SIĞIRLARDAN TOPLANAN SÜT VE SERUM ÖRNEKLERİNDEN BRUCELLOZİS İN TEŞHİSİNDE KULLANILAN ÇEŞİTLİ SEROLOJİK YÖNTEMLERİN KARŞILAŞTIRILMASI.

Transkript

1 i SIĞIRLARDAN TOPLANAN SÜT VE SERUM ÖRNEKLERİNDEN BRUCELLOZİS İN TEŞHİSİNDE KULLANILAN ÇEŞİTLİ SEROLOJİK YÖNTEMLERİN KARŞILAŞTIRILMASI Ufuk ÜLKER DOKTORA TEZİ BİYOLOJİ GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ EKİM 2010 ANKARA

2 Ufuk ÜLKER tarafından hazırlanan SIĞIRLARDAN TOPLANAN SÜT VE SERUM ÖRNEKLERİNDEN BRUSELLOZİS İN TEŞHİSİNDE KULLANILAN ÇEŞİTLİ SEROLOJİK YÖNTEMLERİN KARŞILAŞTIRILMASI adlı bu tezin Doktora tezi olarak uygun olduğunu onaylarım. Doç. Dr. Sumru ÇITAK Tez Yöneticisi Bu çalışma, jürimiz tarafından Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalında Doktora tezi olarak kabul edilmiştir. Başkan : Prof. Dr. Nilüfer CİHANGİR Üye : Doç. Dr. Sumru ÇITAK Üye : Prof. Dr. Rıza DURMAZ Üye : Doç. Dr. Nihal YÜCEL Üye : Doç. Dr. Neslihan GÜNDOĞAN Bu tez, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü tez yazım kurallarına uygundur.

3 TEZ BİLDİRİMİ Tez içindeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm. Ufuk ÜLKER

4 iv SIĞIRLARDAN TOPLANAN SÜT VE SERUM ÖRNEKLERİNDEN BRUSELLOZİS İN TEŞHİSİNDE KULLANILAN ÇEŞİTLİ SEROLOJİK YÖNTEMLERİN KARŞILAŞTIRILMASI (Doktora Tezi) Ufuk ÜLKER GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Ocak 2010 ÖZET Bu çalışmada; Kastamonu, Çankırı, Çorum, Kırşehir ve ilçelerinden, Çubuk ve Bolu Seben ilçelerinden olmak üzere toplam 270 adet atık yapmış ve Brucella şüpheli aşısız sığırların serum ve süt örnekleri materyal olarak kullanılmıştır. Bu sığırların serum ve süt örneklerinde B. abortus teşhis etmek amacı ile Rose Bengal Plate Test (RBPT), Serum Aglütinasyon Test (SAT), Komplement Fikzasyon Test (CFT), Milk Ring Test (MRT) ve Indirekt Enzyme Linked Immnosorbent Assay (I-ELISA) testi çalışılarak, bu testler birbirleri ile karşılaştırılmıştır. Atık yapmış sığır sürülerinden elde edilen 270 adet kan serumunda ELISA ile % 69,0 RBPT ile % 61,1 CFT ile % 41,8 SAT ile % 40,0 pozitif saptanmıştır. Aynı sürüye ait 270 adet süt örneğinde ELISA ile % 81,8 MRT ile % 46,6 oranında pozitif bulunmuştur. Yapılan Testler içerisinde ELISA nın süt ve serum numunelerinde duyarlılık derecesi RBPT, SAT, CFT ve MRT ile karşılaştırılmıştır.

5 v Yapılan çalışma sonucunda: süt ve serum örneklerinde B. abortus infeksiyonu en yüksek oranda pozitifliği ELISA ile tespit edilmiştir. Bu da ELISA nın çok hassas, özgüllük ve duyarlılığının her iki numunede de oldukça yüksek çıktığını göstermektedir. ELISA metodunun da hızlı, uygulaması kolay ve hassas olması gibi nedenlerden dolayı serolojik teşhis amaçlı diğer tamamlayıcı testlerle (RBPT, SAT, CFT, MRT vs.) birlikte kullanılabileceği sonucuna varılmıştır. Bilim Kodu : Anahtar Kelimeler : Brusellozis, ELISA, serolojik testler, sığır. Sayfa Adedi : 112 Tez Yöneticisi : Doç. Dr. Sumru ÇITAK

6 vi THE COMPARISON OF VARIOUS SEROLOGICAL METHODS USED IN DIAGNOSIS OF BRUCELLOSIS IN MILK AND SERUM SAMPLES COLLECTED FROM CATTLE (PhD Thesis) Ufuk ÜLKER GAZI UNIVERSITY INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY January 2010 ABSTRACT In this study; 270 serum and milk samples of unvaccinated cattles which had abortion, have been collected from Kastamonu, Çankırı, Çorum, Kırşehir and their towns, Ankara s town Çubuk and Bolu s town Seben. To detect antibodies against B. abortus, Rose Bengal Plate Test (RBPT), Serum Aglutination Test (SAT), Complement Fixation Test (CFT), Milk Ring Test (MRT) and Indirect ELISA (I-ELISA) have been used and sensitivity of Enzyme linked Immnosorbent Assay (ELISA) was compared with sensitivity of RBPT, SAT, CFT and MRT. 69,0 % of 270 tested serum were found positive for B. abortus by ELISA, 61,1 % by RBPT, 41,8 % by CFT and 40,0 % by SAT. In the same herd, 81,8 % of 270 tested milk samples were found positive by ELISA and 46,6 % of them were positive by MRT. The Sensivity of the ELISA was compared with the sensivity of RBPT, SAT, CFT and MRT in milk and serum samples. At the end of the study: the higest positive results obtained from ELISA among all of the others. These results can be considered as high sensitivity of ELISA for

7 vii both sample types In conclusion, because of its speed, practicity and sensitivity, it is decided that ELISA can be used besides the conventional tests (RBPT, SAT, CFT, MRT). Science Code : Key Words : Brucellosis, ELISA, serological tests, cattle Page Number : 112 Adviser : Doç. Dr. Sumru ÇITAK

8 viii TEŞEKKÜR Çalışmalarım boyunca değerli yardım ve katkılarıyla beni yönlendiren hocam Doç.Dr. Sumru ÇITAK a yine kıymetli tecrübelerinden faydalandığım Prof. Dr. Nilüfer CİHANGİR e ayrıca Doç. Dr. Nihal YÜCEL e, İstatistikçi Ümran İŞKUR a çalışma arkadaşlarım Dr. Yavuz ULUSOY ve Dr. M. Fatih BARUT a ve manevi destekleriyle beni hiçbir zaman yalnız bırakmayan eşim Nihan ÜLKER e de teşekkürü bir borç bilirim.

9 ix İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... iv ABSTRACT... vi TEŞEKKÜR...viii İÇİNDEKİLER... ix ÇİZELGELERİN LİSTESİ...xii ŞEKİLLERİN LİSTESİ... xiv HARİTALARIN LİSTESİ... xv SİMGELER VE KISALTMALAR... xvi 1. GİRİŞ LİTERATÜR BİLGİSİ Brucella Türlerinin Tarihçesi ve Genel Özellikleri Brucella Türleri Brucella Türlerinin Ayırıcı Özellikleri Brucella fajları Brucella türlerinin antijenik karakteristikleri Patogenez Etiyoloji Semptomlar Bulaşma Teşhis Kros Reaksiyonlar Bakteriyoskopi Kültür... 47

10 x Sayfa Hayvan Deneyi Koruma ve Kontrol Aşılama MATERYAL VE METOT Materyal Serum ve süt örnekleri Metot Rose bengal plate testi (RBPT) Serum aglütinasyon testi (SAT) Komplement fikzasyon testi (CFT) Milk ring testi (MRT) Indirect enzyme linked immunosorbent assay (I-ELISA) BULGULAR Rose Bengal Plate Test Sonuçları Serum Aglütinasyon Test Sonuçları Komplement Fikzasyon Test Sonuçları I-ELISA (serum) Test Sonuçları I-ELISA (süt) Test Sonuçları Milk Ring Test Sonuçları İstatiksel Analizler TARTIŞMA VE SONUÇ Elisa İle Serolojik Tanı Serolojik Testlerin Etkinliğinin Karşılaştırılması Sütte Antikor Tespiti Süt ve Serum Numunelerinde Yapılan Testlerin Karşılaştırılması KAYNAKLAR... 94

