RHİZOPUS DELEMAR İLE LİPAZ ÜRETİMİ B. ÇELEBİ, Y. SAĞ Hacettepe Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 653 Beytepe, Ankara ÖZET Bu çalışmada bir kamçılı mantar türü olan Rhizopus delemar mikroorganizması ile dış hücresel enzim, lipaz üretimi, ph, çeşitli karbon kaynakları, başlangıç substrat derişimi ve indükleyicilerin etkisi gibi farklı çevresel faktörlerin fonksiyonu olarak kesikli karıştırmalı kaplarda incelenmektedir. Maksimum enzim aktivitesi ph 8. de elde edilmiştir. En uygun başlangıç glikoz derişimi, 1 g / L olarak bulunmuştur, yüksek glikoz derişimleri lipaz enzimi üretimi üzerine inhibitör etkisi yapmaktadır. Enzim aktivitesi üzerine değişik karbon kaynaklarının etkisi incelenmiş, glikoz, sakkaroz ve melas ile sırasıyla 1.97,.53 ve 4.73 U / L enzim aktivitesi elde edilmiştir. Enzim aktivitesi üzerine indükleyici olarak çeşitli sıvı yağların etkisi incelenmiş, ortamda 1 g / L ye kadar artan derişimlerde ayçiçeği yağının bulunmasının enzim aktivitesini 31.9 U / L ye arttırdığı görülmüştür. Enzim aktivitesi üzerine en az etkili bileşen tribütirin olarak kaydedilirken, karbon kaynağı olarak yalnız Tween-8 nin kullanıldığı durumda enzim aktivitesi 7.8 U/L olarak saptanmıştır. Anahtar Kelimeler Fermentasyon; İşletme parametreleri; Kesikli karıştırmalı reaktör, Lipaz üretimi, Mikroorganizma, Rhizopus delemar. GİRİŞ Lipazlar (triaçil gliserol açil hidrolazlar) endüstriyel enzimlerin en önemli sınıflarından biridir. Lipazlar, trigliseridleri di- ve monogliseridlere, gliserin ve yağ asitlerine hidrolizini, ayrıca belirli şartlar altında ters reaksiyonu, yani gliserin ve yağ asitlerinden gliserid oluşumunu gerçekleştiren biyolojik katalizörlerdir. Son yıllarda yağların hidrolizinde, esterlerin sentezinde, yağların interesterifikasyonunda, biyosurfaktantların üretiminde, optik olarak aktif bileşikler üretmek için rasemik karışımların ayrışmasında, süt tadlandırıcılarında, peptidlerin sentezinde ticari olarak üretilen lipazların kullanımına dünya çapında bir ilgi vardır. Lipazların bu kadar geniş uygulama alanı bulmasının nedeni, substrat spesifikliği, stereospesifiklik ve suda çözünen ve suda çözünmeyen sistemlerin ara yüzeyindeki heterojen reaksiyonları katalizleme yeteneği gibi karakteristik özelliklere sahip olmalarıdır. Lipazlar hayvanlar, bitkiler ve mikroorganizmalarda bulunur. Mikrobiyal lipazlar bitkisel ve hayvansal lipazlar ile karşılaştırıldığında daha kararlı olduklarından ve ucuz elde edildiklerinden endüstriyel uygulamaların daha geniş bir spektrumunda kullanılırlar. Lipazlar bakteriler, mayalar ve mantarlar tarafından üretilirler. Mikrobiyal lipazlar gıda endüstrisinde, deterjan, eczacılık, kozmatik, deri, kağıt, biyosensörler, pestisidler üzerindeki özel önemleri ile değerli kimyasalların üretiminde kullanılırlar [1]. Fermentasyon prosesi esnasında lipaz üretkenliğinin arttırılması, üretim fiyatlarını düşürerek; yeni endüstriyel uygulamaları ilerleteceğinden büyük önem taşımaktadır. Bu nedenle lipaz üretimi için karbon kaynağını optimize etmek ve daha ucuz alternatifler bulmak önemli ölçüde ilgi çekmektedir. Bu çalışmada, R. delemar (mantar) ile lipaz üretimi incelenmektedir.
