizasyonu. Doktora Tezi, Ege Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ýzmir. Goren S, Esen M (2010) Tibbi Atik Yakma Kullerinde Agir Metal Giderimi. Ekoloji 19 (77): 51-58. Güvenç U, Harsa Þ (1986) Melastan laktik asit üretimi. In: Ege Üniversitesi Gýda Sanayi Araþtýrma Geliþtirme 86. Sempozyumu Bildirileri Kitabý, 4-6 Kasým 1986, Ýzmir, 29-41. Hujanan M, Linko YY, Leisola M (2001) Optimization of media and cultivation conditions for L(+)- (S)-lactic acid production by L. casei NRRL B-441. Applied Microbiology and Biotechnology 56: 126-130. Karovicova J, Kohajdova Z, Hybenova E (2002) Using of multivariate analysis for evaluation of lactic acid fermented cabbage juices. Chemical Papers 56: 267-274. Liu Y, Wen Z, Liao W, Liu C, Chen S (2005) Optimization of the process for the production of L(+)- lactic acid from cull potato by Rhizopus oryzae. Engineering Life Science 5 (4): 343. Narayanan N, Roychoudhury PK, Srivastava A (2004) L (+) lactic acid fermentation and its product polymerization. Electronic Journal of Biotechnology 7 (2): 167-179. Tan T, Ding S (2006) L-lactic acid production by L. casei fermentation using different fed-batch feeding strategies. Process Biochemistry 41: 1451-1454. Tkacz JS, Lange L (2004) Agriculture and Medicine: Advances in Fungal Biotechnology for Industry. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York. Vaidya AN, Pandey R A, Mudliar S, Suresh Kumar M, Chakrabarti T, Devotta S (2005) Production and recovery of lactic acid for polylactide - An overview. Critical Reviews in Environmental Science and Technology 35: 429-467. Vick Roy TB (1995) Lactic acid. Comprehensive Biotechnology 3: 1136. Yakupoglu G, Peksen A (2011) Cay atigindan hazirlanan farkli kompost ve partikul buyuklugunun Ganoderma lucidum mantarinin verimi ve bazi morfolojik ozellikleri uzerine etkisi. Ekoloji 20 (78): 41-47. Zhang ZY, Jin B, Kelly JM (2007) Production of lactic acid from renewable materials by Rhizopus fungi. Biochemical Engineering Journal 35: 251-263. 50