11 ÖZGEÇMİŞ xi

12 xii ÇİZELGELERİN LİSTESİ Çizelge Sayfa Çizelge 2.1. Brucella türlerinin ayırt edici özellikleri..36 Çizelge 2.2. Brucella türlerinin biyotiplerinin ayırt edici özellikleri...36 Çizelge 2.3. Diğer bazı Gram (-) bakterilerden Brucella nın ayırt edici karakteristikleri 38 Çizelge 2.4. Süt mamullerinde Brucella spplerin canlılık süreci Çizelge 2.5. Brusellozis in teşhisinde kullanılan serolojik testlerle teşhis edilen ımmunoglobulin sınıfı...46 Çizelge 3.1. Komplement titresinin belirlenmesi...52 Çizelge 3.2. Amboceptör (Hemolizin) titresinin belirlenmesi. 54 Çizelge 3.3. CFT antijen titresinin tayini Çizelge 3.4. CFT testinin uygulanması 56 Çizelge 3.5. CFT testinde kullanılan reagent kontrolu için kullanılan miktarlar 56 Çizelge 3.6. CFT testinde kullanılan reagent kontrolu için kullanılan SRBC miktarları Çizelge 4.1. Sığır serum ve süt numunelerinde serolojik testler sonucunda tespit edilen B. abortus antikorlarının il ve ilçelere göre dağılımı..62 Çizelge 4.2. Serolojik testlerle incelenen kan serumu ve süt örneklerinden elde edilen sonuçların B. abortus açısından değerlendirilmesi 65 Çizelge 4.3. Sığır serum ve süt numunelerinde serolojik testler sonucunda tespit edilen B. abortus antikorlarının illere göre dağılımı..66 Çizelge 4.4. Çalışmada kullanılan serolojik testlerin duyarlılık ve özgüllük değerlerinin hesaplanması Çizelge 4.5. B. abortus infeksiyonunun teşhisinde kullanılan serum örneklerinin özgüllük, duyarlılık ve ortalama uyum değerlerinin karşılaştırılması.. 70

13 xiii Çizelge Sayfa Çizelge 4.6. B. abortus infeksiyonunun teşhisinde kullanılan süt örneklerinin özgüllük duyarlılık ve ortalama uyum değerlerinin karşılaştırılması..71 Çizelge 4.7. B. abortus infeksiyonunun teşhisinde kullanılan serum ve süt örneklerinin özgüllük, duyarlılık ve ortalama uyum değerlerinin karşılaştırılması...71 Çizelge 4.8. Çalışmada kullanılan serum ve süt numunelerinin serolojik testlerle değerlendirilmesi

14 xiv ŞEKİLLERİN LİSTESİ Şekil Sayfa Şekil 2.1. Sığır Brusellozu Mihraklar ( Ekim) 7 Şekil4.1. Çalışmada kullanılan serolojik testlerin serum ve süt örneklerinin elde edilen pozitiflik yönünden kıyaslanması..68

15 xv HARİTALARIN LİSTESİ Harita Sayfa Harita Yılı Sığır Brusellozu Mihrak Sayısı

16 xvi SİMGELER VE KISALTMALAR Bu çalışmada kullanılmış bazı simgeler ve kısaltmalar, açıklamaları ile birlikte aşağıda sunulmuştur. Simgeler Açıklama µl Mikrolitre Kısaltmalar Açıklama WHO FAO TÜBİTAK TÜİK Dünya Sağlık Örgütü Gıda ve Tarım Örgütü Türkiye Bilimsel Teknik ve Araştırma Kurumu Türkiye İstatistik Kurumu

17 xvii

18 1 1. GİRİŞ Brucella türlerinin neden olduğu Brusellozis; sığır, koyun, keçi, domuz, geyik, köpek ve diğer pek çok hayvanda görülmektedir. Sığırlarda hastalığa öncelikle B. abortus sebep olurken koyun ve keçi Brusellozis inde ise B.melitensis önem taşımaktadır. Etken özellikle testis, meme, uterus, gibi organlara yerleşerek abortus, süt verimi kaybı, damızlık değeri kaybı, infertiliteye sebep olması nedeniyle hayvansal üretimde kayıplara yol açarken, infekte hayvanlarla direk temas veya kontamine süt ve süt ürünlerinin tüketimi ile önemli bir halk sağlığı problemi oluşturmaktadır [Alton ve ark., 1988; Arda ve ark., 1987; Arda ve ark., 1999]. Brusellozis dünyanın birçok ülkesinde yaygın ve ekonomik olarak önemli zoonotik bir hastalıktır. Kuzey Avrupa, Kanada, Avustralya ve Yeni Zelanda da yıllar süren yoğun çabalarla Brusellozis büyük ölçüde eradike edilmiştir. Buna karşın Akdeniz bölgesi, Ortadoğu, Batı Asya nın gelişmekte olan ülkelerinde, Afrika ve Latin Amerika nın bir kısmında insan ve hayvanlarda yaygınlığını sürdürmektedir. Akdeniz bölgesinde yer alan ülkemizde de Brusellozis insanlarda ve hayvanlarda yaygın olarak görülen ve önemli sorunlara neden olan bir hastalıktır [Arda ve ark., 1991; Aydın ve ark., 1989]. Ülkemizde 1983 yılında planlanan ve 1984 yılından beri Brusellozis mücadele programı uygulanmaktadır [Anon, 1989]. Bu kapsamda belli aralıklarla sero-survey çalışmaları yapılmakta (1986, 1990, 1991, 1999) ve yoğun aşılama programları uygulanmaktadır [Anon, 1989; Anon,1991; İyisan ve ark., 2000] yılları arasında yapılan en son ülkesel sero-survey çalışması sonucunda 79 ilden tesadüfî örnekleme ile alınan toplam adet sığır kan serumu ve adet koyun kan serumu incelenmiştir. Hastalığın prevalansı sığırlarda % 1,43, koyunlarda ise % 1,97 olarak tespit edilmiştir. Her köy bir sürü kabul edildiğinde sığırlarda 1313 köyde (sürü) prevalans % 11,5, koyunlarda ise 1077 köyde (sürü) prevalans % 15 olarak belirlenmiştir [İyisan, 2000]. Alınan sonuçlar göstermiştir ki Brusellozis ülkemizin en önemli sorunlarından biri olmaya devam etmektedir.

19 2 Bu çalışma bulguları daha önceki yıllarda olduğu gibi, hayvan hareketlerinin fazla olmadığı ve atık vakalarının nadir olduğu Orta ve Doğu Karadeniz sahil şeridindeki iller dışında, ülkemiz genelinde hastalığın yaygın olduğunu göstermektedir. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı ve FAO kayıtlarına göre sığır brusellozu mihrakları ( Ekim) yılları itibariyle 2003: 91 mihrak, 2004: 107 mihrak, 2005: 187 mihrak, 2006: 391 mihrak, 2007: 527 mihrak iken, Sağlık Bakanlığı ve Türkiye İstatistik Kurumu kayıtlarında ise 2004: 18,264 vaka, 2005: 14,644 vaka, 2006: 10,644 vaka görülmektedir [FAO, 2007; Tarım ve Köyişleri Bakanlığı, 2008; TÜİK, 2009] (Şekil 2.1 ve Harita 2.1). Brusellozis in teşhisinde direkt (etken izolasyonu ve identifikasyonu) ve indirekt izolasyonu ve identifikasyonuna bağlı olmasına rağmen, infekte hayvandan etken izolasyonunun her zaman mümkün olmayışı, izolasyonun uzun zaman alması ve çok sayıda hayvan söz konusu olduğunda kültürel muayenelerle infekte hayvanları saptamak saha ve laboratuar personeli için pratik değildir. Bu nedenle hastalığın teşhisi kontrol ve eradikasyon programları serolojik testlerle reaktörlerin saptanması esasına dayandırılmıştır [Alton ve ark., 1988; OIE Manual, 2003]. Ancak her bir testin farklı immunoglobulinleri incelemesi ve yanlış pozitifliklerin görülmesi, kronik ve aktif infekte hayvanların serolojik testlere düzensiz yanıt verebilmesi gibi nedenlerle inkubasyon devresinde serolojik yanıtın oluşmaması, aşı ile doğal infeksiyonun karışması gibi olumsuzluklarından dolayı Brusellozis in serolojik tanısında en az iki testin birlikte yapılarak sonuçların değerlendirmesinin yapılması tavsiye edilmektedir [Alton ve ark., 1975; Fekete ve ark., 1990; Arda ve ark., 1999]. Brusellozis in indirekt teşhisinde Rose Bengal Plate Test (RBPT), Yavaş Tüp Aglütinasyon Testi (SAT), Komplement Fikzasyon testi (CFT), ELISA gibi serolojik yöntemler kullanılmaktadır [Alton ve ark., 1988; OIE Manual, 2003; Nielsen, 2002]. Bu testlerden bazılarında çapraz reaksiyonlar [Diaz-Aparicio ve ark., 1993; İzgür ve ark.,1992; Mittal ve Tizard 1981; Öngör, 1999] ve nonspesifik antikorlar meydana gelmesi [Trap ve ark., 1985] yanlış sonuçlar alınmasına neden olmaktadır. Uluslararası standartlara göre bu testlerden RBPT nin tarama testi olarak, CFT nin