KURAMSAL Gliserol ester hidrolazları veya lipazlar, enzimler içerisinde yağ asidlerini sentezleyen veya yağları hidrolizleyen lipolitik enzimler olduğundan önemli bir grup oluştururlar. Enzimatik hidroliz tepkimesine lipoliz adı verilir. Lipazların doğal substratları uzun zincirli yağ asidlerinin gliserin esterleri suda çok az çözünürler. Lipazlar, enzimin çözündüğü sulu faz ve su ile karışmayan substrat fazı arasındaki ara yüzeyde ester bağlarının hidrolizini katalizler. Gliseridler tercih edilen substratlarsa da lipaz enzimleri yağ asidlerinin diğer alkollerle yaptıkları esterleri de hidrolizleyebilirler. Ancak suda çözünen esterlere karşı aktiviteleri oldukça düşüktür. Lipazların endüstriyel çapta üretiminde mikroorganizmalar, diğer kaynaklar ile karşılaştırıldığında verimin daha yüksek ve genetik manipulasyonlara daha açık olması nedeni ile tercih edilmektedir. Mikrobiyal lipazlar iki grup altında incelenmektedir. Birinci grup seçici olmayan gruptur ve trigliseridin her üç pozisyonundaki yağ asidlerini hidrolizleyerek tamamını serbest yağ asidlerine ve gliseride dönüştürür. İkinci grup lipazlar ise sadece belli pozisyondaki yağ asidlerini hidrolizlemektedir. Lipazlar hidroliz, ester sentezi, alkolizis ve transesterifikasyon reaksiyonlarını katalizlemektedir. Lipazların katalizlediği bu reaksiyonlar oldukça büyük endüstriyel öneme sahiptir. Lipaz enzimi ile katalizlenen söz konusu reaksiyonlar başlıca üç amaçla kullanılır. Bunlar yağ asidi üretimi için trigliserid hidrolizi, lipid sentezi ve esterlerin interesterifikasyonuna dayanan yağ modifikasyonudur. Tüm bu geleneksel kullanım alanlarının yanısıra lipazlar son yıllarda tıpta da geniş uygulama alanları bulmaktadırlar [,3]. Lipazlar fiziksel özellikleri, substrat spesifiklikleri gibi biyokimyasal özellikleri, optimum reaksiyon koşulları, aktivatörlere gereksinimleri ve inhibitörlere duyarlılıkları açısından birbirlerinden farklılıklar gösterirler. Lipazların büyük çoğunluğu trigliseridlerdeki ester bağları ve bu moleküllerdeki yağ asidlerinin uzunluğu için yüksek spesifikliğe sahiptir. Örneğin Candida cylindracea dan elde edilen enzim trigliseriddeki üç ester bağının hepsine birden atak yapar ancak oldukça zayıf termal kararlılığa sahiptir. Penicillium cyclopium dan elde edilen lipazın bu üç pozisyonada atak yaptığı fakat bu zincirin trigliseridlere nazaran monogliseridlere daha hızlı atak yaptığı kaydedilmiştir [4]. Taksonomik olarak yakın zincirler farklı tipte lipazlar üretebilirler, bu nedenle lipazın farklı kaynaklarının araştırılmasına ihtiyaç duyulmaktadır. Lipaz üreten mikroorganizma cinsleri üzerine çalışmalar yapılmış olmasına rağmen, fermentasyon prosesi hakkında sistematik çalışmalar göreceli olarak daha azdır. Halbuki fermentasyon prosesi hakkında sistematik bilginin oluşturulması, enzim üretimi için optimum işletme koşullarının belirlenmesi için büyük önem taşımaktadır. Gelişmiş özellikleri ile lipazlar doğal seleksiyonla üretilmektedir ve protein mühendisliği de bu enzimlerin yararlılığını daha ileri düzeyde arttırmak için uğraş vermektedir. Lipaz bazlı prosesleme ümit veren bir gelecek vaat etmesine rağmen ilerleme hızı yavaştır. Kısıtlamaları yaratan faktörler, lipazların göreceli olarak yüksek fiyatı ve değişik uygulamalarda gereksinilen katalitik spesifikliklerin ve özelliklerin optimum aralığına sahip olan enzimlerin olmayışıdır [5]. Misel oluşturan mantar Rhizopus delemar ikincil değil birincil esterlerin hidrolizi için yüksek seçimlilik gösteren en az üç dış hücresel lipaz üretir. Başka bir deyişle, R. delemar lipazları bir triaçilgliserollün sn- pozisyonundaki değil, sn-1 ve sn-3 pozisyonlarındaki ester bağlarını hidrolizler. Sözü edilen pozisyonel spesifiklik R. delemar lipazı üzerine sürdürülen temel çalışmaların nedenlerinden biridir. Bu enzimlerin kısmen saflaştırılmış karışımları ester ve gliserid sentezi, gliseridin yeniden yapılandırılması ve fosfolipidlerin açil gruplarının değişimini içeren reaksiyonlara uygulanmaktadır [6].