20 3 ise standart doğrulama testi olarak kullanılması önerilmiştir [Nicoletti, 1989; OIE Manual, 2003; Olds, 1989]. Son yıllarda yapılan çalışmalara göre ELISA Testi Brucella teşhisinde büyük önem kazanmıştır ve Brucella teşhisinde kullanılan referans testler arasına girmiştir [OIE Manual, 2003]. ELISA testi, enzimle işaretlenmiş antijen veya antikorun kendine uygun antijen ya da antikorla özgül olarak bağlanabilmesi prensibine dayanan duyarlı ve güvenilir bir testtir. ELISA ile sütte indirekt antikor varlığı ve Brucella türlerinin A ve M antijenlerinin varlığı teşhis edilebilmektedir [Kerkhofs ve ark., 1990; Thoen ve ark., 1979]. Ayrıca anti IgM ve IgG konjugatları kullanılarak Brusellozis hastalığının akut ve kronik şekli hakkında bilgi edinilmektedir [De klerk ve Anderson, 1985; Felek, 1992]. Bu çalışmada; Kastamonu ve ilçesinden, Çankırı ve ilçesinden, Çorum ve ilçesinden, Kırşehir ve ilçesinden, Ankara Çubuk ilçesinden ve Bolu Seben ilçesinden olmak üzere toplam 270 adet atık yapmış ve Brucella şüpheli aşısız sığırların kan ve süt örnekleri alınmıştır. Bu sığırların kan ve serum örneklerinde B. abortus infeksiyonun teşhis etmek amacı ile indirekt ELISA nın sütte ve serumdaki uygulanabilirliğini saptamak ve diğer konvensiyonel testlerle (RBPT, SAT, CFT, MRT) karşılaştırılarak indirekt ELISA testinin duyarlılık derecesinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Atık yapmış sığır sürülerinden elde edilen 270 adet kan serumunda I-ELISA ile % 68,9, RBPT ile % 61,1, CFT ile % 41,8, SAT ile % 40,0 pozitif saptanmıştır. Aynı sürüye ait 270 adet süt örneğinde I-ELISA ile % 81,8 MRT ile % 46,6 oranında pozitif bulunmuştur. Brusellozis in serolojik teşhisinde antikorun farklı gruplar ( IgG 1, IgG 2, IgM ) ile reaksiyon veren konvansiyonel testlerin kombine kullanılmaları yanısıra, ELISA gibi oldukça duyarlı bir testin doğrulama testi olarak kullanılması reaktörlerin kesin olarak belirlenmesinde yararlı olmaktadır. Diğer bir doğrulama testi olan CFT den daha duyarlı kolay ve hızlı bir test olması nedeniyle de teşhis amaçlı tercih edilebilir.

21 4 Bu çalışma da B. abortus teşhisinde ELISA nın sığır kan serumu ve sütlerinde duyarlılık ve özgüllüğünün araştırılıp serolojik teşhis amaçlı diğer tamamlayıcı testlerle (RBPT, SAT, CFT, MRT vs.) etkinliği ve uygulanabilirliğinin araştırılması amaçlanmıştır.

22 5 2. LİTERATÜR BİLGİSİ Brusellozis dünyanın birçok ülkesinde yaygın ve ekonomik olarak önemli zoonotik bir hastalıktır. Brucella etkenlerinin neden olduğu Brusellozis; sığır, koyun, keçi, domuz, geyik, köpek ve diğer pek çok hayvanda görülmektedir. Sığırlarda hastalığa öncelikle B. abortus sebep olurken koyun ve keçi Brusellozis inde ise B. melitensis önem taşımaktadır. Etken özellikle testis, meme, uterus, gibi organlara yerleşerek abortus, süt verimi kaybı, damızlık değeri kaybı, infertiliteye sebep olması nedeniyle hayvansal üretimde kayıplara yol açarken, infekte hayvanlarla direk temas veya kontamine süt ve süt ürünlerinin tüketimi ile önemli bir halk sağlığı problemi oluşturmaktadır [Alton ve ark., 1988; Arda ve ark., 1987; Arda ve ark., 1999]. Kuzey Avrupa, Kanada, Avustralya ve Yeni Zelanda da yıllar süren yoğun çabalarla Brusellozis büyük ölçüde eradike edilmiştir. Buna karşın Akdeniz bölgesi, Ortadoğu, Batı Asya nın gelişmekte olan ülkelerinde, Afrika ve Latin Amerika nın bir kısmında insan ve hayvanlarda yaygınlığını sürdürmektedir. Akdeniz bölgesinde yer alan ülkemizde de Brusellozis insanlarda ve hayvanlarda yaygın olarak görülen ve önemli sorunlara neden olan bir hastalıktır [Arda, 1991; Aydın, 1989;]. Ülkemizde 1983 yılında planlanan ve 1984 yılından beri uygulanan Brusellozis Mücadele programı uygulanmaktadır [Anon, 1989]. Bu kapsamda belli aralıklarla sero-survey çalışmaları yapılmakta (1986, 1990, 1991, 1999) ve yoğun aşılama programları uygulanmaktadır [Anon, 1989; Anon, 1991; İyisan ve ark., 2000] yılları arasında yapılan en son ülkesel sero-survey çalışması sonucunda Türkiye de Brusellozis prevelansı sığır popülasyonunda % 1,43 koyun popülasyonunda ise % 1,97 olarak tespit edilmiştir [İyisan, 2000]. Alınan sonuçlar göstermiştir ki Brusellozis ülkemizin en önemli sorunlarından biri olmaya devam etmektedir. Brusellozis in teşhisinde direkt (etken izolasyonu ve identifikasyonu) ve İndirekt (serolojik testler, vb.) tanı metotları kullanılmaktadır. Hastalığın kesin teşhisi etken izolasyonu ve identifikasyonuna bağlı olmasına rağmen, infekte hayvandan etken

23 6 izolasyonunun her zaman mümkün olmayışı, izolasyonun uzun zaman alması ve çok sayıda hayvan söz konusu olduğunda kültürel muayenelerle infekte hayvanları saptamak saha ve laboratuar personeli için pratik değildir. Bu nedenle hastalığın teşhisi kontrol ve eradikasyon programları serolojik testlerle reaktörlerin saptanması esasına dayandırılmıştır [Alton ve ark., 1988; OIE Manual, 2003]. Harita Yılı Sığır Brusellozu Mihrak Sayısı [Tarım ve Köyişleri Bakanlığı, 2008; TÜİK, 2009]. Ancak her bir testin farklı immunglobulinleri incelemesi ve yanlış pozitifliklerin görülmesi, kronik ve aktif infekte hayvanların serolojik testlere düzensiz yanıt verebilmesi gibi nedenlerle inkubasyon devresinde serolojik yanıtın oluşmaması, aşı ile doğal infeksiyonun karışması gibi olumsuzluklarından dolayı Brusellozis in serolojik tanısında en az iki testin birlikte yapılarak sonuçların değerlendirmesinin yapılması tavsiye edilmektedir [Alton ve ark.,1975; Fekete ve ark.,1990].

24 7 Şekil 2.1. Sığır Brusellozu Mihraklar ( Ekim) [Tarım ve Köyişleri, Bakanlığı, 2008]. Brucella infeksiyonlarına karşı immun yanıt hayvan bireyleri içinde farklıdır [Sutherland ve Searson, 1990]. Bu farklılık alınan suşun miktarına, virulansına, infeksiyonun akut, kronik veya inkubasyon süresi içinde olmasına, konakçının cinsel olgunluğuna, immun durumuna ve infeksiyonun lokalize olduğu dokuya (genital kanal, meme, eklem gibi) bağlıdır [Plommet, 1984]. Ayrıca aşılamalar (aşının tipi, aşının metot ve dozu, hayvanın aşılama yaşı, aşılama peryodu) ve sürünün durumu da test sonuçlarını etkilemektedir [Crawford ve ark.,1990]. Hayvanların Brucella infeksiyonlarına karşı primer antikor yanıtının IgM sınıfı antikorların üretimini takiben IgG lerin ortaya çıkmasıyla karakterize olduğu bilinmektedir. İnfeksiyona karşı kronik veya sekonder immun yanıt maksimum düzeye ulaşan IgM lerdir. IgG ler ise daha sonra (13-21 gün) ortaya çıkar ve aşılamadan sonraki günde en üst düzeye ulaşır [Morgan, 1982]. Doğal

25 8 infeksiyona yakalanmış sığırlarda infeksiyon sonucunda IgM ve IgG düzeylerinde artma oluşur. IgM titresi zamanla düşerek dominant olarak IgG kalır. Bazı kronik vakalarda ise hayvanlarda zayıf aglütinasyon veren, ayrıca serumda bulunabilecek IgM antikorlarının etkin aglütinasyon özelliğini maskeleyen yüksek IgG 1 titreleri bulunabilir [Quinn ve ark., 1994]. Konjunktiva yoluyla virulent B. abortus inokule edilen hayvanlarda antikor üretimi süresi değişmektedir. Bunlarda IgG titreleri inokulasyondan gün sonra IgM titrelerini aşmakta ve gün boyunca yaygın antikor tipi olarak kalmaktadır [Sutherland,1980]. Brucella ile infekte olan ve olmayan hayvanları ayırmak için yapılan çalışmalarda S19 ile aşılı hayvanların serumlarındaki IgM, IgG 1, IgG 2 antikorlarının orantısal dağılımının B. abortus ile infekte olanlarınkinden farklı olduğu ortaya konmuştur. İnfekte hayvanların serumlarında en fazla IgG 1 sınıfı antikorlar hakim bulunurken, S19 ile aşılanan sığır ve buzağıların serumunda oluşan antikorların büyük çoğunluğu IgM ve IgG 1 sınıfına aittir. IgG 2 ler ise daha az miktarlarda bulunmaktadır [Arda ve ark., 1989]. Brucella sp lerin hücre duvarındaki lipopollysakkarit molekülünün bir parçası olan O- polisakkarit antijeni B. abortus, B. melitensis ve B. suis türlerinde büyük miktarlarda bulunurken B. ovis ve B. canis türlerinde ölçülebilir düzeyde bulunmamaktadır [Nielsen, 2002]. İlk 3 Brucella türünde smooth lipopollysakkarit (LPS) molekülünde ortak epitoplar bulunması nedeniyle, bu etkenlere karşı oluşan antikorların tespit edilmesinde kullanılan serolojik testlerde B. abortus antijeni ortak olarak kullanılmaktadır [Nielsen, 2002]. Brusellozis in indirekt teşhisinde Rose Bengal Plate Test (RBPT), Yavaş Tüp Aglütinasyon Testi (SAT), Komplement Fikzasyon testi (CFT), ELISA gibi serolojik yöntemler kullanılmaktadır [Alton ve ark., 1988; OIE Manual, 2003; Nielsen, 2002]. Bu testlerden bazılarında kros reaksiyonların [Diaz-Aparicio ve ark., 1993; İzgür ve ark., 1992; Mittal ve Tizard, 1981; Öngör, 1999] ve nonspesifik antikorların [Trap ve ark., 1985] yanlış sonuçlar alınmasına neden olmaktadır. Uluslararası standartlara göre bu testlerden RBPT nin tarama testi olarak, CFT nin ise standart doğrulama testi olarak kullanılması önerilmiştir [OIE Manual, 2003; Nicoletti, 1989; Olds, 1989].

26 9 RBPT basit spot aglütinasyon testi olup testte rose bengal ile boyanmış ve genellikle 3,65± 0,05 gibi düşük PH ya ayarlanmış antijen kullanılır [Morgan ve ark., 1969]. Bu sayede IgM lerin yanında IgG 1 lerin aglütinasyona katılması sağlanmış olur [Nielsen, 2002; Quinn, 1994]. Oldukça duyarlı bir test olan RBPT zaman zaman S19 aşısı ile aşılanmış hayvanlarda yanlış pozitif sonuçlar ortaya çıkabilmektedir. Bu reaksiyonların nedeni olarak aşı sonucu meydana gelen IgM lerin kros reaksiyon vermesi gösterilmiştir [Sutherland, 1980]. Yanlış negatiflik ise nadir görümektedir. Genellikle bu durum prozon fenomeninden kaynaklanır ve dilüe edilen serum tekrar test edilerek sorun çözülür. Bu gibi sorunlara rağmen RBPT testi infekte sürülerde hastalığın tespiti ya da Brucella dan ari sürülerde negatifliğin garanti altına alınmasında tarama testi olarak önerilmektedir [OIE, 2003]. Bunun yanında özellikle aşılı hayvanlarda yanlış pozitif reaksiyonlara da rastlanmaktadır. Brusellozis ten şüpheli sığır serumlarının 40 C civarındaki sıcaklıklarda laboratuara gecikmiş olarak ulaştırılmasında RBPT de yanlış sonuçlara neden olduğu belirtilmiştir [Herr, 1982]. İtalya da yapılan bir çalışmada 890 manda serum örneğinin 526 adet CFT pozitif ve 364 adet CFT negatif olan kısmı RBPT, FPA ile test edilmiş RBPT nin özgüllüğü % 84,5 ve duyarlılığını % 93,1 olduğu bulunmuştur [Montagnaro ve ark., 2008]. Stemshorn ve ark. (1985) nın yaptıkları çalışmada 16 infekte sığır sürüsünden aldıkları 2209 adet kan serumunu RBPT ve diğer aglütinasyon testleri ile incelemişler ve en duyarlı olarak RBPT ve Brucella Plate Aglütinasyon Test (BPAT) yi bulmuşlardır. Ülkemizde çeşitli Brucella teşhisi ile ilgili olarak 2001 yılında yapılan bir araştırmada Brusellozis li sürüden sağlanan toplamda 250 sığır serumundan 118'i (% 47,2) pozitif, 132'si (% 52,8) negatif reaksiyon göstermiştir. RBPT nin özgüllüğü % 85,7, duyarlılığı % 94,7 olarak belirlenmiştir. SAT da toplamda 250 sığır serumundan 129'u (% 51,6) pozitif, 121'i (% 48,4) negatif olarak saptanmış, SAT ın özgüllüğü % 69,6, duyarlılığı da % 81,6 olarak belirlenmiştir Sonuç olarak, sığır, koyun ve keçi gibi evcil hayvanlarda Brusellozis in serolojik tanısında ve ayrıca

27 10 kronik infekte taşıyıcı hayvanlarla, eradikasyon programları çerçevesinde aşılıinfekte ayırımının yapılabilmesi için RBPT ve SAT gibi konvansiyonel testlerinin mutlaka birlikte kullanılması gerektiği belirtilmiştir [Esendal ve ark., 2001]. Birçok araştırmada, Brusellozis in serolojik teşhisinde RBPT ile SAT, CFT ve ELISA testlerinin paralel olarak kullanıldığı belirtilmiştir. Denizli ve ark., (1992) tarafından yapılan araştırmada atık yapan sığırlardan aldıkları 180 adet sığır kan serumunu ELISA ve RBPT ile incelemişler ve ELISA ile 33 (% 18,4), RBPT ile 53 (% 29,4) pozitif bulmuşlar ve RBPT ile ELISA testi arasındaki pozitiflik ve negatiflik açısından % 78,5 lik bir uygunluk olduğunu bildirmişlerdir. SAT ilk olarak Wright ve Smith tarafından 1897 de Brusellozis in serolojik teşhisinde kullanılmak üzere geliştirilmiş serolojik bir testtir. Nötral veya hafif düşük ph da aktif olan aglütüninlerin en önemli kısmını IgM isotipi teşkil eder. Bu nedenle SAT ile kros reaksiyon veren antikorlarla yanlış pozitif reaksiyon verme olasılığı çok yüksektir. Bu nedenle OIE Manuel in 2000 versiyonunda Brusellozis teşhisinde kulanılan testler arasından çıkarılması önerilmiştir [Nielsen, 2002]. SAT bir alternatif test olarak önerilmemesine rağmen çok eski yılardan beri surveylans ve kontrol programlarında sıklıkla kullanılmaktadır [OIE, 2003]. SAT da tampon solusyon olarak kullanılan Fizyolojik Tuzlu Su (FTS) yun sığır serumları için % 0,85 liği, koyun ve keçi serumları için yüksek konsantrasyonda bulunan ve aglütüne olmayan IgG 1 yüzünden oluşan prozonu önlemek için % 5 liği kullanılmaktadır [Mac Millan, 1990]. SAT (Aglütinasyon test) te kros reaksiyonlardan ötürü şüpheliden yanlış pozitife giden sonuçlar verebilmektedir. Bundan dolayı Tüp Aglütinasyon Test teşhis amaçlı kullanılmamaktadır. Bu durum OIE manualde belirtilmiştir [OIE Manuel, 2000]. Ülkemizde yapılan çalışmalardan örnek olarak yılları arasında Kars bölgesinde sığır ve çiftçilerde Brucella prevalansı araştırılmıştır. Geçmişinde abort yapmış 27 sürüden 407 serum örneği Brucella antikorları yönünden RBPT ve SAT ile incelenmiştir. Ayrıca 246 çiftçi (130 erkek, 116 bayan) kan serumlarıda Brucella yönünden test edilmiştir. Sığır serumlarının analizinde RBPT ile 134 (% 32,9), SAT