DENEYSEL ABD Tarım Bakanlığı Kültür koleksiyonundan liyofilize halde getirtilen, R. delemar 3 o C sabit sıcaklıkta çalışan bir çalkalayıcıya yerleştirilen, 1 ml çalışma hacimine sahip erlenlerde aerobik şartlarda üretilmiştir. Üreme ortamlarının ph ı 8. e ayarlanmış olup, bileşimi şu şekildedir (g / L): Glukoz monohidrat 1, MgSO 4.7H O., K HPO 4.5, KH PO 4.5, maya özütü.. Mikroorganizma üremesi, santrifüjleme veya filtrasyon ile bir örnekten toplanan hücrenin kuru ağırlığı olarak saptanmıştır. Filtratlardaki lipaz enziminin aktivitesi para-nitrofenil palmitat (pnpp) kullanılarak saptanmıştır. Bu saptama yöntemi 41 nm de pnpp ın enzimatik hidrolizinin sonucu olarak serbest kalan para-nitro-fenol (pnp) lün spektrofotometrik olarak saptanmasına dayanmaktadır. Enzim aktivitesinin bir birimi (U) dakikada 1 µmol p-nitrofenol serbest bırakan enzim miktarı olarak tanımlanmaktadır. SONUÇLAR Kesikli karıştırmalı kaplarda, R. delemar ın lipaz üretkenliği ph, ortam bileşimi, substrat derişimi, ve indükleyicilerin varlığı gibi farklı çevresel faktörlerin fonksiyonu olarak incelenmiştir. Maksimum enzim aktivitesi ph 8. de elde edilmiştir. Başlangıç substrat derişiminin enzim aktivitesi üzerine etkisini incelemek amacıyla, başlangıç glikoz derişimi 1-1 g / L aralığında değiştirilmiştir. Şekil 1 den de görüldüğü gibi maksimum enzim aktivitesi 1 g / L glikoz derişiminde elde edilmiştir. 1 g / L den daha yüksek glikoz derişimlerinde, aktivitede gözlenen azalma, yüksek glikoz derişimlerinin inhibisyon etkisi yaptığını gösterir. Bu da yüksek glikoz derişimlerinde açığa çıkan metabolik asidlerin artmasından dolayı enzimin protein yapısının değişmesinden kaynaklanmaktadır. Farklı karbon kaynaklarının enzim aktivitesi üzerine etkisini incelemek amacıyla glikozun yanısıra sakkaroz ve melasda kullanılmıştır. Maksimum enzim aktivitesi sakkaroz için 5 g / L derişiminde, melas için ise 1 g / L derişiminde elde edilmiştir (Şekil ). Elde edilen sonuçlar melasın, R. delemar ile lipaz üretimi için verimli ve ucuz bir karbon kaynağı olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Enzim aktivitesini arttırmak için indükleyici olarak çeşitli sıvı yağların etkisi incelenmiştir (Şekil 3). En yüksek enzim aktivitesi ayçiçeği yağının kullanımı ile elde edilmiştir. Fermantasyonda karbon kaynağı olarak yağ kullanıldığında enzim üretimi önemli ölçüde artmaktadır. Diğer karbon kaynakları glikoz, sakkaroz ve melasda görülen enzim aktivitesindeki ani düşüş, ayçiçeği yağının kullanıldığı durumda gözlenmemiştir. Uzun süreli ve yüksek enzim aktivitesi, ayçiçeği yağının, R. delemar mikroorganizması tarafından substrat olarak tüketilmesinin yanısıra, lipaz enziminin sentezi esnasında indükleyici olarak etki yaptığı sonucunu doğurmaktadır. 