28 11 ile 141 (% 34,64) pozitif bulunmuştur. Çiftçi serumlarında RBPT, SAT ve ELISA ile sırasıyla 32 (% 13), 35 (% 14,22) ve 44 (% 17,88) pozitif bulunmuştur. Brucella seropozitifliği yönünden cinsiyetler arasında fark bulunmamıştır. Brusellozis in hem hayvan hem de insandaki yüksek görülme oranı bu bölgede Brusellozis in yaygın olduğunu göstermektedir [Otlu ve ark., 2007]. Başka bir çalışmada Brusellozis şüpheli hastalarda Rose Bengal Plate Test, Standart tüp Aglütinasyon testi (STA), Coombs Testi, Rivanol Testi ve ELISA yöntemi ile alınan sonuçların karşılaştırılması amaçlanmıştır. Çalışmaya dahil edilen 77 hastadan kan kültürü ve serum örnekleri alınmıştır. Hastaların 35 inde (% 45,49) kan kültürlerinde Brucella türleri üretilmiş ve 62 sinde (% 80,5) brucelloz ile ilgili serolojik testlerden en az bir tanesi pozitif bulunmuştur. Testlerin duyarlılıkları Rose Bengal Plate Test için % 100, (SAT) için % 94,3 ELISA IgG için % 97,7, ELISA IgA için % 94,3, ELISA IgM için % 71,4 belirlenmiştir. Sonuç olarak, Rose Bengal ve SAT testlerinin Brusellozis in tanısında geçerliliğini koruduğu saptanmış, ELISA ile IgA ve IgG tespitinin ise gerek tanı şansının artırılmasında gerekse hastalığın takibin de yararlı olabileceği kanısına varılmıştır [Çiftçi ve ark., 2005]. Esendal ve ark. (2000) bruselloz yönünden şüpheli 250 sığır serumunda RBPT ile % 47,2, SAT ile % 51,6; 250 koyun-keçi serumunda da RBPT ile % 37,6, SAT ile % 44,4 pozitif reaksiyon saptamışlardır. Gürel ve ark. (1992) Denizli ve yöresinde 1012 insan ve 1700 sığır ve toplamda 2712 kan serumunu RBPT, SAT, RT (Rivanol Test) ve CFT ile incelemiş ve SAT ile en yüksek oranda pozitiflik tespit etmiştir. Denizli yöresindeki insan ve sığır serumlarının bruselloz yönünden karşılaştırıldığı bir çalışmada, insan serumlarında Rose-Bengal testi ile % 14,5, serum aglütinasyon testi ile % 16,6 pozitiflik elde edilmiştir [Gürel, 1992]. Karaman ve Güler, (1992) B. abortus aşısı ile aşılı 208 adet, infekte aşılı sığıra ait 623 adet ve atık yapmış koyun-keçiye ait 92 adet kan serumu ile çeşitli hastanelerden

29 12 gelen 154 adet insan kan serumu olmak üzere toplam 1077 adet serumu sero-ring test, SAT, rivanol test ve CFT ile muayene etmişler ve SAT ın akut Brusellozis in teşhisinde çok iyi sonuç verdiğini, bu test ile negatif veya düşük titre veren serumların diğer testlerle de desteklenmesi gerektiğini bildirmişlerdir. Denizli yöresindeki insan ve sığır serumlarının bruselloz yönünden karşılaştırıldığı bir çalışmada, insan serumlarında Rose Bengal testi ile % 14,5, serum aglütinasyon testi ile % 16,6 pozitiflik elde edilmiştir [Gürel, 1992]. Tüm dünyada Brusellozis için CFT referans test olarak kabul edilmiş, SAT ve RBPT inin ise tarama testi olarak kullanılması önerilmiştir [Nicoletti, 1989; Olds, 1989]. Komplement fikzasyon testi doğal infeksiyon ve canlı aşılar ile aşılamadan dolayı oluşan serolojik reaksiyonlar ayırımda önemlidir [Altan, 1987; Doğuer, 1970]. Brusellozis infeksiyonunda şekillenen IgG 1 ve IgG 2 alt sınıf immunglobulinlerin serolojik reaksiyonlarındaki etkileri farklıdır. CFT ile IgG 1 antikorları tespit edilir, IgG 2 komplementi fiske etmediği halde aglütinasyon testinde aktif durumda bulunur ve serumlarda IgG 2 miktarı fazla ise prozona sebep olur ki bu da yanlış negatif reaksiyonlara neden olur [Chappel, 1989]. CFT de rol oynayan antikorlar IgG 1 lerdir. IgG 2 lerin kobay komplementini fikze edici özelliğinde olmaması nedeniyle testte etkinliği yoktur. IgM lerin etkinliği inaktivasyon derecesinden dolayı azdır. Serumun inaktivasyon derecesi yükseldikçe (65 C) IgM inaktif olur [Alton ve ark., 1988]. CFT sığır, koyun ve keçilerin serum dilusyonları ile önceden titrasyonu yapılmış komplement bir arada tutulur. Ortama indikatör sistem olarak koyun eritrositi ve bu eritrosite karşı duyarlılaştırılmış tavşan antikoru ilave edildiğinde şayet serumda IgG 1 antikorları var ise antijene bağlanarak komplementi aktive eder ve eritrositler lize olmaz. Antikor yok ise komplement tavşan antikorlarının Fc porsiyonunda bulunan reseptöre bağlanır, bu durumda eritrositler lize olur [Nielsen, 2002]. Gall ve Nielsen CFT nin mükemmel performasından dolayı iyi bir test olup fakat pek çok pratik zorlukları bulunduğunu ve teknik olarak karışık bir test olduğunu bildirmişlerdir [Stack ve ark., 1999]. Geniş ölçüde doğrulama testi olarak kullanılmasına rağmen CFT oldukça karmaşık, uygulaması ve testte kullanılan reagentlerin standardizasyonu bir hayli zor ve iyi bir laboratuar alt yapısı gerektiren

30 13 serolojik bir testtir. Ayrıca her örneğin bir seri dilusyonunun test edilmesi gerekmektedir. Sayısız varyasyonları olan CFT en sık kullanıldığı şekli mikrotiter şeklidir. CFT oldukça özgül bir test olmasına rağmen diğer bütün serolojik testlerde olduğu gibi aşılı hayvanlarda yanlış pozitif sonuç alınabilir. Ayrıca kötü kalite serumlar (Hemolitik ve antikomplementer etkili) CFT testi için uygun değildir [Nielsen, 2002; Stack ve ark., 1999]. Larsen ve ark. (1988) doğal olarak infekte sığır sürülerinden aldıkları sığır kan serumlarını CFT ve ELISA ile incelemişler ve her iki testle elde edilen sonuçları birbirine yakın bulmuşlardır. Dohoo ve ark. (1986) Brucella dan ari sığır sürülerinden 1578 ve B. abortus izole edilen sığırlardan alınan 174 adet kan serumunu CFT, BPAT (buffered plate agglutinatıon test), SAT, HIGT (hemolysis in gel test) ve ELISA ile test etmişler ve Brucella dan ari sürülerde CFT ile hiç yanlış pozitif alınmamış spesitenin % 100, özgüllüğünün ise ELISA ile benzer olduğu sonucuna varmışlardır. 167 pozitif sığır kan serumu ile Stemshorn ve arkadaşlarının yaptıkları araştırmada, CFT, RBPT ve SAT testlerini bir arada incelemişler ve testlerin özgüllüğü sırayla CFT % 79, RBPT % 74 ve SAT % 68,9 olarak bulunmuştur sığır 24 sürüden yapılan testlerde ise aşısız hayvanlarda duyarlılıklar SAT % 99,5, RBPT % 100, CFT % 100 aşılılarda ise SAT % 98,8, RBPT % 100, CFT % 100 tespit edilmiştir. Pozitif hayvanlarda SAT ın Brusellozis in serolojik teşhisinde % 69 luk bir oran vermesi CFT nın SAT ve RBPT den daha etkili ve değerli olduğu sonucuna varmalarına sebep olmuştur [Stemshorn ve ark., 1985]. Sutherland, (1984) Brucella kültürünün negatif ve pozitif olduğu sığır kan serumlarının serolojik incelemesinde CFT ve SAT ın, ELISA dan daha özgül olduğunu bildirmişlerdir.