1 g / L nin üzerinde artan yağ derişimi ile enzim aktivitesi azalmaktadır (Şekil 4). Bu durum, artan yağ derişimi ile ortamın viskozitesinin artmasından ve mantar pelletler içine substrat difüzyonunun kısıtlanmasından ya da aşırı substratın inhibitör etki yapmasından kaynaklanabilir. Çalışmaların bir sonraki aşamasında, enzim aktivitesi üzerine tribütirin ve rhamnolipid, tween- 8 gibi surfaktantların etkisi incelenmiştir. Surfaktantlar enzim aktivitesi üzerine indükleyici etki yapmalarının yanısıra, dış hücresel enzimin fermentasyon sıvısına salgılanmasını arttırıcı özellikleri ile de bilinirler. R. delemar gibi pellet oluşturarak üreyen mantar türü mikroorganizmalarda bu sonuncu özellik surfaktant kullanımını gerekli kılmaktadır. Tribütirin en az etkili besin ortamı bileşeni olarak kaydedilirken, ortamda Tween-8 nin bulunmasının enzim aktivitesini önemli ölçüde arttırdığı görülmektedir (Şekil 5). Tween-8 derişimi.5-4. g/l aralığında arttırılmış, maksimum enzim aktivitesi 1 g/l Tween-8 içeren ortamda 7.8 U/L olarak elde edilmiştir.
,5 1,5 1,5 4 6 8 1 1 Substrat Derişimi (g/l) Şekil 1. Enzim Aktivitesinin Başlangıç Glikoz Derişimi ile Değişimi (ph: 8.; Sıcaklık: 3 o C; Karıştırma Hızı: 15 devir / dak). 5 4 3 1 Glikoz Sakkaroz Melas 1 1 14 16 18 4 Şekil. R. delemar ile Lipaz Üretimi için Farklı Karbon Kaynaklarının Karşılaştırılması (ph: 8.; Sıcaklık: 3 o C; Karıştırma Hızı: 15 devir / dak).
8 6 4 Ayçiçek yağı Soya yağı Fındık yağı Zeytin yağı Mısır yağı 1 1 14 16 18 4 6 Şekil 3. R. delemar ile Lipaz Üretimi için İndükleyici Olarak Farklı Sıvı Yağların Karşılaştırılması (ph: 8.; Sıcaklık: 3 o C; Karıştırma Hızı: 15 devir / dak). 4 3 1,5 g/l 1 g/l g/l 4 g/l 1 15 5 Şekil 4. Enzim Aktivitesinin Başlangıç Ayçiçeği Yağı Derişimi ile Değişimi (ph: 8.; Sıcaklık: 3 o C; Karıştırma Hızı: 15 devir / dak).
6 4 Tribütirin Rhamnolipid Tween-8 1 16 4 8 Şekil 5. Enzim Aktivitesinin Tribütirin ve Surfaktantların Varlığı ile Değişimi (ph: 8.; Sıcaklık: 3 o C; Karıştırma Hızı: 15 devir / dak). KAYNAKLAR 1- Sharma, R., Chisti, Y., Banerjee, U.C., Production, Purification, Characterization, and Applications of Lipases, Biotechnology Advances, 19, 67-66, 1. - Saxena, R,K., Sheoran, A., Giri, B., Sheba Davidson W., Purification Strategies for Microbial Lipases, J. Microbiologic. Meth., 1-18, 3. 3- Burkert, J.F.M., Maugeri, F., Rodrigues, M.I., Optimization of Extracellular Lipase Production by Geotrichum sp. Using Factorial Design, Bioresource Technol., 91, 77-84, 4. 4- Isobe, K., Akiba, T., Yamaguchi, S., Crystallization and Characterization of Lipase from Penicillium cyclopium, Agric. Biol. Chem., 5, 41-47, 1988. 5- Muralidhar, R.V., Chirumamila, R.R., Marchant, R., Nigam, P., A Response Surface Approach for the Comparison of Lipase Production by Candida cylindracea Using Two Different Carbon Sources, Biochem. Eng. J., 9, 17-3, 1. 6- Haas, J.M., Cichowicz, D.J., Bailey, D.G., Purification and Characterization of an Extracellular Lipase from the Fungus Rhizopus delemar, Lipids, 7, 571-576, 199.