31 14 Nicoletti ve Muraschi, (1966) Brucella infekte sığırlardan aldıkları kan serumlarını çeşitli aglütinasyon testleri incelemişler, 117 infekte sığırın 111 (% 98) ini CFT ile pozitif saptamışlar ve bu testin diğer testlerden daha üstün olduğunu bildirmişlerdir. 167 pozitif sığır kan serumu ile Stemshorn ve arkadaşlarının yaptıkları araştırmada, CFT, RBPT ve SAT testlerini bir arada incelemişler ve testlerin özgüllükleri sırayla CFT % 79, RBPT % 74 ve SAT % 68,9 olarak bulunmuştur sığır 24 sürüden yapılan testlerde ise aşısız hayvanlarda duyarlılıklar SAT % 99,5, RBPT % 100, CFT % 100 aşılılarda ise SAT % 98,8, RBPT % 100, CFT % 100 tespit edilmiştir. Pozitif hayvanlarda SAT ın Brusellozis in serolojik teşhisinde % 69 luk bir oran vermesi CFT nın SAT ve RBPT den daha etkili ve değerli olduğu sonucuna varmalarına sebep olmuştur [Stemshorn ve ark., 1985]. Ülkemizin çeşitli bölgelerinden 13 değişik çalışma grubunun aynı yöntem ve reaktifler kullanarak yaptıkları tarama çalışmalarında, toplumun çeşitli kesimlerinden toplanan 70,009 adet kan serumunu incelemişler ve SAT ile negatif 8,593 örneğin, 35 (% 0,4) ünde komplementi fiks eden antikorların varlığını belirlemişlerdir [Çetin ve ark., 1990]. Elazığ bölgesinde Nartok, (1983) un yaptığı çalışmada, 584 adet sığıra ait kan serumlarında Brucella tespiti için SAT ve CFT testini bir arada uygulamış ve CFT nin, SAT a göre daha hassas olduğunu belirtmiştir. Brucellozun serolojik tanısında yaygın olarak kullanılan test serum aglütinasyon testi (SAT) dir. Ama bu testin, diğer bazı mikroorganizmalarla çapraz reaksiyon vermesi, sonuçların tek başına akut, subakut veya kronik enfeksiyonun ayırt edilmesine imkan vermemesi gibi birtakım olumsuzluklar nedeniyle antikor alt gruplarının belirlenmesine olanak sağlayan yeni tanı yöntemlerinin geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Uygulaması kolay ve duyarlı bir test olan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) üzerinde ençok çalışılan yöntem olmuştur [Corbel, 1997; Bundle ve ark., 1984].

32 15 Son yıllarda yapılan çalışmalara göre ELISA testi Brucella teşhisinde büyük önem kazanmıştır ve Brucella teşhisinde kullanılan referans testler arasına girmiştir [OIE Manual, 2003]. ELISA testinin prensibi Voller ve ark. (1976) tarafından tanımlanmıştır. Bu test ile viral, bakteriyel, paraziter ve fungal birçok infeksiyonda antijen veya antikor aranabildiği gibi, tümör markerleri, hormon düzeyleri ve immonoglobulin düzeyleri de tayin edilebilmektedir [Voller ve ark., 1976 ve 1978]. ELISA testi ile 0,00005, komplement fikzasyon testi ile ise 0,05 ug protein/ml tespit edilebilmektedir [Ayhan, 1988]. Enzimle işaretlenmiş antijen veya antikorun kendine uygun antijen ya da antikorla özgül olarak bağlanabilmesi prensibine dayanan duyarlı ve güvenilir bir testtir. ELISA ile sütte indirekt antikor varlığı ve Brucella türlerinin A ve M antijenlerinin varlığı teşhis edilebilmektedir [Kerkhofs ve ark., 1990; Thoen ve ark., 1979]. ELISA testi ile anti IgM ve IgG konjugatları kullanılarak hastalığın akut ve kronik şekli de belirlenebilmektedir [De Klerk ve Anderson, 1985; Felek, 1992]. I-ELISA ilgili yapılan çalışmalarda diğer testlere göre duyarlılık ve özgüllük oranlarının yüksekliği, testin uygulamasındaki kolaylık ve kısa zamanda sonuç alınabilmesi nedeniyle özellikle tercih edildiği bildirilmektedir. Aynı zamanda, antijen modifikasyonkasyonları ile çapraz reaksiyon riskinin en aza indirilmesi gibi avantajları da vardır. Bruselloz tanısında ELISA testinin hızlı, duyarlı ve özgül olduğu gösterilmiştir. Akut ve kronik brucellozda immunuglobilin profilini göstermede yardımcıdır. Kitle taramalarında ve brusellozun serolojik tanısında seçilebilecek bir yöntem olarak pek çok çalışmada önerilmektedir [Biancifori ve ark., 2000; Nielsen ve ark., 2005]. MRT genellikle kan örneklerinin alınması sırasında karşılaşılan güçlükler ve ek laboratuar çalışmalarını gerektirmesinden dolayı, süt sığırcılığı yapılan bölgelerde, sütte Brucella antikorlarının araştırılması amacıyla bakteriyel kültür metotları ile birlikte uzun yıllar ekonomik bir yöntem olarak, başarıyla kullanılmıştır. Çünkü toplanan süt örnekleri infekte bireylerin tespiti için uygun bir tarama test yöntemidir. [Roepke ve ark., 1950 ve 1974; Alton ve ark., 1975]. MRT de rol oynayan aglütüninler: yağ globullerine bağlanmış glikoprotein yapısında, ısıya ve

33 16 çalkalanmaya duyarlıdır. Bu yüzden MRT de yalancı pozitiflik ve negatiflik sonuçlarında en önemli etken kaymak tabakasındaki değişikliklerdir. Çok az krema içeren, hücre sayısı fazla olan, donmuş, kaynatılmış, pastörize olmuş veya ekşimiş sütler MRT için uygun değildir [Arda ve ark., 1992; Sutra ve ark., 1986]. Bu test özellikle toplu süt örneklerinde sütçü sığırların hastalık yönünden taranmasında etkilidir. MRT büyük sürülerde (100 den fazla), sağmal sığırlarda ve erken infeksiyonlarda yerli duyarlılığa sahip değildir. Bundan başka MRT, süt sulandırılmadan test yapıldığında, doğumdan hemen sonra, laktasyon sonunda ve mastitis varlığında yalancı pozitiflik verir [Alton ve ark., 1988]. MRT nin Aglütinasyon testine adaptasyonu [Hunter ve Allan, 1972; Huber ve Nicoletti, 1986; Sutra ve ark., 1986] tarafından standartize edilmiştir. MRT özgüllüğü düşük bir test olduğu için test yapılacak sütün, mastitis, kolostrum veya laktasyon döneminin sonuna geldiği dönemlerde yanlış teşhis verme durumu bulunduğundan bu test OIE tarafından sığır Brusellozis inin tanısında sadece tarama testi olarak tanımlanmıştır [OIE Manuel, 2000]. Thoen ve ark. (1979), geliştirdikleri enzyme immunoassay (EIA) metodu ve deneysel olarak 2308 suşu ile infekte ettikleri ve bakteriyolojik olarak müspet buldukları 16 sığırda EIA nın MRT den daha özgül ve duyarlı olduğunu tesbit etmişler ve 11 kontrol olarak ayrılan süt numunelerinde EIA ile hiçbir reaksiyon görülmemiştir. Yardımcı (1989), koyun kan serumlarını Brucella teşhisi için RBPT, SAT ve ELISA ile incelemişler ve RBPT ile % 36,5, SAT ile % 39,4 ve ELISA ile % 45,3 lik pozitiflik saptamıştır ve pozitifleri tespit etmede ELISA ve SAT testinin daha duyarlı olduğunu belirtmiştir. Magee (1980), B. abortus teşhisinde ELISA testini, direkt aglütinasyon, komplement fikzasyon ve Coombs testi ile karşılaştırmış ve ELISA ile % 13,39 pozitif bulmuş, ELISA pozitif bulunanlarının 13 tanesi diğer testlerle pozitif reaksiyon vermiştir.

34 17 Böylece ELISA yı diğer testlere oranla daha hassas, çabuk ve basit bir metod olarak değerlendirmiştir. Ruppanner ve ark. (1980), 24 düvede B. abortus 2308 suşu ile konjuktival keseye aşı yapmış 12 ve 102, günler arasında 11 kere serum almış ve antikor titreleri ELISA, SAT, 2-Mercaptoetonol (2-ME), Micro Komplement Fikzasyon Test (MCF) ve Otomatik Komplement Fikzasyon Test (OCF) ile test edilmiştir. ELISA ve diğer testler arasında karşılaştırıldığında SAT ile % 100, 2-Mercaptoetonol ile % 75,7 MCF ile % 97,8 ve OCF ile % 95,2 uyumlu bulunmuştur. Heck ve ark. (1980) ELISA yı sığır süt örneklerinde B. abortus antikorlarının seropozitif ya da negatifliği tespit için uygulamışlar ve ELISA yı sığır süt örneklerinde B. abortus antikorlarını bulmada uygun bir yöntem olduğunu belirtmişlerdir. Boraker ve ark. (1981), süt ineklerinde B. abortus antikorları tespiti için I-ELISA kullanmışlar ve I-ELISA nın kültür ve MRT pozitif olanlarda yüksek bir uyum bulmuşlardır. ELISA metodu aynı şekilde MRT nin yalancı pozitiflerini elimine etmekte bazı MRT negatif örnekleri ortaya çıkarmaktadır. Süt-ELISA nın ferdi ve toplu sütlerde MRT ye göre düşük düzeydeki antikorları tespit edebilen ucuz, çabuk bir metod olduğunu bildirmişlerdir. Sonuçlar göstermektedir ki sadece duyarlı ve özgül olmakla kalmayıp aşılı ve aşısızdan ayırt edebilmekte ve mikrop saçan ve saçma ihtimali olan bireyleri tahmin etmek için teşhis değeri taşımaktadır. Brusellozis olmayan sürüden 41 hayvan alınmış bunlar 3 gruba ayrılarak 14 hayvan göz içi 3x10 9 B. abortus strain 19 suşu ile, 17 hayvan 3x10 7 B. abortus strain 2308 suşu ile aşılanmış aynı zaman zarfında 10 hayvanda negatif kontrol olarak tutulmuştur. Bu hayvanlar gün aralığında kan serumları SAT, CFT, RBPT ve ELISA ile teste alınmış. 101 günün sonunda antikor titresi ölçüldüğünde konvensiyonel testlerde ELISA ya göre daha düşük titre tespit edilmiştir. ELISA daha yüksek özgüllüğü ile teşhisde diğer testlerden daha öne çıkmıştır. İnfekte

35 18 hayvanlarda Brusellozis titresi % 94 olarak tespit edilirken, konvensiyonel metodlarla bu oran % 50 pozitif olarak bulunmuştur [A.Van ve ark., 1984]. Stemshorn ve ark. (1985), sığır Brucella teşhisinde 6 Aglütinasyon ve 2 CFT testi kullanarak Brucella ari 1051 serumu duyarlılık ve özgüllük yönünden karşılaştırmışlardır. Sırasıyla Buffer Plate Antijen Test, SAT, Plate Aglütinasyon Test ve 2-MET de % 98,9, % 99,2, % 99,3, % 99,8 duyarlılık bulmuşlardır. Bununla birlikte RBPT, CT (Coombs test) ve CFT Brusellozis e karşı antikor tespit edememişlerdir. Turilli ve ark. (1986) 1188 sığır serumunu test etmişler ve Brucella için ELISA duyarlılığının SAT ve CFT ile aynı olduğunu bildirmişlerdir. ELISA nın diğer testlerle uygunluğunun % 99 un üzerinde olduğunu bulmuşlardır. Süt immunoglobilinleri doğal infekte veya deneysel olarak aşılanan hayvanların sütlerinin krem rengi doğal halka tabakasından çıkarılmıştır. IgA her zaman bulunmuş ve çoğunlula IgM le benzerlik göstermiştir (15/17). IgG ise örneklerin daha az bir kısmında rastlanmıştır (11/7). Süt numuneleri 20 ºC de 18 saat inkubasyon da daha açık renk oluşturarak pozitif ve negatif örneklere göre daha düşük sonuçlar vermişlerdir [Sutra ve ark., 1986]. Foschner ve Bünger, (1986) tank sütlerinde sığır Brucella antikorlarının araştırılması için 100 kat dilüe edilen infekte inek sütünde antikor saptanmasını yapmışlar, bireysel serolojik testler ile toplu sütlerinin karşılaştırılmasında ELISA nın MRT den çok daha duyarlı olduğunu bildirmişlerdir. Kim ve ark. (1988) 4 Brucella şüpheli ve 44 sağlıklı kontrol hayvanını karşılaştırmışlardır. Plate Aglütinasyon Test (PAT), SAT ile karşılaştırıldığında % 3,1 yalancı pozitif ve % 1,6 yalancı negatif reaksiyon vermiştir. İki test arasındaki uyum % 61,7 bulunmuştur. Rivanol, 2-MET, ELISA, RBPT ve CFT arasında ELISA ve CFT en hassas test bulunurken Rivanol Test en özgül test olarak tespit edilmiştir.

36 19 Barman ve ark. (1989) Hindistan Assam da infekte sağmal inek çifliklerinden alınan sığır serum ve sütlerinde geçmişinde abort, plasenta retensiyonu, mastitis, eklemlerde şişme ve erken doğum olan 129 serum ve 42 süt örneği test yapmış ve test sonucunda serumların % 44,9 u SAT ile % 54,7 si MRT ile pozitiflik tespit etmişlerdir. Al-Khalaf ve El-Khaladi. (1989) Kuveyt te develerde serum ve sütlerde Brucella antikorlarının varlığını serumda 3 serolojik test RBPT, SAT ve CFT süt de ise MRT ile incelemişler prevalansı CFT ve RBPT ile % 14,8 SAT ile % 10,8, süt için prevalansı MRT ile % 8,0 bulmuşlardır. 7 infekte sürüde 6,472 sığırdan toplanan serum ve sütler serolojik ve bakteriyolojik olarak test edilmiş bunların % 16,31 i 1056 sı serolojik olarak pozitif ve % 25,21 i 1632 si de MRT ile pozitif bulunmuştur [Zowighi ve ark., 1990]. Sharma ve ark. (1990), Brusellozis in seroprevalans çalışmalarında 208 manda ve sığır serum örneklerinde RBPT ve SAT çalışmışlardır. RBPT ile % 12,98 SAT ile % 2,40 pozitiflik bulmuşlardır. Aynı şekilde SAT pozitif bulunan 5 hayvanın RBPT de 3 adet i (% 60) pozitif sonuç vermiştir. Doğal infekte sığır sütleri bir tankta toplanarak Sonica B. abortus S-99 antijeni ve monoclonal antibovine IgM, IgA ve IgG konjugatları kullanılıp I-ELISA ile teste tabi tutularak MRT ile karşılaştırılmış. Bunlar içinde IgG 1 in kullanıldığı konjugat daha özgül ve duyarlı bulunup, I-ELISA ile ferdi ve toplu süt örneklerinin titreleri MRT ye göre daha yüksek tespit edilmiştir. Brucella olmayan 5910 süt örneğinde sadece 24 (% 0,4) ünde I-ELISA ile pozitif bulunmuştur. Buradan I-ELISA nın ferdi süt örneklerinde MRT yerine geçecek uygun bir test olduğu sonucuna varılmıştır. Fakat toplu süt örneklerinde Brucella antikor aramada her iki test MRT ve I-ELISA uygulanmalıdır [Bercovich ve ark., 1990]. Kerkhofs ve ark. (1990), yaptığı bir çalışmada sütte Brucella antikorlarının IgA, IgG, IgG 1 e yönelik teşhisinde antijen olarak Lipopollysakkarit kullanılarak ELISA

37 20 testleri yapılmıştır. Brucella nın görüldüğü çiftliklerden toplanan 3212 tank süt örneği MRT ve ELISA ile 40 MRT pozitif sürüde ELISA ile teste alınmıştır. 3 sürüdeki ELISA ile yapılan testte IgG 1 titrasyonu % 92,8 bulunmuştur. IgA ELISA özgüllüğü ise % 100, duyarlılığı daha düşük bulunmuştur. IgG 2 ELISA teşhisinde kullanılmamış. 110 ferdi MRT pozitif süt örneği içinde negatif süt örnekleri ELISA ile MRT ve IgG 1 in özgüllüğünü öğrenmek için teste alınmış. Ortalama olarak IgG 1 ELISA 22 defa MRT den daha duyarlı bulunmuştur. Bu çalışmada ELISA nın B. abortus antikorlarını sütte tespit etmede MRT den daha etkili ve infekte hayvanların erken teşhisinde önemli olduğu Ayrıca MRT deki sütteki az krema, çok fazla hücre, sütte donma, bozulma gibi olumsuz etkenlerin ELISA da analiz için risk teşkil etmediği sonucuna varılmıştır. Kerkhofs ve ark. (1990) sütte IgG 1, IgG 2 ve IGA yı araştırmışlar, serolojik pozitif test sonuçlarını MRT ve ELISA ile karşılaştırdıkların da, MRT ile % 58 pozitif sonuç alındığını ELISA ile bu değerin IgG 1 de % 92,8 olduğu görülmüş ve IgG 2 ELISA nın MRT e göre 22 defa duyarlı olduğunu, infekte sürülerin erken teşhisini kolaylaştırdığını bildirmişlerdir. Farklı bir çalışmada doğal infekte sığır sütleri bir tankta toplanmış Sonica B. abortus- S99 antijeni ve monoclonal antibovine IgM, IgA ve IgG konjugatları kullanılıp I- ELISA ile teste tabi tutularak MRT ile karşılaştırılmış. Bunlar içinde IgG 1 in kullanıldığı konjugat daha özgül ve duyarlı bulunmuştur. I-ELISA ile ferdi ve toplu süt örneklerinin titreleri MRT ye göre daha yüksek bulunmuştur. Brucella ari 5910 süt örneğinde sadece 24 (% 0,4) ünde I-ELISA ile pozitif bulunmuştur. Buradan I- ELISA nın ferdi süt örneklerinde MRT yerine geçecek uygun bir test olduğu sonucuna varılmıştır. Fakat tank süt örneklerinde Brucella antikor aramada her iki test MRT ve I-ELISA uygulanmalıdır [Bercovich ve Taıjke, 1990]. Sürü aralığı olan B. abortus 19 suşu ile aşılanmamış 10 infekte sürüden 1082 örnekle yapılan bir çalışmada testlerin özgüllüğü RBPT ile % 84 ve % 79,1 serum- ELISA ile % 97,1 ve % 95,2 bulunmuştur. Sürü aralığı olan 4765 örnek ve 30 sürüdeki aynı grup infekte hayvanlara yapılan test çalışmalarında ELISA nın

38 21 özgüllük ve duyarlılık yönünden diğer testlerle karşılaştırılabileceği ve güvenle kullanılabileceği görülmüştür [Saravi ve ark., 1995]. Arjantin ve Şili den temin edilen B. abortus ile infekte 202 örnek ve Kanada dan temin edilen B. abortus ile infekte olmayan sürülerden 6283 süt örneği teste alınmış, yapılan çalışmada I-ELISA ile özgüllük, B. abortus ile infekte sürüde % 95,2 bulunmuştur. I-ELISA nın sığır sütlerinde B. abortus yönünden antikorları teşhis etmede MRT den daha yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahip olduğunu belirterek tercih edilebileceğini bildirilmiştir [Nielsen ve ark., 1996]. Biancifiori ve ark. (1996) süt-elisa yı keçi sütünde standart referanslar kullanarak düşük antikor seviyelerini tespit etmek ayrıca duyarlılık ve özgüllüklerini öğrenmek ve konvensiyonel tarama testleri ve saha şartlarında uygunluğunu karşılaştırmak için uygulamışlardır. Araştırıcılar süt-elisa nın RBPT ve CFT ile karşılaştırıldığında duyarlılığını % 65 ve % 83 olarak bulmuşlardır ki bunların % 92 si kültür pozitif hayvanlardır. Brucella olmayan ari sürüde ise duyarlılık % 100 bulunmuştur. Araştırıcılar pozitif koyunlara ait kolostrumdaki sütte, doğumdan sonraki 30 gün sonundaki sütteki ımmunoglobilinlerin konsantrasyonu doğumdan hemen sonra hızlı bir şekilde düşüş eğiliminde iken serumda sürekli yüksek kalmış ve keçi sütlerinde Brucella antikorları için süt-elisa nın bireysel testlerde tamamlayıcı bir teşhis aracı sayılabileceği fakat birleştirilmiş koyun sürülerinde tarama testi olarak uygulamada uygun olmayabileceğini bildirmişlerdir. Kerby ve ark. (1997) I-ELISA ile CFT yi B. abortus S-19 ile aşılanmamış negatif sürede ve aşılanıp aşılanmadığı bilinmeyen pozitif sürüde değerlendirme yapmışlar ve pozitif sürede ELISA nın CFT den daha çok pozitif gösterdiğini, yüksek duyarlılık ve düşük özgüllüğe sahip olduğunu tespit etmişlerdir. Mikolon ve ark. (1998) süt-elisa nın MRT ye göre daha özgül ve duyarlı olduğunu, objektiflik, yorumlama avantajları olduğunu bildirmişlerdir.

39 22 Paweska ve ark. (2002) Güney Afrika dan 3643 Kanada dan 652, Almanya dan 240, Fransa dan 73, ABD den 195 toplam 4803 serumu analiz etmişler, I-ELISA nın diagnostik duyarlılığı % 100, CFT % 83,3 özgüllüğünü ise I-ELISA % 99,8 ve CFT nin % 100 bulmuşlardır. Sonuç olarak I-ELISA nın test çalışmalarında yüksek özgüllük, duyarlılık ile geniş çaplı Brucella antikor taramalarında sade, hızlı, basit bir tarama testi olduğunu bildirmişlerdir. Yukarda ki çalışmaya dayanarak bu testin sadece doğrulama testi olan CFT değil konvansiyonel testlerden RBPT ve SAT ın yerine geçmesini de önermişlerdir. Nazem ve ark. (1998) Geçmişinde Brucella infeksiyonu geçirmiş Friessian ırkı süt sığırlarının 54 süt örneğini MRT ve süt-elisa ile test etmişler ikisi arasında % 48,10 oranında uyum bulmuşlardır. MRT nin özgüllük ve duyarlılığının ELISA ya oranla sırasıyla % 48,15 ve % 72,22 bulmuşlardır. Sonuç olarak süt-elisa nın MRT ye oranla daha özgül ve duyarlı olduğunu tespit etmişlerdir. Brucella ari koyun ELISA, SAT, CFT, RBPT ile teste tabi tutulmuş infekte hayvanları tespit etmede CFT-SAT ya da CFT-RBPT kombinasyonları % arasında olurken ELISA ile bu oran % olmuştur koyunun I-ELISA ile 17 si pozitif bulunmuş ve duyarlılıkları % 99,8 olarak tespit edilmiştir. Ve I- ELISA nın sürülerde seropozitif hayvanları bulmada diğer konvensiyonel testlerden daha başarılı olduğu bildirilmiştir [Bercovich ve ark., 1998]. Vanzini ve ark. (1998) I-ELISA yı Arjantin de 24 aylıktan büyük Brucella dan en az 5 yıldır ari 12 sürüde toplanan 2646 sığır serum ve 2119 süt örneğini B. abortus antikorlarını tespit için uygulamışlar. I-ELISA nın oldukça özgül ve duyarlı bir test olduğu, bundan dolayı büyük miktarlı örneklerde yenilikçi bir yöntem olarak kullanılabileceğini bildirmişlerdir serum örneği I-ELISA ve C-ELISA yı sığır Brusellozis teşhisinde değerlendirmek ve rutin konvensiyonel testlerle karşılaştırmak için, doğal infekte ve aşılı sürüde ki hayvanlardan alınmıştır. Aglütinasyon, RBPT, I-ELISA, C-ELISA ile test yapılmıştır. C-ELISA nın özellikle aşılanmış hayvanlarda diğer testlerden daha